RAPORTARE STIINTIFICA - lab20.infim.rolab20.infim.ro/magbiof/docs/RSTFaza4.pdf · RAPORTARE...

1

RAPORTARE STIINTIFICA

Proiect 72-151/2008

NANOPARTICULE MAGNETICE FUNCTIONALIZATE PENTRU BIOSENSORI

RST - Raport stiintific si tehnic in extenso

CUPRINS

I. Obiective generale 2

II. Obiectivele etapei de executie 2

III. Rezumatul etapei 3

IV. Descrierea stiintifica si tehnica 5

IV.1. Introducere 5

IV.2 Obtinerea de vitroceramici cu proprietati magnetice din precursori vitrosi de tip

borosilicatic in vederea obtinerii de nanoparticule magnetice din Fe3O4, Fe2O3 6

IV.3. Caracterizare structurala 8

IV. 4. Morfologie 8

IV. 5. Spectroscopie Mössbauer 15

IV. 6. Magnetizare in curent alternative 20

IV. 7 Extragerea si conditionarea nanoparticulelor 24

IV.8. Investigatii prin microscopie de forta atomica. 26

IV.9. Iradierea cu radiatie gama a sticlelor precursoare 26

V. Introducerea de nanostructuri magnetice in MgB2 29

VI. Teste de functionalizare a nanoparticulelor magnetice in vederea

imobilizarii de substante biologic active (enzime si proteine) 33

VI.1. Introducere. Nanoparticulele magnetice. Aplicatii medicale 33

VI.2. Studiul privind functionalitatea unor suporturi nanocompozite pentru fixarea

diferitelor substante biologic active 35

VI.3. Imobilizarea diferitelor substante biologic active pe suporturi vitroceramice

39

VII. Rezultate experimentale 40

VII.1. Imobilizarea lipazei pe suporturi vitroceramice 40

VII.2. Imobilizarea tripsinei pe suporturi vitroceramice 45

VII.2.1. Materiale si metode 45

VII.2.2. Functionalizarea suportului vitroceramic BSF1 prin tratament cu

chitosan 48

VII.3. Imobilizarea acidului l-aspartic pe suporturile vitroceramice studiate 49

VII.4. Imobilizarea l-cisteinei pe suporturile vitroceramice studiate 53

VII.5. Concluzii 55

2

Bibliografie 56

Diseminare. Publicatii/Conferinte 60

I. Obiective generale

Obiectivul general al proiectului consta in valorificarea proprietatilor de

exceptie care apar la interfetele in interactie dintre materialel magnetice

nanostructurate si materia vie pentru fabricarea de mijloce in vederea biodetectiei

si biomanipularii. Proiectul are doua obiective specifice:

I. Producerea de precursori vitrosi cu proprietati magnetice, stimularea

proceselor de nucleatie si sinterocristalizarea acestora. Separarea nanoparticulelor

magnetice monodomeniale, selectarea lor dimensionala si tratarea lor in vederea

functionalizarii. Investigarea posibilitatii de realizare de sisteme cu arhitectura

dubla miez(magnetic)/camasa (nemagnetica) in vederea abordarii schemelor de

detectie duala optica si magnetica. Acest obiectiv presupune si efectuarea de

investigatii asupra stimularii nucleatiei prin iradiere gama.

II. Functionalizarea nanoparticulelor prin atasarea unui efector destinat unor

biomolecule tinta care sunt de interes in investigatii biomedicale. Avem in vedere

folosirea ca efector a annexinei V pentru fosfatidilserina ca receptor. Pe masura

dezvoltarii obiectivului se vor incerca si alte functionalizari cu tinta specifica.

II. Obiectivele etapei de executie

Obiectivul acestei etape il constituie conditionarea si functionalizarea

nanoparticulelor pentru biodetectie.

3

III Rezumatul Fazei

In Etapa IV a prezentului proiect a fost continuata caracterizara precursorilor

vitroceramici pentru intelegerea mai profunda a fenomenelor care au fost observat

in investigatiile precedent si care sa permita dezvoltari ulterioare ale metodei. In

acest sens s-au aprofundat investigatiile structurale care au confirmat datele

anterioare si s-a procedat la investigari de microscopie electronica de transmisie,

incluzand si difractia de electroni pentru confirmarea omogenitatii fazice a probelor.

Astfel s-a constatat ca probele mai bogate in Fe au tendinta spre formarea de

clusteri de nanoparticule indiferent de nucleator, pe cand la cele cu Fe redus (17.5

% Fe2O3) nucleatorul pe baza de Cr duce la formarea de nanocristale separate, bine

definite si uniform distribuite in masa vitroasa.

Un rezultat deosebit de valoros a fost dat de spectroscopia Mössbauer care a

evidentiat mecanismul care duce la formarea detaliilor de magnetizare la

temperaturi mai mici decat temperatura Verwey care a fost atribuit multor

mecanisme in trecut dar pentru care am reusit sa demonstram ca se datoreaza

relaxarii superpapramagnetice a cozii de distributie pe dimensiuni a nanoparticulelor

de magnetita.

Au fost efectuate de asemenea masuratori de susceptibiltate in curent

alternativ pentru caracterizarea proceselor dinamice legate de nanoparticule.

Acestea au relevat unele similitudini intre probele BSF 1 si BSF 5 precum si intre

probele BSF 3 si BSF 4. Este interesant ca datele de spectroscopie Mössbauer

confirma aceste similitudini in ceea ce priveste gradul aproape identic de populare a

al celor doua perechi, mai precis prima perche corespunde unei magnetite cu

pozitiile octaedrice complet ocupate in timp ce a doua pereche prezinta o sub

ocupare a a cestor pozitii (R=1.7).

Pentru aplicatii s-a studiat posibilitatea de extractie a magnetitei din matrice

vitroasa prin dizolvare in acizi.

Au continuat de asemenea investigatiile de microscopie de forta atomica.

Totusi estimam ca datele obtinute nu aduc informatii noi in cazul compozitelor

vitroceramice.

Efectul radiatiei gama (568 ore de iradiere) pare sa fie destul de sever si

duce la amorfizare suplimentara a probelor asa cum reiese din reducerea si chiar

disparitia histerezisului in masuratorile de magnetizare. Cele mai afectate sunt

probele cu granulatie mica.

O aplicatie suplimentara a constituit-o introducerea de nanostructuri

magnetice, fier incapsulat in carbon, in supraconductor de tip MgB2. Avantajul

acestei metode este dublu: pe de o parte din camasa exterioara a nanoparticulelor

se ia carbon care sa substituie borul si sa mareasca campul critic superior, iar pe de

alta parte camasa de carbon separa Fe metallic de matricea de MgB2 prevenind

interactia nedorita cu Fe care duce la formarea de boruri, deci la saracirea matricii

in bor. In plus nanoparticulele pot deveni centri pinning magnetic. Tranzitia normal-

4

supraconductor R(T) este ridicata, la 38.6 K la 38.3 K in functie de cantitatea de Fe.

Densitatea de curent critic a crescut pana la 1.1 MA/cm2 la 5 K si 1 T

Probele vitroceramice au fost apoi testate pentru imobilizarea unor enzime

ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-aspartic si L-cisteina).

Probele de suporturi vitroceramice provenite de la coordonator au fost

testate pentru imobilizarea unor enzime ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din

Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-

aspartic si L-cisteina).

Metoda de imobilizare aplicata a fost aceea a adsorbtiei fizice, metoda

simpla, des utilizata in tehnicile de separare a produsilor prin cromatografia de

afinitate si in obtinerea biocatalizatorilor si a unor biosenzori. Pentru marirea

capacitatii de imobilizare a principiilor active pe acest tip de suporturi, s-a testat

functionalizarea lor prin tratare cu glutaraldehida, inainte sau dupa fixarea enzimei

pe suport, cat si prin cuplarea pe suprafata suportului a chitosanului urmata de

reticularea cu borohidrura de sodiu.

Metodele analitice aplicate au fost pentru determinarea activitatii enzimatice

a lipazei libere si imobilizate metoda titrimetrica, iar pentru activitatea enzimatica a

tripsinei metoda spectrofotometrica.

Rezultatele obtinute indica faptul ca in functie de tipul suportului (sticla

borosilicatica de baza, sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice si sticla

vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic), si de tratamentul

aplicat, atat lipaza cat si tripsina se imobilizeaza cu diferite randamente.

Se constata ca lipaza pancreatica se imobilizeaza cu randamente ridicate pe

acest tip de suporturi, functie de durata adsorbtiei si tratamentul preliminar cu GA,

in timp ce lipaza fungica din Aspergillus niger prezinta randamente scazute.

In ceea ce priveste imobilizarea tripsinei pe acest tip de suporturi

randamentul aparent de imobilizare este de peste 99%, randamentul real fiind in

general mai scazut. Se constata ca acesta poate fi imbunatatit de pana la 11,6 ori

mai mare, in situatia in care suportul este activat prin tratarea cu GA 2,5%, urmat

apoi de adsorbtia enzimei.

Functionalizarea suporturilor vitroceramice prin tratament cu chitosan pentru

marirea capacitatii de fixare a tripsinei, indica faptul ca atat randamentul aparent

cat si cel real de imobilizare a tripsinei este mare, in situatia in care suportul este

activat in prealabil prin tratament initial cu GA.

Probele de suporturi testate prezinta de asemenea afinitate diferita pentru

aminoacizii testati, acidul L-aspartic si L-cisteina, datorita gruparilor functionale

diferite implicate in legaturile ce se formeaza intre suport si aminoacid.

5

Descrierea stiintifica si tehnica

IV. Conditionarea si functionalizarea nanoparticulelor

nanoparticulelor pentru biodetectie

IV. 1. Introducere

Cristalizarea sticlelor conduce la formarea unei clase speciale de

nanocompozite care constau din mici nanocristale inglobate intr-o matrice vitroasa.

Procesul de cristalizare ofera posibilitatea de obtinere de noi clase de materiale

nanostructurate in care proprietatile fazei nanocristaline pot fi modificate prin

alegerea nucleatorilor, a compozitiei oxidice a matricii vitroase si tratamente

termice [1-4]. Printre aceste compozite materialele vitroceramice cu faze cristaline

cu ordonare magnetic [3-6] prezinta interes special datorita unui camp extrem de

larg de aplicatii care se intinde de la dispozitive cu memorie magnetica

(vitroceramica este considerate ca materialul ideal 3D pentru memorii magnetice

datorita campului mare de coercitivitate) la medicina (hipertermie magnetica,

agenti de contrast pentru imagistica de rezonanta magnetica, magnetofectie,

biodetectie, etc). Aceasta gama larga de aplicatii este rezultatul flexibilitatii metodei

de producere de nanocompozite sticla-cristal care permite fabricarea de material cu

o mare varietate de forme, proprietati magnetice, si mecanice, durabilitate chimica

si biocompatibilitate.

In general aceste compozite se obtin pornind de la topitura unei sticle

polinare in care ingredientii sunt alesi cu grija. Aceasta presupune o alegere corecta

a compozitiei sticlei intrucat cei mai multi ioni magnetici se afla in topitura in mai

multe stari de valenta, iar fazele magnetice nanocristaline rezultate trebuie sa fie

aduse intr-o stare data de valenta. Este de asemenea importanta alegerea

nucleatorilor care controleaza procesul de formare si crestere a cristalitelor si a

procedurii concrete de treatment termic de cristalizare care are rol important in

dezvoltarea de faze magnetice uniform dispersate in matricea vitroasa.

Exista nenumarate materiale magnetice cu proprietati speciale obtinute sub

forma de nanocompozite vitroceramice cu proprietati magnetice dintre care

mentionam: feritele de litiu (LiFe5O8 [7]), BaFe12-2xTixCoxO19 [5, 8-10]) feritele de

calciu (Ca2Fe2O5 [11]), feritele de cobalt (CoxFe3-xO4 [12]), hexaferitele de bariu

(BaFe12O19) [13, 14], YIG (Y3Fe5O12) [15], SrFe12O19 [16] etc. Totusi, cele mai multe

investigatii s-au adresat magnetitei Fe3O4 care este unicul material acceptat pentru

aplicatii biologice in vitro.

Cand faza magnetica este magnetita, Fe3O4, problema raportului dintre

cationi este mai complexa intrucat presupune un echilibru precis intre ionii de fier

bivalent si trivalent, Fe2+ si Fe3+, pentru a obtine ocuparea perfecta a pozitiilor

6

octaedrice si tetraedrice. In general ambii ioni in topitura vitroasa exista in echilibru

cu oxigenul dizolvat fizic dar in echilibrul redox ar trebui introdusi si restul ionilor

prezenti in topitura. Din acest motiv au fost publicate numeroase rezultate asupra

comportarii fierului in sticla legate de termodinamica perechii redox [17-33]. La

temperature ridicate, starea redusa Fe2+ este favorizata in sticlele silicatice. In

sticlele boratice in schimb, procesul de reducere este si mai rapid datorita

vascozitatii mai reduse a acestor sticle la temperatura de topire care da

nastere unei convectii imbunatatite. In general oxizii de fier intra in reteaua

de sticla la concentratii rezonabile (sunt formatori de sticla) dar diferitele

valente prefea coordinatii diferite: ionul Fe3+ in sticla prefera coordinatiile

tetraedrice (FeO4) in timp ce ionul Fe2+ intra in coordinatie octaedrica (FeO6).

Diversi aditivi care au proprietati de formatori pot intra in competitie cu una din

cele doua stari de valenta prin coordinatia pe care o suporta. Un alt aspect apare

din faptul ca, pentru obtinerea de cantitati mari de particule de magnetita

nanocristalina, este necasara o concentratie de volum de Fe mai mare.

In acest proiect am utilizat sticle borosilicatice cu continut ridicat de Fe care

au fost supuse cristalizarii prin utilizarea Cr2O3 si a P2O5 ca nucleatori impreuna cu

Al2O3 and MgO2 in calitate de intermediator si repectiv modificator pentru

producerea de vitroceramici pe baza de magnetita din care ulterior am separat

magnetita pentru aplicatii. Este vorba de o magnetita speciala care sa aiba si o

camasa silicatica.

IV.2 Obtinerea de vitroceramici cu proprietati magnetice din

precursori vitrosi de tip borosilicatic in vederea obtinerii de nanoparticule

magnetice din Fe3O4, Fe2O3

Sticlele borosilicatice au fost fabricate dupa retetele prezentate in raportarile

anterioare (RIA faza 2/2009) din cantitati corespunzatoare de SiO2, H3BO3, Na2CO3

si Fe2O3 with nucleators (Cr2O3 sau P2O5) si mici cantitati de MgO or Al2O3. Nu

insistam asupra tehnologiei, care a fost prezentata pe larg, dar pentru o buna

intelegere redam tabelul cu datele compozitionale ale sticlelor utilizate la cristalizare

si transformare in vitroceramici pe baza de magnetita, date care sunt prezentate in

Tabelul 1. De notat ca proba BSF2 a fost eliminata din investigatii datorita

proprietatilor necorespunzatoare si a neuniformitatii in distributia si a fost inlocuita

cu proba BSF2a cu acelasi continut de Fe.

