I. Departament Culturi de Celule, Microscopie Digitala si ......Culturi de celule, Microscopie...

1

RAPORT

Catre Academia de Stiinte Medicale privind activitatea de cercetare a Institutului

Regional de Oncologie (IRO)-TRANSCEND Iasi, 2020

Obiectivul general al cercetarii IRO: Cercetare oncologica translationala

Finalitate: Taxonomia moleculara a tumorilor cu prevalenta ridicata. Identificarea de leziuni

moleculare cu potential teranostic de monitorizare si interventie pe baza heterogenitatii

tumorale si subtipurilor evolutive a pacientilor incadrati diagnostic in aceiasi localizare

neoplazica.

CENTRUL DE CERCETARE FUNDAMENTALĂ SI DEZVOLTARE EXPERIMENTALĂ

IN MEDICINĂ TRANSLATIONALĂ-TRANSCEND, realizat in cadrul Programului

Operational Cresterea Competitivitatii Economice, Axa prioritară 2 – Competitivitate prin

cercetare, dezvoltare tehnologica si inovare, Domeniul major de interventie 2.2 – Investitii în

infrastructura de CDI, Operatiunea 2.2.1: Dezvoltarea infrastructurii CD existente si crearea de

noi infrastructuri CD în valoare de 50.000,00 mii lei, a implinit, la sfarsitul anului 2018, 29 luni

de activitate.

Activitatea de cercetare a centrului TRANSCEND se desfasoara pe doua nivele: medicina

moleculara si medicina nucleara.

Nivelul de medicina moleculara este constituit dintr-un flux de activitati desfasurate in cadrul

urmatoarelor departamente:

Culturi de celule, Microscopie digitala, si Tissue Array, Proteomica, Biologie si genetica

moleculara, Bioinformatica si simulare moleculara, Citometrie in flux si Imunofenotipare

Nivelul de medicina nucleara este reprezentat de: Unitatea de sinteza si cercetare radiotrasori,

Unitatea de radiofarmacie si Unitatea PET-CT diagnostic translational.

La acestea se adauga Biobanca criogenica pentru stocarea tesuturilor, celulelor si plasmei.

I. Departament Culturi de Celule, Microscopie Digitala si Tissue Array

Echipamente utilizate in tehnicile de Culturi de Celule, Microscopie Digitala si

Tissue Array din cadrul proiectelor de cercetare desfasurate in Transcend 1. Incubatoare pentru culturi celulare Sartorius Stedim biotech si ThermoScientificl; 2. Hote BIOAIR s@feflow 1.2 and Flores Valles Fume Cupboard model

VA150960ADVC+M; 3. Hote chimice pentru imunohistochimie BIOAIR safehood 120; 4. Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R; 5. Microscop Zeiss AXIO Observer.Z1, prevazut cu obiective 5x, 10x, 20x, 40x si 63x,

camera color Baumer, camera monocroma pentru fluorescenta Hamamatsu, filtre

Chroma 69000, 89401, 89901, 49006 si 49007precum si softuri de achizitie si analiza a

imaginilor furnizate de TissueGnostics; 6. Sistem de Tissue Microarray Galileo TMA CK 4500; 7. Microtoame CR-601ST; 8. Baie de flotatie pentru imunohistochimie FTB 35 Medite; 9. Modul de pretatare a sectiunilor in timpul procesului de colorare

imunohistochimica Dako PT Link PT20027; 10. Agitator magnetic cu incalzire DLAB MS-H280-PRO; 11. Congelator –80⁰C – ThermoScientificl;

mailto:s@feflow

12. Congelator –150⁰C – ThermoScientific; 13. Aparat electroforeză verticală PowerPac200 – Biorad; 14. Sistem migrare si transfer proteine Biorad; 15. Schenar de vizualizare proteine (pe membrana) C-Digit LI-COR; 16. Etuva pentru uscare si sterilizare uscata Biobase; 17. Cititor de placi FilterMax F5, Sunnyvale, CA, USA.

Lista detaliata a echipamentelor se gaseste pe ERRIS: https://erris.gov.ro/Center-of-Fundamental-Resear

Tehnici-suport practicate in departamentul de Culturi de Celule, Microscopie

Digitala si Tissue Array: culturi celulare (monoculturi si coculturi in sisteme 2D si 3D)

procesarea probelelor biologice prin derularea/realizarea tehnicilor de tissue microarray,

imunohistochimie si imunofluorescenta si achizitia digitala prin microscopie a probelor,

precum si analiza ulterioara a datelor obtinute prin microscopie.

Personal angajat cercetare:

Crina E Tiron, PhD, Msc, CSIII (Cercetator stiintific III)

Adrian Tiron, PhD, Msc, CSIII (Cercetator stiintific III)

Paula Postu, PhD, Msc, AS (Asistent de cercetare)

Gabriel Luta, Msc, AS (Asistent de cercetare)

Mihail Butura, Msc, AS (Asistent de cercetare)

1. Desfasurarea etapei de lucru 2020 a proiectului “Platforme teranostice

antitumorale pe baza de carbon-dots si matrice polimerice din programul proiecte

complexe CDI Nr. 37PCCDI/2018”.

Coordonator echipa IRO: Crina Tiron

Personal implicat: Adrian Tiron, Florin Eloaie-Zugun, Butura, Mihail si Gabriel

Luta.

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 lucrare publicata si 1 lucrare

submisa si 2 manuscrise in lucru

LUCRARE PUBLICATA

NHF-derived carbon dots: prevalidation approach in breast cancer treatment - Crina Elena

Tiron1, Gabriel Luta1,+, Mihail Butura1,+, Florin Zugun-Eloae1,2, Corneliu S. Stan3, Adina Coroaba4, Elena-Laura

Ursu4, Gabriela Dumitrita Stanciu5, Adrian Tiron1,* * autor corespondent Adrian Tiron, + equal contributions, Sci

Rep. 2020; 10: 12662. Published online 2020 Jul 29. doi:10.1038/s41598-020-69670-z (Impact Factor: 4.1,

Q1: Zona Rosie)

În studiul de față am extins investigațiile cu privire la proprietățile antitumorale ale structurilor

pe baza de carbon preparate din precursorul N-hidroftalimidei (CD-NHF). Am evaluat efectul

CD-NHF asupra migrației și invaziei celulelor tumorale in vitro și impactul acestora asupra

progresiei tumorii utilizând un model in vivo. Mai mult, am investigat mecanismele moleculare

implicate în efectele antitumorale CD-NHF. Tumorile mamare in vivo au fost induse la șoareci

femele Balb / c prin injectarea celulelor 4T1 in glanda mamară. Tratamentul condiționat cu

CD-NHF a afectat semnificativ atât migrația, cât și invazia celulelor metastatice ale cancerului

de sân. Prezența CD-NHF în culturile de celule 3D a inhibat puternic fenotipul malign al

celulelor MDA-MB-231, 4T1 și MCF-7 în cultura 3D, rezultând colonii de cultură lipsite de

proiecții invazive și reducerea numarului de mamosfere. Important, creșterea tumorii mamare

și diseminarea metastazelor au fost reduse semnificativ in grupurile tratate cu CD-NHF și acest

fenomen fost corelat cu reducerea expresiei de Ki67 și HSP90. In concluzie, nanostructurile

CD-NHF oferă o perspectivă interesantă pentru îmbunătățirea rezultatelor tratamentului în

3

cancerul de sân.

LUCRARE SUBMISA Enhancing anti-tumoral potential of CD-NHF by modulating PI3K/Akt axis in

U87 ex vivo glioma model - Gabriel Luta 1,#, Mihail Butura 1,#, Adrian Tiron 1,*, Florin Zugun-

Eloae 1 and Crina Elena Tiron 1 1Regional Institute of Oncology, 2-4, General Henri Mathias Berthelot

Street, 700483, Iasi, Romania, # Equal contributions Correspondence: Adrian Tiron – submisa in jurnalul

Pharmaceutics 2020 În acest studiu, ne-am propus să sensibilizăm celulele de gliom U87 la tratamentul CD-

NHF prin inhibarea unor cai moleculare cheie. Unul dintre inhibitori, K252A, este un

inhibitor pan-Trk, precum și semnalizarea lor ulterioara, inclusiv PI3/Akt și Ca2 +/protein

kinaza II calmodulin-dependentă (CaMKII). Al doilea inhibitor, AktVIII, deși poate inhiba

toate cele 3 izoforme Akt, este mai specific pentru Akt1 și Akt2 și poate inhiba, de asemenea,

Ca2 +/protein kinaza dependentă de calmodulină Iα (CaMKIα). Luând în considerare

toxicitățile asociate inhibiției PI3K/Akt/mTOR și noile date care demonstrează metastazarea

crescută indusă de nanoparticule prin inducerea scurgerilor endoteliale, am testat concentrația

redusă atât a CD-NHF, cât și a inhibitorilor. Proprietățile antitumorale ale CD-NHF au fost

potențate de doze reduse de inhibitori K252A sau AKTVIII pentru a evita efectele secundare.

Mai important, această potențare a fost semnificativă chiar și la o concentrație redusă de CD-

NHF. Deși nu cunoaștem mecanismul exact al acțiunii CD-NHF, propunem o nouă strategie

pentru tratarea gliomului.

