tehnologia hibridomului

7/18/2019 tehnologia hibridomului

http://slidepdf.com/reader/full/tehnologia-hibridomului-56d78978721fb 1/18

Universitatea Alexandru Ioan Cuza

Facultatea de Biologie

Master Biotehnologii microbiene i celulareș

Anul II

Ia iș

Tema proiectului: Tehnologia hibridomului

1



CUPRINS

INTRODUCERE...................................................................................................3

. !ETOD" C#"SIC$ DE O% INERE " "NTICORPI#OR Ț .......................&

1.1. DEA!A"#A$E%E ME#&DEI C%A'ICE..............................................................(

'. TE(NO#O)I" !ODERN$ DE O% INERE " "NTICORPI#OR Ț ...........*

).1. E#A*E%E &B+I"E,II -IB,ID&MU%UI..............................................................

3. "+"NT",E#E %IOTE(NO#O)IEI (I%RIDO!U#UI............................3

-. "P#IC"II PR"CTICE "#E "!C.............................................................-

%I%#IO)R"/IE..................................................................................................0

Introducere

)



-ibridomul /din latina h0brida metis2 cu s3nge amestecat 4 oma tumor56 este

o linie celular5 creat5 in vitro /7n laborator6 8rin hibridizarea somatic5 a unor ti8uri

celulare genetic di9erite2 ale c5ror cromozomi se amestec5. "ucleele hibride 9ormate

8osed5 caracterele genetice ale celor dou5 s8ecii de celule. -ibridoamele sunt de obicei

9ormate 8rin 9uziunea lim9ocitelor B sau # cu o celul5 tumoral5. -ibridoamele B sunt

utilizate 8entru 8roducerea de anticor8i monoclonali. De exem8lu 9uziunea lim9ocitelor

B de oarece 8roduc5toare deș anticor8i /dar 7n cantitate redus56 cu celule canceroase

/cu dezvoltare nelimitat56 ale mielomului de oarece a 8ermis ob inerea secre ieiș ț ț

masive i durabile de c5tre acest hibridom /sau imunom6 a unor ș anticor8i

monoclonali. -ibridoamele # sunt utilizate 8entru studiile biochimice ale moleculelor s8eci9ice 9iec5rei clone # /#C,6 i semnalelor de activarea sau moarte celular5.ș

/igura . ,e8rezentare schematic5 de ob inere a hibridomuluiț

In1:( biologul ;<hler =. i biochimistul Milstein C. au 8us bazele tehnologiiș

hibridomului. Du85 imunizare cu antigen>8ur2 are loc 9uziunea celulelor s8lenice de

oarece cu celulele de mielom2 at3t cu celule tumorale cu 9ormare de celule hibrodom.ș

-ibridoamele de oarece se ob in 8rin 9uziunea lim9ocitelor B s8lenice cu celulele deș ț

mielom. 'co8ul 9uziunii este ?imortalizarea@ celulelor 8roduc5toare de anticor8i2 ele

re8rezint5 esen a biotehnologiei hibridomului /;<hlerMilstein2 1:(6.ț

"um5rul i varietatea hibridoamelor este mare2 ceea ce im8une selec ia 8entru aș ț

ob ine anticor8i cu s8eci9icitatea dorit5. Amestecul rezultat 7n urma 9uziunii con ineț ț

celule s8enice i celule mielom ne9uzionate2 8recum i celule hibridom rezultate 7nș ș

urma 9uziunii celulelor s8lenice cu celule mielom. 'co8ul selec iei este se8arareaț



celulelor de hibridom i inhibarea celorlalte ti8uri celulare de aceea amestecul seș

cultiva 8e mediu -A# 8entru su8ravie uirea celulelor 9uzionate mielom>s8lenocit.ț

Fiecare celul5 de hibridom 8rin diviziuni succesive 8roduce o colonie o clon5

celular5. Dintre sutele de hibridoame clonate2 este necesar5 selec ia doar a celor cuț

ca8acitate de sintez5 a anticor8ilor s8eci9ici 9a 5 de antigenul cu care s>a 95cutț

imunizarea.