Alegerea nucleatorilor s-a bazat pe testarea a doua mecanisme diferite de

actiune. Cromul are o solubilitate rezonabila in topitura de sticla in care prezenta

sodiului favorizeaza starea de oxidare cea mai inalta Cr6+ in prezenta oxigenului

[34]. La scaderea temperaturii solubilitatea scade in timp ce intensitatea campului

imbunatateste rearanjarea structurii vitroase cu formarea de spineli pe baza de Cr

care devin nucleele ulterioare pentru cresterea de cristalite [35,36]. Fosforul este

7

un formator de sticla in care fiecare atom de fosfor este legat de un tetraedru de

oxigen din care unul formeaza o legatura terminala dubla P = O. Totusi, cand este

inserat intr-o sticla borosilicatica, in coordinare tetraedrica, diferenta de sarcina

dintre Si4+ si P5+ duce la separarea fosforului in combinatie cu un metal alcalin.

Legatura dubla P = O favorizeaza astfel formarea de faze fosfatice in reteaua

silicatica si astfel care duce la tendinta spre cristalizare [37].

Tabelul 1 PArametrii compozitionali si de process ai probelor vitroceramice

magnetice

Proba Composition Process parameters

Compozitia

de start

(wt%)

Nucleato

r

(wt%)

Intermedi

ant /

modifier

(wt %)

Temperatura

de topire (C)

/ timp (h)

Temperat

ura de

turnare

(C)

Temperat

ura de

tratament

termic

(C)/timp

(h)

BSF1 26.8B2O3

6.4Na2O3

17.5Fe2O3

47SiO2

0.5Cr2O3 1430/3 1400 560/2

BSF2a 26.8B2O3

6.4Na2O3

17.5 Fe2O3

43.5 SiO2

0.5Cr2O3 3.5Al2O3 1480/2.5 1470 560/8

BSF3 26.8B2O3

6.4Na2O3

17.5Fe2O3

46.5SiO2

1P2O5 1480/2.5 1470 560/2

BSF4 26.8B2O3

6.4Na2O3

24.5Fe2O3

36.5SiO2

0.5Cr2O3 3.5Al2O3 1480/2.5 1470 560/6

BSF5 26.8B2O3,

6.4Na2O3

24.5Fe2O3

39.5SiO2

1P2O5 1480/2.5 1470 560/2

8

IV.3. Caracterizare structurala

Pentru analiza structurala s-a folosit o instalatie de difractie de raze X tip

Bruker-AXS-D8 Advance cu radiatie Cu K si detector liniar de mare eficienta de tip

Lynx Eye. Probele au fost scanate in domeniul 15 – 100o, cu pas de 0.03 si timp de

inregistrare de 6 s pe pas. Fitarea dateleor s-a facut prin metoda Rietveld folosind

programul TOPAS V3: General profile and structure analysis software for powder

diffraction data. Profilul liniei instrumentale s-a determinat folosind pulbere tratata

termic de CeO2, testate ca sa nu aibe largimi suplimentare detectabile datorita

tensiunilor. Fondul amorf a fost aproximat din cele trei maxime largi situate la 23o,

45o si 60o, fitate pentru pozitie, arie si largime pentru fiecare proba. Gradul de

cristalinitate s-a determinat ca raportul dintre intensitatea fazei cristaline si

intensitatea totala. Datele de difractie sunt prezentate in Fig. 1.

Datele de difractie arata ca magnetita este faza dominanta sau unica in toate

probele (Fig. 1) cu mici cantitati de -Fe2O3 prezenta in proba BSF-1. Probele

obtinute cu Cr2O3 prezinta un grad de cristalinitate mai mare de 50 % care creste

cu cresterea cantitatii de Fe. Mai precis creste de la 52.4% in BSF-1, la 73.1% in

BSF 4. Desi P2O5 s-a dovedit a fi faza cu gradul cel mai ridicat de puritate

structurala (vezi studiile de spectroscopie n ucleara gama) este mai putin efficient

in formarea de probe cristaline. Ca si in Cr2O3, gradul de cristalinitate creste cu

continutul de Fe de la 38.2 % in cazul probei BSF-3 la 45.1% pentru BSF-5. Analiza

semilargimii maximelor de difractie arata ca nucleatorul pe baza de Cr2O3

favorizeaza cresterea de garaunti mari: 121; 77, 79 nm probele BSF-1, BSF2a si,

respectiv, BSF-4.

IV. 4. Morfologie

Datele de microscopie electronica au fost obtinute cu un microscop electroni

ce transmisie JEM 200CX TEM/SCAN. Micrografiile TEM arata ca in aceste probe sunt

doar graunti de magnetita. Datele TEM confirma datele de difractie dar furnizeaza

mai multe detalii asupra morfologiei interne a grauntilor cristalini cu diferente

majore intre cei obtinuti prin Cr2O3 si cei obtinuti via P2O5. Dimensiunea grauntilor

obtinuti prin aceasta metoda directa sunt ceva mai mici decat cea determinata din

difractie. Probele obtinute prin Cr2O3 au cristalite mai mari si uniform distribuite in

matricea vitroasa. De altfel din a cest punct de vedere cel mai bine se prezinta

proba BSF-1 cu monocrisatlite de magnetita bine formate si bine definite (Fig. 2).

Difractia de electroni arata ca proba este monofazica (Fig. 3).

Pe aceasi proba s-au obtinut si imagini de difractie de electroni

retroimprastiati (Fig. 4)

9

Fig. 1. Difractogramele probelor vitroceramice cu continut de magnetite

obtinute prin cristalizarea unei topituri de sticla borosilicatica cu continut de fier.

10

Fig. 2. Micrografie TEM pe proba BSF1 (nucleator Cr2O3)

Fig. 3. Difractograma de electroni pe proba BSF1. Spoturile indexate apartin

magnetitei.

11

Fig. 4. Imagine de microscopie de difractie de electroni retroimprastiati pe Proba

BSF-1

La cresterea cantitatii de fier inclus in proba de la 17.5 la 24.5 % (in procente de

Fe2O3) are loc o modificare structurala a grauntilor prin micsorarea lor si

aglomerarea in entitati mai mari cu suprafata mai dezordonata (Fig. 5). SI in acest

caz difractia de electron arata ca avem o singura faza: Fe3O4 (Figura 6).

In cazul probelor obtinute cu P2O5, probele prezinta clusteri de nanocristale

incepand cu concentratiile mici de fier (Fig. 7). Proba contine doar cristalite de

magnetita dupa cum arata difractia de electroni (Fig. 8) dar cu dimensiune medie

mult mai mica decat a celor din aglomerarilor produse de Cr2O3 (vizibile in proba

bogata in Fe, BSF-4) mai precis dimensiunea medie este de nm pentru proba BSF-

3. Proba BSF-5cu 24.5% Fe2O3 are o granulatie si mai fina si graunti mai mici (Fig.

9) de dimensiune 26 nm, iar nanoparticulele sunt numai magnetita (Fig. 10).

12

Fig. 5 Micrografie TEM pe proba BSF4 (nucleator Cr2O3)


magnetitei.

13

Fig. 7 Micrografie TEM pe proba BSF3 (nucleator P2O5)


magnetitei.

14

Fig. 9. Micrografie TEM pe proba BSF5 (nucleator P2O5)


magnetitei.

15

IV. 5. Spectroscopie Mössbauer

Experimentele de spectroscopie nucleara gama (Mössbauer) au fost facute

atat la temperatura camerei, iar datele au fost deja prezentate in raportul anterior,

cat si la temperaturi intre 4.5 si 120 K iar datele sunt prezentate in continuare.

Pentru experimentare s-a folosit un spectrometru cu acceleratie constanta cu unda

de forma triunghiulara. Sursa folosita a fost 57Co(Rh) la care s-a asociat un contor

proportional cu xenon. Spectrele au fost fitate cu pachetul de programe NORMOS

[38] cu deplasarea izomerica raportata la -Fe la temperatura camerei.

Cel mai bun fit a fost obtinut prin prelucarea cu 6 subretele la temperaturi

scazute (sub 90 K) si cu 4 subretele la temperature mai ridicate (peste 100 K).

Diferenta provine de la faptul ca magnetitei mai bine formate I s-au atribuit, la

temperature joase, 4 subretele magnetice, in timp ce la temperature ridicate, I s-au

atribuit numai 2 subretele. Temperatura de trecere intre aceste configuratii (intre

90 K si 100 K) trebuie sa corespunda tranzitiei Verwey, a.i. semnificatia

subspectrelor magnetice este urmatoarea: sub tranzitie, pozitiile tetraedrice si

octaedrice pot fi ocupate de ioni de Fe2+ si Fe3+ distincti, rezultand astfel o

distributie mai larga de campuri hiperfine (in acest caz, 4 valori), in timp ce peste

temp de 100 K, activarea termica a delocalizarii termice conduce la ocuparea celor

doua pozitii, de catre ioni cu valenta intermediara (fiecare subretea magnetica, fiind

legata numai pe pozitia cristalografica ocupata de ionii de Fe). Cea de a doua

observatie se refera la componentele paramagnetice ale spectrelor (exista 2

componente, una atribuita ionilor de Fe3+ si alta, ionilor de Fe2+).

Spectrele Mössbauer ale probei BSF-4 obtinuta cu nucleatorul Cr2O3 sunt

prezentate in Fig. 11. Ele au fost achizitionate la temperature crescatoare, intre 5 K

si 130 K. In acest caz, componenta superparamagnetica (atribuita Fe3+) este

aproape neglijabila, in domeniul de temperaturi de la 5 K la 130 K.

In cazul probei BSF 5, se observa ca acea componenta atribuita ionilor de

Fe3+ creste sensibil in pondere la temperatura de 30 K (Fig. 12) ceea ce conduce la

idea atribuirii ei unei tranzitii superparamagnetice (existenta unei distributii de

dimensiuni a nanoparticulelor de magnetita implica si prezenta unor particule de

dimeniuni foarte mici, de 2-3 nm care se relaxeaza deja sub 30 K). Ca urmare, cele

2 tranzitii magnetice vor fi evidentiate si in curbele de magnetizare in functie de

temperatura M(T). Acestea pot fi atribuite astfel: cea de sub 40 K corespunde unei

tranzitii superparamagnetice, iar cea de la aprox 100 K, tranzitiei Verwey.

O situatie similara se observa si pentru proba BSF 3 (Fig. 13). Deosebirea

dintre cele 2 probe, consta in special in diferenta de pondere a componentei

superparamagnetice (la peste 30 K), aceasta fiind mult mai accentuata in proba

BSF 5 (in care datele TEM arata prezenta de graunti mai mici).

16

Fig. 11. Spectre Mössbauer pentru vitroceramica BSF4 masurata intre 5 si 130 K.

17


18


Tinand cont de cele mentionate mai sus, tranzitia de la 40 K, ar trebui sa fie din ce

in ce mai slaba, in ordinea proibelor BSF5, BSF 3 si BSF 4. Pentru toate probele se

observa tranzitia Verwey in jur de 100 K.

Reamintim ca la temperatura camerei (cf. RSI 3), analiza datelor arata ca

proba BSF-1 are o structura ocupationala apropiata de cea a magnetitei ideale cu o

19

usoara subpopulare a pozitiilor tetraedrice (R > 1) Proba BSF-3, are un raport de

ocupare R = 1.7 si un camp hiperfin Hhf = 45.8 T, valori consistente cu o

subpopulare a pozitiilor octaedrice dar in care ionii di- si trivalenti sunt distribuiti in

mod egal in pozitiile subretelei octaedrice.

La probele cu continut ridicat de Fe situatia este dependenta de nucleator.

Astfel proba BSF-4 are raportul R = 1.7 si campul hiperfin apropiat de valoarea

teoretica Hhf = 46.1 T fapt care sugereaza un grad de ocupare a celor doua pozitii A

si B similara cu cea din cazul precedent. In timp ce proba BSF-5 are o structura

ocupationala a pozitiilor tetraedrice si octaedrice ideala corespunzand unei

magnetite bine structurate din acest punct de vedere.

Dubletii paramagnetici arata ca 16% din cantitatea de ioni de Fe ramane

dispersat in cazul probei BSF-1. In cazul probei BSF-3, procentul de Fe cu raspuns

paramagnetic este de 25 % din care, conform parametrilor hiperfini, 22% din ioni

sunt in coordinatie tetraedrica ca Fe3+ si doar 3% este in coordinatie octaedrica ca

Fe2+. Din punctul de vedere al recuperarii fierului, proba BSF-4 prezinta doar 10%

din ionii de Fe ramasi dispersati in matricea vitroasa, majoritatea ca Fe3+. In sfarsit,

notam ca proba cea mai buna din punct de vedere structural BSF-5 are si cea mai

mare parte de fier cu raspuns paramagnetic 41 %.

Datele de masura la temperatura camerei sunt prezentate in Tabelul 2.

Tabelul nr. 2. Datele de spectroscopie Mössbauer

proba Componenta*

Deplasare Isomerica

(mm/s)

Despicare cuadrupol

(mm/s)

Bhf (T)

Largime de linie

(mm/s)

Arie relativa

(%)

BSF-1 S1 (T) 0.29 0.0 49.1(5) 0.28 26

S2(O) 0.66 0.0 45.9 0.49 58

D1 1.28 2.5(9) - 0.67 6

D2 0.72 2.0(4) - 0.81 10

BSF-4 S1 (T) 0.28 0.0 49.2 0.34 32

S2(O) 0.66 0.0(2) 46.0 0.49 56

D1 0.28 0.70 - 0.82 12

BSF-3 S1 (T) 0.29 0.0(0) 48.9 0.32 28

S2(O) 0.66 0.0(0) 45.8 0.42 46

D1 0.42 1.0(2) - 0.80 22

D2 0.83 2.5(7) - 0.31 3

BSF-5 S1 (T) 0.30 0.0(0) 48.7 0.34 19

S2(O) 0.65 0.0(1) 45.6 0.53 39

D1 0.34 1.0(0) - 0.70 32

D2 0.88 2.4(3) - 0.95 9

*S1 (T): sextet / coordinare tetraedrica; S2(O): sextet / coordinare octaedrica; D1,

D2 dubleti paramagnetici

20

IV. 6. Magnetizare in curent alternativ

Dinamica nanoparticulelor magnetice asa cum este ea reflectata in datele de

susceptibilitate magnetica ’(T) si ”(T) au fost determinate cu ajutorul unui

magnetometru cu SQUID de tip MPMS (Quantum Design). Datele au fost colectate

prin incalzire de la 5 la 150 K. Pentru comparatie, vom prezenta si datele de

magnetizare satatica.

