Studiile de Taxonomie polifazica

METODELE FENOTIPICE

(1) spectrul larg de trasaturi exprimate, (2) markeri chemotaxonomici si (3) proteine si functiile lor; Informatia fenotipicaConstituie baza descrierii formale a taxonilor, de la nivel de specie si subspecie pna la nivel de gen si familie, asa cum este prevazuta in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. tabele de identificare / chei de determinare

Identificarea microorganismelor prin metode fenotipice Tabele politeticeIdentificarea fenotipica a membrilor familiei Enterobacteriaceae cu ajutorul tabelelor politetice (dupa Difco Laboratories).

Identificarea microorganismelor prin metode fenotipice chei de determinare

Metode fenotipiceCaractere stabile si caractere variabilecontroale pozitive si negative, in special in cazul in care conditiile de analiza difera de cele prezentate in lucrarile standard de referinta. caracteristicile morfologice, fiziologice si biochimice trebuie atent evaluate pentru a determina pe cele comune, unice taxonului respectiv

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateforma si dimensiunea celulelor, modul de gruparecaractere celulare specifice: crestere apolara, formarea de apendici celulari, prosteca, muguri, ramificatiiprezenta unui ciclu de viata Caulobacter spp, Pirellulaformarea de endospori, exospori dimensiunea acestora in raport cu dimensiunea celulei vegetativelocalizarea flageluluimobilitatestructuri intracelulare specifice: vacuole cu gaz, granule cu S sau PHB

Tipuri morfologice

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Metode de microscopieMetode de microscopie clasic, optic sau fotonic utilizeaz spectrul luminii vizibile (cu cele doua extremitti: IR i UV) i care folosete fotonii radiaiilor luminoase pentru formarea imaginiimicroscopul cu fond clar, cu fond negru, cu contrast de faza, cu lumina polarizat, cu fluorescenMetode de microscopie electronicutilizeaz fascicule de electroni pentru formarea imaginii, lentilele fiind nlocuite cu cmpuri electrice microscopie electronic de transmisie, microscopie electronic de baleiaj sau scanning.

Microscopie optica fond intunecato surs de iluminare lateral, indirect a preparatului, cmpul microscopic rmnnd negru deoarece nu primete lumin direct, n timp ce particulele existente n cmpul microscopic, chiar cele de dimensiuni foarte mici, absorb o cantitate suficient de radiaie luminoas pe care o disperseaz, devenind astfel surse secundare de lumin, vizibile pe cmpul microscopic ntunecat (aspect de cer nstelat).

Microscopie in contrast de fazadecelarea i localizarea microorgansimelor vii in esuturi, pentru evidenierea micrii flagelilor, sporulrii i a altor procese care necesit studiul microorganismelor n stare viabil, cu pstrarea nemodificat a aspectelor lor structurale.

Microscopie fluorescenta

Microscopie electronica

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateMorfologia bacterianaCaracterul acido-alcoolo-rezistentCaracter Gram,

Formarea de spori

Endospori bacterieni forme de rezistenta la conditile nefavorabile de mediu inconjuratorColoraia Benito-Trujillo

Formarea de sporispori de propagare

Incluzii intracitoplasmatice

Polimeri extracelulari capsula

MobilitateFlagel

Tipuri de mobilitatemobilitatea trebuie descrisa intr-un mod adecvat, atat forma cat si viteza de deplasare prezinta semnificatie taxonomica

MobilitateFilamente axiale - spirocheteFilamente axiale structuri tip flagel, intalnite la spirocheteMobilitate prin insurubareTreponema pallidumOrdinul Spirochetales

Ciclu de viataCaulobacter crescentushttp://en.wikipedia.org/wiki/Caulobacter_crescentus

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateCaractere de colonie si de culturamorfologia, culoarea si dimensiunea coloniei, prezenta si tipul corpilor de fructificare, a miceliului).

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateTrasaturile fiziologice includ date despre parametrii de crestere:Tipul respirator.temperaturapH-ultoleranta la diferite concentratii de NaCl,tipul respirator. DOMENIUL ARCHAEAfenotipurile archeene - grupuri fiziologice principale

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateTrasaturile nutritionale - tipuri de trofii si la exigentele de crestere (dupa forma in care pot prelua din mediu diferitele elemente biogene: nativa sau combinata si respectiv din combinatii simple, complexe, anorganice sau organice).Waites Michael J., Morgan Neil L., Rockey John S., Higton Gary. Industrial Microbiology:An Introduction; Blackwell Science Ltd. 2001.