MANUSCRISE IN LUCRU pentru a fi submise spre publicare in anul 2021:

“Enhanced antitumoral effect of Carbon Dots NHF loaded in liposomes” - Corina-

Lenuta Savin*, Crina E.Tiron*, Catalina A. Peptu , Mihail Butura, Corneliu S. Stan, Gabriel Luta,

Adrian Tiron. Autor corespondent IRO: Adrian Tiron. * contributie egala In acest manuscris membrii echipelor partenere din proiect au sintetizat un tip de lipozomi in

care au fost incarcati Carbon Dots iar echipa IRO a evaluat actiunea lor pe diferite linii

celulare. Unii lipozomi au fost incarcati doar cu Carbon Dots iar altii si cu Doxorubicina pentru

a investiga in vitro imbunatatirea metodei de livrare a Carbon Dots si implicit reducerea

dozelor terapeutice folosite. Chimioterapia este o alegere de tratament comună pentru multe

tipuri de cancer și prezintă limitări critice (adică o lipsă de specificitate, efecte secundare toxice

și dezvoltarea rezistenței la medicamente). Lipozomii (LP) au apărut ca cele mai utilizate

sisteme nano-la scară ca eliberare de medicamente pentru terapia cancerului datorită

proprietăților farmacologice remarcabile, cum ar fi: biodegradabilitate, toxicitate redusă,

biocompatibilitate sporită. Am demonstrat recent că structurile de carbon preparate din N-

hidroxitftalimidă (CD-NHF) prezintă proprietăți antitumorale pe mai multe linii celulare

canceroase prin afectarea viabilității și a activității mitocondriale. În acest studiu, am explorat

lipozomii ca metodă de livrare in vitro pentru CD-NHF. CD-NHF încărcati în lipozomi

(Lps-CD-NHF) au redus semnificativ viabilitatea celulelor cancerului mamar și pulmonar la

doze mai mici comparativ cu structurile pe baza de CD-NHF neinclusi in lipozomi. Acest efect

a fost potențat în continuare de asocierea LPs-CD-NHF cu doxorubicina. Lipozomii incarcati

cu CD-NHF reduce expresia de AKT (1,2,3), mTOR și ERK - molecule cruciale implicate in

numeroase procese celulare. Rezultatele noastre in vitro arată că sistemul LP-CDots posedă

activități complexe și interesante de modulare a celulelor, relevante pentru controlul cancerului

și, de asemenea, potențiale pentru aplicare clinică.

Evaluarea in vitro si in vivo a platformelor teranostice pe bază de complecși

Carbon Dots – Mn; Autori: Gabriel Luta, Adrian Tiron, Gabriela Dumitrita Stanciu,

Cristina Uritu, Florin E. Zugun, Crina E.Tiron; Autor corespondent: Adrian Tiron.

In acesta etapa s-au testat in vitro pe linii celulare nanostructuri pe baza de complecsi Carbon

Dots-NHF-Gd3+, Carbon Dots-NHF-Mn2+ si Carbon Dots-NH-Fe3+. Testele au fost facute in

sisteme 2D adica in celule cultivate în plăci de plastic normale.Analizele de viabilitate celulara au

aratat ca, compusii pe baza de Carbon Dots- Gd3+ si Fe3+ au o toxicitate ridicata la nivelul

celulelor mamare normale fata de compusii complexati cu Mn2+. In acelasi timp, actiunea

antitumorala a compusului Carbon-Dots-Mn2+ este semnificativ crescuta fata de cea a compusilor

pe baza de Gd3+ si Fe3+ (Fig. 1 B_3,4). Evaluarea efectului antitumoral in vitro pe linii celulare

mamare a fost urmata de evaluarea imagistica prin tehnica de rezonanta magnetica (MRI).

In acesta etapa din cadrul activitati am evaluat efectul CD-NHF-Mn2+ in vivo pe model

animal cu tumori mamare induse . Datorita faptului ca structurile complexate cu Mn sunt

mai putin toxici, au activitate antitumorala ridicata si au proprietati superioare ca si agent de

contrast, s-au inlocuit complecșii Carbon Dots – Gd3+ cu cei cu Mn.

Pentru a evalua influența CD-NHF-Mn2+ în evoluția tumorii și diseminarea metastazelor, celule

canceroase mamare murine s-au injectat ortotopic (in glanda mamara) in soareci din specia Balb/c.

Modelul animal ales este frecvent utilizat in studiul cancerului mamar deoarece reda complexitatea

interactiilor tuturor sistemelor (hormonal, imunitar, nervos etc). Animalele au fost impartite in: 1.

grupul cu model tumoral indus dar fara nici un tratament aditional in vederea evaluarii dezvoltarii

tumorale (tumora primara si metastaze) si injectati cu Gadovist pentru a putea fi scanati prin

tehnica RMN 2. grupul cu model tumoral indus si 20% CD-NHF-Mn2+ per volum sanguin

(administrat prin injectare intraperitoneala); Tratamentul cu 20% CD-NHF-Mn2+ a redus rata de

creștere a tumorilor primare (N=7 soareci/grup). Datele experimentale demonstreaza proprietatile

superioare ale CD-NHF-Mn2+ atat ca agent de contrast cat si din punctul de vedere al toxicitatii

scazute comparativ cu compusul pe baza de Gd3+ propus initial.

POSTERE: 2 postere care au fost prezentate in cadrul Conferintei Internationale CONFER, organizata de

Institutul Regional de Oncologie Iasi care se va desfasura la Iasi in perioada 19-22 Noiembrie

2020: “Potentarea proprietatilor antitumorale ale CD-NHF de catre inhibitorii K252A,

AktVIII in linia celulara de gliom U87”. Autori: Gabriel Lutaa, Mihail Buturaa, Adrian

Tirona,, Florin E. Zuguna , Crina E.Tirona

“Cai moleculare modulate de catre CD-NHF si inhibitorii K252A, AktVIII in linia

celulara de gliom U87 ”. Autori: Mihail Buturaa, Gabriel Lutaa, Adrian Tirona,, Florin

E. Zuguna , Crina E.Tirona

2. Desfasurarea etapei experimentale 2020 in cadrul proiectului „THE EFFECT OF

DIFFERENT CONCENTRATIONS OF SEVOFLURANE ON AKT ISOFORMS IN

BREAST CANCERS CELLS”.

Proiect intern Universitatea de Medicina si Farmacie „Grigore T. Popa” Iasi

Coordonator echipa IRO/UMF: Emilia Patrascanu

Personal implicat: Crina Tiron, Adrian Tiron, Paula Alexandra Postu, Irina Trandafir;

Utilizand baza materiala din acest departament, personalul angajat reprezentat de Crina Tiron,

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 lucrare submisa si 1 manuscris in

lucru

LUCRARE SUBMISA

„SEVOFLURANE MODULATES AKT ISOFORMS IN TRIPLE NEGATIVE BREAST CANCER

CELLS. AN EXPERIMENTAL STUDY” CRINA E. TIRON1#, EMILIA PATRAȘCANU2,3#, PAULA A.

POSTU1, IRINA C. VACAREAN TRANDAFIR1, ADRIAN TIRON1*, IOANA GRIGORAS2,3

Autor corespondent: Adrian Tiron;# contributie egala; Submisa in jurnalul Breast Cancer Anesthesiology

5

Rezultatele obtinute in acest proiect indica faptul ca anestezicul sevofluran moduleaza diferit

cele 3 izoforme ale Akt-ului functie de concentratie si de timpul de expunere ale celulelor

normale si triplu negative tumorale umane. Investigatiile au fost facute atat in model 2D cat

si in 3D. In plus s-a investigat si efectul sevofluranului asupra Vimentinei si Hif1 alfa. Expresia markerului Hif1 alfa a fost investigata atat prin imunofluorescenta cat si prin RT-

PCR. Rezultatele sunt in concordanta cu literatura ce indica faptul ca anestezicele volatile au

mai multe efecte nedorite comparativ cu celelalte anestezice. Expunerea la sevofluran în timpul

intervenției chirurgicale poate contribui la recurența cancerului prin EMT indus de AKT3 și de

către toate cele trei izoforme AKT care contribuie la supraviețuirea și proliferarea celulelor

canceroase.

MANUSCRIS IN LUCRU pentru a fi submis spre publicare pana la sfarsitul anului 2020

„Sevoflurane and AKTs – friends and/or enemies” EMILIA PATRAȘCANU, CRINA E.

TIRON, ADRIAN TIRON, IOANA GRIGORAS

Acest manuscris de tip review va trece in revista informatiile cu privire la administrarea

sevofluranului atat in conditii normale cat si patologice precum si legatura dintre sevoflurant si

molecula PKB/AKT (Protein Kinaza B).

3. Desfasurarea etapei experimentale finale in 2020 din cadrul proiectului “FACTORS

INVOLVED IN HYPEROXIA-INDUCED CANCER PROGRESSION”. Proiect intern Universitatea de medicina si Farmacie Grigore T Popa Iasi

Coordonator echipa IRO/UMF: Irina Ristescu

Personal implicat: Crina Tiron, Adrian Tiron, Florie Eloaie-Zugun, Paula Alexandra Postu

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 lucrare publicata si 1 manuscris in lucru

LUCRARE PUBLICATA „Long-Term Deleterious Effects of Short-term Hyperoxia on Cancer Progression—Is

Brain-Derived Neurotrophic Factor an Important Mediator? An Experimental Study”.

Autori: Adrian Tiron*, Irina Ristescu*, Crina Elena Tiron , Paula Alexandra Postu, Florin E.

Zugun, Ioana Grigoras. * contributie egala, autor corespondent: Crina Elena Tiron Cancers

2020,12, 688; doi:10.3390/cancers12030688 (Impact factor: 6.37, Q1:Zona Rosie) In acest manuscris s-a investigat nivelul de expresie a factorilor implicati in hiperoxia

perioperatorie. În timp ce toxicitatea oxigenului este documentată în mai multe circumstanțe

acute, implicația sa în evoluția tumorala este slab înțeleasă. Am investigat efectele pe termen

lung ale hiperoxiei asupra progresiei tumorale și a unor mecanisme care stau la baza dezvoltarii

tumorale utilizând atât modele in vitro cat si in vivo de cancer mamar triplu negativ (TNBC).