Cea mai sim8l5 metod5 ado8tat5 este cultivarea in vivo ce const5 7n inocularea

intra8eritoneal5 de celule hibridoma. -ibridomul se dezvolt5 intraabdominal i 7nș

lichidul de ascit5 care o 7nso e te. Anticor8ii din lichidul ascitic se 8uri9ic5 8rinț ș

9rac ionare sau 8rin metoda cromatogra9iei cu schimb de ioni /;<hlerMilstein2 1:(6.ț

n 1:2 Milstein C. 7m8reun5 cu =eorges $. F. ;<hler2 au 8rimit *remiul "obel 8entru Medicin5 8entru ?teoriile legate de specificitatea dezvoltarea iș

controlul sistemului imunitar i descoperirea principiului pentru producereaș

anticorpilor monoclonali”.

*rimul hibridom a 9ost o ramur5 abordat5 de Milstein C. 8entru a realiza o linie de

celule ca8abile de a sintetiza anticor8i s8eci9ici2 derivat din 9uziunea unei celule de

mielom i un lim9ocit. A introdus un nou conce8t 7n extinderea unor alte categorii deș

celule care sintetizeaz5 substan e utile /insulina6. Acum anticor8ii monoclonali 8ot 9iț

ob inuti i 8rin mani8ulare in vitro2 ceea ce duce la o im8rotant5 evolu ie 7n a8lica iileț ș ț ț

tera8eutice /Milstein2 1:::6.

. !etoda cla1ic2 de ob inere a anticorpilorț

Metoda clasica de obGinere a anticor8ilor necesari studiilor clinice si de

diagnostic2 consta 7n stimularea re8etata2 8rin inHectarea antigenului 7ntr>un organism

cu reactivitate imunitara o8tima. C3nd titrul anticor8ilor s8eci9ici este maxim2 animalul



este s3ngerat si se obGine serul imun /antiserul62 care este 9olosit 7n stare nativa sau este

utilizat 8entru 8uri9icarea anticor8ilor /Mihaescu2 )16.

.. Dea4anta5ele metodei cla1ice

Metoda are c3teva dezavantaHeJ

>cantitatea si calitatea anticor8ilor 9ata de un antigen variaz5 de la un organism la

altul si chiar 7ntre s3nger5rile succesive ale aceluiaKi animal

>serul imun este un amestec 9oarte heterogen de molecule de anticor8i2 chiar si

7n cazul 7n care imunizarea se 9ace cu un antigen cu grad 7nalt de 8uritate

>oric3t de sim8lu ca structura moleculara2 un antigen are mai multi e8ito8i care

stimuleaz5 mai multe clone de lim9ocite2 ce 8roduc anticor8i cu s8eci9icit5Gi si a9init5Gi

di9erite

>antigenele 7nalt 8uri9icate conGin im8urit5Gi antigenice care induc sinteza

anticor8ilor s8eci9ici 7n cantit5Gi dis8ro8orGionat de mari

>chiar du85 8uri9icare L 8roces costisitor L antiserurile conGin anticor8i cu a9init5Gi

di9erite si cu reactivitate 7ncruciKat5.

Din aceste cauze2 toate serurile imune sunt amestecuri de anticor8i 8oliclonali2 7n

cantit5Gi variabile de la un organism la altul. &bGinerea unor cantit5Gi mari de anticor8i

cu s8eci9icitate de legare 9ata de un e8ito8 unic2 8rin metoda clasica este im8osibil5

/Mihaescu2 )16.

'. Tehnologia modern2 de ob inere a anticorpilorț

#ehnologia modern5 de obGinere a anticor8ilor omogeni2 denumita hibridoma

/hibrid 4 mieloma6 a 9ost 8ro8usa de ;<hler i Milstein /1:(62 se bazeaz5 8eș

urm5toarele 8rinci8ii metodologice si teoreticeJ

16 Antigenul 8uri9icat se inHecteaz5 animalelor de ex8erienta.

(



)6 %a momentul adecvat2 din s8lina sau din ganglionii lim9atici2 se se8ara

lim9ocitele. Fiecare lim9ocit si 8lasmocitele derivate sintetizeaz5 molecule omogene de

anticor8i2 cu s8eci9icitate unica de combinare 8entru un singur e8ito82 denumiGi

anticor8i monoclonali /AMC6.