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateTrasaturile biochimice se refera la sursa de C utilizata, fermentarea glucidelor, profilul enzimatic.

(1) teste conventionale(2) sisteme multi-test, (3) sisteme microtest

Teste biochimice conventionaleRespiratia aeroba lantul respirator proteine de oxidoreducere:

Mediile multitestTSI Triple Sugar Iron + indicator de pHRosu fenolPermit evidentirea simultana a mai multor caractere biochimice

Mediile multitestMIU Mobilitate Indol UreazaOpacifierea uniforma a mediuluiMetabolizarea triptofanului cu producere de indol volatil Inrosirea benzii de hartie de filtru Metabolizarea ureei inrosirea mediului

Mediile multitestMILF Mobilitate Indol Lizin-decarboxilaza Fenil-alanin-dezaminazaMetabolizarea triptofanului cu producere de indol volatil Inrosirea benzii de hartie de filtru Opacifierea uniforma a mediuluiFermentarea glucozei acumulare de aciziVirajul culorii la galben (R -)LDC determina acumularea de cadaverinaVirajul culorii la violet (R+)Adaugarea 1-2 pic FeCl3 Aparitia unui inel verde

Sistemele microtest Sistemele microtest sunt sisteme automatizate de fingerprinting fenotipic utile la analiza fenotipica clasica. Identificarea microorganismelor se obtine cu ajutorul unui manual numeric sau a soft-urilor de calculator bazate pe Taxonomia numerica. Datele fenotipice sunt analizate prin comparatie numerica computerizata.

Sistemele microtest

Sistemele Automatizate

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateTestele de inhibitie selectiva a cresterii pe medii selective (cu adaos de antibiotice /coloranti),permit cresterea si izolarea anumitor microorganisme in prezenta diferitelor substante si prezenta sau activitatea diferitelor enzime, metabolizarea diferitilor compusi, rezistenta constitutiva la antibiotice etc.

CRESTEREA BACILILOR DE PE MEDIU MACCONKEYcultura lactozo-non fermentativasubstanele nutritiveagent selectiv,inhiba cocii Gram pozitiviindicator de pHSubstrat fermentescibil

MacConkey Agar recomandat pentru detectia si izolarea enterobacteriilor din probe clinice, produse lactate, alimente, apa, produse farmaceutice si industriale MacConkey Broth- Pharmacopoeia mediu de diferentiere a speciilor de enterobacterii lactozo fermentative (virajul culorii mediului la galben) de cele non-fermentative

VRBG agar (Violet Red Bile Glucose) - mediu MacConkey modificat, dezvoltat de Moessl; in 1960, lactoza fiind inlocuita de glucoza, prin urmare nu permite diferentierea coliformilor lactozo-pozitivi de lactozo-negativi, insa are o rata de recuperare mai mare decat acesta - aplicatii in analiza probelor clinice, produse alimentare si cosmeticaEnterobacteriile dezvolta colonii roz inconjurate de un halou rosieticSursa de Nagent selectiv,inhiba cocii Gram pozitiviindicator de pHSursa de carbon si energie

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N LABORATORCetrimide agar

folosit pentru izolarea si identificarea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa Sursa de C si NStimuleaza producerea de piocianina si fluoresceinaAgent selectiv actioneaza ca o sare cuaternara de amoniu, producand eliberarea de azot si fosfor din celulele bacteriene, altele decat PseudomonasSursa de C

Slanetz and Bartley MediumMEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N LABORATORmediu inalt selectiv pentru enterococi, dupa incubare la 44-45C, toate coloniile rosii sau brune - presumptive enterococci.utilizat pentru determinarea cantitativa a enterococilor din apa, bauturi racoritoare, ape uzate si diferite produse biologice de origine animala prin metoda membranei filtranteagent selectiv,inhiba bacteriile Gram negative

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N LABORATORBaird Parker Agarmediu selectiv pentru izolarea si identificarea prezemtiva a stafilococilor coagulazo-pozitiviutilizat pentru detectia si determinarea cantitativa a tulpinilor de Staphylococcus aureus in produse alimentare, produse cosmetice