Am emis ipoteza că expunerea ridicată la oxigen, chiar și de scurtă durată, poate avea efecte pe

termen lung asupra dezvoltarii tumorale. Având în vedere că expunerea hiperoxică are ca

rezultat formarea de specii reactive de oxigen (ROS), stres oxidativ crescut și expresie crescută

a factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF), BDNF poate media efectele hiperoxiei

oferind celulelor canceroase un avantaj de supraviețuire prin creșterea angiogenezei și

promovarea fenomenului EMT (Tranziția Mezenchimal Epiteliala). Atat celulele mamare

normale cum ar fi MCF10A cat si cele tumorale umane si murine, MDA-MB-231 uman și

murin 4T1, au fost investigate în 2D in vitro sistem. Celulele au fost expuse la normoxie sau

hiperoxie (40%, 60%, 80% O2) timp de 6 ore. Am evaluat nivelurile ROS, viabilitatea celulară

și expresia BDNF, HIF-1α, VEGF-R2, Vimentin și E-Cadherin prin imunofluorescență.

Modelul in vivo a constat în inocularea 4T1 la șoareci Balb/c și rezecția tumorii la 2 săptămâni

după inoculare și 6 ore expunere la normoxie sau hiperoxie (40%, 80% O2). Am măsurat

metastazele pulmonare și aceiași markeri moleculari, imediat și la 4 săptămâni după operație.

Experimentele in vitro au arătat că expunerea la hiperoxie pe termen scurt (80% O2) a celulelor

TNBC crește expresia de ROS, crește expresia BDNF și promovează EMT-ul și angiogeneza.

Datele in vivo indică faptul că hiperoxia perioperatorie promoveaza metastazarea și acest efect

ar putea fi mediat de BDNF.

MANUSCRIS IN LUCRU pentru a fi submis spre publicare pana la sfarsitul anului 2020

„Specii reactive de oxigen în celulele canceroase: mecanisme și interferențe chimio si

radioterapia”. Irina Ristescu, Adrian Tiron, Florin Zugun-Eloae, Crina E. Tiron, Ioana Grigoras Acest manuscris de tip review va trece in revista controversele cu privire la administrarea

oxigenului in concentratie mare in perioada perioperativa. Mult timp vazut ca fiind benefic si

fara efecte secundare, in ultimii 10 ani apar dovezi ale efectelor negative ale concentratiilor

mari de oxigen ce includ leziuni pulmonare sau favorizarea progresiei/recurentei cancerului. In

acest manuscris se vor interpreta si implicarea unor molecule in raspunsul celular anti-ROS si

care pot fi determinanti cheie ale efectelor toxice ale concentratiilor mari de oxigen.

4. Desfasurarea etapei experimentale in 2020 din cadrul proiectului “Influența uleiului

volatil de Origanum majorana asupra memoriei spațiale a unui model amiloidic de

demență”. Proiect intern Universitatea „Al.I.Cuza”, Iasi

Coordonator echipa UMF: Lucian Hritcu

Personal implicat: Postu Paula Alexandra, Lucian Dragoș Gorgan, Oana Cioanca, Manuela

Russ, Stefan Mikkat, Michael Otto Glocker.

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 lucrare publicata

LUCRARE PUBLICATA

Memory-Enhancing Effects of Origanum majorana Essential Oil in an Alzheimer’s

Amyloid beta1-42 Rat Model: A Molecular and Behavioral Study; Postu P. A., Gorgan D.

L., Cioanca O., Russ M., Mikkat S., Glocker M. O., Hritcu L.; Antioxidants 2020, 9(10), 919,

https://doi.org/10.3390/antiox9100919. IF: 5.014, Q1 (zona roșie); Origanum L. (Lamiaceae) este un gen important de plante medicinale și aromatice utilizate în

medicina tradițională din cele mai vechi timpuri. Scopul acestui studiu a fost de a evalua

compoziția chimică, precum și activitățile biochimice și celulare ale uleiului esențial proaspăt

preparat de Origanum majorana L. (OmEO) într-un model animal de demență Alzheimer

(AD). Modelul de AD a fost indus prin administrarea intracerebroventriculară a soluției de

amiloid beta 1-42 (Aβ1-42), iar OmEO (1% și 3%) a fost inhalat timp de 21 de zile

consecutive. Datele obținute demonstrează că OmEO a crescut activitatea antioxidantă și a

stimulat expresia factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF), care a contribuit la

îmbunătățirea funcției cognitive a animalelor. Mai mult decât atât, OmEO a prezentat efecte

benefice asupra performanței memoriei șobolanilor cu model amiloidic de AD în testul

labirintului Y și în testul labirintului cu brațe radiale.

5. Desfasurarea etapei experimentale in 2020 din cadrul proiectului “Aspecte cognitive

și moleculare privind acțiunea unor extracte de origine vegetală în afecțiunile

neurodegenerative. Studii pe modele animale ale bolii Alzheimer”. Proiect intern Universitatea „Al.I.Cuza”, Iasi

Coordonator echipa UMF: Lucian Hritcu

Personal implicat:Postu Paula Alexandra, Lucian Dragoș Gorgan, Marius Mihășan, Adrian

Tiron, Crina Elena Tiron.

https://doi.org/10.3390/antiox9100919

7

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 manuscris submis

Manuscris submis

“Conifer Essential Oils Reversed Amyloid Beta1-42 Action by Modulating BDNF and ARC

Expression in The Rat Hippocampus”; Postu P. A., Tiron A., Tiron C. E., Gorgan L., Mihășan

M., Hritcu L., submis în Jurnalul CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, BMS-

CNSNDDT-2020-185. Manuscris status: Awaiting EiC Decision.

Speciile de conifere Pinus halepensis (Pinaceae) și Tetraclinis articulata (Cupressaceae) sunt

utilizate pe scară largă în medicina tradițională datorită proprietăților lor benefice pentru sănătate.

Acest studiu a avut ca scop investigarea mecanismelor prin care uleiurile esențiale P. halepensis și

T. articulata (1% și 3%) ar putea prezenta efecte neuroprotectoare într-un model animal al

demenței Alzheimer (AD). Uleiurile esențiale au fost administrate prin inhalare, o dată pe zi, timp

de 21 de zile. Fragmentarea ADN-ului a fost evaluată prin metoda ELISA. Expresia genelor BDNF,

ARC și IL1β a fost investigată prin metoda RT-qPCR, în timp ce expresiile proteinelor BDNF și

ARC au fost evaluate folosind tehnica imunohistochimică. Datele obținute au arătat că ambele

uleiuri esențiale au ameliorat substanțial deficitele de memorie, P. halepensis stimulând în principal

expresia ARC, în timp ce T. articulata a determinat o creștere substanțială a expresiei BDNF. De

asemenea, inhalarea uleiurilor esențiale a redus expresia IL1β și a atenuat semnificativ

fragmentarea ADN asociată toxicității Aβ1-42, contribuind în continuare la îmbunătățirea cognitivă

a șobolanilor cu model de AD.

6. Desfasurarea etapei experimentale in 2020 din cadrul proiectului “Studiu asupra

transgelinei in cadrul patologiei colo-rectale”. Proiect intern Universitatea de medicina si Farmacie Grigore T Popa Iasi

Coordonator echipa UMF: Manuela Ciocoiu

Personal implicat: Crina Tiron, Mihail Butura, Adrian Tiron.

Rezultatele acestei etape de lucru se regasesc in: 1 manuscris in lucru

MANUSCRIS IN LUCRU pentru a fi submis spre publicare la inceputul anului 2021 -

„Association of the acting binding protein Transgelin with EMT biomarkers in Triple

Negative Breast Cancer ” Autori: Danilela E Semen, Adrian Tiron, Butura Mihail, Crina E Tiron, Manuela

Ciocoiu In acest manuscris s-a investigat nivelul expresiei de Transgelina in asociere cu molecule

implicate in procesul de Tranzitie Epitelial Mezenchimala (EMT). Transgelina este o proteină

care leagă actina, si care joacă un rol în reglarea funcțiile celulelor musculare netede sau ale

fibroblastelor. Dovezi recente indică faptul că Transgelina este implicată în diverse tipuri de

cancer. S-a demonstrat recent că Transgelin 2 induce rezistența la medicamente, migrarea și

invazia celulelor tumorale. Scopul acestui studiu a fost de a determina funcțiile biologice ale

Transgelin 2 și mecanismul care stă la baza modului în care Transgelin 2 induce rezistența la

medicamente in cazul cancerului de sân triplu negativ. Rezultatele obtinute in acest proiect

indica faptul ca exista o corelatie directa intre Transgelin si molecule asociate EMT-ului cum ar

fi, vimentina, CD-44. Transgelina 2 poate fi, prin urmare, utilă ca biomarker nou și țintă

terapeutică pentru cancerul de sân.

7. Desfasurarea etapei experimentale in 2020 din cadrul proiectului “Distribuția

neurotrofinelor și a receptorilor specifici la nivelul SNC al peștelui zebră adult (Danio

rerio) și dinamica lor în urma administrării unor pesticide”. Proiect intern Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

Coordonatori: Solcan Carmen (USAMV Iași) și Lucini Carla (Università Federico II,

Napoli)

Personal implicat: Adriana Petrovici (USAMV Iași), Crina Tiron, Mihail Butura, Adrian

Tiron.

