PREGTIREA PREPARATELOR PENTRU TEHNICILE DE MICROSCOPIE

Pregtirea preparatelor pentru tehnicile de microscopieDr. Mihnea I. Nicolescu2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti11. MicroscopieOptic (MO)2. MicroscopieElectronic (ME)2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiObiectivul lucrrii practiceCunoaterea etapelor de pregtire a preparatelor pentruhttp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b1/Optical_microscope_nikon_alphaphot_%2B.jpg/220px-Optical_microscope_nikon_alphaphot_%2B.jpg

http://research.stowers-institute.org/microscopy/external/Technology/Microscopy/index.html

microscop optic microscop electronic ochiul uman Puterea de rezoluie2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti3

Cerine necesare pentru o examinare precis: Celulele i celelalte elemente prezente n esut s fie pstrate n condiii ct mai apropiate de condiiile lor naturale (FIXARE) Preparatul s fie transparent, subire, plat Diferitele componente s fie colorate diferit (COLORARE)Pregtirea preparatului pentru microscopie optic2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiS permit trecerea luminiiS fie monostrat

4

Posibiliti de preparare seciuni in toto (structuri/organisme mici, suficient de subiri pt. a fi ntinse pe o lam) zdrobire (pt. studiul coninutului celulei) frotiuri (celule suspendate n fluid) culturi celularePregtirea preparatului pentru microscopie optic2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiWhole-mounts, where an entire organism or structure is small enough or thin enough to be placed directly onto a microscope slide (e.g. a small unicellular or multicellular organism or a membrane that can be stretched thinly on to a slide)Squash preparations, where cells are intentionally squashed or crushed onto a slide to reveal their contents (e.g. botanical specimens where cells are disrupted to reveal chromosomes)Smears, where the specimen consists of cells suspended in a fluid (e.g. blood, semen, cerebro-spinal fluid, or a culture of microorganisms), or where individual cells have been scraped brushed or aspirated (sucked) from a surface or from within an organ (exfoliative cytology). Smears are the basis of the well-known Pap test that is used to screen for cervical cancer in women.Sections, where specimens are supported in some way so that very thin slices can be cut from them, mounted on slides, and stained. Sections are prepared using an instrument called a microtome.

5Preparatul microscopic permanentModalitatea de examinare a unor celule, fragmente de esut sau organ, crora li s-au suprimat procesele vitale prin fixare

Permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale celulelor i a modului lor de organizare2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiPreparatul microscopic permanentUn preparat microscopic este alctuit din:

obiect de examinat (subire i transparent)

mediu de montare (transparent)

suport de montare (lam i lamel/gril)

http://www.agtcbioproducts.com/images/slide.jpg2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiPreparatul microscopic permanentScopul realizrii de a conserva - structurile celulare i - raporturile dintre ele pe un timp nelimitat.Este folosit n:-clinic -laboratorul de anatomie patologic-medicin legal-cercetare-scop didactic2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiEtapele obinerii preparatului microscopic permanent1. Recoltare2. Fixare3. Includere4. Secionare5. Colorare sau impregnare/contrastare6. Montare (ntre lam i lamel/pe gril)

7. Etichetare2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiMEMO

1. RECOLTAREA= Operaia prin care fragmentul de esut/organ este prelevat de la om, animal viu sau de la cadavruRECOLTAREA BIOPSIC

Se recolteaz de la om sau animal viu i se practic n scop diagnostic.

Se realizeaz prin :raclare puncie-biopsieaspiraie cu ac finintervenie chirurgicaldimensiunea pieselor s nu depeasc 5 mm

instrumentele bine ascuite pentru a evita zdrenuirea i pierderea paralelismului dintre planuri

adecvat n funcie de tipul organului; se vor evita modificrile de volum, form i relief2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

RECOLTAREA NECROPSIC

recoltarea de la cadavrele umane se practic n laboratoarele de anatomie patologic i medicin legal cu scopul de a confrunta datele de anatomie clinic i tanatogenetice

dup sacrificarea animalului, n scop de cercetare sau didactic

1. RECOLTAREA(ct mai aproape de momentul decesului) pentru a evita procesele de autoliz2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Recoltarea biopsicraclare B. puncie biopsie

C. aspiraie cu ac fin

D. intervenie chirurgicalbiopsie incizionalbiopsie excizional

http://img.webmd.com/dtmcms/live/webmd/consumer_assets/site_images/articles/health_tools/eczema_overview_slideshow/photolibrary_rm_photo_of_hand_with_eczema.jpghttp://www.beliefnet.com/healthandhealing/images/si55551723.jpghttp://www.glowm.com/resources/glowm/graphics/figures/v1/0270/016f.jpg