Sursa de C si Npromoveaza cresterea stafilococilorAgenti selectivi, inhiba cresterea altor bacterii, cu exceptia stafilococilorDiferentierea stafilococilor coagulazo pozitivi colonii negre inconjurate de o zona opaca de precipitare

Chapman AgarMEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N LABORATOR

izolarea stafilococilor prin inhibarea cresterii majoritatii bacteriilor datorita concentratiei ridicate de sare mediu inalt selectiv, recomadat pentru izolarea stafilococilor patogeni din probe clinice, produse cosmeticeSursa de C si NSubstrat fermentescibilAgenti selectivi, inhiba cresterea altor bacterii, cu exceptia stafilococilorindicator de pH

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N LABORATORBile Esculine Azide agar mediu selectiv utilizat pentru izolarea selectiva si diferentierea streptococilor de grup DSursa de C si Nagent selectiv + azida de sodiu inhiba bacteriile Gram negative si pozitive, altele decat enterocociiesculetol+Precipitat de culoare neagra

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateLizotipizarea (tiparea fagica) specificitatea relatiei bacteriofag-bacterie identificare a tulpinilor bacteriene in functie de sensibilitatea lor fata de un bacteriofag / un set de bacteriofagi. se evidentiaza prin aparitia plajelor de liza celulara in cultura bacteriana obtinuta din tulpina analizata; pattern de sensibilitate caracteristic fagograma

stabilirea diagnosticului bacteriologic in clinica, in studiile de sistematica bacteriana, ca si in studiile epidemiologice la stabilirea originii si circulatiei unei tulpini bacteriene intr-o colectivitate in cursul unei epidemii. Aplicatii:

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateAntibiotipizarea - sensibilitatea la antibiotice este determinata prin stabilirea antibiotipului ce reprezinta pattern-ul de rezistenta sau sensibilitate a microorganismelor fata de un set de agenti antimicrobieni (antibiotice). Antibiotipul se stabileste cu ajutorul tehnicii antibiogramei

I. Metode fenotipice Trasaturi fenotipice exprimateTeste serologice (identificare pe baza caractere de antigenitate) capsula, flageli, fimbrii, ca si molecule intracelulare sau produsi de secretie (enzime, toxine). Testele serologice au aplicatii taxonomice restrnse a unele microorganisme si laboratoare de referinta.aglutinare, seroneutralizareimunofluorescenta

Aglutinarea bacteriana

Neisseria meningitidis,Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzaeStaphylococcus aureusListeria monocytogenesSalmonella sppEscherichia coliVibrio choleraeLeptospira (MAT test)

Markeri chemotaxonomiciPerete celular:

Membrana plasmatica:

Citoplasma:

peptidoglican, acizi micolici,acizi teichoici etc.Acizi grasi, Lipide polareLipoquinone respiratoriiPigmenti etcPoliamine

Markeri chemotaxonomiciPeptidoglicanstructura relativ uniforma la bacteriile Gram-negative si, prin urmare, nu prezinta interes taxonomic.

este extrem de variabil ca structura si compozitie chimica si, implicit, extrem util la bacteriile Gram-pozitive, in mod special la actinomicete si bacteriile inrudite acestora, la care s-au identificat 8 chemotipuri de peptidoglican cu specificitate de gen sau specie.

Nu au fost observate diferente printre membrii Diviz Proteobacteria si Diviz Bacteroides

Analiza structurii PG la bacteriile Gram pozitiveLa bacteriile Gram-pozitive se observa o variatie mare, diferentele in secventa de aminoacizi, tipurile de diaminoacizi prezenti si modul de legare incrucisata fiind folosite la descrierea tipurilor de peptidoglican. Diaminoacizi : acidul meso- si L-diaminopimelic, L-ornitina, L-Lizina si acid L-diaminobutiric. D-ornitina este prezenta uneori in puntile interpeptidice.clasificarea bacteriilor Gram-pozitive, ex. Brevibacterium ammoniagenes a devenit Corynebacterium ammonigenes.

Peptidoglican de tip A (3-4)Compozitia in aac a lantului lateral peptidic (tetrapeptid) ce include diaminoacidul caracteristic este de obicei comuna tuturor speciilor unui gen Peptidoglican de tip B (2-4)genurile fam MicrobacteriaceaeUn grad mare de variabilitate se poate detecta in modul de legare incrucisata intre laturile peptidice laterale, ce poate varia printre speciile unui anumit gen ex g. Microbacterium sau chiar intre tulpinile unei specii Micrococcus luteus.