In acest proiect s-a realizat in cadrul IRO

hibridizarea in situ pentru detecția ARNm pentru neurotrofine și receptori;

colorația imunohistochimică pe culturi celulare de celule stem mezenchimale de la

șobolan folosind anticorpii CD20 și CD90;

analiza expresiei de CD20 si CD90;

Alte activitati:

a) Proiecte depuse

- Depunere proiect international in competitia ERA PerMed JTC2020: „Exploring and

modulating the effects of perioperative hyperoxia and/or sevoflurane exposure on cancer

recurrence: from the triple negative breast cancer model to personalised treatment

strategies.” (ERAPERMED2020-323)

Principal investigator: Ioana Grigoras

Personal implicat: Crina Elena Tiron, Adrian Tiron, Florin Zugun-Eloae, Paula Alexandra

Postu, Gabriel Luta, Irina Anca Ristescu, Emilia Patrascanu, Irina C. Vacarean Trandafir si

Alexandru Bogdan Stache.

Factorii determinanți cheie în îmbunătățirea rezultatului pacientului cu cancer includ selecția/

combinația adecvată de terapii pentru a elimina tumora primară și pentru a preveni recurența/

metastaza cancerului. În ciuda acestora, multe tratamente antitumorale avansate eșuează sau

chiar se transformă în factori iatrogeni condiționali. O sursă promițătoare de progrese este

acum onco-anesteziologia emergentă. Utilizați ca adjuvanți circumstanțiali în timpul rezecției

tumorale primare, factorii legați de anestezie pot modula activ stresul celular și programele

homeostatice în celulele canceroase. În ciuda utilizării la scară largă a hiperoxiei (HO) și

sevofluranului (SF) în timpul/după anestezie în chirurgia oncologică, cunoștințele despre

impactul lor biomolecular, consecințele și efectele pe termen lung sunt rare.

Datele noastre experimentale preliminare sugerează că atât hiperoxia (HO), cât și sevofluranul

(SF) ar putea promova efectiv invazia locală. În plus, am obținut sugestii moleculare asupra

mecanismelor putative, indicând o activare dependentă de calea ROS – BDNF – TrkB a axei

HIF1-α, inducerea EMT și semnalizarea VEGF-R, toți contribuabili majori la agresivitatea

cancerului.Prezenta noastră aplicație își propune să documenteze efectele HO și SF asupra

agresivității TNBC sub o abordare multi-omică la cultura celulară și la nivelul probei

tumorale umane. Având în vedere faptul că în practica clinică actuală sunt oferite puține îndrumări privind

reglarea protocolului de anestezie la pacienții oncologici și pe baza propriilor noastre studii

preliminare, proiectul de cercetare propus poate dezvălui strategii preventive pentru a evita cel

puțin efectele nocive pe termen lung ale expunerii la SF și HO , la pacienții cu TNBC.

Ținând cont de faptul că proiectul nostru va oferi informații despre mecanismele implicate la

nivel de genă/proteină/metabolism într-un anumit tip de cancer, acest lucru deschide calea unei

abordări personalizate, care să ia în considerare specificitatea tumorala, specificitatea

tratamentului precum și factori specifici pacientului.

- Depunere proiect in competitia PCE 2020: Hiperoxia si sevofluranul administrate

perioperator: promotori ai recurenței cancerului - mecanisme moleculare în model de

cancer mamar triplu negativ (PN-III-P4-ID-PCE-2020-1307)

Principal investigator: Crina Elena Tiron

Personal implicat: Ioana Grigoras, Adrian Tiron, Florin Zugun-Eloae, Paula Alexandra Postu,

9

Gabriel Luta, Irina Anca Ristescu, Emilia Patrascanu, Irina C. Vacarean Trandafir si Alexandru

Bogdan Stache.

Îmbunătățirea prognosticului pacientului oncologic depinde major de alegerea terapiilor optime

menite să vindece tumora primară, dar și să prevină recurența tumorală și metastazarea,

determinanți ai mortalității. Factorii asociați anesteziei pot modula activ stresul celular și

programele homeostatice ale celulelor canceroase. Deși hiperoxia (HO) și sevofluranul (SF)

sunt utilizate frecvent în anestezia din chirurgia oncologică, cunoștințele despre impactul

biomolecular și efectele pe termen lung sunt reduse. Datele noastre experimentale sugerează că

atât hiperoxia (HO), cât și sevofluranul (SF) contribuie la dezvoltarea tumorală, prin activarea

diverselor căi metabolice, una fiind posibil reprezentată de calea ROS-BDNF-TrkB. Acestea

induc programe asociate cu progresia/agresivitatea tumorală, precum activarea axei HIF1-α,

semnalizarea VEGF-R și inducția EMT.

Având în vedere că există puține date despre efectele pe termen lung ale HO și SF asupra

celulei canceroase, că există puține indicații de adaptare a planului anestezic la pacientul

oncologic și ținând cont de rezultatele noastre anterioare, studiul nostru își propune să

elucideze impactul HO și SF asupra evoluției tumorale și să ofere date utile în practica clinică

pentru prevenția efectelor pe termen lung asupra evoluției cancerului, cel puțin în cancerul

mamar triplu negativ (TNBC).

b) Proiecte scrise pentru depunere

- Diferiți agenți terapeutici afectează expresia AXL într-o linie celulara de glioblastom

Documentare literatură de specialitate: Glioblastomul (GBM) este cea mai frecventă neoplazie

malignă primară a creierului caracterizată prin proliferare rapidă, invazie în țesuturile cerebrale

normale înconjurătoare și vascularizație aberantă. La pacienții cu GBM, supraexprimarea AXL

este asociată cu o rată de supraviețuire redusă. Mai mult, implicarea AXL în tranziția epitelial

mezenchimală promovează comportamentul migrator și invaziv al celulelor tumorale GBM.

Considerând potențiala susceptibilitate a GBM la terapia anti-AXL, în cadrul acestui proiect, se

dorește identificarea de agenți terapeutici și combinații de agenți terapeutici cu potențial de

inhibare a tranziției epitelial mezenchimale prin intermediul receptorului tirozin-kinazic AXL.

Tatonare experimente: cultivare celule U87 și HMLE, aplicare de agenți terapeutici (AKTVIII,

K252A, Doxorubicină și Warfarină), efectuare teste de viabilitate celulară, fixarea celulelor cu

paraformaldehidă și aplicare de protocoale de imunofluorescență pentru a evidenția expresia

receptorului tirozin-kinazic AXL și al markerului epitelial E-Cadherina.

Personal implicat: Crina Elena Tiron, Adrian Tiron și Paula Alexandra Postu.

- Evaluarea in vitro a rolului unor proteine specifice demenței Alzheimer în neoplazii

cerebrale Documentare literatură de specialitate: Procesul de îmbătrânirea necesită un echilibru între

promovarea reînnoirii țesuturilor și suprimarea ciclului celular. Vârsta avansată este

recunoscută ca factor de risc dominant pentru majoritatea bolilor umane, inclusiv neoplasme

maligne și tulburări neurodegenerative. Având în vedere numărul tot mai mare de studii ce

indică o asociere negativă între cancer și neurodegenerare, scopul acestui studiu este de a

investiga mecanismele prin care înclinația către o familie de boli poate reduce riscul pentru

cealaltă și viceversa.

Personal implicat: Paula Alexandra Postu, Crina Elena Tiron și Adrian Tiron.

- Determinarea viabilitatii in vitro a nanoparticulelor teranostice: colaboare cu Dr. Brandusa

Dragoi. S-au realizat teste preliminare pe linii celulare tumorale (CC531 colon cells, U87 GBM

cells, HLME mamar cells) si normale (231 normal mamar cells). Pentru a studia influenta

concentratiei de nanoparticule cu si fara FU asupra celulelor, s-au realizat teste cu 10 si 50

-au realizat si teste de

asemenea, celulele au fost puse in con

identifica efectul nanocarrier-ului asupra efectului terapeutic. Rezultatele au fost interpretate

dupa 48 de ore CellTiter-Blue® Cell Viability Assay.

Personal implicat: Gabriel Luta , Crina Elena Tiron, Brandusa Dragoi

- Efectele unor anestezice volatile asupra cancerului mamar triplu negativ. O abordare

proteomică Documentare literatură de specialitate: Cancerul de sân triplu negativ este un subtip molecular

de cancer de sân care are o rată ridicată a mortalității datorită proliferării agresive, apariției

rapide a metastazelor și lipsei unui tratament eficient. Noi studii evidențiază că tipul de

anestezic poate afecta rata de recurența și rezultatul pe termen lung al pacientelor cu cancer de

sân. În cadrul acestui studiu, analiza proteinelor prin tehnici de spectrometrie de masă ar putea

evidenția mecanismele moleculare prin care anestezicele volatile influențează tumorigeneza în

cadrul cancerului de sân triplu negativ.

Tatonare experimente: cultivare celule MDA-MB-231 și preparare și liofilizare extracte

proteice pentru Western Blot și analize de spectrometrie de masă.

Personal implicat: Crina Elena Tiron, Adrian Tiron, Paula Alexandra Postu și Michael Otto

Glocker.

c) Participări conferințe și cursuri online: Conferinte: “Diferiți agenți terapeutici afectează expresia AXL într-o linie celulara de

glioblastom”.

Mod de prezentare: Poster

Personal implicat: Crina Elena Tiron, Adrian Tiron și Paula Alexandra Postu

Cursuri online: Recognition of pain, suffering and distress and its application in the

evaluation of severity of the procedures (species specific: mice and rats). Perioada:

01.11.2020 – 31.12.2020

Personal implicat: Paula Postu si Luta Gabriel

d) Colaborari:

Analiza date in colaborare cu Emily Arner from Prof. Dr. Rolf Brekken group, UT

Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, USA;

Testare compusi in colaborare cu Dr. Pieptu, Petru Poni in vederea stabilirii unor date

pentru publicare si aplicare pentru finantari viitoare.

e) Studenti in stagiu de pregatire 2020: Ianuarie 2020 - Eduardo Chavez Ornelas, Mexic, Facultad de Medicina, Universidad

Autonoma de Nuevo Leon, [email protected]

Ianuarie 2020 -Javier Navas Pizarro, Chile, Universidad Mayor,[email protected]

Martie 2020 - Hiromu Maeda, Japonia, Kagoshima Medical School, [email protected]

II. DEPARTAMENT BIOLOGIE MOLECULARA

ECHIPAMENTE UTILIZATE IN TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARA

DIN CADRUL PROIECTELOR DE CERCETARE DESFASURATE IN TRANSCEND

Platforma de secvențiere masivă paralelă Miseq- Illumina.

mailto:[email protected]



11

Platforma de secvențiere masivă paralelă IonTorrent – LifeTechnologies,

Aparat electroforeză pe chip în sistem microfluidic Bioanalyser 2100 Agilent,

Scanner microarray de înaltă rezoluție Agilent cu cuptor de hibridizare și hota

OzoneFree.