6 %im9ocitele B tr5iesc 8utin 7n a9ara organismului2 iar 8lasmocitele care

sintetizeaz5 cea mai mare cantitate de anticor8i2 nu su8ravieGuiesc in vitro si de aceea

cultivarea sau clonarea lor nu este 8osibila.

6 Celulele de mielom sunt nemuritoare2 datorita ca8acit5Gii lor de a se menGine un

tim8 nelimitat 7n cultura. Fuziunea lor cu lim9ocitele B in vitro2 le con9er5 celor din

urma 8ro8rietatea de nemurire@2 rezult3nd o celula hibrida /hibridom62 care

sintetizeaz5 si secreta anticor8i monoclonali /AMC6. AMC sunt consideraGi ca variantain vitro a 8roteinelor de mielom2 8entru ca 7n ambele cazuri2 o clona de lim9ocite

8roli9ereaz5 si secreta anticor8i cu o anumit5 s8eci9icitate

(6 -ibridomul 8roduc5tor de anticor8i moKteneKte caracteristici at3t de la

lim9ocit L adic5 secreta anticor8i cu s8eci9icitate 9ata de un antigen2 c3t si de la celula

de mielom2 adic5 este nemuritor.

N6 Celulele hibridoma 8ot 9i clonate individual si 9iecare clona 8roduce anticor8is8eci9ici 9ata de un singur determinant antigenic. Ele 8ot 9i menGinute inde9init 8rin

8asaHe in vivo sau 8rin cultivare in vitro /Mihaescu2 )16.

'.. Etapele ob6inerii hibridomului

Metodologia obGinerii unei linii celulare hibride2 nemuritoare2 8roduc5toare de

AMC2 8arcurge mai multe eta8e /Mihaescu2 )16J

. Ob6inerea celulelor de mielom.

N



Baza tehnologiei hibridomului a 9ost obGinerea unei linii celulare mutante de

mielom2 care nu secreta anticor8i si este de9icienta 8entru hi8oxantin>guanozin>9os9o>

ribozil>trans9eraza /-=*,#6.

Mielomul /8lasmocitomul6 este rezultatul diviziunilor necontrolate ale unui singur

8lasmoblast sau ale unui 8recursor al sau din linia lim9ocitara B. *roli9erarea

necontrolata este 7nsoGit5 de sinteza unor cantit5Gi mari de molecule omogene de

imunoglobulina2 cu 8ro8riet5Gi biochimice uni9orme. Moleculele sintetizate de tumorile

de mielom se deosebesc de imunoglobulinele normale2 8rin aceea ca nu 8rezint5

s8eci9icitate de legare cu antigenul.

#umorile de mielom a8ar s8ontan la multe mami9ere2 iar la om2 1O din tumori

sunt mieloame. #umorile de mielom se induc ex8erimental la mai multe linii deKoarece /BA%BPc si "B62 du85 inHectarea intra8eritoneala a uleiurilor minerale2 sau

du85 im8lantarea materialelor 8lastice2 care 8roduc o reacGie in9lamatorie cronica.

#umorile a8ar du85 1)>1 de zile si se 8ot menGine 8rin 8asaHe seriate la Koareci din

aceiaKi linie inbred sau 8rin cultivare in vitro si 8roduc cantit5Gi su9iciente de

imunoglobuline 8entru analiza biochimica. "u s>au obGinut mieloame care sa

sintetizeze anticor8i cu s8eci9icitate de legare 9ata de un antigen. -ibridoamele se obGin din linii s8eciale de mielom2 care au doua 8articularit5Gi

mutaGionaleJ

> "u sintetizeaz5 8ro8ria molecula de imunoglobulina2 ast9el ca celula hibrida va

8roduce exclusiv molecule de imunoglobulina caracteristice lim9ocitului B normal

> 'unt de9iciente 8entru sinteza enzimei -=*,#2 necesara sintezei acizilor

nucleici.