Markeri taxonomicipeptidoglicanAnaliza chimica structurii PG este obligatorie pentru toti membrii unui nou gen Gram pozitiv descris precum si in cazul unui noi specii Gram pozitiv.

Compozitia completa a PG unei noii specii descrise a unui gen recunoscut trebuie sa fie in acord cu caracteristicile genului si trebuie sa ofere informatii care sa realizeze diferentierea noii specii descrise de alte specii ale genului.

Domeniul Archaea pseudomureina acidul N-acetil muramic a fost inlocuit de N acetil talosuronic.

Markeri chemotaxonomiciLipidele lipide polare (constituienti majori ai stratului lipidic al membranei plasmatice bacteriene),sfingolipide (doar la un numar limitat de taxoni) si LPS (lipopolizaharidele din membrana externa a bacteriilor Gram-negative).

Lipidele polare molecule amfipatice ce contin o grupare polara legata la 2 acizi grasi.unele lipide polare sunt comune printre bacterii si, ca atare, nu prezinta valoare taxonomica. Altele insa sunt specifice:

Lipidele polare fosfatidil-inozitol-manozidele sunt specifice actinomicetelor; Archaea au lipide cu legaturi eterice intre glicerol si regiunea hidrofoba a lanturilor, in contrast cu eubacteriile ce prezinta lipide cu legaturi esterificate;membrii genului Sphingomonas prezinta un singur lipid polar (ex. sfingoglicolipid) ce reprezinta o caracteristica taxonomica distinctiva.

Bacteriafosfolipide, glicolipide, fosfoglicolipideaminofosfolipide, lipide aminoacid derivate, capnine, sfingolipide (glico sau fosfosfingolipide) si hepanoideArchaeaaminofosfolipide, glicolipide, fosfoglicolipideDiversitate mare de lipide polare cunoscute in prezent la procariote, in numeroase cazuri structurile acestora nu au fost elucidate.

LipopolizaharideleSemnificatii taxonomice:

Natura glucidului prezent la nivelul Lipidului A precum si natura acizilor grasiModul de legare al acestora (legaturi esterice sau amidice) la glucidLungimea lantului de acizi grasi.

Markeri chemotaxonomicisunt constituenti majori ai lipidelor, fosfolipidelor si LPS din membrana externa a bacteriilor Gram-negative si ai acizilor lipotheicoici la bacteriile Gram-pozitive > 300 de structuri chimice diferite:

Acizii grasi cu lant lung variatia de lungime a lantului de carbon (intre 8 si 26 atomi de C);

prezenta acizilor grasi saturati (acid capric, acid lauric, acid miristic etc.) si nesaturati (obisnuit mononesaturati: pentadecenoic, acid palmitoleic, acid palmitelaicic, acid oleic, acid vaccenic);

prezenta sau absenta ramificatiilor (ramificatiile sunt predominante la bacteriile Gram-pozitive) si tipul de acizi ramificati;

Markeri chemotaxonomiciprezenta si tipul grupelor substituite: ciclopropan sau OH (in pozitia 2/3 a moleculei: acid 3-hidroxicapric, acid 2- sau 3-hidroxilauric, acid 2- sau 3-hidroximiristic, acid 2- sau 3-hidroxipalmitic); gradul de saturare a legaturilor chimice dintre atomii de carbon;

prezenta unui singur acid gras sau a unui pattern specific:bacteriile - subdiviziunii a-Proteobacteria au ca trasatura comuna prezenta a 40-70% acid octadecenoic;

prezenta de acizi grasi modificati in cadrul unor grupe de bacterii (formati prin condensarea unui acid gras cu o molecula cu greutate mica, ex un aac) sfingolipide, capnine, alchilamine dioli Thermomicrobium roseum

Acizii micolici acizi grasi 2-alchil-3-hidroxilanturi lungi caracteristice (intre 24 si 90 atomi de carbon) identificati doar la un numar limitat de genuri corineforme si genuri filogenetic inrudite: Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Dietzia, Gordona, Rhodococcus, Turicella, Tsukamurella.Prezenta acizilor micolici diferentiaza aceste genuri de alti corineformi lipsiti de acizi micolici (genurile Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Microbacterium) (Zuber si colab., 2008).In cazul majoritatii bacteriilor, lungimea lantului lateral micolat se coreleaza strans cu clasificarea bazata pe secventierea genelor ARNr 16S.