Fig. 14. prezinta datele de magnetizare pentru proba BSF1: Fig. 14a prezinta

datele de magnetizare in curent alternativ masurate la frecvente cuprinse intre 30

si 1030 Hz, iar figura 14b datele de magnetizare specifica masurate in curent

continuu. Susceptibilitatea in curent alternative prezinta maxime atat pentru ’(T)

cat si pentru ”(T) si toate se deplaseaza la temperaturie mai mari cu cresterea

frecventei asa cum apare si in alte cazuri raportate in literatura [39]. Totusi

deplasarea maximului larg al partii reale a susceptibilitatii ’(T) este prea mic

pentru a fi atribuit vreunui proces activat. In consecinta acest maxim nu poate fi

atribuit temperaturii de blocare ci mai degraba temperaturii Verwey TV (90.4 K la 30

Hz). De notat ca datele de difractie si de microscopie arata ca aceasta proba are

cristalite destul de mari, cca 120 nm. In jurul probei de 23 K este prezent un umar,

vizibil in partea imaginara a susceptibilitatii ”. Bałanda et al. [40] considera ca fiind

rezultatul proceselor electronice care apar in urma relaxarii de domenii (tunelare

incoerenta intre Fe+2 si Fe+3 sau excitari ale starii Fe+2). Datele de spectroscopie

Mössbauer arata insa ca acest umar este mai degraba un fenomen de relaxare a

particulelor superparamagnetice din coada de distributie dimensionala.

Analiza dependentei de frecventa in termeni de activare (Arrhenius) conduce la un

timp de proba extrem de mic 0 10-23 s in comparatie cu datele din literatura [41].

Proba BSF3 prezinta o tranzitie Verwey foarte bine precizata atat in datele de

curent alternativ cat si in magnetizarea statica (Fig. 15 a si b). Temperatura Verwey

este bine definite la 122 K in concordanta si cu datele de spectroscopie Mössbauer.

O a doua tranzitie este bine precizata la 39 K unde componenta disipativa ”

prezinta un maxim. De notat ca dependneta de frecventa este neglijabila.

Proba BSF4 prezinta si ea o tranzitie Verwey bine definite la TV = 116 K

masurata la 30 Hz dar frecventa este tot slaba ca si in cazul precedent (Fig. 16). ”

scade in amplitudine cu cresterea frecventei ca si in cazul probei BSF-3. In acelasi

timp, umarul de la temperaturi joase evolueaza intr-un maxim (21.12 K la 30 Hz).

Un al doilea umar este vizibil la temperaturi mai ridicate (85 K la 30 Hz). De notat

ca datele de spectroscopie Mössbauer arata subocupari identice ale pozitiilor

octaedrice pentru BSF 3 si BSF 4 (R= 1.7).

21

a

b

Fig. 14. Proprietatile magnetice ale probei BSF1: a) susceptibilitatea in curent

alternativ masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica

masurata la 50 Oe.

a

b


alternative masurata la frecvente intre 30 si 1030 Hz; b) magnetizarea specifica

masurata la 50 Oe.

22

Proba BSF5, care are cristalitele cu cele mai fine nanocristale (26 nm)

prezinta tranzitia Verwey la TV = 112 K (la 30 Hz). Este interesant ca ” este foarte

larg cu maximul la o temperatura ceva mai mica decat TV adica la 104 K (la 30 Hz)

si amplitudini crescatoare cu frecventa (ca in cazul probei BSF-1). Dimensiunea de

graunti sugereaza faptul ca nanocristalitele sunt monodomeniale fiind sub limita de

extensie a domeniului. [42], unde A este constanta de

rigiditate de schimb, iar ms magnetizarea de saturatie. Pentru aceasta compozita

datele de spectroscopie Mössbauer sunt consistente cu o magnetite cu grad de

ocupare aproape perfect cu R = 2. De notat ca proba BSF1 cu R = 2.1, prezinta, in

mod similar, o crestere cu cresterea frecventei a amplitudinii maximului

componentei imaginare ”.

De notat ca magnetizarea specifica la tranzitia Verwey variaza destul de

consistent intre probele la care nucleatorul este Cr2O3 fata de cele la care

nucleatorul este P2O5.

a

b



masurata la 50 Oe.

23

a

b



masurata la 50 Oe.

Si aceasta dependenta se poate explica prin datele de spectroscopie

Mössbauer. Daca consideram fractia de ioni de fier care ramane sub forma

paramagnetica, rezulta ca, in cazul probelor BSF3 si BSF5, cantitatea de magnetita

care da rapunsul magnetic este mult mai redusa. O reprezentare a magnetizarii

specifice raportata la continutul total de Fe mFe in functie de fractia de fier

paramagnetic asa cum rezulta din datele hiperfine, se observa o scadere monotona

a acesteia cu cresterea cantitatii de Fe paramagnetic (Fig. 18). Prin urmare, proba

BSF-5 cu cea mai mare fractie de Fe paramagnetic, x = 41 %, prezinta cea mai

mica valoare a mFe in timp ce proba BSF-4 cu cel mai mic continut de ioni de Fe in

stare paramagnetica prezinta cea mai mare valoare a mFe. Abaterile de la liniaritate

pot fi puse pe faptul ca popularea subretelor octaedrice (in principal) este

insuficienta in cazul probelor BSF3 si BSF 4.

24

Fig. 18. Dependenta magnetizarii specifice raportata la cantitatea totala de ioni de

Fe mFe in functie de fractia de ioni paramagnetici de Fe.

IV. 7 Extragerea si conditionarea nanoparticulelor

Prin tratament termic de cristalizare sticlele bazate pe compozitii

chimice in sisteme borosilicatice pot prezenta o separare in faze mai bogate

in SiO2 respectiv in R+, B2O3 alaturi de cristalele dezvoltate in natricea

vitroasa initiala. Ultima faza este relativ solubila in diferite medii de solventi,

inclusiv acizi minerali ( HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4) iar in atare conditii, prin

atac chimic, precipitatul rezultat poate contine faza insolubila bogata in SiO2

(amorfa sau partial cristalizata) si faza cristalina specifica. Prin atac chimic

se urmareste indepartarea fazei solubile nesilicioasa si a fazelor cristaline

neincorporate in faza de SiO2 de ex. faze cristaline pe baza de Fe2O3. O

temperatura putin peste TG este necesara pentru a permite mobilitate in

interiorul fazei vitroase in vederea cresterii fazei cristaline. Este de

asemenea posibil ca alte cristale fata de cele magnetitice, dorite pentru

structura cristalizata, sa fie dezvoltate in matricea vitroasa,pe durata racirii

topiturii sau cea a tratamentului termic de cristalizare. De exemplu, faze

nonmagnetice secundare, de tipul hematitei (α-Fe2O3) pot fi generate, dupa

cum rezulta, in cantitati nesemnificative, din rezultatele dr difractie de raze X

pentru unele probe. Pentru compozitii de baza in sisteme borosilicatice poate

rezulta si o faza cristalina bogata in SiO2, de ex. cristobalit. Cresterea

25

cristalelor pe durata cristalizarii determina corespunzator reducerea fazei

vitroase deoarece constituentii fazei cristaline sunt separati de compozitia

amorfa. Chiar si in conditiile unei cristalizari masive, cel putin o parte din

fazele care contin fier sunt incorporate (imbracate, invelite) in faza bogata in

SiO2 chiar daca este predominant cristalina [43]. Proportia si tipul fazelor

dezvoltate pe durata racirii topiturii si a tratamentului termic de cristalizare

depinde de: compozitia sticlei de baza, metoda de racire a topiturii si

parametrii tratamentului termic aplicat sticlei de baza. Chiar si pentru

aceeasi compozitie a sticlei de baza, tipul, proportia si dimensiunea

cristalitelor depind de istoria termica care cuprinde topirea, formarea si

tratamentul ulterior de cristalizare.

Probele de sticla BSF au fost supuse tratamentelor chimice de

solubilizare a fazei boratice, bogata in R+, B2O3. Pulberea vitroceramica

adusa la granulatie sub 40 microni a fost tratata chimic cu solutie 3N HNO3

prin imersie timp de 3 h la 1000C urmata de spalari repetate cu apa distilata

si sonificare. In etapa a 2 a pulberea se introduce in solutie 1,25 N NaOH cu

palier de mentinere intre 30-90 min la temperatura camerei urmata de

spalare repetata in apa distilata pana la obtinerea unui pH <8. Prin

seeparare magnetica s-a urmarit obtinerea mostrelor cu faza cristalina

bogata in SiO2 si Fe3O4.

Comportarea probelor de pulbere a fost diferita pe durata atacului

chimic. In cazul probelor BSF2a si BSF5 a rezultat un precipitat de culoare

neagra, bine delimitat si decantat la spalare in apa distilata (ramasa limpede

la suprafata) dupa atac acid/baza. Celelalte probe au prezentat o tenta

rosiatica specifica hematitei iar separarea in solutia de spalare s-a facut cu

dificultate (solvent tulbure). Figura 19 prezinta difractograma pulberii

obtinuta prin acest procedeu din proba BSF2a care arata fara indoiala

existenta doar a magnetitei ca produs final.

26

Fig. 19. Difractograma de raze X a unei nanoparticulelor extrase din proba

BSF2a prin tratament chimic de dizolvare a amatricii vitroase.

IV.8. Microscopia de forta atomica (AFM)

Investigatii de microscopie de forta atomica au fost efectuate pe proba BSF3

si pe BSF4 folosind un microscop AFM de tip MultiMode NanoScope IIID Controller

(Digital Instruments Veeco Metrology Group, Santa Barbara, CA, USA). Scanarea s-

a facut in modul de contact intermitent la o frecventa de 300 kHz la temperatura

camerei iar imaginile de toptografie a suprafetei a fost obtinuta cu o rezolutie de

256x256 pixeli si o frecventa de 0.5 Hz. Pentru prelucrarea imaginilor s-a folosit

softul NanoScope (531r1). Datele de microscopie de forta atomica sunt prezentate

in Figurile 20 si 21.

a) Proba BSF3. Figurile 20 a si b prezinta imagini tridimensionale ale

suprafetei probei luate in doua moduri diferite: direct si unghiular.

Figurile 21a si 21b prezinta imagini tridimensionale ale suprafetei probei

BSF4 luate in doua moduri diferite: direct si unghiular.

IV.9. Iradierea cu radiatie gama a sticlelor precursoare

Probele vitroceramice au fost supuse iradierii gama la iradiatorul IRASM de la

IFIN-HH. Durata tratamentului a fost de 568 de ore. Cutia de probe a fost plasata

pe masa de iradiere, langa conveior, intr-o geometrie stationara la distanta de cca

27

125 cm de sursa de 60Co. Pentru masurarea dozei absorbite de probe a fost plasat

un dozimetru ECB (B 3016) in cutia de probe, intr-o pozitie de doza medie pentru

geometria de iradiere utilizata. Dozimetrul a fost scos si masurat dupa 49h50 min

de iradiere. Pentru estimarea dozei totale absorbite, s-au insumat timpii de iradiere

corespunzatori fiecarei luni de expunere, iar debitul dozei absorbite calculat a fost

corectat lunar scazandu-l cu 1,011%. Sistemul dozimetric de masura a fost de tip

ECB (IRASM, lot B0 –cu trasabiitate la Risø-HDRL si NPL Anglia (cert. 06C-50)

a

b

Fig.20 Imagine AFM asupra probei BSF3. a) aspect general; b) Imagine unghiulara

de faza si de inaltime

a

b

Fig.21 Imagine AFM asupra probei BSF4. a) aspect general; b) Imagine

unghiulara de faza si de inaltime

Doza absorbita: Conform masuratorilor dozimetrice efectuate (Buletin ECB

22/09.02.2009) debitul dozei absorbite in perioada 28.01.2009-08.02.2009,

evaluata cu un nivel de incredere de 95% este D=(61.74.4) kGy la un debit de

28

Debit (1.3120.094) kGy/h. Prin urmare in cazul probelor de vitroceramica

magnetica doza totala absorbita, evaluata cu un nivel de incredere de 95 % este

Dtotal = (66847) kGy.

Iradierea se realizeaza pe baza unor proceduri de lucru specifice tipului de

iradiator, proceduri elaborate in cadrul sistemului de asigurare a calitatii de catre

responsabilul cu managementul calitatii din compartimentul respectiv.

Dupa iradiere probele au fost stocate cateva saptamani la temperatura camerei

si apoi s-au prelevat esantioane pentru masuratori magnetice. Datele de masura

sunt prezentate in Figurile 22-24.

Se observa ca probele la care s-a folosit Cr2O3 in calitate de nucleator sufera o

reducere in dimensiunea de graunti fara insa sa le aduca in stare

superparamagnetica (Fig. 22 pentru BSF1 si 24 pentru BSF-4). Proba BSF1 care

initial are graunti mari are si histerezisul mai dezvoltat astfel incat s-a putut

determina si campul de coercivitate (Fig.23).

Fig. 22. Curbele de histerezis pentru

proba BSF-1 iradiata gama masurata

intre 2 si 120 K

Fig. 23. Dependenta de temperatura a

magnetizarii probelor iradiate si

neiradiate de vitroceramica BSF-2

In cazul probelor la care nucleator a fost P2O5 alterarile sunt serioase si proba

este practic superparamagnetica la temperaturi foarte joase (6K) (Fig. 25).

Cresterea continutului de Fe conduce la reaparitia histerezisului (Fig. 26).

29


magnetizarii probelor BSF-4 iradiate gama


magnetizarii probelor BSF-3 iradiate gama

Fig. 26. Dependenta de temperatura a magnetizarii probelor BSF-5 iradiate gama

V. Introducerea de nanostructuri magnetice in MgB2

In incercarea de a extinde aplicatiile nanostructurilor cu proprietati magnetice am

testat efectul acestora asupra proprietatilor MgB2 in speranta imbunatatirii

30

pinningului prin adaugarea mecanismului de pining magnetic. In acest scop s-au

adaugat la MgB2 nanoparticule de fier incapsulat in carbon (FIC) si apoi s-a

procedat la sinterizare prin metoda plasmei de scanteie (spark plasma sintering-

SPS). S-au obtinut astfel nanocompozite supraconductoare. Avantajul acestei

metode este dublu: pe de o parte din camasa exterioara a nanoparticulelor se ia

carbon care sa substituie borul si sa mareasca campul critic superior, iar pe de alta

parte camasa de carbon separa Fe metalic de matricea de MgB2 prevenind

interactia nedorita cu Fe care ar duce la formarea de boruri, deci la saracirea

matricii in bor [44], si de asemenea pot deveni centri pinning magnetici [45].