Secvențiator Sanger ABI3500 – Life Technologies,

Aparat pentru PCR în timp real LightCycler480II - Roche Diagnostics,

Aparat pentru PCR în timp real Stratagene MX30005p – Agilent,

Thermocycler PalmCycler - Corbett Research,

Thermocycler SureCycler 8800 – Agilent,

Thermocycler Labcycler – Sensoquest,

Sistem de vizualizare și interpretare geluri Geldoc – UVP,

Aparat electroforeză orizontală geluri SubCell - Biorad,

Aparat electroforeză verticală PowerPac200 - Biorad,

Uscător de geluri Gel Dryer - Biorad cu pompa de vid Hydrotech.

Mașina de fulgi de gheata Medical Refrigeration – Evermed,

Pipetor automat cu doua brațe (8 si 96) Biomek Fx – Beckman Coulter,

Hote cu flux laminar sterile Euroclone SafeCyto și SafeMate,

Congelator –80⁰C - ThermoScientific,

Congelator –150⁰C - ThermoScientific,

Containere cu azot lichid TaylorWharton LABS-80k cu butelii de alimentare

dedicate (240l), stație produs azot lichid (60l/zi) Cryomech Syracuse.N.Y.

Autoclav 50L orizontal Raypa Model AH-75- DRY,

Pupinel Memmert 3,

Centrifuga Allegra X-15R - Beckman Coulter,

Centrifuga Microfuge 22R - Beckman Coulter,

Centrifugi cu vortex Biosan,

Centrifuga 3-30K –Sigma,

Centrifuga Microfuge 30R – BeckmanCoulter,

Centrifuga Microfuge 16 – BeckmanCoulter,

Aparat de filtrare apă și generare apă deionizată MaxiTower Plus 80 si 3

Barnstead GenPure Pro pentru producere apă nuclease free – ThermoScientific,

Băi uscate termostatate cu agitare TS-100 Thermo-Shaker – BioSan,

Baie termostatata Heto Model AG,

Baie termostatata WB7 – Memert,

Vortex pentru eprubete,

Spectrofotometru NanoDrop 2000 – Thermo Scientific,

Ultrasonicator Bioruptor Pico – Diagenode,

Pipete automate Eppendorf cu vârfuri detașabile,

Tehnici-suport practicate in departamentul de Biologie Moleculara: PCR, Real-Time

PCR, Secventiere Sanger, Secventiere masiva paralela Next Generation, Micro array (array

CGH si gene expression array), Revers Hibridizare (Colon, melanom, viremie), Multiplex

Ligation Probe Amplification – MLPA – (LLC)

A. PROIECTE IN STADIU DE DOCUMENTARE SI INSTRUIRE TEHNICA

SI IN DESFASURARE :

1. „Network of Excellence in Diagnosis and Research in Lung Cancer Disease

– Lungnex-RD” (IRO este coordonator)

Durata: 18 luni

Tip proiect: – proiect transfrontalier cu Republica Moldova

Personal implicat: Irina Cezara Văcărean-Trandafir, Iuliu Ivanov, Loredana Mihaiela

Dragoș, Mihaela Mențel

Activitati: selectarea lotului de pacienti, schimb de experienta cu echipa din

MMoldova, realizarea de optimizari in determinari RealTime PCR si NGS, realizarea de

ghiduri

Changes in human colonic microbiome in antibiotic generated stress –

COLONSTRESS (IRO este partener 1)

Durata: 18 luni

Tip proiect: – proiect transfrontalier cu Republica Moldova


Dragoș, Mihaela Mențel

Activitati: selectarea lotului de pacienti, schimb de experienta cu echipa din

MMoldova, realizarea de optimizari in determinari RealTime PCR si NGS, realizarea de

ghiduri

Studiul unor anomalii moleculare si citogenetice in Mielomul Multiplu

Tip proiect: proiect doctoral Univeritarea Al.I. Cuza Iasi,

Personal implicat: doctorand Dragos Loredana, Ivanov Iuliu, Mihaela Zlei

Activitati: separarea plasmocitelor atipice prin flowcitometrie si bile magnetice,

extractie ADN si ARN, aCGH+SNP, secventiere Sanger, MLPA.

Mutatii in receptoruil FC in Purpura Trombocitopenica Idiopatica, la

pacientii copii.

Tip proiect: proiect intern Transcend in colaborare cu clinica de Oncohematologie

Sp.Sf.Maria Iasi

Personal implicat: Mentel Mihaela, Ivanov Iuliu, Loredana Dragos, Anca Ivanov,

Daniela Jitaru

Activitati: purificarea de ABN din sange perifiric, determinari de variatii de numar de

cipii genice prin tehnica MLPA (P110-P111)

Efectul unor peptide citotoxice asupra unor linii celulare pozitive pentru

gene de fuziuni implicate in patogenia leucemiilor acute

Tip proiect: proiect pilot Transcend,

Personal implicat: Jitaru Daniela, Loredana Dragos

Sortarea populatiilor celulare caracteristice dezvoltarii normale a lineajului

limfoid B prin utilizarea flowcitometrului FACS ARIA III.


Personal implicat: Mentel Mihaela, Ivanov Iuliu, Gorovei Claudia

Activitati: Sortarea plasmocitelor in Mielom multiplu in vederea imbogatirii probelor

pentru SNParray

Identificarea factorilor de semnalizare solubili eliberati de celulale

embrionare in mediul de cultura, ca potentiale elemente cheie in descifrarea capacitatii de

resetare a genomului indusa de sistemul imun embrionar.


Personal implicat: Bogdan Doroftei, Simona Cumpana, Ivanov Iuliu, Radu Iliescu,

13

Andrei Neamtu, Alina Petre, Roxana Avadanei, Eugen Carasevici

Activitati: Identificarea diferentelor spectrale intre mediile de cultura control si cele de

la embrionii cu dezvoltare normala sau cei degenerati

Realizarea unei baze de date cu pacientii cu leucemii acute din clinica de

Hemato-Oncologie, in vederea investigarii statistice a parametrilor clinici, paraclinici si

imagistici colectati in etapele de diagnostic si urmarire a raspunsului la tratament, cu

recoltarea si stocarea de probe biologice suplimentare in vederea utilizarii acestora in

studii ulterioare.


Personal implicat: Angela Dascalescu, Irina Cezara Văcărean-Trandafir, Daniela

Jitaru, Loredana Dragos, Ivanov Iuliu, Mihaela Zlei, Oana Pintilie, Ion Antohe, Catalin Danaila

Activitati: Completarea bazei de date cu pacientii nou diagnosticati; Recoltarea de

probe pentru prezervarea de material biologic; Procesarea probelor primare pentru extractia

acizilor nucleici, a celulalor de interes, plasma, ser, inregistrarea si stocarea acestora in

congelatoare.

Metode de identificare a agentilor patogeni din biofilme la pacientul critic –

studio comparativ

Tip proiect: proiect doctoral UMF Iasi,

Coordonator: Prof. Luminita Smaranda Iancu

Personal Transcend implicat: Ivanov Iuliu, Mihaela Mentel, Lungu Olguta

Activitati: Extractie ADN din peliculele depuse pe aparatajele medicale (catetere,

sonde de intubare etc) utilizate la pacientii din clinica ATI. Verificarea ADN-ului extras prin

amplificare cu primeri specifici pentru 16S.

Clonarea genelor de fuziune identificate in leucemiile acute

Tip proiect: proiect TRANSCEND

Personal implicat: Mihaela Mențel, Irina Cezara Văcărean-Trandafir, Iuliu Ivanov

Activități: Extracția de ARN din culturi celulare ce sunt pozitive pentru o anumită genă

de fuziune. Amplificarea PCR a fragmentului de ADN corespunzător genei de fuziune.

Inserarea fragmentului de interes intr-un vector de clonare. Constructul, astfel obținut va fi

folosit drept control pozitiv pentru identificarea genelor de fuziune la pacienți cu leucemii

acute. Confirmarea clonării fragmentului de ADN în vectorul de clonare s-a realizat prin

secvențiere Sanger cu primeri specifici.

Corelarea datelor de imunofenotipare cu modificarile genetice identificate

la pacientii cu leucemie acuta B, diagnosticati la Institutul Regional de Oncologie, Iasi Tip proiect: proiect TRANSCEND

Personal implicat: Mihaela Mențel, Irina Cezara Văcărean-Trandafir, Mihaiela

Loredana Dragos, Iuliu Ivanov

Sumarul proiectului: Corelarea markerilor imunofenotipici identificati la precursorii

limfoizi B prin citometrie-in –flux cu prezenta genelor de fuziune identificate prin reactia de

polimerizare in lant.

Evaluarea efectelor tratamentului cu plasmă non-termică la presiune

atmosferică pe modele celulare in vitro

Coordonator: Dragoș Lucian Gorgan

Personal implicat: Alexandru Bogdan Stache, Lucian Hrițcu, Ionuț Cristian Topală,

Cosmin Teodor Mihai, Iuliu Cristian Ivanov, Loredana Mihaiela Dragoș.