ACDB

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucuretietap critic pentru un bun preparatproces fizic sau chimic prin care:sunt oprite rapid procesele vitale (celulare), pstrndu-se cu alterri minimevolumul, forma, relieful i raporturile moleculare (n structuri/ultrastructuri) i spaiale (ntre structuri/ultrastructuri) Prin fixare urmrim:Conservarea esuturilor Prevenirea pierderii de constitueni celulariCreterea diferenierii optice a structurilor celulare Mrirea consistenei esuturilor n scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape i mai ales pentru secionare2. FIXAREAhttp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0004_d0f91f3944.jpg2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Fizic: criofixareChimic: alcool metilic, aceton,formolFixare dublFixare cu glutaraldehid Stabilizeaz proteinelePostfixare cu tetroxid de osmiuStabilizeaz lipidele i proteinele

2. FIXAREA2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiMOME- etapa care asigur condiii optime pentru secionarea pieselor - precedat de deshidratare n soluii de alcool de concentraii crescndeCea mai folosit mas de incluziune: parafinaRini epoxidice (epon)

3. INCLUDEREAhttp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Embedding_028_sized_31fe12192c.jpghttp://www.leicabiosystems.com/typo3temp/pics/Sci_Lab_Histo_Lead0008_03_a9cda89157.jpg2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiMOMEcu microtomul (aprox. 5m)

cu ultramicrotomul (40-100nm)

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti4. SECIONAREAMOME

Eantion de esutn bloc de epon, fixatn menghina ultramicrotomului2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti17

Bac cu apCuitde sticl(Pentru recoltarea seciunilor)2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti18

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti19- creterea contrastului ntre elementele tisulare sau celulare cu ajutorul coloranilorPrin metode compatibile cu metoda de fixare Pot fi metode universale (HE) sau specifice esutului studiat (Nissl)Contrastare n soluii de metale grele (acetat de uranil i citrat de plumb)2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti5. COLORAREAMOME- permite conservarea specimenelor pentru ct mai mult timpntre lam i lamel, n diferite medii de montare, iniial fluideProtejarea seciunilor fragile de eventualele deteriorri Conservarea coloraiei i asigurarea unui mediu optic omogen i transparent necesar examinrii microscopice

pe grile de cupru

2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti6. MONTAREAMOME

Seciuni pe gril2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti227. ETICHETAREAPe fiecare lam se noteaz:

tipul celular/tisularsursa de recoltare fixatorulmetoda de coloraredata realizrii preparatului2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila BucuretiPregtirea preparatului pentru microscopie electronic de baleiaj/scanning (SEM)Pentru o imagine convenional de SEM, suprafaa probelor de analizat trebuie s fie conductiv electric i s fie asigurat mpmntarea pentru a mpiedica acumularea ncrcrii electrostatice a acestei suprafee2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti

Probele biologice sunt acoperite cu un strat foarte subire de materiale conductive (Au, Au/Pd, Pt, Os, Ir, Tu, Cr). Exist tehnici de SEM care permit examinarea probelor fr acoperire ESEM (Environmental SEM).mtse.unt.edu/FACULTY/bgorman/sample%20prep.pdfProblem: e- accelerated at your insulating sample do not conduct away from wherethey are absorbed results in an effect called charging, e.g. there is a buildup of electric charge inone spot on your sample charging induces a static electric field on your sample which deflects secondaryelectrons and causes strange contrast which is inconsistent with your actualsample Solution: coat your sample with a small amount of conductive material to carryaway the charging electrons materials: metals (Au, Au/Pd, Pt, Cr); carbon need to keep the material as thin as possible and keep the coating layer particlesas small as possible in order to accurately image your sample surface other advantages: conductive materials give a high secondary electron yield -more SE signal, better images

http://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=10&cad=rja&ved=0CIIBEBYwCQ&url=http%3A%2F%2Fmtse.unt.edu%2FFACULTY%2Fbgorman%2Fsample%2520prep.pdf&ei=7AE1Uc_kEoG3hQfSkoDgAQ&usg=AFQjCNFhRFEgEDpmrJHrVas0GMylhxuJlQ&bvm=bv.43148975,d.ZG424Pregtirea preparatului pentru microscopie electronic de baleiaj/scanning (SEM)Fixare (fizic prin cldur sau ngheare / chimic)Deshidratare (soluii de alcool de % diferite)MontareAcoperire (nvelire) cu metale nalt conductiveExaminare2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureticomponentele obiectelor neomogene se difereniaz prin contrast 25CONCLUZIEMicroscopia optic prezint structura celulei i a esuturilor.Pentru completarea informaiilor obinute, se utilizeaz microscopia electronic, pentru descifrarea ultrastructurii acestora.2013 Disciplina de medicin celular i molecular - medicina dezvoltrii umane, UMF Carol Davila Bucureti