Probele s-au fabricat prin amestecul de FIC si MgB2 si ulterior sinterizarea lor prin

SPS. Pulberea de FIC a fost obtinuta la INFLPR prin decarbonoilarea secventiala a

Fe(CO)5 prin piroliza laser [46]. Nanoparticulele astfel obtinute au un miez de -Fe

imbracat in cateva straturi de grafit. S-au fabricat trei tipuri de probe cu diferit

continut de fier metalic: 0.35 wt % (MFC-03), 0.6 wt % (MFC-06), si 1.0 wt %

(MFC-10). Probele au densitate ridicata comparativ cu cele preparate prin

sinterizare clasica. Mai precis, daca densitatea ideala a monocristalului este 0 =

2.62 g/cm3 atunci densitatile relative r = /0 ale probelor produse prin SPS sunt

destul de apropiate de unitate, mai précis r = 0.954, 0.988, 0.985, si 0.873 pentru

proba martor MgB2, si respectiv pentru MFC-03, MFC-06, si MFC-10.

DIfractia de raze X indica probe monofazice cu usoare urme de MgO. Mai precis

cantitatea de MgO este de 4.9, 5.5, si 6.2 % wt pentru MFC-03, MFC-06 si,

respective, MFC-10. Analiza maximului de difractie (110) arata o deplasare spre

unghiuri mai mari consistent cu scaderea parametrului de retea a. Descresterea se

datoreaza substitutiei borului de catre carbon cu formarea unui compus de tip

Mg(B1-xCx)2. Analiza datelor de difractie da pentru x valorile 0.013, 0.026 si 0.019

for MFC-03, MFC-06 si, respective, MFC-10.

Tranzitia normal-supraconductor R(T) este prezentata in Fig. 27 in care

rezistenta a fost normata la rezistenta la temperature camerei R300k. Dupa cum ne

asteptam rezistenta reziduala creste cu continutul de FIC. De notat ca temperature

critica este foarte inalta pentru nivelul de dopare cu carbon extras din datele de

difractie [47-50] ea scade de la 38.8 K pentru MgB2 pur la doar 38.6 K, 38.41, si

38.3 K pentru MFC-03, MFC-06 si, respectiv MFC-10. A doua caracteristica

interesanta o reprezinta dezvoltarea unei a doua tranzitii la temperaturi ceva mai

coborate (insetul la Fig. 27) care devine cu atat mai bine definita cu cat creste

cantitatea de FIC. Aceasta comportare sugereaza o structura complexa a grauntilor,

mai precis grauntii au un miez curat din material nedopat cu carbon si o patura

externa mai bogata in carbon.

31

Fig. 27. Dependenta de temperatura a rezistentei electrice normalizate R/R300 K a

compozitelor de MgB2 si FIC. In inset: detaliile tranzitiei supraconductoare.

Campul critic superior Bc2 a fost determinat din rezistenta electrica, iar

dependenta acestuia de temperatura redusa t = 1-T/Tc urmeaza o lege de tip

putere pentru t < 0.5, Bc2(T) = A(1-T/Tc) unde 1.5 si A o constanta cu unitati

de camp magnetic (Fig. 28). Marimea A creste cu continutul FIC de la 27.88 (pentru

proba nedopata) la 28.04, 32.15 si 31.20 T pentru probele MFC-03, MFC-06 si,

respectiv, MFC-10.

Densitatea critica de curent a fost obtinuta din datele de magnetizare M(B)

folosind metoda Bean [23]:

Jc=2ΔM/[a(1-a/3b)]

unde a si b sunt dimensiunile probei perpendiculare pe directia campului aplicat iar

M este diferenta dintre magnetizarea pe ramurile descendenta si ascendenta ale

curbei de histerezis. Dependenta densitatii critice de curent Jc de campul magnetic

este prezentata in figura 29 la campurile de 5, 20 si 30 K pentru toate probele. O

observatie este demna de mentionat in raport cu aceste curbe: proba cu cel mai

mic continut de FIC (MFC-03) prezinta cel mai mare Jc pentru toate temperaturile

32

pentru B < 8 T atingand valori mai mari de 1.1 MA/cm2 la 5 K si 1 T. La B > 8 T in

limita temperaturilor joase, cea mai mare valoare o prezinta proba MFC-06.

FIG. 28. Dependenta de temperatura redusa t = 1-T/Tc a campului Bc2. In inset:

dependenta de temperatura a campului critic superior.

33

Fig. 29. Dependenta densitatii critice de curent de campul aplicat la 5, 20 si 30 K:

-MgB2, -MFC-03, -MFC-06, si -MFC-10. Inset: campul Bcr la care curentul critic

al probei nedopate devine egal cu curentul critic al probelor MFC-06 si, respectiv,

MFC-10

Un alt parametru important este campul de ireversibilitate Birr si dependenta

lui de temperatura. O estimare corecta a acestui camp poate sa dea informatii

asupra naturii pinningului si a evolutiei lui creterea temperaturii sau campului.

Aceasta marime a fost extrasa din dependenta de camp a densitatii critice de curent

cu criteriul Jc = 100 A/cm2. Resultatele sunt prezentate in Fig.30.

Fig. 30. Dependenta de temperatura a campului de ireveribilitate Birr

Aceste rezultate impreuna cu datele Jc-B indica faptul ca pinningul este in

mod evident imbunatatit prin comparatie cu proba nedopata cu maximul pentru

proba MFC-03.

VI. Teste de functionalizare a nanoparticulelor magnetice in vederea

imobilizarii de substante biologic active (enzime si proteine)

VI.1. Introducere. Nanoparticulele magnetice. Aplicatii medicale.

In ultimii ani, cercetarile in domeniul nanoparticulelor sunt de mare

actualitate datorita perspectivelor largi de utilitate pe care le deschid.

34

Astfel fixarea substantelor biologic active (enzime, acizi nucleici, anticorpi,

antigene) pe nanosuporturi solide reprezinta o directie moderna pentru obtinerea

de biosenzori si biocatalizatori performanti, utilizati in bioanaliza si in biotehnologia

substantelor cu potential biomedical.

In acest context nanomaterialele ceramice ca atare precum si cele

magnetizate sunt tot mai des utilizate ca suporturi pentru imobilizarea enzimelor si

a altor produsi biologic activi.

Nanoparticulele magnetice al caror diametru este cuprins in intervalul 5-

100nm, sunt alcatuite din substante cu un caracter magnetic pronuntat (fier, oxizi

de fier-magnetita, diverse ferite), microparticule ce prezinta un moment magnetic

mare, ce permite atasarea diverselor entitati nemagnetice, cum ar fi celule,

substante biologic active, agenti patogeni, xenobiotice etc. Proprietate ce si-a gasit

aplicatii de interes pentru multe domenii.

Aplicatiile nanoparticulelor în domeniul medical.

Descoperirile nanoparticulelor cu aproape cinci decenii în urma a deschis noi

orizonturi pentru oamenii de stiinta si a determinat aparitia a numeroase aplicatii

biomedicale.

Multe teste de diagnostic in vitro cum ar fi: teste de latex aglutinare, teste

de celularitate analitica si teste de fagocitoza au devenit teste de rutina. Toate

acestea s-au dezvoltat pe baza particulelor mici legate de molecule biologic active

si a marcherilor fluorescenti si radioactivi. In prezent, cercetarile continua, fiind

axate pe aplicatiile nanoparticulelor polimerice în controlul si directionarea

transportului de medicamente la nivelul sistemelor vii.

In cadrul clasei nanoparticulelor, o importanta deosebita o au acelea care

care contin înglobat un miez magnetic.

Acoperirea particulelor magnetice cu polimeri sintetici biodegradabili si

biocompatibili este una dintre cele mai noi directii de cercetare de o importanta

deosebita pe plan international în acest domeniu datorita avantajelor extrem de

importante ce privesc biocompatibilitatea (nefiindu-le detectate nici un efect acut

sau subacut toxic prin studii histologice si serologice) si posibilitatea adsorbtiei si

legarii chimice de substante biologic active pe care le ofera utilizarea acestor

polimeri ca strat de acoperire a particulelor sensibile magnetic.

Pe masura ce studiile trec de la faza cercetarilor de laborator in vitro si

in vivo, pe animale de laborator, în cea de studiu clinic, folosirea

microparticulelor magnetice în domeniul oncologiei devine din ce în ce mai

evidenta ca o metoda de mare viitor, cu un potential cu totul fantastic.

De asemenea acest tip de substante ofera posibile aplicatii atractive în

biomedicina.

Avand dimensiuni controlabile de la câtiva nanometri pâna la zeci de

micrometri, care le plaseaza într-un domeniu de dimensiuni comparabile cu cele

35

ale celulelor (10-100µm), virusurilor (20-450nm), a proteinelor (5-50nm) sau a

genelor (2nm latime si 10-100nm lungime) putand veni în contact cu o entitate

biologica tinta si întradevar, ele pot fi acoperite cu molecule biologice, si au

capacitatea de a interactiona.

Deci, in concluzie particulele magnetice si-au gasit o sfera larga de

aplicabilitate:

- extractia, purificarea si concentrarea acizilor nucleici;

- purificarea culturilor de celule;

- drept componenta a biosenzorilor pentru detectarea unor anumite tipuri de

molecule;

- pentru controlul adsorbtiei sau desorbtiei unor molecule;

- în analizele imunologice.

În ce priveste primul domeniu, acela al extractiei si concentrarii acizilor

nucleici respectiv a AND si ARN, purtatorii magnetici si-au adus a importanta

contributie în automatizarea procesului.

Fie ca sunt folosite particule supermagnetice uniforme ca dimensiuni

[48,49], fie latexuri magnetice hidrofile [50]. în ambele cazuri se fac manipulari

ale încarcarii electrice a suprafetei particulei magnetice prin alegerea unor grupari

chimice, spaceri si agenti de blocare adecvati scopului propus, acela de a imobiliza

oligonucleotidele. Prin folosirea gruparillor -NH2 si -SH pentru legarea de

suprafata purtatorului magnetic.

VI.2 Studiul privind functionalitatea unor suporturi nanocompozite

pentru fixarea diferitelor substante biologic active.

Pe baza studiului datelor de literatura privind functionalizarea suporturilor

magnetice, prezentam rezultatele semnificative obtinute de diversi cercetatori:

Ugur Tamer et al. [51], au raportat pentru prima dată sinteza la

temperatura camerei a nanoparticulelor de fier cuplate cu aur în soluţie apoasă.

Nanoparticulele rezultate au fost caracterizate prin microscopie electronica de

transmisie (TEM), spectroscopie de electroni pentru analiza chimică (ESCA),

spectroscopie UV-VIS şi difractie de raze X (XRD). Au determinat, de asemenea,

incarcaturile de suprafaţă şi proprietăţile magnetice ale nanoparticulelor.

Nanoparticulele magnetice au atras atenţia datorita aplicaţiilor în imagistică

prin rezonanţă magnetică (RMN); [52, 53, 86], stocare a datelor, livrare la tinta a

medicamentelor [54-58].

Numeroase lucrări de cercetare au fost efectuate pentru a evalua utilizarea

nanoparticulelor magnetice pentru tratarea celulelor cancerigene din tumorile pe

creier si celulelor de cancer mamar [59].

Progrese importante s-au facut în ceea ce priveste aplicaţii biomedicale,

inclusiv separarea şi purificarea de biomolecule matriceale [60-62].

36

Metodele de sintetizare chimica pentru nanoparticulele magnetice sunt

simple, iar controlul dimensiunii, formei şi compoziţiei nanoparticulelor depinde de

tipul de săruri folosite, raportul Fe+2 şi Fe+3, pH-ul şi tăria ionică a mediului [63].

Investigaţii ample asupra nanoparticule de aur, ca materiale la scara nanometrica şi

dispozitive, sunt în curs de desfăşurare şi există multe metode sintetice pentru a

obtine nanoparticule de aur [64-69].

Zhou et al. [87] au preparat nanoparticulele de fier filmate cu aur folosind

micelele inverse caracterizate prin microscopie electronica de transmisie (TEM).

Formarea unui film de aur pe nanoparticule magnetice a fost, de asemenea,

efectuata printr-o metoda de reducere cu hidroxilamina ca reducător [70].

Proprietatile optice si magnetice ale silicei fluorescent-filmate cu nanoparticule de

aur şi nanocristale magnetice au fost, de asemenea, raportate [71].

Caracterizarea nanoparticulelor, folosind TEM este reprezentata in fig 31 si

32.

Fig.31. Imagini TEM ale nanoparticulelor Fe3O4.

Fig.32. Imagini TEM ale nanoparticulelor Fe3O4-Au

Pregătirea nanoparticulelor de aur si fier în soluţie apoasă pare a fi

convenabila pentru diverse aplicaţii, in timp ce modificarea suprafeţei ar putea fi

efectuata prin bine-cunoscuta metoda cu tiol.

37

Pentru pregătirea acoperirii cu aur, experimentele initiale au fost efectuate

prin reducerea directă aur (III) în prezenţa nanoparticulelor Fe3O4. După reducere,

morfologia nanoparticulelor de aur-fier nu a fost uniformă.

S-a observat formarea de aglomerari mari, cresterea dimensiunii particulelor

dupa reducere.

Takuya Kinoshitaa et al. [72], indica nanoparticulele magnetice ca materiale

atractive pentru biologie şi biomedicina. Datorita dimensiunilor variind de la câtiva

nanometri pana la cateva zeci de nanometri, dimensiuni care sunt comparabile cu

cele ale unei proteine, anticorpi, ADN sau ARN, acestea se pot lega cu astfel de

biomolecule. Proprietăţile lor magnetice conduc la suporturi magnetice pentru

aplicatii biomedicale, cum ar fi purificarea ADN-ului şi ARN-ului, separarea celulelor,

livrarea magnetica a medicamentelor, hipertermie şi imagistica prin rezonanta

magnetica (IRM) îmbunătăţirea contrastului [63, 88-91].

Pentru aceste aplicaţii, suprafaţa particulelor trebuie modificată de către un

compus biocompatibil, cum ar fi polietilen glicol, alcool polivinilic, dextran sau dioxid

de siliciu [91]. Aceste modificări de suprafaţă acţionează pentru a proteja

particulele magnetice din microclimat şi pentru a fixa pe ele biomolecule [92, 93].

În general, aurul se combină ferm cu biomolecule care au grupuri de sulf,

cum ar fi grupurile mercapto, prin intermediul legaturilor Au-S [94] şi prezintă o

culoare roşiatică într-o soluţie coloidală datorită absorbţiei suprafatei plasmonilor.

Agregarea nanoparticulelor de aur cauzata de reticulare, cum ar fi

hibridizarea ADN-ului, poate schimba culoarea soluţiei coloidale in purpuriu, făcând

astfel posibila o detectie colorimetrica a ADN-ului [95-97].

Arthur Taylor et al. [73] au studiat functionalizarea nanoparticulelor de fier

incapsulate cu carbon.

Nanoparticulele magnetice incapsulate cu carbon reprezinta o noua clasa de

materiale in cazul carora miezul nanoparticulelor magnetice este protejat de

reacţiile cu mediul său prin invelisuri de grafit. Având o structură similară cu

nanotuburile de carbon, aceste nanoparticule ar putea fi functionalizate utilizând

metode care sunt deja aplicate pentru aceste structuri. Au fost prezentate efectele

tratamentelor acide pe baza de HCl, HNO3, H2SO4 asupra acestor nanoparticule,

evidenţiind impactul asupra proprietăţilor magnetice şi de suprafaţă. S-a aratat că

tratamentele acide bazate pe HNO3 pot fi aplicate cu succes pentru generarea de

grupari carboxilice pe suprafaţa nanoparticulelor.