Sumarul proiectului: Osteosarcomul (OS) este un tip de cancer osos, ce prezintă

prognostic slab și tratament dificil. Aproximativ 19% dintre toate tumorile maligne care se

dezvoltă la nivelul țesutului osos sunt de tip OS, aceasta fiind a treia cea mai des întâlnită

malignitate la copii și cea mai frecventă tumoră solidă la persoanele tinere. Plasma non-termică

la presiune atmosferică (CAP) este un gaz ionizat, cu o temperatură apropiată de temperatura

camerei, fiind alcătuită din fotoni, ioni, electroni, radicali liberi și molecule neutre sau excitate

și este generată prin aplicarea de descărcări electrice într-un gaz. Datorită generării speciilor

reactive de oxigen și de azot, corelată cu efectele antitumorale observate, plasma non-termică

la presiune atmosferică (CAP) poate deveni o nouă și inovatoare terapie împotriva cancerului.

Cu toate acestea, mecanismul complet de acțiune între CAP și celulele vii sau țesuturi rămâne

neînțeles complet, motivul pentru care sunt necesare studii suplimentare pentru a stabili CAP

ca fiind un tratament solid în domeniul medical. Scopul acestui studiu îl reprezintă analiza

efectelor plasmei non-termice la presiune atmosferică pe modele experimentale „in vitro” în

vederea evaluării potențialului apoptotic al acesteia și a identificării mecanismelor celulare

implicate în interacțiunile plasmă – celule.

Evaluări moleculare ale unor celule umane de osteosarcom supuse unui

tratament indirect cu plasmă non-termică la presiune atmosferică - Aplicare la 2020

ArcherDX Research Grant

Coordonator: Alexandru Bogdan Stache

Personal implicat: Iuliu Cristian Ivanov, Loredana Mihaiela Dragoș, Mentel Mihaela

Sumarul proiectului: Literatura de specialitate descrie potențialul de utilizare a

plasmei non-termice produsă la presiune atmosferică, un gaz ionizat cu temperatura apropiată

de temperatura camerei, ca o bună alternativă la terapiile comune împotriva cancerului. Pentru

a analiza efectele sale antitumorale, sunt descrise două metode principale de aplicare a plasmei:

tratamentul direct și tratamentul indirect cu ajutorul unei soluții activate cu plasma (PAM).

Mediile activate de plasmă sunt produse prin descărcări electrice în interfața gaz-lichid, ceea ce

duce la formarea unui flux de radicali liberi, electroni, ioni, specii reactive și radiații UV.

Expunerea unui lichid la plasmă induce producția de specii reactive de oxigen și azot (RONS),

cum ar fi nitriți (NO2ˉ), nitrați (NO3ˉ), peroxinitriți (OONOˉ), ozon (O3), dioxigen, radicali (·

OH) și peroxid de hidrogen (H2O2). S-a demonstrat că activitatea antitumorală a CAP se

datorează generării de RONS. Pentru a facilita administrarea RONS, a început să fie testat

potențialul diferitelor soluții care pot substitui PAM. Scopul acestui studiu este de a investiga

efectul tratamentelor PAM sintetice asupra expresiei genice a unor linii celulare umane de

osteosarcom (HOS) și mielom multiplu (U-266), folosind panoul Archer® FusionPlex Heme

v2. PAM sintetic conține soluție salină tampon fosfat, peroxid de hidrogen, nitriți și nitrați,

despre care se crede că sunt factori cheie în efectul anti-timoral al tratamentelor CAP.

Concentrațiile de RONS utilizate în PAM sintetic vor fi corelate cu concentrația lor măsurată în

PAM obținută prin expunerea la mediul CAP.

Abordări diferite pentru analiza mutațională IDH1/2 în leucemia acută

mieloidă (LAM)

Tip proiect: proiect TRANSCEND - draft:

Coordonator: Irina Cezara Văcărean-Trandafir


Dragoș, Mihaela Mențel, Roxana Maria Pomohaci

Sumarul proiectului: Leucemia acută mieloidă (LAM) este un neoplasm heterogen și

complex, având un prognostic slab, indiferent de tratamentele agresive cu chimioterapie.

Mutațiile din izocitrat dehidrogenazele 1 și 2 (IDH1/IDH2) observate mai întâi în gliom

și, ulterior în LAM au fost descrise recent în diverse tulburări mieloproliferative cronice și

15

sindroame mielodisplazice. Frecvența mutațiilor IDH1/2 este mai mare în cazurile de LAM

citogenetic normale (CN-LAM) (aproximativ 30%), comparativ cu mai puțin de 17% în LAM,

poziționându-le între cele mai întâlnite modificări moleculare în CN-LAM. Cele mai frecvente

mutații sunt IHD1R132 (~10% din cazurile CN-LAM), IDH2R140 (~80% din cazurile CN-

LAM) și IDH2R172 (~2,5% din cazurile CN-LAM), cu o frecvență redusă în cazurile

pediatrice. Mutațiile IDH1/2 apar în domeniul catalitic și duc la o producție crescută de (R)-2-

hidroxiglutarat (2-HG) care poate funcționa ca un oncometabolit. Expresia enzimatică mutantă

a IDH1/2 conduce la un blocaj al diferențierii celulare hematopoietice și la extinderea

populațiilor de celule imature.

În acest studiu ne propunem să detectăm și să evaluăm persistența mutațiilor IDH1/2 în

cazurile de LAM în timpul remisiunii, pentru a determina dacă aceste mutații ar putea prezice

recidiva bolii și ar putea servi ca marker molecular al bolii minime reziduale. De asemenea,

intenționăm să investigăm corelația mutațiilor IDH1/2 cu alte modificări moleculare, cum ar fi

mutațiile FLT3, mutațiile NPM1 sau alte gene de fuziune implicate în LAM, pentru a evalua

riscul recăderii și supraviețuirii acestor pacienți.

Pentru a identifica aceste anomalii genetice, în studiul de față, vom aborda tehnici

sensibile, cum ar fi “high-resolution melting PCR”, urmată de secvențierea Sanger și

secvențierea de generație următoare (NextGen) pentru a monitoriza boala minimă reziduală.

Prin dezvoltarea unei analize de spectrometrie în masă MALDI-TOF sau cromatografie

gazoasă (GC–MS/MS), intenționăm să determinăm oncometabolitul 2-HG pentru screeningul

mutației IDH1/2 și să stabilim dacă putem utiliza 2-HG ca biomarker pentru discriminarea

probelor pozitive pentru mutațiile IDH.

Studiul propus abordează un subiect actualizat care are nevoie de o mai bună înțelegere

a patogenezei bolii, urmărind dezvoltarea unor abordări terapeutice eficiente suplimentare

necesare pentru îmbunătățirea rezultatelor clinice. Ne propunem să abordăm implicațiile

potențiale ale mutațiilor IDH în tratamentul clinic al LAM prin evaluarea și corelarea

consecințelor moleculare și biologice ale mutațiilor IDH1/2 cu alte anomalii genetice și

urmărirea acestor mutații pe parcursul evoluției bolii.

Profilul repertoriului imun BCR/TCR în cazurile SARS-CoV-2 – dinamica

răspunsului imun adaptativ

Tip proiect: proiect TRANSCEND - draft:

Coordonator: Irina Cezara Văcărean-Trandafir


Dragoș, Mihaela Mențel, Roxana Maria Pomohaci, Florin Eloae Zugun

Sumarul proiectului: Progresele actuale în secvențierea repertoriului imun au subliniat

existența unei legături strânse între diversitatea BCR/TCR și răspunsurile imunologice

împotriva antigenelor virale. În mod normal, repertoriul imun este policlonal și semnificativ

divers; cu toate acestea, în cazul infecțiilor virale, un anumit grup de clone de celule T poate

ajuta la limitarea unui repertoriu TCR specific antigenului. Varietatea, structura și dinamica

repertoriului TCR contribuie la funcția răspunsului imun adaptiv împotriva infecțiilor virale și

sunt influențate de o serie de aspecte precum alte infecții, îmbătrânire și variabilitatea genetică

HLA. Analiza repertoriului imun BCR/TCR ne poate ajuta, de asemenea, să găsim potențiale

TCR-uri comune, permițându-ne să urmărim infecția și, de asemenea, să elucidăm

mecanismele imunității „de turmă” ale acestei boli.

Alelele antigenului leucocitar uman (HLA) sunt părți critice ale căii de prezentare a

antigenului viral și s-a dovedit anterior că oferă susceptibilitate virală și contribuie la

severitatea bolii. În timp ce caracteristicile panoului clinic al pandemiei COVID-19 continuă să

apară, există întrebări semnificative fără răspuns cu privire la partea pe care variabilitatea

genetică individuală o are în răspunsul imunologic împotriva SARS-CoV-2. Diferențele

genetice între genele clasa I ale complexului major de histocompatibilitate (MHC) (antigenul

leucocitar uman A [HLA-A], -B și -C) sunt predispuse să afecteze predispoziția și acutizarea

infecției cu coronavirus.

Având în vedere aceste lucruri, ne propunem să căutăm rolul crucial al celulelor T care

mobilizează răspunsul antiviral care stă la baza patogeniei SARS-CoV-2. Subliniem

raționamentul biologic pentru analiza extinsă a repertoriului imun BCR/TCR la pacienții cu

COVID-19, care va duce la constatări relevante care ar putea elimina heterogenitatea cu privire

la cazurile de coronavirus. De asemenea, vă prezentăm un plan de lucru care detaliază

metodele cu avantajele și problemele legate de obținerea unor date valoroase din repertoriul

BCR/TCR pentru a ne ajuta să câștigăm lupta în curs împotriva acestui virus. Cu acest studiu

sperăm să găsim ce aspecte ale repertoriului imun BCR/TCR pot elucida riscul variabil de

infecție la populația în vârstă și cum contribuie diversitatea genetică HLA la repertoriul unic

TCR și la răspunsul imunologic.