Markeri chemotaxonomiciLipoquinone respiratorii/Quinonele izoprenoideprezente la microrganismele aerobe si anaerobe Bacteria si Archeaeclasificate pe baza structurii chimice in doua clase:, naftoquinone benzoquinoneo a 3 clasa: quionone (Sulfolobus, Caldariella),

naftoquinonefiloquinona (vitamina K1) prezenta doar la plante; menaquinone (inclusa si vitamina K2) detectate la membrii Dom. Archaea, -, - si -Proteobacteria, in mod exceptional la - si -Proteobacteria, celelalte bacterii Gram-pozitive;derivati ai vitaminei K2 :dihidromenaquinona, dimetilmenquinone si chlorobiumquinona (bacteria sulfuroasa verde Chlorobium thiosulphatophilum); lungimea lantului lateral variaza 5-15 unitati izoprenoide, de obicei nesaturate, insa anumite grupe de organisme prezinta pattern-uri specifice de saturare:

Lungimea lantului lateral, gradul de saturare si pozitia saturarii urmareste indeaproape clasificarea ARN16S proteobacteria si clasa Halobacteria puct de saturare - alifatic al lantului laterallanturile laterale - clasa Halobacteria- octaprenil - Proteobacteria penta-hepta prenil bacterii Gram pozitive cu procent molar G+C ridicat pct de saturare- inelul naftoquinoneiLanturi laterale izoprenoide complet saturate - Archaea

Benzoquinone subdivizate in:ubiquinone (formal denumite coenzima Q) detectate doar la membrii -(Q10, Q9 si Q11), - (Q8)si -Proteobacteria (Q7-Q14), descrise si la microfungi (mucegaiuri si drojdii);

rhodoquinona (identificata la bacteria nesulfuroasa rosie Rhodospirillum rubrum).

plastoquinone prezente doar la alge si plante si absente la bacteriile fotosintetizante.

reprezinta markeri chemotaxonomici pentru membrii grupului de archee metanogene, ca si pentru membrii familiei Vibrionaceae .

clasificarea proteobacteriilor: -Proteobacteria -spermidina sau sym-homospermidina;-Proteobacteria - putrescinei si diamin-2-hidroxiputrescinei -Proteobacteria: familia Enterobactericeae - componentele principale sunt reprezentate de diaminopropan si putrescina;sym-norspermina la genul Vibrio; spermidina la genurile Xanthomonas, Freteuria, Halomonas, Deleya si Oceanospirillum; cadaverina si spermidina la genul Stenotrophomonas;putrescina, spermidina si cadaverina la genul Pseudomonas.Markeri chemotaxonomiciPoliaminele

Analize chemotaxonomiceProcariotele sunt foarte diversificate din punct de vedere chimic iar prezenta unor compusi chimici precum:Acizi teichoici, acizi teichuroniciArabinogalactani, alte heteropolizaharideSfingolipide - Sphingomonadaceaediferentierea variatelor grupe taxonomice.

Analize chemotaxonomiceCromatografia metod de separare bazat pe distribuia unui solut ntre dou faze, una mobil (gaz sau lichid) i alta staionar (un solid sau un lichid).

TLC (Thin layer chromatography) faza mobil este un solvent sau un amestec de solveni care strbat ascendent o faz staionar (un gel de 0,25m de silice sau alt absorbant) fixat pe o plac de sticl sau o foaie semirigid, din material plastic sau aluminiu.

Analize chemotaxonomiceCromatografia n faz gazoas faza mobil este un gaz (gaz purttor de obicei heliu sau hidrogen), iar faza staionar poate fi lichid sau solid.

Distribuia compuilor din amestec se produce printr-un proces de transfer de mas interfazic, prin repartiie. Pentru a putea fi separai, compuii din prob trebuie s aib solubiliti diferite.

Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC)sistemul HPLC are trei componente critice, coloana (n care se produce separarea), pompa (care foreaz trecerea fazei trecerea fazei mobile prin coloan) i detectorul (care monitorizeaz separarea). uzual se utilizeaz detectorul spectrofotometric bazat pe absorbia molecular n UV i VIZ. - datelor de structur pentru compuii de identificat.