Gasindu-si o gamă largă de aplicaţii, inclusiv stocare a datelor [74], pompe

magnetice (Ando et al. [76]), purificarea apei (Yavuz et al. [77]), biocipuri (Graham

et al. [98]) şi biomedicina (Shubayev et al. [78]).

Diferite metode recente de preparare au permis sintezele de structuri miez-

invelis în care nanoparticulele metalice sunt incapsulate de metale preţioase,

polimeri, silice sau carbon [75] pentru a preveni oxidarea lor şi, prin urmare, pentru

păstrarea proprietăţilor lor magnetice.

38

In aplicatii medicale, prezinta interes functionalizarea suprafaţei

nanoparticulelor magnetice cu molecule biologic relevante, cum ar fi proteinele sau

acizii nucleici. În caz de structurilor miez-invelis, acestea ar fi posibile prin

modificarea invelisului nanoparticulelor pentru legare covalenta.

In acest sens exista functionalizarea metilaminei. Metoda ce se bazează pe

activarea grupurilor carboxilice cu ECD (carbodiimida).

ECD reacţionează cu grupurile carboxilice formand amine reactive, o-acil-iso-

uree intermediare, care pot reacţiona cu un grup amino pentru a forma o legătură

amidica stabilă.

Tomoko Yoshino et al. [99], o metoda foarte recenta este aceea de a separa

magnetic celulele dintr-un amestec eterogen, aceasta metoda fiind mult mai rapida,

mai simpla, comparativ cu trierea celulelor prin activare fluorescenta (FACS) [100-

102].

Particulele magnetice folosite in acest tip de separare au dimensiuni cuprinse

in intervalul micrometri şi nanometri, ceea ce ofera numeroase avantaje in ceea ce

priveste sensibilitatea metodei de dozare, rapiditatea, precizia şi reducerea

toxicităţii celulare.

O alta utilitate a nanoparticulelor a fost raportata de Yean S. et al. [103],

acestia au cercetat purificarea apei potabile cu ajutorul nanoparticulelor magnetice

cu afinitate maxima pentru indepartarea arsenicului din apa de baut.

Balan V [79, 80], a studiat particulele magnetice de tip compozit magnetită-

chitosan obtinute prin gelifierea ionică a chitosanului cu tripolifosfat de sodiu (TPP),

în prezenţa magnetitei si folosite pentru legarea biotinei prin intermediul unei

carbodiimide solubile in apa (EDAC) cu rol de activator al gruparii carboxil a biotinei

ca sistem biologic.

Morfologia particulelor de magnetită a fost studiată prin tehnica TEM-

microscopie electronica de transmisie si este redata in figura 33.

Fig. 33. Imagine TEM a particulelor de magnetita.

De asemenea in brevetul de invenţie RO 122194 B1 [81]; este prezentat un

compozit vitroceramic pentru imobilizarea acidului L-aspartic si a L-asparaginazei.

39

VI.3. Imobilizarea diferitelor substante biologic active pe suporturi

magnetice, vitroceramice.

Din studiul datelor de literatura privind imobilizarea de substante biologic

active pe suporturi vitroceramice, prezentam rezultatele semnificative obtinute de

diversi cercetatori.

Imobilizarea enzimelor, inclusiv pe suprafete de siliciu, a fost

efectuata cu mai multi ani in urma [82].

Roger A. Sheldon, [83] a studiat imobilizarea lipazei Mucor javanicus (EC

3.1.1.3) pe nanoparticule de silice functionalizate.

Autorul a studiat stabilitatea termica a lipazei imobilizate pe acest tip de

suport si activitatea enzimatica la diferite valori ale pH-ului.

Figura 34 . Imobilizarea lipazei Mucor javanicus pe nanoparticule de siliciu.

S-a obtinut o stabilitate termică crescută şi o pastrare mai mare a activitatii,

într-o gamă mai largă de pH-uri (Figura 34).

Wang şi Caruso [104] au imobilizat catalaza (EC 1.11.1.6) pe sfere de siliciu

nanoporoase, având o suprafaţă de 630 m2 g-1 şi mesopori cu o dimensiune a

porilor de până la 40nm, şi asamblate ulterior intr-un invelis de acoperire nano-

compozit, compus din trei straturi de clorură de poli-dimetildialilamoniu (PDM) şi

nanoparticule de siliciu de 21nm.

40

Imobilizatul rezultat a prezentat o activitate de 75 ori mai mare fata de

catalaza imobilizata pe sfere de siliciu mezoporoase.

Legarea covalenta a α-chemotripsinei (EC 3.4.21.2) pe o sticla mezoporoasa

sol-gel, a fost modificata prin reacţia grupări hidroxi la suprafaţă cu 3,3,3-

trimetoxipropanal, a rezultatt un catalizator imobilizat cu un timp de înjumătăţire

mult mai ridicat fata de enzima libera.

Allan E. David [84] a studiat imobilizarea termolizinei pe silica gel activate cu

glutaraldehida GA, silica gelurile furnizeaza zone de suprafaţă si porozitate mare.

Activitatea termolizinei a fost determinata colorimetric utilizand azocazeina (Sigma-

Aldrich, Catalogue Number A-2765) ca substrat. Acest substrat contine cazeina

modificata cu un colorant. Termolizina libera si imobilizata a fost incubata cu un

volum de 4 mL solutie azocazeina 5%. Pentru precipitarea azocazeinei s-au

adaugat 500 μL acid tricloracetic 15% (TCA). Precipitatul rezultat a fost centrifugat

la 12 000 G timp de 5 minute.

Activitatea enzimatica este proportionala cu colorantul ramas in solutie,

pentru determinarea acesteia, s-a masurat extinctia la 440 nm.

In brevetul de inventie RO 122364 B1 [85], este prezentat un procedeu de

imobilizare a tripsinei pe suport biopolimeric pe baza de chitosan prin metoda

includerii in gel urmata de reducere cu borohidrura de sodiu.

VII. Rezultate experimentale.

VII.1. Imobilizarea lipazei pe suporturi vitroceramice.

In faza anterioara s-au analizat o serie de suporturi pentru imobilizarea

lipazei pancreatice si a lipazei fungice din Aspergillus niger si anume:

-suport sticla borosilicatica de baza (Lot I)

-suport sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice (Lot II),

-suport sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic(Lot

III)

Asa cum am precizat anterior, metoda de imobilizare aplicata a fost cea de

adsorbtie. In scopul suplimentarii puntilor de legare, prin formarea de baze Schiff

cu gruparile aminice ale enzimei, suportul vitroceramic a fost tratat in prealabil cu

solutie de glutaraldehida 2,5%. Suportul vitroceramic s-a adaugat progresiv in

solutia de enzima, cu agitare ocazionala, sistemul mentinanadu-se la temperatura

de 5ºC, pana la plafonarea valorii asctivitatii enzimatice in supernatant.

Activitatea lipazei s-a determinat prin metoda titrimetrica utilizand ca

substrat uleiul de masline, descrisa in paragraful 4.2. din raportul /2010.

Randamentul de imobilizare s-a determinat prin formula:

η = (Ai/ Af) x 100

41

unde: Ai este activitate initiala introdusa exprimata in U lipazice, Af este (Activitatea

initiala - Activitatea din supernatant)

Rezultatele obtinute pe loturile de probe sunt prezentate in tabelele: 3, 4 si

5, (detalierea tabelului 5 din Faza /2010).

Pentru imobilizarea lipazelor pe suport vitroceramic s-au utilizat doua tipuri

de lipaza: lipaza pancreatica (FLUKA) si lipaza din Aspergillus niger (FLUKA).

Tabelul 3. Imobilizarea lipazei pe suport sticla borosilicatica de baza (Lot I).

Nr.

crt.

Proba

Cantitate

suport

(mg)

Timp

adsorbtie

(ore)

Activitate lipazica

Rand.

de

imob.

(%)

Obs. Initiala

(Utotal

e)

Imob.

(Utotal

e)

U/g

suport

1. I-1LP 1 000 24,0 12

098,0

5 102,5 5 102 42,17

2. I-1LP-GA 3 000 20,0 12

098,0

4 602,5 1 534 38,04

3. I-1LP-GA 500 2,0 2 956,0 589,0 1 178 19,92

4. I-1LP-GA 500 18,0 2 956,0 642,0 1 284 21,71

5. I-1LP-GA 1 000 20,0 2 956,0 1662,5 1 662,5 56,24

6. I-1LAN-

GA

500 16,0 9 389,0 0 0 0

LP- Lipaza pancreatica.

LAN-lipaza Aspergillus niger.

Din analiza rezultatelor obtinute privind randamentul de imobilizare in

corelatie cu durata de adsorbtie si incarcarea enzimatica pe gram suport, cele mai

bune rezultate se obtin cu proba I-1LP (lipaza pancreatica imobilizata pe suport lot

I, proba 1) fara adaos de aldehida glutarica (GA), ca agent suplimentar de legare,

desi conduce la un randament de imobilizare aparent mai mare, incarcarea

enzimatica se situeaza practic la valori mai mici, indiferent de timpul de adsorbtie

folosit.

In ceea ce priveste lipaza de origine microbiana din Aspergillus niger

rezultatele privind imobilizarea acesteia pe suport ceramica simpla au fost negative.

Tabelul 4. Imobilizarea lipazei pe suport sticla vitroceramica pe baza de

cristale magnetice (Lot II).

42

Nr.

crt.

Proba Cantita

te

suport

(mg)

Timp

adsorbt

ie

(ore)

Activitate lipazica Rand.

de

imob.

(%)

Obs.

Initiala

(Utotal

e)

Imobiliza

ta

(Utotale)

U/g

supor

t

1. II-6LAN-

GA

500 20,0 7 758,5 131,5 263 1,69

2. II-6LAN 500 16,0 9 389,0 263,0 526 2,82

3. II-7LAN 500 20,0 9 389,0 868,0 1 736 9,24

4. II-7LP 500 2,0 12

098,0

723,0 1 446 5,97

5. II-7LAN 500 20,0 9815,0 1 394,0 2 788 14,05 *Reads

orbit

6. II-7LP-GA 500 20,0 12

098,5

3 577,0 7 154 29,56

7. II-7LP 1 000 20,0 12

098,5

3 077,5 3 077 25,43

In ceea ce priveste imobilizarea pe suporturile din lotul II rezultatele indica

faptul ca proba 6, lipaza din Aspergillus niger se imobilizeaza in general cu

randamente mici, usor mai ridicat daca nu este tratata cu GA. Pe proba 7 se obtine

un randament de 9,24% si prin readsorbtia supernatantului randamentul creste la

14,05%. Lipaza pancreatica se imobilizeaza pe acest tip de suport dupa 20 de ore

de adsorbtie cu un randament ridicat de 29,56% si la o valoare a incarcarii

enzimatice ridicate de 7 154 U/g suport, daca este tratata cu GA in concentratie

de 2,5% in tampon fosfat 0,01M, pH=7,0; comparativ cu proba netratata, unde

desi randamentul de imobilizare se situeaza aproximativ la aceeasi valoare,

incarcarea enzimatica per gram suport este sub 50% din aceasta valoare.

In cazul imobilizarii lipazei pancreatice pe suport, proba 1 lotul III, valoarea

randamentului de imobilizare, cat si cea a incarcarii enzimatice, sunt ridicate de

33,48% si respectiv 4 050 U/g, daca suportul este adaugat in 2 prize cu

mentinerea la aceeasi valoare a timpului de adsorbtie, acesta poate creste pana la

63,34% comparabil cu datele din literatura pentru acest tip de enzima.

In ceea ce priveste lipaza microbiana din Aspergillus niger, valorile

randamentului de imobilizare cat si a incarcarii enzimatice sunt scazute atat la

proba tratata cat si la proba netratata cu GA.

Referitor la imobilizarea lipazei pe cele 3 loturi de probe, comparand

rezultatele obtinute anterior, se poate concluziona faptul ca lipaza pancreatica se

imobilizeaza cu un randament relativ ridicat, peste 42% si incarcare enzimatica

mare 5102U/g suport pe lotul I, fara nici un tratament iar pe lotul III prin tratare cu

43

GA 2,5%. Valorile randamentului de imobilizare a lipazei fungice din Aspergillus

niger sunt foarte scazute pe toate loturile de probe indiferent de faptul ca acestea

au fost activate sau nu cu GA.

Tabelul 5. Imobilizarea lipazei pe suport sticla vitroceramica pe baza de

cristale magnetice tratata chimic (Lot III).

Nr.

crt.

Proba

Cantita

te

suport

(mg)

Timp

adsorbt

ie

(ore)

Activitate lipazica

Rand.

de

imobiliza

re

(%)

Initiala

(Utotal

e)

Imob.

(Utotal

e)

U/g

supor

t

1. III-1LP 1 000 20,0 12

098,0

2 051,5 2 051 16,95

2. III-1LP-GA 1 000 20,0 12

098,0

4 050,0 4 050 33,48

3. III-1LP-GA 500 2,0 2 956,0 841,5 1 682 28,46

4. III-1LP-GA 1 000

18,0

2 956,0 1 115,0 2 230 37,71

5. III-1LP-GA 1 000 20,0 2 956,0 1 872,5 3 745 63,34

6. III-1LAN-

GA

1 000 20,0 7 758,0 237,0 237 3,05

7. III-1LAN 1 000 20,0 9 915,0 894,5 894,5 9,02

Ca urmare in experimentele urmatoare s-a utilizat numai lipaza pancreatica

(FLUKA).

Dintre metodele fizice, imobilizarea prin adsorbtie este cel mai des utilizata,

reprezentand cel mai economic si simplu procedeu de imobilizare a enzimelor.

Enzimele sunt fixate la suprafata suportului datorita:

- interactiunilor Van der Waals,

- punti de hidrogen

- transferului de sarcina –toate interactiunile intre substante electrofile si

nucleofile

- schimb ionic

Cantitatea de enzima legata de suport in cazul adsorbtiei depinde de

urmatorii parametrii:

- concentratia proteica a solutiei enzimatice influent, masa de enzima fixata

creste proportional cu concentratia pana la o valoare limita, cand adsorbantul

se satureaza, valoarea acestuia este data de izoterma Freundlich:

m=k1 Ck2

unde: m-masa legata, C- concentratia la echilibru, k1, k2- constantele de

echilibru

44

- timpul de contact: viteza de adsorbtie este determinata de caracteristicile

fizico-chimice ale suportului si ale proteinei adsorbite (dimensiunile

moleculelor si ale particulelor suportului, prezenta si natura sarcinilor

electrice). In conditii obisnuite, timpul necesar pentru obtinerea unui

preparat enzimatic imobilizat este, in general scurt, nedepasind cateva ore.

