UNIVERSITATEA OVIDIUS CONSTANA FACULTATEA DE MEDICIN

STUDIUL MORFOLOGIC AL STRUCTURILOR GLANDULARE MAMARE I IMPLICAREA LOR N LEZIUNILE DISPLAZICE I TUMORALE

REZUMAT

Coordonator: Prof.Univ.Dr. DAN ULMEANU Doctorand: MARIANA DEACU

CONSTANA 2007

Acest studiu s-a desfurat sub atenta ndrumare a Prof. Univ. Dr. Dan Ulmeanu, personalitate marcant a nvamntului medical superior romnesc, care este nu numai conductorul meu tiinific de doctorat ci i profesorul de la care am audiat primul curs la nceperea studiilor universitare ca student. Competena i exigena care l caracterizeaz dar i ndemnul i ncrederea pe care mi le-a acordat, m-au ajutat s duc la bun sfarit studiul i s elaborez aceast lucrare. Pentru toate acestea i mulumesc clduros. mi exprim sincera recunotin pentru spirjinul acordat i interesul manifestat D-nei Prof. Univ. Dr. Mariana Aschie, eful Serviciului Clinic de Anatomie Patologic al Spitalului Clinic Judeean de Urgena Constana, care mia pus la dispoziie cazuistica necesar, dar i pentru rolul pe care l-a avut n formarea mea ca medic anatomo-patolog i cadru didactic. Adresez mulumiri colegilor mei care m-au susinut i ncurajat permanent, precum i asistenilor medicali din Serviciul de Anatomie Patologic care m-au ajutat n efectuarea preparatelor de microscopie. Mulumesc D-lui Conf. Univ. Lucian Petcu pentru sprijinul acordat n prelucrarea statistic a datelor. Nu n ultimul rnd, mulumesc familiei mele, soului i copilului meu, pentru susinerea, afeciunea, ntelegerea i rbdarea pe care pe care mi le arat permanent. Familiei mele i tuturor celor care sunt alturi de mine le dedic aceast lucrare.

CUPRINS 1. 2. Introducere Stadiul actual al cunotintelor despre structura i dezvoltarea glandei mamare 2.1. Scurt prezentare anatomic a glandei mamare 2.2. Microscopia glandei mamare normale n repaus funcional. 2.3. Etapele dezvoltrii glandei mamare 2.3.1. Etapa dezvoltrii embrio-fetale 2.3.2. Etapa dezvoltrii prepubertale 2.3.3. Etapa dezvoltrii postpubertale 2.3.4. Etapa dezvoltrii n cursul sarcinii 2.3.5. Etapa dezvoltrii n cursul lactaiei 2.3.6. Regresia glandei mamare 2.4. Bibliografie selectiv Stadiul actual al cunotinelor despre mecanismele i factorii implicai n modificarea structurilor anatomice ale glandei mamare. 3.1. Transformarea tumoral 3.1.1. Teorii asupra genezei tumorale 3.1.2 Mecanisme genetice i epigenetice 3.2. Factorii de risc n cancerul glandei mamare 3.2.1 Factorii hormonali 3.2.2. Factorul ereditar 3.2.3. Leziunile displazice 3.2.4. Obezitatea i dieta bogat n grsimi 3.2.5. Ali factori 3.3. Bibliografie selectiv Stadiul actual al cunotinelor despre modificrile patologice ale structurilor anatomice ale glandei mamare 4.1. Leziunile displazice ale glandei mamare 4.1.1. Mastopatia fibrochistic 4.1.2. Papilomul intraductal 4.1.3. Fibroadenomul mamar 4.2. Carcinoamele glandei mamare 4.2.1. Carcinomul ductal in situ 4.2.2. Carcinomul lobular in situ 4.2.3. Carcinomul ductal invaziv 4.2.4. Carcinomul lobular invaziv 4.3. Bibliografie selectiv CONTRIBUII PROPRII Material i metod 5.1. Metode de examinare a preparatelor 5.2. Studiu morfometric 5.3. Studiu statistic 5.4. Bibliografie selectiv