Proteinele bacterieneAnaliza proteomului sau a unor seturi proteice

analiza proteomului, spectrometrie de masacompararea pattern-urilor proteice si a LPS prin electroforeza in gel de poliacrilamida si electroforeza enzimelor multilocus.

Proteomica = Genomica functionala abordata la nivel proteic.variatia de lungime si continutul in baze azotate (G+C %mol) a secventelor genice dicteaza variatia de secventa a proteinelor si, ca atare, proteomul poate fi considerat marker taxonomic.pattern-uri proteice:

MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry)metod analitic rapid pentru caracterizarea microorganismelor (identificare, profil antibiorezisten, caractere biochimice diverse).

Etape:proba este depus pe un suport metalic, mpreun cu o substan cu greutate molecular mic cu rol de matrice care favorizeaz ionizarea probei (acioneaz ca donor de protoni). uscarea i cocristalizarea matricei i a probei de analizat, expuse apoi unui fascicul laser de obicei cu lungime de und de 337nm (aceasta este varianta cea mai des utilizat n dispozitivele comerciale, dar iradierea laser se poate face i la alte lungimi de und), care va fi aplicat n spot pe suprafaa probei, pentru evitarea degradrii termice a acesteia (dimensiunile spotului 0,05-0,2mm).

MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry)absorbia unei cantiti mari de energie determin sublimarea rapid a probei i ionizarea acesteia. pot fi astfel analizate inclusiv proteine ribozomale, cu dimensiuni de pn la 100 kDa.

analizorul TOF presupune parcurgerea de ctre moleculele ionizate a unei distane pn la detector, fiind expuse acestuia n ordinea cresctoare m/z (mas/ sarcin).

spectrele de mas obinute sunt utilizate pentru identificarea microorganismelor din prob, de obicei fiind identificate proteinele ribozomale, utilizndu-se biblioteci de date spectrale.

Spectrometria de masa (SM) avantaje:spectrul larg de aplicabilitate;rapiditatea, sensibilitatea si caracterizarea cu acuratete/ confidenta a microorganismelor individuale;simplitatea etapei de prepare a probelor, absenta etapelor premergatoare de separare a proteinelor de interes si automatizarea etapelor de obtinere a fingerprint-ului de masa (Lange si colab., 2008).

separarea proteinelor doar pe baza masei lor moleculare, nu si a compozitiei lor astfel ca fiecare banda electroforetica contine de fapt mai multe clase de proteine.

investigarea relatiilor la nivel de gen si de specie.

gradul de similaritate a pattern-urilor proteice este o masura a gradului de inrudire, detalii informative fiind furnizate prin analiza numerica.

bacteriile Gram-negative, inrudirea infraspecifica este investigata si prin EGPA a lanturilor O specifice LPS.

Electroforeza in gel de poliacrilamida (EGPA)

secventierea comparativa a aminoacizilor din componenta proteinelorprin reactii de tip serologic (Ag-Ac).

Reactiile de tip serologic pot detecta asemanari structurale intre enzime din diverse tulpini bacteriene. Acesta tehnica se bazeaza pe faptul ca orice variatie in secventa de aminoacizi a unei proteine se va reflecta in structura sa secundara si, deci, si in antigenitate.

genurile Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, PediococcusCompararea proteinelor individuale Serologia comparativa a proteinelor

Fenotipul unui organism este in mod obisnuit restrictionat/limitat la parametrii/trasaturi precum: forma si dimensiune celula, mod de grupare, caractere macroscopice: caractere de cultura si colonie (morfologia coloniilor), caractere biochimice, parametrii fizici de crestere: pH optim, temperatura optima. Insa o astfel de caracterizare fenotipica este simplista si reflecta intrutotul fenotipul unui organism.Astfel, compozitia chimica a celulei (compozitia in acizi grasi, lipide polare si lipoquinone respiratorii, compozitia in aac in cazul bacteriilor Gram pozitive, prezenta si marimea acizilor micolici, pattern-ul de poliamine) = chemotaxonomie = componenta a informatiei fenotipice a unui organism.Analiza trasaturilor morfologice, fiziologice si biochimice reprezinta metode clasice de caracterizare si clasificare a procariotelor. Toate trasaturile relevante trebuie listate in descrierea fiecarui taxon; iar in cazul rangurilor taxonomice de specie si subspecie trebuie sa includa cel putin o tulpina reprezentativa pentru stabilirea caracteristicilor stabile si variabile. Analizele trebuie sa inlcuda controale pozitive si negative, in special in cazul in care conditiile de analiza difera de cele prezentate in lucrarile standard de referinta. Caracteristicile morfologice, fiziologice si biochimice trebuie atent evaluate pentru a determina pe cele comune, unice taxonului respectiv.