- temperatura de reactie: viteza de adsorbtie, depinde de caracteristicile

difuzionale ale moleculelor, deci va creste cu temperatura pana la o valoare

optima a acesteia.

- pH-ul: s-a constatat experimental ca de regula in apropierea pH-ului

izoelectric al enzimei, adsorbtia este maxima.

In experimentele ulterioare efectuate s-a tinut cont de toti acesti parametrii.

Astfel s-a testat dinamica imobilizarii lipazei pe setul de suporturi primite in

cursul acestui an pe baza modului de lucru descris in cele ce urmeaza.

In vase Erlenmayer de 100 mL continand cate 0,5 g din proba de suport,

cate 50 mL solutie lipaza 0,3% in tampon fosfat 0,01M, pH=7,0 cu 241,9 UL/mL

activitate. S-a lucrat la temperatura de 5°C sub agitare continua, timp de 3 ore

prelevandu-se probe din ora in ora pentru determinarea activitatii enzimatice, a

randamentului de imobilizare, precum si a incarcarii enzimatice /g de suport pe

baza metodei descrise anterior.

Rezultatele obtinute sunt prezentate in Tabelul nr. 6.

Tabelul 6. Dinamica imobilizarii lipazei pe suporturi ceramice.

Nr.

crt.

Proba

Activitate lipazica

1 ora 2 ore 3 ore

Utotale % Utotale % Utotale %

1. BSF1 5527 45 5768 48 6490 54

2. BSF2 4685 39 5335 44 6490 54

3. BSF4 5245 43 5960 49 7717 64

4. BSF5 3482 29 4396 36 4781 39

5. BSF6 3770 31 4853 40 5745 47

6. BSF7 5239 43 8150 67 9353 77

7. ITC 4515 37 4709 39 8583 71

Asa cum se poate observa, suporturile ceramice cu afinitate ridicata pentru

lipaza pancreatica sunt in ordine descrescatoare : BSF7, ITC, BSF4, BSF2 si BSF1,

care dupa 3 ore de adsorbtie fixeaza 77, 71, 64 si respectiv 54% din activitatea

enzimatica initiala, rezultate confirmate si de valorile ridicate ale incarcarii enzimei

pe unitatea de suport (Fig. 35).

45

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

1 2 3 4 5 6 7

Activ. lipazica

Fig. 35. Activitatea lipazica pentru cele 7 probe (1-BSF1, 2-BSF2, 3-BSF4, 4-

BSF5, 5-BSF6, 6-BSF7, 7-ITC.

Cea mai ridicata valoare a incarcarii enzimatice dupa 3 ore de adsorbtie de

42915 U/g suport este prezenta la proba ITC, urmata de proba BSF7-18520U/g,

BSF4-15281 U/g si BSF1-12226 U/g respectiv BSF2-12153U/g.

Activitatea ridicata a acestor suporturi se manifesta chiar in prima ora de

adsorbtie, probele BSF4 si BSF7 adsorbind 43% din activitatea enzimatica initiala.

VII.2. Imobilizarea tripsinei pe suporturi vitroceramice.

VII.2.1. Materiale si metode.

Pentru imobilizarea tripsinei pe suporturile ceramice studiate s-a utilizat

aceeasi metoda de imobilizare si anume adsorbtia fizica.

Pregatirea suportului:

Probele de suport s-au mojarat si s-au mentinut in tampon fosfat 0,1 M ,

pH=7, timp de 21 de ore, dupa care s-au uscat la etuva. Pentru adsorbtie s-a luat

in lucru 0,5 g de suport astfel pregatit.

Tripsina utilizata pentru adsorbtie (SIGMA) a fost sub forma de solutie 0,055

in acid clorhidric 0,001 M, pH=6, cu activitate tripsinica de 264,27 U/mL si 12,60

mg/mLcontinut proteic.

Adsorbtia s-a efectuat prin adaugarea cantitatii de suportin 50 mL solutie de

tripsina, cu agitare ocazitionala, timp de o ora, la temperatura de 5°C. S-a analizat

activitatea enzimatica si continutul de proteine in supernatant, pentru estimarea

randamentului aparent de imobilizare:

ηa=Ai-As/Aix100

unde: Ai- activitatea initiala, UTotale iar As-activitate in supernatant, UTotale

Activitatea enzimatica a tripsinei s-a determinat pe baza metodei

spectrofotometrice utilizand substrat BAPNA.

46

Determinarea activitatii tripsinei cu substrat sintetic N-benzoil-L-

arginin-4-nitroanilina, (BAPNA).

Principiul metodei:

Metoda se bazeaza pe actiunea tripsinei asupra substratului sintetic, N-

benzoil-L-arginin-4-nitroanilina, (BAPNA), pe care il scindeaza cu formarea de 4-

nitroanilina, care adsoarbe la 405 nm.

1 U tripsina catalizeaza transformarea a 1μmol de substrat/minut in

conditiile de reactie.

Calculul activitatii tripsinei se face utilizand urmatoarea formula:

Activitatea (μmoli/min)=∆Exd/ x V

unde: ∆E = suma extinctiilor, d = factor de dilutie, acolo unde este cazul; ε = 0,001

si reprezinta modificarea extinctiei la 405 nm intr-un minut; V= volumul de proba

luat in lucru (mL) sau cantitatea de imobilizat (mg). Rezultatele obtinute sunt

prezentate in Tabelul nr. 7.

Tabelul 7. Imobilizarea prin adsorbtie a tripsinei pe suporturi vitroceramice.

Nr.

crt.

Proba

SUPERNATANT IMOBILIZAT Rand.

imob. Activ. Protei

ne

Activita

te

Protei

ne

Asp. Activita

te

(UT) (mg) (UT) (mg) (U/m

g)

(U/mg

support

)

%

1. BSF1

60,17

5

3,475 13153,

325

626,5

2

21 26,307 99,54

2. BSF2

35,65

0

3,995 13177,

850

626,0

05

21 26,356 99,73

3. ITC

7,440 0,324 7920 377,6

7

21 26,400 99,89

4. BSF4

45,87

5

419 13167,

625

211 62 26,330 99,65

5. BSF5

37,90

0

421 13175,

600

209 63 26,350 99,71

6. BSF6

44,33

5

444,5 13169.

165

185,5

00

71 26,330 99,66

7. BSF7

46,72

5

345,7

1

13166,

775

284,2

90

46 26,330 99,66

Rezultatele obtinute la imobilizarea prin adsorbtie a tripsinei (SIGMA) pe

suporturile studiate indica valori ridicate ale randamentului aparent de imobilizare,

peste 99% si ale incarcarii enzimatice pe suport, peste 26 300 U/g suport. Se

constata ca unele probe de suport sunt selective pentru tripsina intrucat o

47

imobilizeaza cu activitate specifica ridicata de 71, 63, 62, 46 U/mg respectiv

probele BSF6, BSF5 si BSF7.

Imobilizatele astfel obtinute au fost separate din mediul de adsorbtie prin

filtrare sub vid pe palnie Buchner, si testate pentru activitatea reala imobilizata.

Activitatea reala imobilizata s-a determinat prin produsii de reactie eliberati

de 100 mg imobilizat pe 12,5 mL substrat BAPNA conform metodei descrise

anterior.

Rezultatele sunt prezentate in tabelul nr. 8.

Tabelul 8. Activitatea reala a tripsinei imobilizate.

Nr.

crt.

Proba Activitate

practica

(UT)

Activitate

teoretica

(UT)

% din

teoretic

1. BSF1 13,7620 13153,325 0,1

2. BSF2 5,500 13177,850 0,04

3. ITC 42,5571 7920 0,5

4. BSF3 58,0710 13167,625 0,44

5. BSF4 357,1425 13175,600 2,93

6. BSF5 19,7140 13169,165 0,14

7. BSF6 18,4285 13166,775 0,13

Din analiza rezultatelor se constata ca activitatea reala imobilizata la

majoritatea probelor testate se situeaza la valori scazute raportate la activitatea

teoretica imobilizata a tripsinei, probele BSF 4 prezentand o stabilitate ceva mai

buna respectiv 2,93% activitate.

S-a testat in continuare efectul reticularii cu glutaraldehida asupra

randamentului de imobilizare a tripsinei pe suporturi ceramice, in doua variante de

lucru:

1) adsorbtia initiala a tripsinei pe suportul vitroceramic urmata de tratarea

cu GA solutie 2,5%.

2) tratarea suportului cu GA solutie 2,5% si apoi imobilizarea tripsinei pe

acesta. Solutia initiala de tripsina a avut 1171,66 UT activitate.

Rezultatele sunt prezentate in tabelul nr. 9.

Din rezultatele prezentate in tabel reiese faptul ca desi randamentele de

adsorbtie aparenta se situeaza la valori ridicate de peste 93%, randamentele reale

sunt mai mari in cazul variantei II, cand suporturile vitroceramice studiate sunt mai

intai tratate cu GA 2,5% si dupa aceea folosite pentru adsorbtia lipazei pancreatice.

In aceste conditii proba BSF5 prezinta valoarea cea mai mare a

randamentului de imobilizare de 20,88%.

48

Tabelul 9. Influenta tratamentului cu GA asupra randamentului de imobilizare.

Nr

.

crt

.

Proba

Varianta I

Varianta II

Activ.

imob.

Rand.

apare

nt

Rand.

real

Activ.

imob.

Rand.

aparent

Rand.

real

(UT) (%) (%) (UT) (%) (%)

1. BSF1

0,774

2

97,65 0,06 45,292 96,64 11,59

2. BSF2

4,166

6

93,35 0,35 44,885 95,77 16,64

3. BSF5

11,80

12

97,95 1,00 45,287 96,63 20,82

VII.2.2. Functionalizarea suportului vitroceramic BSF1 prin tratament

cu chitosan.

Functionalizarea suportului vitroceramic cu chitosan s-a efectuat prin metoda

complexarii cationice a acestuia cu compusi anionici, urmata de formarea de

particule sferice prin tratare cu agent reducator GA sau borohidrura de sodiu.

Modul de lucru abordat a constat in :

S-au luat 500 mg din suportul vitroceramic BSF1, mojarat sub forma de

pulbere fina si la care s-a adaugat 10 mL solutie chitosan 0,1% in acid acetic,

acetat de sodiu, s-a omogenizat timp de 30 minute la temperatura de 50°C, dupa

care pentru indepartarea apei s-a tinut la etuva la 60°C timp de 24 ore.

Suportul astfel pregatit a fost prelucrat in continuare in doua variante de

lucru:

Varianta I- suportul s-a tratat cu GA 2,5% in tampon acetat de sodiu 50

mM, pH=6 in raport greutate, suport:chitosan:GA, de 50:1:50, agitare ocazionala

si pastrare pentru perfectarea reticularii timp de 3 ore la temperatura camerei. S-a

filtrat pe palnie cu hartie de filtru, s-a spalat in continuare cu o solutie de L-lizina

0,1 M in tampon fosfat 0,05M, pH=7,4; pentru indepartarea glutaraldehidei

nereactionata.

Imobilizarea tripsinei s-a facut prin suspendarea suportului astfel pregatit

intr-o solutie de tripsina pancreatica (SIGMA) 0,05% in acid clorhidric 0,001M cu

agitare ocazionala la temperatura de 5°C, timp de 24 ore.

Imobilizatul vitroceramic s-a separat prin filtrare si s-a spalat cu solutie de L-

lizina.

Activitatea tripsinica imobilizata s-a calculat pe baza bilantului dintre

activitatea initiala si activitatea tripsinica neadsorbita din supernatant si apele de

spalare.

49

Varianta II- pe suportul pregatit initial s-a imobilizat prin adsorbtie tripsina

sub forma de solutie 0,05% in acid clorhidric 0,001M, cu agitare ocazionala, timp

de 4 ore la temperatura de 5°C. Imobilizatul este separat prin filtrare, spalat cu

solutie tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4; dupa care este tratat cu GA 2,5% in solutie

tampon acetat de sodiu 50 mM, pH=6 in acelasi raport ca la varianta I, spalare cu

solutie de L-lizina 0,1M in tampon fosfat 0,05M, pH=7,4; pentru indepartarea GA in

excess urmata de tratarea cu borohidrura de sodiu 0,5% in tampon TRIS-HCl,

50mM, pH=7,5; pentru fixarea covalenta a tripsinei.

Rezultatele obtinute sunt prezentate in tabelul nr. 10.

Tabelul 10 Functionalizarea cu chitosan.

Nr.

crt.

Indicator Varianta

I

Varianta

II

1. Suport BSF1 g 500 500

2. Glutaraldehida g 500 500

3. Chitosan g 10 10

4. Borohidrura de sodiu - 30

5. Solutie tripsina initiala.

Activitate U totale

8768 8768

6. Activitate tripsinica

supernatant

58 166

7. Activitate tripsinica

adsorbita

8710 8602

8. Randament de imobilizare

aparent (%)

99,33 98,10

9. Randament real de

imobilizare (%)

19,36 3,63

Din rezultatele prezentate reiese faptul ca atat randamentul aparent cat si cel

real de imobilizare a tripsinei pe suport functionalizat cu chitosan este mai mare in

varianta I de 99,33%, respectiv 19,36%. Acest lucru denota faptul ca prin

tratarea suportului vitroceramic cu chitosan, urmata de reticularea cu GA, cresc

gruparile functionale apte pentru fixarea tripsinei, randamentul de imobilizare

creste de 1,66 ori fata de proba netratata cu chitosan.

VII.3. Imobilizarea acidului L-aspartic pe suporturile vitroceramice

studiate.

Imobilizarea acidului L-aspartic pe suporturi vitroceramice s-a facut astfel:

suporturile vitroceramice s-au mojarat manual in mojar de portelan pana s-a

obtinut o pudra fina. Pentru activare acestea au fost mentinute in solutie de tampon

fosfat 0,01 M pH=7, timp de 24 ore, s-au filtrat si s-au uscat la etuva la 60°C.

50

Probele astfel pregatite s-au suspendat in solutie de acid L-aspartic 0,05% in acid

clorhidric 0,05M in raport suport:acid L-aspartic, g/v, 1:2. S-a agitat ocazional timp

de o ora la temperatura ambianta, nivelul de adsorbtie al aminoacidului pe suport

fiind controlat prin metoda cromatografiei in strat subtire utilizand placi de silicagel

(FLUKA). Pe placa s-au pipetat cate 10 μL de supernatant, comparativ cu o solutie

etalon de acid L-aspartic 0,05%.

Suporturile s-au uscat, placile s-au imersat apoi in sistemul de migrare

butanol: acid acetic: apa in raport 4:1:5,. Dupa evaporarea solventilor organici,

cromatogramele au fost relevate prin pulverizare cu solutie de ninhidrina 0,3% in

acetona si pastrate timp de 2-3 minute la 105°C cand sunt evidentiate spoturi de

culoare rosu-violet. Cantitatea de acid L-aspartic adsorbita pe suporturile

vitroceramice luate in lucru a fost estimata prin scaderea intensitatii culorii si a

dimensiunii, comparativ cu proba martor, arata un maximum de semne (+).