*entru hibridare sunt dis8onibile linii celulare de mielom de Koarece2 de Kobolan2

de om2 dar cea mai 9olosita este linia *>QN>Ag2 izolata de la linia BA%BPc2 cu

urm5toarele caracteristiciJ

L Este -=*,#

> Este tumorigena 8entru Koarece



> Are o 9recventa relativ 7nalta /1P1(>1N6 de 9uziune cu lim9ocitele de Koarece

> "u sintetizeaz5 imunoglobulina 8ro8rie si nu de8reseaz5 genele 8entru sinteza

imunoglobulinei 7n hibridom

> Are o e9icienta 7nalta de clonare in vitro.

Deoarece sunt de9iciente 8entru sinteza enzimei -=*,#2 celulele sale nu

detoxi9ica e9ectul amino8terinei2 care se adaug5 7n mediul de creKtere. Amino8terina2

un antagonist al reductazei acidului 9olic2 blocheaz5 calea sintezei AD" 8rin inhibiGia

sintezei 8urinelor /A2 =6 si a timidinei. n mediul cu amino8terina2 celulele cu -=*,#>

nu su8ravieGuiesc.

'. Imuniarea.

&bGinerea unei 8o8ulaGii mari de lim9ocite B2 8rin 9enomenul ex8ansiunii clonale2angaHate 7n sinteza anticor8ilor s8eci9ici 9ata de un anumit e8ito82 se realizeaz5 8rin

imunizare. Antigenul stimuleaz5 mai multe clone de lim9ocite. Fiecare clona de

lim9ocite activate2 sintetizeaz5 anticor8i s8eci9ici 9ata de unul din e8ito8ii antigenului.

*rocedura de imunizare /cantitatea de antigen2 ti8ul de adHuvant2 calea de administrare6

este selectata em8iric.

Cea mai buna sursa de lim9ocite r5m3ne s8lina de Koarece si de Kobolan2 dar 7ns8ecial Koarecele BA%BPc2 8entru ca mielomul are aceiaKi origine si 8rin hibridare se

evita incom8atibilitatea CM-. -ibridoamele de Kobolan2 obGinute 8rin 9uziunea

lim9ocitelor s8lenice cu celule de mielom2 sunt mai stabile si anticor8ii 8e care 7i

sintetizeaz5 9ixeaz5 com8lementul.

Cantitatea de antigen necesara 8entru imunizare de8inde de imunogenitatea

acestuia. Antigenele celulare bacteriene sau ale celulei eucariote sunt 9oarte

imunogene. Antigenele solubile /8oli8e8tide2 glucide2 hormoni6 sunt slab antigenice.

Imunogenitatea lor creste du85 cu8larea cu hemocianina de %imulus /;%-6 sau cu

albumina. Cea mai buna imunizare se obGine 8rin inHectare intravenoasa sau

intra8eritoneala re8etata2 tim8 de c3teva s58t5m3ni sau luni2 a antigenului slab

imunogen.



'8lina se recolteaz5 7nainte de atingerea titrului maxim al anticor8ilor serici.

Blastele 9uzioneaz5 mai uKor dec3t celulele 7n re8aus. & alternativa a imuniz5rii este

stimularea lim9ocitelor in vitro2 8rin incubarea 7n 8rezenta antigenului.

3. /uiunea

'e realizeaz5 7n sco8ul imortaliz5rii@ celulelor 8roduc5toare de anticor8i si este

esenGa biotehnologiei hibridomului. 'co8ul imortaliz5rii@ este 85strarea ca8acit5Gii

lim9ocitelor individuale de a secreta un singur ti8 de AMC2 8rin creKterea nelimitata 7n

tim82 9ara senescenta2 in vivo sau in vitro2 ca o consecinG5 a trans9orm5rii2 indusa cu

celule de mielom.

%im9ocitele sau imortalizat 8e trei caiJ > *rin 9uziune cu celule tumorale de mielom

> *rin in9ecGie cu un virus trans9ormant AD"

> *rin trans9ectie cu AD" trans9ormat din celulele maligne sau cu AD" al unui

oncodnavirus.

Cea mai utilizata metoda de imortalizare@ este aceea a 9uziunii cu o celula de

mielom. Fuziunea lim9ocitelor viabile din s8lina2 obGinute 8rin dezagregare mecanica2cu celulele de mielom -=*,#> se realizeaz5 8rin amestecul lor 7n 8ro8orGie de )>(

celule s8lenicePo celula de mielom.