B. REDACTARE ȘI SUBMITERE ARTICOLE

Manuscris publicat: Boiangiu, R.S., Mihasan, M., Gorgan, D.L., Stache, B.A., Petre,

B.A. and Hritcu, L., 2020. Cotinine and 6-hydroxy-L-nicotine reverses memory deficits and

reduces oxidative stress in Aβ25-35-induced rat model of Alzheimer’s

disease. Antioxidants, 9(8), p.768.IF: 5.014 (Q1).

Abstract: Derivații nicotinici, cotinina (COT) și 6-hidroxi-L-nicotina (6HLN), au arătat

efecte promițătoare de îmbunătățire cognitivă, fără a prezenta efectele secundare ale nicotinei.

În acest studiu, s-a investigat impactul COT și 6HLN asupra tulburărilor de memorie și a

stresului oxidativ la un model animal al demenței Alzheimer (AD) indus prin infuzia

intracerebroventriculară a peptidei Aβ25-35. COT și 6HLN au fost administrate cronic

șobolanilor tratați cu Aβ25-35, iar performanțele lor cognitive au fost evaluate folosind teste in

vivo (Testul labirintului Y, Testul de recunoaștere a unui obiect nou și Testul labirintului cu

brațe radiale). Prin utilizarea instrumentelor in silico, s-a încercat asocierea rezultatelor

comportamentale cu potențialul calculat de legare al acestor compuși nicotinici în siturile

alosterice ale subtipurilor α7 și α4β2 ale receptorilor nicotinici de acetilcolină (nAChRs).

Starea oxidativă și activitatea acetilcolinesterazei (AChE) au fost determinate în țesuturi

hipocampice. Prin analiza RT-qPCR s-au evaluat nivelurile de expresie ale genelor bdnf, arc și

il-1β. Datele obținute au arătat că COT și 6HLN s-ar putea lega de α7 și α4β2 nAChRs cu

afinitate similară sau chiar mai mare decât nicotina. În consecință, tratamentul a prezentat un

profil pro-cognitiv, antioxidant și anti-AChE în modelul animal de șobolan de AD indus cu

Aβ25-35. În cele din urmă, analiza RT-qPCR a arătat că COT și 6HLN au modulat pozitiv

expresia genelor bdnf, arc și il-1β. Prin urmare, acești derivați nicotinici care acționează asupra

sistemului colinergic ar putea reprezenta o alegere promițătoare pentru ameliorarea

simptomatologiei AD.

Manuscris trimis către publicare: Relative expression of different Ikaros isoforms in

leukaemia - Anca-Viorica Ivanov, Amalia-Andrea Titieanu, Mihaela Mențel, Angela Smaranda

Dăscălescu, Catalin Danailă, Ingrith-Crenguța Miron, Ion Antohe, Mirabela Alecsa, Irina-

Cezara Văcărean-Trandafir*, Daniela Jitaru – trimis către Journal of Cancer Research and

Clinical Oncology (JOCR-D-20-01233)

Abstract: Ikaros este un factor de transcripție necesar pentru diferențierea și

proliferarea celulelor hematopoietice normale, în special în linii limfoide. Există mai multe

izoforme Ikaros cărora le lipsește un număr diferit de exoni, având funcții celulare diverse.

Expresia genei Ikaros neregulată participă la procesele leucemice; izoformele mai scurte, care

nu au domeniul care mediază legarea ADN, prezintă un efect negativ dominant partenerilor

heterodimeri mai lungi. În acest studiu, am analizat probe de măduvă osoasă/sânge de la 147 de

pacienți (46 cu leucemie mieloblastică acută, 78 cu leucemie limfoblastică acută, 23 cu

leucemie mieloidă cronică), spitalizați în perioada 2015-2018 în Spitalul pentru Copii „Sfânta

17

Maria” și Institutul Regional de Oncologie, Iași, România. Aceste cazuri au fost investigate

prin analize moleculare pentru a identifica apariția următoarelor anomalii genetice: în ALL:

MLL-AF4, TEL-AML-1, BCR-ABL-p190, E2A-PBX-1, în LMC: BCR-ABL-p210 și în AML:

PML-RARα, AML-ETO și CBFβ-MYH11. În paralel, am examinat prezența izoformelor

Ikaros scurte versus lungi în toate probele. Am observat coexistența mai multor variante de

splicing corespunzătoare izoformelor Ik1, Ik2, Ik4, Ik4A, Ik5A, Ik6 și Ik8 în același PCR.

Identificarea Ik6 a fost direct corelată cu modificările numărului de copii ale ADN-ului în gena

IKZF1 prin tehnica MLPA. Studiul nostru a demonstrat că expresia izoformelor Ikaros care nu

se leagă de ADN nu este limitată la un tip specific de celule maligne și, de asemenea, nu se

limitează la apariția genelor de fuziune specifice. Tehnica de electroforeză semi-fluidică ne-a

permis nu numai să identificăm diferite variante, ci și să le cuantificăm în același experiment

într-un test de screening rapid.

Manuscris trimis către publicare: Molecular diagnosis of Clostridioides difficile

infections in Northeast Romania: evaluation of the GenePOC CDiff assay - Anca-Viorica

Ivanov, Madalina Ștefan, Brindușa Copacianu, Florina Fotache, Irina Cezara Văcărean-

Trandafir*, Daniela Jitaru trimis către European Journal of Clinical Microbiology & Infectious

Diseases (No. EJCM-D-20-00541)

Abstract: În contextul actual în care grupul de lucru al Societății Europene de

Microbiologie Clinică și Boli Infecțioase (ESCMID), recomandă utilizarea unui algoritm de

diagnosticare în doi pași pentru infecțiile cu Clostridioides difficile (CDI) pentru a obține un

diagnostic optim, numeroase laboratoare clinice fac tranziția de la imunoanalize ce determină

enzima toxinelor (EIA) la teste de amplificare a acidului nucleic (NAAT). În timp ce în multe

regiuni din Europa de Est, testarea pe linia primară cuprinde încă teste de tipul EIA care

vizează toxinele A și B ale C. difficile cu (sau mai ales fără) confirmarea rezultatelor pozitive

prin teste de amplificare a acidului nucleic, am căutat să evaluăm acuratețea moleculară a

analizei GenePOC CDiff (GP) în comparație cu metodologia de diagnostic de rutină care

constă în testarea EIA pentru TOX A și B, într-o cohortă de pacienți cu cancer supuși

chimioterapiei de la Institutul Regional de Oncologie din Nord-Estul României. Testul GP s-a

efectuat conform normelor și a afișat o sensibilitate și specificitate de 96,7% (88.7-99.6) și

respectiv 96.1% (90.3-98.9), în comparație cu testul RIDAQUICK care a afișat o sensibilitate

generală de 72.1% (59.2-82.9) și o specificitate de 91.2% (83.9-95.9). Testul molecular

GenePOC pentru detectarea genei tcdB a C. difficile toxigenice este simplu și constituie un test

diagnostic precis, oferind rezultate fiabile în timp minim.

C. PARTICIPĂRI LA CONFERINȚE

CONFER 2020 (online, 19-22 Noiembrie, Iași, Romania)

Abordări diferite pentru analiza mutațională IDH1/2 în leucemia acută mieloidă (LAM)

- Irina-Cezara Văcărean-Trandafir, I.C. Ivanov, Loredana Mihaiela Dragoș, Mihaela Mențel,

Amalia Andrea Titieanu, I. Antohe, Angela Smaranda Dăscălescu, Daniela Jitaru, E.

Carasevici -prezentare orală

Impactul tratamentului a două medii diferite expuse la plasmă non-termică de presiune

atmosferică asupra viabilității celulelor de osteosarcom - A.B. STACHE, LOREDANA

MIHAIELA DRAGOS, I.C. IVANOV, I. MIHAILA, I. TOPALA, C.T. MIHAI, D.L.

GORGAN – e-poster

III. DEPARTAMENT CITOMETRIE IN FLUX SI IMUNOFENOTIPARE

Departamentul de Citometrie in Flux si Imunofenotipare este alcatuit din echipamente

si metodologie specifica dedicate imunofenotiparii multiparametrice (maxim 12 parametri

celulari investigabili concomitent), evaluarii apoptozei, viabilitatii celululare, ciclului celular,

fragmentarii ADN, proliferarii celulare, detectiei populatiilor celulare rare, sortarii aseptoce a

populatiilor celulare de interes care, ulterior, pot fi transferate altor departamente (Culturi

celulare, Biologie Moleculara, Citogenetica).

Echipamentele din dotarea Departamentului sunt:

- Platforma de separare celule si Citometru in flux AriaIII, Becton Dickinson, serie

P648282B200, cu trei lasere, 10 detectori fluorescenta, maxim 12 parametri celulari si

posibilitatea de sortare aseptica a celulelor de interes.

- Citometru in flux Navios, Beckman Coulter, seria AW14250, cu trei lasere, 10

detectori fluorescenta, maxim 12 parametri celulari.

- Citometru in flux Gallios, Beckman Coulter, seria AV29646, cu trei lasere, 10

detectori fluorescenta, maxim 12 parametri celulari.

Personalul angajat reprezentat de CSIII, PhD Mentel Mihaela si Biol. Spec. Gorovei

Claudia Elena, utilizand baza materiala din acest departament, a fost implicat in urmatoarele

activitati in 2020:

Personalul Departamentului furnizeaza urmatoarele activitati suport pentru proiectele

de cercetare: consiliere design experimental; consiliere selectie reactivi; optimizare metoda;

instruirea tehnica a solicitantilor (utilizare citometru, inclusiv mentenanta, utilizare software

de achizitie date, utilizare software analiza date, la cerere); consiliere tehnica (troubleshooting);

analiza fisierelor de date cu furnizarea unei statistici brute si imagini +

interpretare pentru rapoarte/ publicatii, la cerere.