*Aceste metode sunt folosite curent in schemele de identificare si la subtiparea speciilor microbiene. Subtiparea clasica a speciilor era realizata prin intermediul analizelor fenotipice de tipul testelor biochimice (biotiparea) sau serologice (serotiparea), a pattern-ului de sensibilitate la antibiotice, tiparea fagica etc.

*Criterii morfologie*Diversitatea morfologiei celulare si a structurilor acesteia este relevata printr-o varietate de metode de vizulizare, microscopice.Desi microscopia optica poate fi adecvata pentru descrierea trasaturilor fenotipice (morfologie, dimensiune, mod de grupare, alte caracteristici specifice), imaginile de microscopie electronica au o rezolutie mai buna. In functie de organismul analizat. Micrografii electronice de scanning/baleiaj pot fi utilizate pentru vizualizarea morfologiei celulelor, in timp ce micrografiile electronice de transmisie pot fi utilizate pentru analiza structurilor celulare: perete celular, incluzii intracitoplasmatice, structuri ale membranei plasmatice.Forma celulei trebuie descrisa in mod adecvat si sustinuta de fotografii adecvate (inclusiv micrografii electronice). Fotografiile trebuie sa fie de buna calitate, iar trasaturile discutate/abordate in text sa fie evidente in fotografii. De cele mai multe ori celulele sunt coci cu forma ferica sau bacili cu capete rotunjite si marime uniforma. In alte cazuri capetele bacililor pot avea forme caracteristice sau cocii pot prezenta dupa diviziune suprefete plate de jonctiune. Spirilii si spirochetele forme diferite, amplitudini si lungimi ale turelor de spira variate. Vibrionii pot avea diferite dimensiuni*Trebuie sa se tina seama de varsta culturii microbiene. Unele bacterii Gram pozitive prezinta o structura alterata/modicata a peretelui celular astfel incat se coloreaza Gram negativ.*Formarea de spori (endo si exospori). In cazul organismelor sporogene, localizarea sporilor si marimea acestora in comparatie cu marimea celulei vegetative trebuie notate.*Structuri intracelulare vizibile la MO: vacuole cu gaz, granule cu S sau PHB investigate folosind metode adecvate. Ex incluziile lipofile (PHB) Sudan Black*Polimerii extracelulari pot fi vizualizati prin suspendarea celulelor intr-o solutie de tus de India si realizarea de preparate microscopice umede. Halouri stralucitoare in jurul celulelor indica prezenta materialului polizaharidic extracelular.*Localizarea flagelului polar, subpolar, laterat inserat sau distribuit in diferite zone. Testarea, analiza mobilitatii teste standard/microscopie (atentie flagelul se pierde prin fixare)*Mobilitatea trebuie descrisa intr-un mod adecvat, atat forma cat si viteza de deplasare prezinta semnificatie taxonomica. Unele MO se deplaseaza mai rapid altele mai lent. Trebuie realizata distinctia intre mobilitatea determinata de flageli si cea determinata de alunecare sau alte forme de mobilitate. *- multe componente celulare ce apartin fenotipului bacterian sunt utilizate in sistemele de biotipare prin caracterizarea la nivel infraspecific a tulpinilor. In cadrul acestora, testele de *Peretele celular bacterianPeretele celular bacterian prezinta o compozitie si o structura care sunt suficient de variabile pentru a furniza informatii cu valoare taxonomica, in special pentru bacteriile Gram-pozitiveintra in compozitia peretelui celular la marea majoritate a bacteriilor si prezinta diferente de structura mai ales la nivelul diaminoacidului lanturilor tetrapeptidice si a unor peptide (puntile interpeptidice).

*au fost identificate cu ajutorul gaz cromatografiei (GC) cuplata frecvent cu spectrometria de masa (SM). Utilitatea lor in clasificarea si identificarea bacteriilor se bazeaza pe diferentele structurale date de:

*Trasaturile caracteristice unui grup filogenetic sunt dominate prin *Analizele taxonomice pe proteine pot fi realizate **