*rocesul 9uziunii este stimulat 8e mai multe cai2 dar cel mai adesea se 9oloseKte

*E= cu gr. mol. de D. Amestecul de celule se menGine minute 7n 2)>2( ml

*E= O2 la 2 8- 2(>2. Frecventa 9uziunii creste sub acGiunea im8ulsurilor

electrice scurte2 de mare intensitate.

"um5rul si varietatea hibridoamelor obGinute este mare2 ceea ce im8une selecGia

celor 8roduc5toare de anticor8i cu s8eci9icitatea dorita.

-. Selec6ia celulelor de hibridom.

:



Amestecul de 9uziune conGine celule s8lenice si celule de mielom ne9uzionate2

celule s8lenice 9uzionate 7ntre ele2 celule de mielom 9uzionate 7ntre ele si celule

hibridom2 rezultate 8rin 9uziunea s8lenocitelor cu celule de mielom.

'elecGia are ca sco82 se8ararea celulelor de hibridom si eliminarea din amestec2 a

celorlalte ti8uri celulare2 ne9uzionate sau 9uzionate neutilizabile. In acest sco82

amestecul de celule se cultiva 8e mediul selectiv -A# /hi8oxantina>amino8terina>

timidina62 7n care s8lenocitele ne9uzionate si 9uzionaGii s8lenocit x s8lenocit mor 7n 1>)

s58t5m3ni2 co8leKite 9iind numeric de celulele de hibridom2 care se divid la 9iecare 1>

) de ore.

Mediul selectiv -A# 8ermite su8ravieGuirea numai a 9uzionaGilor mielom x

s8lenocit si este inhibitor 8entru celulele de mielom2 ca si 8entru 9uzionaGii mielom xmielom.

AcGiunea sa selectiva se bazeaz5 8e urm5toarele condiGii ex8erimentaleJ

A6 Amino8terina din mediul -A# blocheaz5 sinteza 8urinelor /A2 =6 8e calea

inozin>mono9os9atului si ast9el blocheaz5 sinteza acizilor nucleici. In acest mediu2

celulele -=*,#> devin de8endente de surse externe de 8urine /A2 =6 si de timidina.

-i8oxantina din mediul -A# 8oate 9i convertita la inozin>mono9os9at2 de c5tre enzima-=*,# si se 9ormeaz5 adenozin>mono9os9at si guanozin>mono9os9at. #imidina 8oate

9i 9os9orilata la timidin>mono9os9at si timidin>tri9os9at2 de c5tre enzima #;. Ambele

enzime /-=*,# si #;6 se g5sesc 7n s8lenocitele normale.

B6 Celulele de mielom sunt -=*,#> si 8e mediul selectiv -A# nu su8ravieGuiesc

nici celulele ca atare2 nici 9uzionaGii mielom>mielom. *e acest mediu su8ravieGuiesc si

se divid inde9init2 celulele de hibridom2 deoarece sunt -=*,#4 /codi9icata de genomul

s8lenocitelor6 si sunt nemuritoare@2 calitate con9erita de celulele de mielom.

&. Clonarea.

Clona este o 8o8ulaGie de celule identice2 genetic stabile2 derivate din diviziunea

unei singure celule. Clonarea se 9ace 8rin diseminarea sus8ensiei celulare diluate2 8e

1



medii nutritive agarizate. Fiecare celula de hibridom2 8rin diviziuni succesive2 8roduce

o colonie2 adic5 o clona celulara. &8eraGia de clonare se re8eta 8entru a garanta o

descendenta omogena. Dintre sutele de hibridoame clonate2 este necesara selectarea

celor cu ca8acitate de sinteza a anticor8ilor s8eci9ici 9ata de antigenul cu care s>a 95cut

imunizarea.

-ibridoamele 8roduc5toare de anticor8i cu s8eci9icitatea dorita2 se cultiva in

vitro2 7n culturi cu 8er9uzie continua cu mediu 8roas85t sau 7n bioreactoare cu

ca8acitate mare.

Cea mai sim8la tehnica este a cultiv5rii in vivo si consta 7n inocularea

intra8eritoneala a circa ) x 1N celule hibridoma2 la organisme ale aceleaKi linii

genetice /8entru evitarea 9enomenului de incom8atibilitate CM-6. -ibridomul sedezvolta intraabdominal si lichidul de ascita care o 7nsoGeKte2 conGine anticor8i 7n

8ro8orGie de (O din totalul 8roteinelor sale.