3

4

5

6

7 8 9

Rezultate i discuii 6.1. Evaluarea morfologic i morfometric a esutului glandular mamar n repaus funcional 6.1.1. Evaluarea esutului mamar normal n faza foliculinic 6.1.2. Evaluarea esutului mamar normal n faza luteal 6.1.3. Studiu comparativ al esutului mamar normal n cele dou faze ale ciclului menstrual 6.2. Evaluarea morfologic i morfometric a cazurilor cu mastopatie fibrochistic 6.2.1. Mastopatia fibrochistic simpl i proliferativ tipic 6.2.2. Mastopatie fibrochistic cu hiperplazie ductal atipic 6.3. Evaluarea morfologic i morfometric a cazurilor cu fibroadenom 6.4. Evaluarea morfologic i morfometric a cazurilor cu carcinom intraductal. 6.5. Bibliografie selectiv. Concluzii Bibliografie general Anexe

Introducere Alegerea temei tezei de doctorat se datoreaz faptului c n practica anatomo-patologic am remarcat o frecven crescut a patologiei glandei mamare dominat de leziunile displazice i tumorale. Pentru a avea o dimensiune a acestei patologii trebuie s spun c n Serviciul de Anatomie Patologic al Spitalului Judeean Clinic de Urgena Constana n care mi desfor activitatea, anual sunt diagnosticate peste 550 de cazuri de afeciuni cu aceast localizare Creterea adresabilitii populaiei n unitile medicale i introducerea mamografiei ca metod de screening a facut ca numrul cazurilor diagnosticate precoce cu leziuni la limita malignitii sau carcinoame in situ s creasc. n acelai timp am constatat o cretere a frecvenei fibroadenomului mamar, n special la pacientele de vrst tnr. Importana diagnosticrii acestor leziuni, rezid din necesitatea aplicrii unei terapii eficiente adaptate fiecrei leziuni n parte i nu n ultimul rnd, fiecrui caz. ncadrarea leziunilor mamare ca displazice sau leziuni tumorale, se realizeaz pe baza unor criterii calitative i cantitative, care au n vedere arhitectura, aspectul i dimensiunile celulelor, precum i proporia componentelor constitutive. Caracterul benign sau malign al unei leziuni este dictat de aspectul i dimensiunile nucleului. Pentru a-mi crea o fundamentare ct mai solid i a-mi valida rezultatele obinute, am realizat un studiu bibliografic preliminar care a cuprins 405 titluri: cri, monografii, publicaii, articole i comunicri tiinifice din literatura de specialitate naional i internaional. n studiul meu am pornit de la ideea c glanda mamar este un organ hormono-dependent care prezint modificri repetitive determinate de ciclul ovarian. n acelai timp am avut n vedere c majoritatea leziunilor care se dezvolt la acest nivel i au originea la nivelul componentei epiteliale. Am ncercat s surprind modificrile care se produc la nivelul glandei mamare n evoluia de la normal la carcinomul in situ, cu evaluarea etapelor intermediare unanim recunoscute ca leziuni displazice. n acest sens am pornit de la evaluarea esutului mamar normal n repaus funcional i am continuat cu analiza morfologic a mastopatiei fibrochistice tipice i atipice i a carcinomului in situ. n paralel am analizat modificrile care se produc la nivelul glandei mamare n fibroadenom. Am utilizat o serie de metode validate n practica anatomo-patologic i de cercetare tiinific. Lucrarea este structurat n dou pri, cuprinde 9 capitole repartizate n 260 pagini cu noiuni sistematizate n 65 tabele, este ilustrat cu 75 grafice i iconografie bogat reprezentat de 153 imagini. n prima parte a lucrrii am trecut n revist noiunile care se refer la stadiul actual al cunotintelor despre dezvoltarea, anatomia macroscopic i microscopic, precum i modificrile patologice ale structurilor glandulare mamare.

Material i metod. Studiul s-a desfurat n perioada 2001 2006, pe baza cazuisticii Serviciului de Anatomie Patologic al Spitalului Clinic Judeean de Urgena Constana. Materialul de studiu este reprezentat de piese operatorii provenite de la 85 paciente tratate chirurgical n seciile de Chirurgie Clinic I, II, confirmate anatomo-patologic n serviciul nostru cu mastopatie fibrochistic, fibroadenom mamar i carcinom ductal in situ. Pentru examinarea esului mamar normal, am utilizat i piese chirurgicale provenite din interveniile estetice de reducie mamar efectuate n Clinica de Chirurgie Plastic i Reparatorie.Tabel 26 Componena lotului luat n studiu

LOTesut glandular normal Fibroadenom Mastopatie fibrochistic Carcinom ductal in situ