Interpretarea calitativa a cromatogramelor relevate este reprezentata in

Tabelul 11 comparativ cu spotul probei martor.

Tabelul 11 Adsorbtia acidului L-aspartic pe suporturi vitroceramice.

Nr.

crt.

Proba Intensitate

culoare

Rezultat

adsorbtie

1. Etalon acid L-

aspartic

+ + + + + 0

2. BSF1 + + Buna

3. BSF2 + + + Relativ buna

4. ITC + + + + Slaba

5. BSF4 + + + + Slaba


7. BSF6 + + Buna

8. BSF7 + + + + Slaba

Pe baza aprecierii cromatogramelor rezulta ca probele BSF1 si BSF6 fixeaza

cel mai bine acidul L-aspartic din solutie si intr-o proportie mai mica probele BSF2 si

BSF5 lucru evidentiat si in cromatogramele printate, figurile 36 si 37.

51

1. 2. 3. 4. 5.

Figura 36 – Cromatograma acidului L-aspartic pe suport vitroceramic (probele 1, 2,

3,4)

52

1. 2. 3. 4. 5.

Figura 37 – Cromatograma acidului L-aspartic pe suport vitroceramic (probele 5,6

si 7)

53

VII.4. Imobilizarea L-cisteinei pe suporturile vitroceramice studiate.

Se lucreaza identic ca in modul descris la imobilizarea acidului L-aspartic,

singura deosebire fiind aceea ca raportul adsorbant: adsorbit (g/v) este de 1: 1 si

solutia de L-cisteina este de concentratie mai mare respectiv de 0,1%.

Cromatogramele obtinute au fost interpretate calitativ din punct de vedere al

intensitatii culorii spoturiloe relevate, comparativ cu spotul martor. Scaderea

intensitatii culorii indica adsorbtia L-cisteinei pe suport, Tabelul 12 si

cromatogramele din fig. nr. 38 si 39.

Tabelul 12. Adsorbtia L-cisteinei pe suporturi vitroceramice.

Nr.

crt.

Proba Intensitate

culoare

Rezultat

adsorbtie

1. Etalon acid L-

cisteina

+ + + + + 0

2. BSF1 + + + + Slaba

3. BSF2 + + + + Slaba

4. ITC + + + + + Foarte slaba

5. BSF4 + + Buna

6. BSF5 + + Buna


8. BSF7 + + + + Slaba

Rezultatele obtinute indica faptul ca L- cisteina se adsoarbe cel mai bine pe

suporturile BSF4 si BSF5 si bine pe suportul BSF6.

54

1. 2. 3. 4. 5.

Figura 38 – Cromatograma L-cisteina pe suport vitroceramic (probele 1, 2, 3 si 4).

55

1. 2. 3. 4. 5.

Figura 39 – Cromatograma L-cisteina pe suport vitroceramic (probele 5,6,7)

56

VII.5. CONCLUZII

Rezultatele obtinute conform planului de realizare al proiectului din cadrul

prezentei etape, conduc la urmatoarele concluzii:

Probele de suporturi vitroceramice provenite de la coordonator au fost

testate pentru imobilizarea unor enzime ca: lipaza pancreatica, lipaza fungica din

Aspergillus niger si tripsina pancreatica precum si a unor aminoacizi (acidul L-

aspartic si L-cisteina).

Metoda de imobilizare aplicata a fost aceea a adsorbtiei fizice, metoda

simpla, des utilizata in tehnicile de separare a produsilor prin cromatografia de

afinitate si in obtinerea biocatalizatorilor si a unor biosenzori. Pentru marirea

capacitatii de imobilizare a principiilor active pe acest tip de suporturi, s-a testat

functionalizarea lor prin tratare cu glutaraldehida, inainte sau dupa fixarea enzimei

pe suport, cat si prin cuplarea pe suprafata suportului a chitosanului urmata de

reticularea cu borohidrura de sodiu.

Rezultatele obtinute indica faptul ca in functie de tipul suportului (sticla

borosilicatica de baza, sticla vitroceramica pe baza de cristale magnetice si sticla

vitroceramica pe baza de cristale magnetice tratata chimic), si de tratamentul

aplicat, atat lipaza cat si tripsina se imobilizeaza cu diferite randamente.

Se constata ca lipaza pancreatica se imobilizeaza cu randamente ridicate pe

acest tip de suporturi, functie de durata adsorbtiei si tratamentul preliminar cu GA,

in timp ce lipaza fungica din Aspergillus niger prezinta randamente scazute.

In ceea ce priveste imobilizarea tripsinei pe acest tip de suporturi

randamentul aparent de imobilizare este de peste 99%, randamentul real fiind in

general mai scazut. Se constata ca acesta poate fi imbunatatit de pana la 11,6 ori

mai mare, in situatia in care suportul este activat prin tratarea cu GA 2,5%, urmat

apoi de adsorbtia enzimei.

Functionalizarea suporturilor vitroceramice prin tratament cu chitosan pentru

marirea capacitatii de fixare a tripsinei, indica faptul ca atat randamentul aparent

cat si cel real de imobilizare a tripsinei este mare, in situatia in care suportul este

activat in prealabil prin tratament initial cu GA.

Probele de suporturi testate prezinta de asemenea afinitate diferita pentru

aminoacizii testati, acidul L-aspartic si L-cisteina, datorita gruparilor functionale

diferite implicate in legaturile ce se formeaza intre suport si aminoacid.

Bibliografie

1. Z. Strnad, Glass–Ceramic Materials, Elsevier, Amsterdam, 1986. 2. R. Müller, R. Hiergeist, H. Steinmetz, N. Aqoub, M. Fujisaka, W. Schüppel,

J. Magn. Magn. Mater., 201 (1999) 34. 3. P. A. Mariño-Castellanos, J. C. Somarriba-Jarque, J. Anglada-Rivera,

Physica B 362 (2005) 95

57

4. D. D. Zaitsev, P. E. Kazin, A. V. Garshev, Yu. D. Tret’yakov, and M. Jansen, Inorg. Mater., 40 (2004). 881

5. Y.-K. Lee and S. Y. Choi, J. Am. Ceram. Soc. 79 (1996) 992. 6. P. Görnert et al., IEEE Trans. Magn. 26 (1990) 12

7. N. Rezlescu, E. Rezlescu, P. Pasnicu, M.L. Crans, J. Magn. Magn. Mater. 131 (1994) 274.

8. B. T. Shirk, W. R. Buesseln, J. Am. Ceram. Soc. 53 (1970) 192.

9. W. J. S. Blackburn, B. P. Tilley, J. Mater. Sci. 9 (1974) 1265. 10.Th. Klupsch, E. Steinbeiss, R. Müller, C. Ulbricht, W. Schüppel, H.

Steinmetz, T. Höche, J. Magn. Magn. Mater. 196&197 (1999) 264. 11.Tetsuaki Nishida, Shiro Kubuki, Morihiro Shibata, Yonezo Maeda and

Toyomi Tamaki , J. Mater. Chem., 7 (1997) 1801

12.R. Müller and W. Schüppel, J. Magn. Magn. Mater., 155 (1996) 110 13.M. Pal, P. Brahma, D. Chakravorty, D. Bhattacharyya, H. S. Maiti,

Nanostructured Materials 8, (1997) 731 14.G. J. Chen, L. Y. Jian, Y. S. Chang, C. Y. Chung and Y. L. Chai, J..Cryst.

Growth, 277 (2005), 457

15.G. J. Chen, H. M. Lee, Y. S. Chang, Y. J. Lin, Y. L. Chai, J. Alloys Comp. 388 (2005) 297

16.D. D. Zaitsev, P. E. Kazin, Yu. D. Tret'yakov, Yu. V. Maksimov, I. P. Suzdalev and M. Jansen, Inorg. Mater. 40 (2004) 1111

17.A. Paul, R.W. Douglas, Phys. Chem. Glasses 6 (1965) 207. 18.H.V. Lauer Jr., R.V. Morris, J. Am. Ceram. Soc. 60 (1977)443. 19.G. Jeddeloh, Phys. Chem. Glasses 25 (1984) 163.

20.A. Paul, J. Non-Cryst. Solids 71 (1985) 269. 21.H.D. Schreiber, S.J. Kozak, R.C. Merkel, G.B. Balazs,P.W. Jones, J. Non-

Cryst. Solids 84 (1986) 186. 22.K. Takahashi, Y. Miura, J. Non-Cryst. Solids 80 (1986) 11. 23.A. Sasahira, T. Yokokawa, Electrochim. Acta 30 (1985)441.

24.M. Maric, M.P. Brungs, M. Skyllas-Kazacos, Phys. Chem.Glasses 30 (1989) 5.

25.C. Montel, C. Rüssel, E. Freude, Glastech. Ber. 61 (1988)59. 26.C. Rüssel, E. Freude, Glastech. Ber. 63 (1990) 149. 27.E. Freude, C. Rüssel, Glastech. Ber. 63 (1990) 193.

28.M. Zink, C. Rüssel, H. Müller-Simon, K.W. Mergler,Glastech. Ber. 65

(1992) 25.

29.C. Rüssel, Glastech. Ber. 66 (1993) 93.

30.R. Pascova, C. Rüssel, Glastech. Ber. Glass Sci. Technol.67C (1994) 93.

31.H. Müller-Simon, K.W. Mergler, Glastech. Ber. Glass Sci.Technol. 68

(1995) 273.

32.O. Claußen, C. Rüssel, Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100(1996) 1475; 69

(1996) 95.

33.C. Rüssel, Glastech. Ber. Glass Sci. Technol. 70 (1997) 17.

34.H. Khedim, R. Podor, C. Rapin and M. Vilasi, J. Am. Ceram. Soc. 91

(2008) 3571.

35.R. Harizanova, G. Volksch and C. Russel, J. Mater. Sci. 45 (2010) 1350.

58

36.R. Muller, J. Eur. Ceram. Soc. 19 (1999) 1547.

37.R. D. Rawlings, Glass-Ceramic Materials-Fundamentals and Applications

Series of Monographs on Material Science, Engineering and Technology,

Mucchi Editore, Modena, 1997, pp. 115-133.

38.R. A. Brand, Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B 28, (1987) 398

39.D.D. Zaitsev, S.E. Kushnir, P.E. Kazin, Yu. D. Tretyakov and M. Jansen, J.

Magn. Mag. Mater. 301, (2006) 489.

40.M. Bałanda, A. Wiecheć, D. Kim, Z. Kąkol, A. Kozłowski, P. Niedziela, J.

Sabolb, Z. Tarnawski, and J.M. Honig, Eur. Phys. J. B 43 (2005) 201

41.J. L. Dormann, D. Fiorani, and E. Tronc, J. Magn. Magn. Mater. 202 (1999)

251

42.W. F. Brown Jr., J. Appl. Phys. 39 (1968) 993

43.US patent 4 233 169

44.C. R. M. Grovenor, L. Goodsir, C. J. Salter, P. Kovac, and I. Husek,

Supercond. Sci. Technol. 20, (2004) 479

45.A. Snezhko, T. Prozorov, and R. Prozorov, Phys. Rev. B 71 (2005) 024527

46.F. Dumitrache, I. Morjan, R. Alexandrescu, R. E. Morjan, I. Voicu, I.

Sandu, I. Soare, M. Ploscaru, C. Fleaca, V. Ciupina, G. Prodan, B. Rand,

R. Brydson, and A. Woodword, Diamond & Rel. Mater. 13, 362 (2004)

47.D.-X. Chen, J. Nogues, and K. V. Rao, Cryogenics 29, 800 (1989)

48.M. Bosnes, D. Arne, A. Rian, L. Korsnes, F. Larsen, "Magnetic separation

in molecular biology, Scientific and clinical application of magnetic

carriers, Plenum Press, New York, 269-85 (1997).

49.J. Oster, J. Parker, L. A. Brassard, J. Magn. Mag. Mater. 225, (2000) 145.

50.A. Elaissari, M. Rodrigue, F. Meunier, C. Herve, J. Magn. Mag. Mater. 225

(2001) 127.

51.Ugur Tamer, Y. Gundogdu, I. Hakkı Boyacı, K. Pekmez, J. Nanopart. Res.

12 (2010) 1187.

52.W.S. Seo, J.H. Lee, X.M. Sun, Y. Suzuki, D. Mann, Z. Liu, M. Terashima,

P.C. Yang, M.V. Mcconnell, D.G. Niohimura, H.J. Dai, Nat. Mater 5 (2006)

971.

53.J.H. Lee, Y.M. Huh, Y.W. Jun, J.W. Seo, J.T. Jang, H.T. Song et al),. Nat

Med 13 (2007) 95.

54.C. Chouly, D. Pouliquen, I. Lucet, J.J. Jeune, P. Jallet J Microencapsul 13

(1996) 245.

55.G. Storm, S.O. Belliot, T. Daemen, D.D. Lasic Adv Drug Deliv Rev 17

(1995) 31.

56.Y. Zhang, N. Kohler, M.Q. Zhang Biomaterials 23 (2002) 1553–1561.

57.M. Yamazaki, M. Ito Biochemistry 29 (1990) 1309.

58.K.J. Widder, A.E. Senge, D.F. Ranney, Cancer. Res. 40 (1980) 3512.

59

59.K. Subramani, H. Hosseinkhani, A. Khraisat, M. Hosseinkhani, Y. Pathak,

Curr Nanosci 5 (2009) 134.

60.H. Xu, L. Cui, N. Tong, H. Gu, J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 15582.

61.F.C. Meldrum, B.R. Heywood, S. Mann, Science 257(5069) (1992)522

62.T. Tanaka, T. Matsunaya Anal Chem 72 (2000) 3518.

63.A.K. Gupta, M. Gupta Biomaterials 26 (2005) 3995.

64.L.O. Brown, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 12384

65.L.O. Brown, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 882.

66.M.G. Warner, S.M. Reed, J.E. Hutchison, Chem Mater 12 (2000) 3316.

67.W.W. Weare, S.M. Reed, M.G. Warner, J.E. Hutchison, J. Am. Chem. Soc.

122 (2000) 12890

68.T. Yonezawa, K. Yasui, N. Kimizuka, Langmuir 17 (2001) 271.

69.M.Q. Zhao, L. Sun, R.M. Crooks, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 4877.

70.J. Jeong, T.H. Ha, B.H. Chung, Anal. Chim. Acta. 569 (2006) 203.

71.A.T. Heitsch, D.K. Smith, R.N. Patel, D. Ress, B.A. Korgel, J. Solid State

Chem. 181 (2008) 1590.

72.Takuya Kinoshitaa, S. Seinoa, Y. Mizukoshib, T. Nakagawaa, T. A.

Yamamotoa, J. Magn. Mag. Mater. 311 (2007) 255–258.

73.A. Taylor, Y. Krupskaya, S. Costa, S. Oswald, K. Krämer, S. Füssel, R.