,andamentul 8roducerii AMC in vivo este de 1>1 de ori mai mare dec3t in

vitro. Anticor8ii din lichidul ascitic se 8uri9ica 8rin 9racGionare cu sul9at de amoniu sau

8rin metoda cromatogra9iei cu schimb de ioni.

/igura '. Ilustrarea schematic5 a eta8elor de 8roducere a AMC /Mihaescu2 )16

11



3. "4anta5ele

biotehnologiei

hibridomului

*roducerea AMC

8rin tehnologiahibridomului are un

avantaH net 9ata de

metoda convenGional5 a

obGinerii serului imun2 deoarece se 8ot obGine anticor8i s8eci9ici 8roduKi de c3te un

hibridom2 8entru 9iecare e8ito8 al unui antigen natural. Clonarea individuala a 9iec5rui

hibridom2 creeaz5 condiGii ca 9iecare clona celulara sa secrete anticor8i cu s8eci9icitateunica 9ata de un singur e8ito8 al unui antigen /Mihaescu2 )16.

Celulele de hibridom 8roli9ereaz5 ra8id2 ceea ce scurteaz5 tim8ul necesar obGinerii

AMC. -ibridoamele 8roduc cantit5Gi 9oarte mari de anticor8i2 ce de85Kesc de c3teva ori

concentraGia anticor8ilor din serul animalelor imunizate. Clonele de hibridom se

menGin inde9init 8rin cultivare in vitro sau in vivo.

-ibridomul o9er5 8osibilitatea obGinerii AMC marcaGi2 8rin ad5ugarea

8recursorilor marcaGi radioactiv /marcare interna6. Anticor8ii marcaGi in situ /7n tim8ul

sintezei6 o9er5 un avantaH net 7n ra8ort cu anticor8ii marcaGi du85 8uri9icare /marcare

externa6. Marcarea externa cu I1)( im8lica 8uri9icarea imunoglobulinelor din antiserul

convenGional2 dar 8resu8une modi9icarea chimica si denaturarea 8arGial52 cu 8ierderea

8ro8orGional5 a s8eci9icit5Gii de legare. *entru marcarea interna se 9olosesc elemente

1)



radioactive cu 8erioada de 7nHum5t5Gire mai lunga dec3t a I1)(J C12 '(2 -.

MarcaHul radioactiv intern este net su8erior celui cu 8eroxidaza si 9eritina2 utilizat 7n

tehnicile convenGionale /Mihaescu2 )16 .

#ehnologia hibridomului este un model ex8erimental care 8oate 9i extins si la alte

categorii de celule care sintetizeaz5 substanGe utile /inter9eron2 insulina6. &bGinerea

unor hibrizi dintre celula de mielom de Koarece si un lim9ocit normal2 de la aceiaKi

s8ecie2 7n sco8ul 8roducerii AMC2 a introdus un conce8t nou 7n biologia moleculara >

conce8tul imortaliz5rii 9uncGiilor s8eci9ice di9erenGiate.

-. "plica6ii practice ale "!C

AMC re8rezint5 un reactiv imunochimic bine de9init si de aceea2 rezultatele

obGinute 8rin utilizarea lor sunt re8roductibile. AMC se 9olosesc ca reactivi de mare

s8eci9icitate 7n cercetare2 7n diagnosticul clinic2 7n 9armacologie 8entru 8ro9ilaxia si

tera8ia unor in9ecGii la om si animale2 7n tehnicile de biochimie analitica 8entru

8uri9icarea unor molecule /eneaMihaescu2 1::(6.n domeniul cercet5rii imunocitochimice2 AMC sunt reactivi cu 7nalta

s8eci9icitate2 utilizaGi 8entru identi9icarea unor 8roteine care se g5sesc 7n cantit5Gi 9oarte

mici. De exem8lu2 AMC marcaGi cu 9luoresceina 8ermit evidenGierea moleculelor

membranare2 inaccesibile investigaGiei cu metodele clasice. AMC au 9ost marReri

e9icienGi 8entru identi9icarea di9eritelor sub8o8ulaGii de lim9ocite # si B2 a antigenelor

membranare ale celulelor seriei mieloide si monocitare. 'istemul CD /cluster

di99erentiation6 este de9init 7n 7ntregime 8e baza utiliz5rii AMC si cu8rinde acum 8este

) de marReri de su8ra9aG5. AMC cu s8eci9icitate CD se 9olosesc 8entru a detecta

a8ariGia sau absenta 8o8ulaGiilor celulare 7n tim8ul stimul5rii antigenice

/eneaMihaescu2 1::(6.