Nr. cazuri20 20 25 20

Limite de varsta (ani)18-41 18-44 29-45 28-45

Varsta medie (ani)31,45 30,23 38,80 40,04

Evaluarea esutului mamar am realizat-o prin metode macroscopice, microscopice i morfometrice. Pentru fiecare caz studiat, datele analizate le-am cuprins n fie de studiu originale (Anexa 1, Anexa 2). Examenul macroscopic a fost realizat n funcie de tipul piesei operatorii: tumorectomie, sectorectomie, mastectomie i a urmarit dimensiunile, aspectul, forma, culoarea i consistena. Fragmentele tisulare, recoltate dup fixarea prealabil n soluie de formaldehid 10%, au fost prelucrate automat cu ajutorul procesorului de esuturi ATP1, incluse n parafin, seionate la 4m i colorate cu Hematoxilina-Eozin, van Gieson i Orcein [1]. Preparatele microscopice obinute au fost examinate cu ajutorul microscopului NIKON E600 prevzut cu sistem de achiziie a imaginii NIKON DN 100. n evaluarea esutului mamar sntos am inut cont de faza ciclului menstrual. n acest scop, n alegerea pacientelor am avut n vedere urmtoarele criterii: ciclu menstrual regulat (interval de 28 zile +/- 2 zile) n ultimile 6 luni, precum i cunoaterea datei exacte a ultimei menstruaii [2]. Criteriile de excludere au fost : alte afeciuni ale galndei mamare n afara fibroadenomului, sarcina, consumul de contraceptive orale sau alte medicamente cu influen asupra esutului mamar, afeciunile endocrine. Fibroadenomul mamar este o leziune tumoral cu risc sczut de malignizare i care permite evaluarea esutului mamar sntos adiacent [2]. Pentru cazurile patologice, diagnosticul microscopic a fost reconfirmat de doi anatomo-patologi cu respectarea criteriilor standard pentru fiecare leziune luat n studiu. Pentru o evaluare ct mai amnunit a modificrilor componentei epiteliale am utilizat metoda morfometriei semiautomate.

Am avut n vedere faptul c tehnicile histologice determin modificri n diferite proporii la nivelul structurilor celulare [4] motiv pentru care, compararea rezultatelor s-a realizat pe material prelucrat similar ca fixare, includere, secionare i colorare. Pentru evaluarea morfometric am folosit preparate de microscopie colorate hemalaun-eozin. Msuratorile au implicat utilizarea microscopului Nikon prevazut cu camera digital de preluare a imaginii Nikon DN 100 cu rezoluie 1280x1024 pixeli, conectat la un calculator cu program de morfometrie Lucia Net Laboratory Imaging Eclipse Net Software. Pentru fiecare caz am efectuat msuratori pe 300 de nuclei din cmpuri relevante care nu s-au suprapus, prin trasarea conturului nuclear la o magnificaie de 400x [5,6,7]. Efectuarea msuratorilor a fost precedat de calibrarea soft-ului pentru obiectivul utilizat. Unitatea de msura folosit a fost m. Valorile obinute au fost nregistrate de programul calculatorului n tabele, cu calcularea mediei i a deviaiei standard pentru fiecare parametru [8,9]. Parametrii evaluai au fost: diametrul maxim Dmax (m) i deviatia standard a diametrului maxim dst Dmax; diametrul minim Dmin (m) i deviaia standard a diametrului minim dst Dmin ; factorul de elongaie E i deviaia standard dst E a factorului de elongaie (constant care reflect forma nucleilor ; pentru nucleii de form rotunda/sferic E= 1 ; pentru nucleii de form elipsoidal, valoarea sa crete). perimetrul nuclear P (m) i deviaia standard dst P aria nuclear AN (m2) i deviaia standard dst AN Rezultatele obinute au fost sistematizate sub forma de tabele funcie de tipul de tesut analizat. Prelucrarea datelor a fost realizat cu ajutorul programelor Excel, Origin7, SPPS 12.0. Testele utilizate pentru prelucrarea datelor au fost: Student (t-Test), ANOVA i calculul corelaiei. Graficele realizate prezint dependena dintre parametrii studiai. Reprezentrile sunt de tip coloana, x-y i histograme conform cerinelor tiinifice n domeniu [10]. n completarea studiului, pentru evaluarea modificrilor componentei conjunctive am utilizat coloraii speciale i imunohistochimice. Am utilizat metoda indirect LSAB (streptavidina-biotina) care este mai sensibil, permite vizualizarea antigenelor existente n concentraii mici i prelucrarea simultan a mai multor lame ntr-un interval de 3 ore. Am folosit pentru marcarea membranei bazale anticorp monoclonali AntiHuman Collagen IV (clona CIV 22, isotip IgG, kappa) DAKO. Pentru evidenierea celulelor mioepiteliale am utilizat Ac Mo anti -SMA (clona 1A4, isotip IgG2a) DAKO, iar pentru evaluarea componentei vasculare am aplicat Ac Mo anti-CD34 (clona QBEnd-10) DAKO [11,12].