Klingeler, B. Büchner, E. Borowiak-Palen, M. P. Wirth, J. Nanopart. Res.

12 (2010) 513

74.S.K. Lim, K.J. Chung, Y-H. Kim, C.K. Kim, C.S. Yoon, J. Colloid. Interface

Sci. 273 (2004) 517.

75.A-H. Lu, E.L. Salabas, F. Schüth, Angew. Chem. Int. Ed. 46 (2007)1222.

76.B. Ando, A. Ascia, S. Baglio, N. Pitrone, Development of novel ferrofluidic

pumps. In: Engineering in Medicine and Biology Society EMBS 2006. 28th

Annual International Conference of the IEEE, pp 2828–2831.

77.C.T. Yavuz, J.T. Mayo, W.W. Yu, A. Prakash, J.C. Falkner, S. Yean, L.

Cong, H.J. Shipley, A. Kan, M. Tomson, D. Natelson, V.L. Colvin, Science

314 (2006) 964.

78.V.I. Shubayev, T.R. Pisanic, S. Jin, Adv. Drug. Deliv. Rev. 61 (2009) 467.

79.V. Balan, Teza de Doctorat-“Micro si nanoparticule magnetice

functionalizate cu aplicatii in detoxifierea sangelui”, Vera Balan -2011).

80.V. Bălan, A. M.Vasi, M. Butnaru, V. Badescu, M. I. Popa, L. Verestiuc, 4th

International Conference Biomaterials, Tissue Engineering and Medical

Devices, ISSN 2069-0193, Sinaia, Romania, 23-25 Septembrie 2010.

81.L. Tcacenco, I. Lupescu, E.-D. Teodor, D. Pomponiu, Brevet de inventie

RO 122364 B1; „Procedeu de imobilizare a tripsinei pe suport

biopolimeric”

82.H.H Weetall, Appl. Biochem. Biotechnol. 41 (1993) 157.

83.R. A. Sheldon, Enzyme Immobilization : The quest for optimum performance. Reviews, 2007.

60

84.A.E. David, Lucrare de dizertatie: Immobilization of enzymes on nanoporous silica compozites, 2004.

85.L. Tcacenco, I. Lupescu, C. Stan, E. Teodor, Brevet de invenţie RO 122194 B1 „Compozit vitroceramic si procedeu de imobilizare a acidului L-

aspartic si L-asparaginaza “ 86.R. Weissledel, A. Moure, U. Mahmood, R. Bhorade, M. Benveniste, E.

Chiocca et al., Nat. Med. 6 (2000) 351

87.W.L. Zhou, E.E. Carpenter, J. Lin, A. Kumbhar, J. Sims, C.J. O’Conner, Eur. Phys. J. D 16 (2001) 289.

88.U.O. Häfeli, G.J. Pauer, J. Magn. Magn. Mater. 194 (1999) 76. 89.M. Shinkai, J. Biosci. Bioeng. 94 (2002) 606. 90. S. Mornet, A. Vekris, J. Bonnet et al., Mater. Lett. 42 (2000) 183.

91.Q.A. Pankhurst, J. Connolly, S.K. Jones, et al., J. Phys. D 36 (2003) 167 92.M.C. Daniel, D. Astruc, Chem. Rev. 104 (2004) 293.

93.K. Sato, K. Hosokawa, M. Maeda, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003), 8102. 94.R.G. Nuzzo, D.L. Allara, J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 4481. 95.C.A. Mirkin, R.L. Letsinger, R.C. Mucic et al., Nature 382 (1996) 607

96.S. Seino, T. Kinoshita, Y. Otome, et al., Chem. Lett. 32 (2003) 690. 97.Y. Mizukoshi . S. Seino, K. Okitsu, et al, Ultrason. Sonochem.12 (2005)

191 98.D.L. Graham, H.A. Ferreira, P.P. Freitas, Angrew Chem. Int. Ed. 46 (2004)

4909 99.T. Yoshino, H. Hirabe, M. Takahashi, M. Kuhara, H. Takeyama, T.

Matsunaga, Magnetic Cell Separation Using Nano-Sized, Bacterial

Magnetic Particles With Reconstructed Magnetosome Membrane, Biotechnology Bioengineering, 2008.

100. M. Cobbold, N. Khan, B. Pourgheysari, S. Tauro, D. McDonald, H. Osman, M. Assenmacher, L. Billingham, C. Steward, C. Crawley et al.. J. Exp. Med. 202 (2005) 379.

101. Z. Dembic, J.A. Rottingen, J. Dellacasagrande, K. Schenck, B. Bogen, Blood 97 (2001) 2808

102. M. Kuhara, H. Takeyama, T. Tanaka, T. Matsunaga, Anal. Chem. 76 (2004) 6207

103. S. Yean, L. Cong, C.T. Yavuz, J.T. Mayo, A.T. Kam, V.L. Colvin, M.B.

Tomson, Magnetite Nanoparticles as Adsorbents for Arsenic Removal and Magnetic Separation

104. Y. Wang, F. Caruso, Chem. Commun. 2004, 1528 – 1529

Diseminare

1. V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, S. Popa, I. Pasuk, C. Ghica, E. Sandu,

Structure and Magnetic Properties of Nanosized Magnetite Obtained by Glass Recrystallization, Journal of Nanoscience and Nanothechnology (accepted)

2. V. Sandu, E. Cimpoiasu, G. Aldica, S. Popa, E. Sandu, N. Hurduc, and I. Nor,

Fabrication and Superconducting Properties of MgB2 Doped with Polysiloxane

61

Based Copolymers, IEEE transactions on Applied Superconductivity, vol. 21, issue 3(3), 2631-2634 2011

3. V. Sandu, G. Aldica, S. Popa, P. Badica, E. Cimpoiasu, F. Dumitrache, E. Sandu, Transport Properties of Superconducting MgB2 Composites with Carbon-

Encapsulated Fe Nanospheres, acceptat la J. Applied Physics 4. V. Sandu and I. Ivan On the scaling of pinning force in ceramic MgB2 acceptat la

J. Physics: Conf. Series

5. E. Berteanu, V. Sandu, S.M. Nicolescu, M.I. Enache, A.L. Zuav, L. Tcacenco, The study of some enzymes immobilization on magnetic nanoparticles” International

Journal of Nano and Biomaterials (in curs de redactare). 6. V. Sandu, M.S. Nicolescu, S. Popa, V. Kuncser, N. Aldea, E. Sandu Effect of P2O5

on the Growth of Nanosized Magnetite in a Glassy Matrix, prezentata la

International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT) – Singapore, 26th June/1st July 2011

7. V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, I. Ivan, E. Sandu, Magnetite in glassy Matrix, The 18th International Conference on Compozite Materials (ICCM18) August 21-26, 2011, Jeju Island, Korea

8. V. Sandu, Advanced Superconducting Ceramics by Spark Plasma Sintering, IUPAC 7th International Conference on Novel Materials and Synthesis (NMS-VII)

& 21st International Symposium on Fine Chemistry and Functional Polymers (FCFP-XXI) in Shanghai, China on 16th~21st October

9. E. Berteanu, V. Sandu, S. M. Nicolescu, L. Tcacenco, Studiul imobilizarii lipazelor pe nanoparticole magnetice, Simpozionului Naţional cu Participare Internaţională - PRIORITĂŢILE CHIMIEI PENTRU O DEZVOLTARE DURABILĂ

PRIOCHEM, ediţia a VII-a, 27-28 octombrie 2011, Bucureşti 10.F.Tolea, M. Tolea, M. Sofronie, A.D.Crisan, A. Birsan, M.Valeanu, Influence of

thermal treatments on the martensite-austenite transformation in Ni-Fe-Co-Ga

melt-spun ribbons, First Central and Eastern European Conference on Thermal

Analysis and Calorimetry (CEEC-TAC1) Craiova, Romania 7th to the 10th of

September 2011

Date despre conferintele la care s-a participat:

1. International Conference on Materials for Advanced Technologies or ICMAT

(ICMAT) – Singapore, 26th June/1st July 2011.

Lucrare prezentata:V. Sandu, M.S. Nicolescu, S. Popa, V. Kuncser, N. Aldea, E. Sandu Effect of P2O5 on the Growth of Nanosized Magnetite in a Glassy Matrix.

Conferinta a avut urmatoarele sectiuni:Nanoscience and technology

(Nanostructured Oxides, Interfaces, Heterostructures and Devices, Synthesis and Architecture of Nanomaterials, Graphene: Calling all Chemists; Toxicology of Engineered Nanomaterials; NEMS/MEMS and microTAS; Nanodevices and

Nanofabrication; Semiconductor Nanowires and Heterostructures: Synthesis, Properties and Multifunctions; Nanoscale Patterning, Assembly, and Surface

Modification; Nanotechnology with Soft Matter; Memory, Nanomagnetics, Materials and Devices); Energy and the environment (Nanonets and Nanomaterials for

http://www.mrs.org.sg/icmat2011/s1.htm

















62

Energy Harnessing and Storage; Advanced Materials for Energy Storage Systems - From Fundamentals to Applications; Photovoltaic Materials and Devices; Membrane Materials and Technologies for Emerging Applications); Functional materials

(Interfacial Chemistry and Engineering and Their Applications for Molecular and Organic Electronics; Organic, Flexible, and Printed Electronics; Metamaterials;

Advanced Structural and Functional Materials for Protection; Compozites and Nanocompozites; 3D TSV Process and Design Challenges; Reliability and Variability of Emerging Devices for Future Technologies and ULSI Circuits and Systems);

Bio/soft materials (Advanced Biomaterials for Delivery of Therapeutics; Biomaterials and Tissue Engineering; Sustainable Biobased Polymers); Imaging

(Frontiers in Optical Bio-imaging and Microscopy; Nanoscale Imaging, Fabrication and Materials Modification Using Ion Beams; Nanophotonics and Imaging); Crystal growth and crystal technology

La aceasta conferinta am fost contactati de Prof. Liangliang Li de la departamentul

de Stiinta Materialelor si inginerie al Universitatii Tsinghua din Beijing care s-a arata

interesat de o colaborare in domeniul nanostructurilor magnetice pe baza de

magnetita.

2. The 26th International conference on Low Temperature Physics. A fost tinuta in

Beijing, China, 10-17 August 2011.

Lucrare prezentata: V. Sandu and I. Ivan On the scaling of pinning force in ceramic

MgB2 acceptat la J. Physics: Conf. Series Conferinta a avut 5 linii directoare : A. Quantum Gases, Fluids and Solids; B.

Superconductivity; C. Magnetism and Quantum Phases; D. Electronic Quantum

Transport in Condensed Matter; and E. Cryogenic Techniques and Applications.

La aceasta conferinta am fost contactati de Dr. Alexei Suslov de la Florida State

University care ne-a solicitat probe pentru masuratori la de absorbtie de ultrasunete

in campuri magnetice intense la Talahassee.

3. 18th International Conference on Compozite Materials (ICCM18) August 21st- 26th

Jeju, Korea

Lucrare prezentata: V. Sandu, M. S. Nicolescu, V. Kuncser, I. Ivan, E. Sandu,

Magnetite in glassy matrix, Conferinta a avut cu urmatoarele obiective: Active and Passive Health Monitoring;

Applications of Composites, Bio-inspired Composzites; Biomedical Compozites;

Carbon and Ceramic Matrix Composites; Damage and Fracture; Durability and

Aging; Emerging NDE Technology and Reliability Issues; Energy Technology

Applications; Environmental Awareness and Life Cycle Analysis; Experimental

Techniques; Fibres, Matrices and Interfaces; General Industrial Applications; Green

Compozites; Health Monitoring; Impact and Dynamic Response; Information

Technology Applications; Infrastructure; Interlaminar reinforcements; Joints and

Bearing Behavior; Life Cycle Analysis and Sustainability; Low Cost Technologies;

Mechanical and Physical Properties; Metal Matrix Composites; Multi-functional























63

Composites; Nanocomposites; NDE Technologies.

La aceasta conferinta si-a manifestat interesul pentru probele de magnetita Prof. .

Hyungsun Kim de la Inha University din incheon seul, corea. Urmand sa stabilim o

modalitate de colaborere.

3. IUPAC 7th International Conference on Novel Materials and Synthesis (NMS-VII)

& 21st International Symposium on Fine Chemistry and Functional Polymers (FCFP-

XXI), Shanghai, China on 16th~21st October, 2011 Topics: biomaterials, functional

polymers, energy storage and conversion materials, nano materials, ceramic

materials, metallic materials, other novel materials and application of neutron

scattering.

Lucrare prezentata V. Sandu, Advanced Superconducting Ceramics by Spark Plasma

Sintering,

4. First Central and Eastern European Conference on Thermal Analysis and

Calorimetry (CEEC-TAC1) Craiova, Romania 7th to the 10th of September 2011

Lucrare prezentata: F.Tolea, M. Tolea, M. Sofronie, A.D.Crisan, A. Birsan,

M.Valeanu, Influence of thermal treatments on the martensite-austenite

transformation in Ni-Fe-Co-Ga melt-spun ribbons.

Topics: Kinetics and catalysis; Thermophysical properties and thermal reactivity of

solids. Nanomaterials; Metals, alloys, intermetallics & high temperature materials;

Thermally stimulated processes in ceramics; from electroceramics & magnetic

materials to thermoelectrics; Functional soft inorganic, organic and macromolecular

materials (polymers, complex precursors, dyes, textiles, etc.); Thermal

investigation of thin films and other minute materials; Thermochemistry and

calorimetry; Thermodynamics of biomolecules; from stability to interactions;

Metastability in polymers; Combustion, fuels & biofuels. Alternative sources for

energy; Materials for energy conversion and storage; Energetic materials, thermal

hazards & fire safety; Advanced materials processing and applied thermal

engineering; Composites in extreme conditions and environments; Instrumentation

and theory; coupled, complementary and alternative techniques: sample controlled

thermal analysis, microcalorimetry, emanation thermal analysis, nanoTA, PulseTA,

laser pyrolysis, thermochromatography, etc.; Thermal analysis and calorimetry in

life sciences, natural products, fertilizers, soil science, geosciences, pharmaceutics,

forensics and arts.

5. Simpozionului Naţional cu Participare Internaţională - PRIORITĂŢILE CHIMIEI PENTRU O DEZVOLTARE DURABILĂ PRIOCHEM, ediţia a VII-a, 27-28 octombrie 2011, Bucureşti

Lucrare prezentata: E. Berteanu, V. Sandu, S. M. Nicolescu, L. Tcacenco, Studiul imobilizarii lipazelor pe nanoparticole magnetice,

RAPORTARE STIINTIFICA - lab20.infim.rolab20.infim.ro/magbiof/docs/RSTFaza4.pdf · RAPORTARE...

Documents

Transcript of RAPORTARE STIINTIFICA - lab20.infim.rolab20.infim.ro/magbiof/docs/RSTFaza4.pdf · RAPORTARE...