1



Datorita s8eci9icit5Gii lor de legare2 AMC se 9olosesc 8entru a evidenGia

di9erenGele antigenice minore 7ntre di9erite variante moleculare. Ast9el sau identi9icat

variaGiile com8oziGiei 7n aminoacizi ale s8iculelor glico8roteice2 consecutive dri9tului

antigenic la virusul in9luenza A.

AMC se 9olosesc 8entru identi9icarea moleculelor neurotransmitatoare2 a

rece8torilor sina8tici si a enzimelor de biosinteza. '>au obGinut AMC 9ata de rece8torul

de acetilcolina2 dar di9icult5Gile sunt mari 8entru ca neurotransmiG5torii sunt antigene

slabe.

n diagnosticul serologic2 serurile imune obGinute 8rin metoda clasica au avut

adeseori inconvenientul maHor al li8sei re8roductibilit5Gii rezultatelor. AMC se 9olosesc

ca reactivi de mare s8eci9icitate 8entru diagnosticul rabiei 8e secGiunile de Gesut nervosal animalelor in9ectate.

Anticor8ul este marcat cu o molecula generatoare de semnal /de exem8lu2 un

9luorocrom2 o enzima 8roduc5toare de culoare 8rin acGiunea sa asu8ra substratului

s8eci9ic2 ori o 8articula metalica6. 'ensibilitatea metodei2 adic5 8uterea semnalului

8oate 9i m5rit5 8rin creKterea ra8ortului dintre molecula indicator /anticor8ul marcat6 si

antigen. Imunocitochimia necesita 8roducerea anticor8ilor s8eci9ici si tratamentuladecvat al Gesuturilor2 adic5 9ixarea si histo8re8ararea 8entru a 9avoriza interacGiunea

o8tima 7ntre reactiv si molecula tinta a he8atitelor virale B2 C2 D2 a in9ecGiei cu -I!

/8rin determinarea 8rezentei antigenelor 7n ser6 si a unor in9ecGii bacteriene. *entru

diagnostic se 9olosesc anticor8i marcaGi cu 9luoresceina sau metodele E%I'A sau ,IA

/eneaMihaescu2 1::(6 .

AMC se 9olosesc 8entru diagnosticul neo8laziilor2 8e baza evidenGierii antigenelor

s8eci9ic>tumorale. In acest sco8 se utilizeaz5 AMC marcaGi cu izoto8i radioactivi2 cu

s8eci9icitate 9ata de CEA2 AF* etc.

AMC se 9olosesc 8entru detectarea hormonilor 8oli8e8tidiciJ #'-2 F'-2 -C=.

-ormonii sunt molecule cu un num5r mic de e8ito8i. 'ubunit5Gile a ale di9eriGilor

hormoni sunt 9oarte asem5n5toare2 dar di9er5 7n s8ecial 8rin catenele b. Exista AMC

1



s8eci9ici 8entru ambele subunit5Gi si AMC care recunosc e8ito8ii con9ormaGionali ai

moleculei native /eneaMihaescu2 1::(6.