Rezultate i discuii. Evaluarea esutului mamar normal n repaus funcional. Evaluarea macroscopic a evideniat parenchim mamar de culoare albicioas, aspect compact, consistena elastic, inclus n esut conjunctivoadipos. n analiza histologic pentru realizarea corelaiei ntre aspectul morfologic al esutului mamar normal i perioada foliculinic sau luteal a ciclului menstrual [13], m-am bazat pe criteriile elaborate de Longacre si Bartow 1986 [14], completate de Russo J. i Russo I.H n 1987 [15], privind evaluarea esutului glandular normal n repaus funcional: aspectul celulelor epiteliale i mioepiteliale activitatea proliferativ aspectul stromei intralobulare Pentru cazurile ncadrate conform anamnezei n faza foliculinica a ciclului menstrual, aspectul microscopic al seciunilor colorate n H&E a relevat lobuli de dimensiuni mici, cu lumene acinare parial deschise i distincie redus ntre cele dou straturi celulare constitutive. Celulele epiteliale au prezentat citoplasm slab eozinofil, nuclei bazofili, bine conturai, cu cromatina fin dispersat i absenta nucleolilor. Celulele mioepiteliale au prezentat nuclei bazofili, alungii i citoplasm redus.

Fig. 70 - Lobul mamar n faza foliculinic la femeie de 24 ani stroma dens intrai interlobular (40XH&E)

Fig. 71 - Lobul mamar n faza foliculinic la femeie de 24 ani lumene acinare parial deschise (200XH&E).

Stroma intralobular s-a caracterizat prin structur dens, celule inflamatorii rare sau absente, absena adipocitelor i a fibrelor elastice. La nivelul stromei interlobulare am remarcat prezena de fibrocite cu dispoziie dens, fr modificri distrofice, inflamatorii sau mitoze atipice i insule de esut adipos prinse ntre celulele conjunctive. Evaluarea parametrilor morfometrici pe componenta epitelial ductal i acinar a relevat valorile sistematizate n tabelele 28 i 29.

Tabel 28 Valorile morfometrice ale nucleilor celulelor epiteliale ductale n faza foliculinic Arie Diam. Diam. Factor Perimetru Diam.eq. Nuclei ducte nuclear maxim minim elongatie P Deq faza foliculinic AN Dmax Dmin E (m) (m) (m2) (m) (m) Valoare maxim Valoare minim Valoare medie Dev. standard 29,16 18,64 23,97 3,88 7,08 5,85 6,49 0,65 5,33 4,26 4,72 0,57 1,56 1,32 1,41 0,25 19,11 15,33 17,32 1,44 6,07 4,07 5,37 0,44

Tabel 29 Valori morfometrice ale nucleilor celulelor acinare n faza foliculinic Nuclei acini faza foliculinic Valoare maxim Valoare minim Valoare medie Dev. standard Arie nuclear AN (m2) 31,23 11,17 23,27 3,39 Diam. maxim Dmax (m) 7,41 4,47 6,37 0,58 Diam. minim Dmin (m) 5,44 3,24 4,59 0,55 Factor elongatie E 1,45 1,36 1,4 0,23 Perimetru P (m) 19,86 11,76 16,91 1,24 Diam. eq. Deq (m) 6,29 3,76 5,35 0,38

Din studiul comparativ al parametrilor morfometrici evaluai pe celulele epiteliale ductale i acinare n faza foliculinic, pentru un nivel de semnificatie = 0,05, a rezultat p> , deci nu exist diferene semnificative ntre acestea (tabele 30, 31).Tabel 30 - Comparaie nuclei celule epiteliale ductale i acinare n faza foliculinic Parametru Faza foliculinic Valoare medie Varianta Observatii Diferenta medie presupusa df t Stat P(T