AMC se 9olosesc 7n 9armacologie. In sco8 8ro9ilactic se 9ac imuniz5ri 8asive 9ata

de in9ecGiile bacteriene care nu bene9iciaz5 de 8re8arate vaccinale si sunt rezistente la

antibioticeJ *seudomonas2 Clostridium.

n sco8 tera8eutic2 AMC se 9olosesc 8entru tratamentul rabiei2 8entru

neutralizarea endotoxinelor /%*'6 8roduse de in9ecGiile cu bacterii =ram negative2

consecutive arsurilor. 'e8ticemiile sunt cauzate de o larga varietate de bacterii =ram

negative2 toate av3nd 7n comun li8idul A 7n structura chimica a %*'. *entru tratamentul

maHorit5Gii in9ecGiilor bacteriene se utilizeaz5 antibiotice2 la un 8reG de cost in9erior 7n

ra8ort cu AMC /eneaMihaescu2 1::(6.AMC se 9olosesc 7n controlul 9ertilit5GiiJ AMC anti>-C= si anti>zona 8elucida

sunt 9olosiGi 8entru imunizarea 8asiva a 9emeilor 9ertile. '8eranGa utiliz5rii AMC 7n

tratamentul tumorilor s>a n5ruit. Una din cauze este ca maHoritatea tumorilor umane 7Ki

au originea 7n celulele e8iteliale ale colonului2 s3nului2 8l5m3nului si 8rostatei2 iar

oncogenele activate codi9ica 8roteine intracelulare2 inaccesibile tera8iei cu AMC.

Frecventa acestor tumori nu creste la 8ersoanele imunosu8resate2 ceea ce este unargument 7n 9avoarea codi9ic5rii antigenelor intracelulare2 inaccesibile sistemului

imunitar. Chimiotera8ia o9er5 mult mai multe Kanse de succes2 la un 8reG de cost

in9erior /eneaMihaescu2 1::(6.

n sistemul hemato8oietic si imunitar2 AMC se 9olosesc 8entru a distruge toate

8o8ulaGiile celulare2 cu exce8Gia celulelor stem2 cu sco8ul elimin5rii celulelor

malignizate si a 8recursorilor ei care 8oarta oncogena activata.

AMC se 9olosesc 8entru neutralizarea nivelelor toxice ale unor medicamente

/digoxina6.

AMC se 9olosesc ca agenGi imunosu8resori. ,ece8torilor de gre9a li se

administreaz5 AMC s8eci9ici 9ata de com8lexul antigenic membranar CD2 7n cazurile

7n care imunosu8resia chimica /cu ciclos8orina6 nu reuKeKte.

1(



n maladiile autoimune2 AMC se administreaz5 8entru a realiza o imunosu8resie

8arGial52 care sa 8ermit5 a85rarea 9ata de in9ecGiile cu agenGi o8ortuniKti.

AMC se 9olosesc 8entru 8roducerea imunotoxinelor /conHugate AMC>

medicamente6. Medicamentele utilizate sunt agenGi citotoxici2 care2 8rin intermediul

situsului de legare a AMC2 sunt destinate sa se lege s8eci9ic de celulele tinta /de

exem8lu2 celulele maligne6. In acest sco8 sunt necesari AMC cu o a9initate 7nalta a

s8eci9icit5Gii de legare 9ata de antigene s8eci9ic tumorale. AMC se cu8leaz5 cu toxine

/di9terica2 ricina2 abrina62 cu medicamente citostatice sau cu radionuclizi.

AMC se 9olosesc 7n tehnicile de biochimie analitica2 7n sco8ul 8uri9ic5rii

8roteinelor2 sub 9orma coloanelor de a9initate imunoabsorbante. AMC sunt imobilizaGi

8e su8orturi 7n coloane solide /imunosorbenGi62 8rin care este trecut amestecul de 8roteine. In coloana sunt reGinute s8eci9ic2 moleculele care se leag5 cu AMC. Ast9el se

8uri9ica 8roteine care se g5sesc 7n amestec2 7n concentraGii 9oarte mici /IF"6.

1N



%ibliogra7ie

1. ;<hler =.2 Milstein C.2 ? Continuous cultures of fused cells secreting

antibody of predefined specificity”, "ature2 1:(.

). Mihaescu =.2 „ Imunologie i imunochimie”ș 2 Editura Universit5 ii dinț

Bucure ti2 )12 8. )(>).ș

. Milstein C.2 „ The hibridoma revolution: an offshoot of basic research”2

BioEssa0s2 1:::.

. enea =.2 Mihaescu =r.2 „ Imunologie”2 Editura Universit5 ii dinț

Bucure ti2 1::(2 8. )1>).ș

1



1

tehnologia hibridomului

Documents

Transcript of tehnologia hibridomului