Activitate cercetare Studiu Dr. Ana Maria Mușina (Prof. Dr. Scripcaru)

Grant intern UMF: Systemic and local immune response evaluation to tumor

aggressiveness in patients with colorectal cancer Proiect finalizat cu publicarea a 2 articole in anul 2020:

Personal implicat: Mihaela Mentel, Mădălina Ștefan (voluntar), Oana Maria Pintilie,

Mihaela Zlei

- Muşină, A., Huţanu, I., Zlei, M., Ştefan, M., Mentel, M., Aniţei, M., Filip, B.,

Scripcariu, D. V., Gavrilescu, M., Panuţa, A., Buna-Arvinte, M., Radu, I., & Scripcariu, V.

(2020). Assessment of circulating tumor cells in peripheral blood using flow cytometry in

patients with surgery for colorectal cancer – review, Revista Romana de Medicina de

Laborator, 28(4), 365-379. doi: https://doi.org/10.2478/rrlm-2020-0033

- Mușină, Ana-Maria; Zlei, Mihaela ; Mentel, Mihaela; Scripcariu, Dragoș-Viorel;

Ștefan, Mădălina; Aniței, Maria-Gabriela; Filip, Bogdan; Radu, Iulian; Gavrilescu, Mihaela-

Mădălina; Panuța, Andrian; Buna, Mihaela; Cordun, Cristiana-Ioana; Predescu, Dragoș-

Valentin; Scripcariu, Viorel; Hutanu, Ionut. Evaluation of circulating tumor cells in colorectal

cancer by means of flow cytometry, (DOI: 10.1177/0300060520980215/ ID: JIMR-20-

1998.R1) in Journal of International Medical Research.

Participare la Congresul Asociatiei de Medicina de Laborator (AMLR), Bucuresti

2020

Prezentare cu titlul: Molecular diagnosis of Chronic Lymphocytic Leukemia

Autori: Claudia E. Grigoras, Mihaela Mentel, Oana M. Pintilie, Loredana M. Dragos,

Irina C. Vacarean-Trandafir, Madalina C. Stefan, Adriana Sireteanu, Iuliu C. Ivanov, Raluca E.

Oana, Daniela Jitaru.

Participare la CONFER 2020

19

Prezentare cu titlul: Provocări de diagnostic și tratament la un pacient de 40 de ani cu

leucemie / limfom agresiv a celulelor NK

Autori: V.A. Cianga, Oana Pintilie, Mihaela Zlei, Mihaela Menţel, Raluca Oană, Angela

Dăscalescu, C.D. Dănailă, Alina Dascălu

Articol in colaborare cu Institutul de Biochimie din Bucuresti:

Ionescu AE, Mentel M, Munteanu CVA, Sima LE, Martin EC, Necula-Petrareanu G,

Szedlacsek SE. Analysis of EYA3 Phosphorylation by Src Kinase Identifies Residues Involved

in Cell Proliferation. Int J Mol Sci. 2019 Dec 13;20(24):6307. doi: 10.3390/ijms20246307.

PMID: 31847183; PMCID: PMC6940942.

IV. Departament Proteomică și Bioinformatică

Activitatea desfăşurată în Laboratoarele de Proteomică și Bioinformatică ale Centrului

de Cercetare Fundamentală ṣi Dezvoltare Experimentală ȋn Medicină Translațională

TRANSCEND din cadrul Institutului Regional de Oncologie Iaşi cuprinde activităţi de

cercetare, diseminare şi formare a tinerilor cercetători sau studenţi, efectuate în colaborare

strânsă de către membrii echipei (Dr. Brânduşa-Alina Petre, Dr. Radu Iliescu - Laboratorul

de Proteomică și Dr. Andrei Neamţu, Dr. Roxana-Maria Pomohaci (nee Amărandi)–

Laboratorul de Bioinformatică). În decursul anului 2020 au fost abordate urmatoarele teme de

cercetare:

Investigarea determinanţilor moleculari ai activităţii antitumorale

pentru noi compuşi organici de mici dimensiuni cu nuclee

heterociclice

Stadiu avansat

Numeroase eforturi actuale sunt direcționate către dezvoltarea de noi agenți antiproliferativi, o

atenție deosebită fiind acordată inhibitorilor care alterează dinamica microtubulilor. Dintre

numeroșii agenți ce țintesc microtubulii, fenstatina este o structură chimică promițătoare care

poate fi utilizată ca punct de plecare pentru proiectarea de noi derivați antitumorali.

În cadrul acestui studiu s-au investigat particularitățile de legare la nivelul tubulinei a unor serii

de noi derivați de izochinolină, chinolină şi indolizină, similari din punct de vedere structural

cu fenstatina. Acești compuși au fost evaluați in vitro pentru abilitatea de a inhiba creșterea a

60 de linii tumorale, câțiva dintre ei fiind foarte activi (concentrație inhibitorie maximă 50% de

ordin submicromolar). Experimentele de andocare moleculară au fost derulate în Autodock

Vina, pe situsul de legare a colchicinei din structura tubulinei (cod Protein Data Bank: 4O2B).

În vederea validării rezultatelor andocării moleculare, compușii au fost evaluați pentru

abilitatea de a inhiba polimerizarea tubulinei in vitro.

Proiectarea moleculară asistată de calculator este o stategie eficientă pentru identificarea de noi

structuri chimice cu utilitate terapeutică. În cadrul acestui studiu, compușii cu activitate

antitumorală submicromolară (ex. glioblastom SNB-75 GI50 = 35.1 nM, melanom MDA-MB-

435 GI50 = 36.7 nM) au inhibat polimerizarea tubulinei in vitro și au fost acomodați la nivelul

acesteia prin interacțiunea cu o serie de aminoacizi considerați importanți în activitatea

antitumorală a altor agenți cunoscuți care țintesc microtubulii. Astfel, modelarea moleculară

joacă un rol extrem de important în elucidarea determinanților moleculari ai activității

biologice. Rezultatele acestui proiect au fost diseminate cu succes într-un articol ştiinţific [1] şi

la 4 manifestări ştiinţifice internaţionale [I-IV].

Modelarea moleculară şi sinteza unor peptide cu proprietăţi

neutralizante pentru infecţia cu virusul SARS-CoV-2.

Stadiu avansat

În cadrul acestui proiect s-a efectuat analiza bioinformatică a secvenței primare a regiunii de

legare a proteinei virale S cu receptorul celular ACE2, în urma căreia a fost identificată o

secvență de aminoacizi esențială pentru interacțiunea moleculară a celor două proteine și

internalizarea celulară a virusului. O serie de perechi importante de reziduuri au fost

identificate pe baza distanței de contact în structura cristalografică, determinând două regiuni

cheie în interfața de legare. Cu toate acestea, conformația statică dată de un experiment

cristalografic poate împiedica identificarea interacțiunilor importante, relevate doar de

dinamica complexului proteic. Simulările noastre preliminare ample asupra complexului

SARS-CoV-2/ACE2 au identificat trei regiuni cheie suplimentare care implică reziduuri de pe

ambii parteneri de interacțiune. Regiunea de legare de receptor a proteinei S (receptor binding

domain – RBD) interacționează cu un epitop ACE2 care constă în principal din mai multe

reziduuri consecutive situate pe o creastă α-elicoidală lângă capătul N-terminal al proteinei.

Secvența acestei regiuni elicoidale a fost utilizată ca șablon de pornire pentru proiectarea

peptidelor. Simulările noastre preliminare au sugerat o listă cu 4 mutații care, încorporate în

peptidele terapeutice neutralizante mimetice ACE2, au potențialul de a crește afinitatea de

legare.

În continuare, pe baza simulărilor bioinformatice s-a realizat sinteza chimică a primei peptide

din secvenţa primară a receporului uman ACE2

(STIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNT - secvenţa nativă), urmând ca celelalte

peptide mutant, cu capacitate de legare mai ridicată pentru proteina Spike de la suprafaţa

virusului SARS-CoV-2 să fie sintetizate la începutul anului 2021. Sinteza s-a realizat prin

strategia de sinteza în fază solidă pe o răşină ce avea deja cuplat primul aminoacid, rezultând

astfel un randament de cuplare mărit. Peptida rezultată urmează a fi purificată prin

cromatografie de lichide de înaltă performanţă iar masa moleculară va fi determinată prin

spectrometrie de masă de tip MALDI – ToF. Toate peptidele propuse spre a fi sintetizate

(peptide de tip ACE2 - mutant şi peptida ACE2 - nativă) vor fi utilizate in experimente de

afinitate intre cei doi parteneri biogeni pentru a demonstra eficacitatea interacţiunilor.

Ţinta finală a proiectului (proiectată a fi atinsă în anii următori) este:

Demonstrarea prototipului (soluție peptide terapeutice neutralizante cu administrare

inhalatorie) în studiu clinic fază I (optimizare concentrații, identificare efecte adverse,

clearance, eficacitate)

Această direcţie de cercetare a fost inclusă într-o propunere de proiect pentru dezvoltarea

componetei cercetare-inovare în cadrul apelului RIS3 lansat de Agenţia de dezvoltare

Regionala ARD-Nord-EST. De asemenea, rezultatele cercetării acestui proiect sunt integrate

într-un manuscris în curs de preparare [2].

Studiul peptidelor neurodegenerative Aβ 1-16 şi neuroprotectoare de

tip NAP: sinteză, caracterizare și interacțiune cu ioni metalici

Stadiu avansat

Proiectul a urmărit:

(i) Sinteza de peptide (1) Aβ 1-16 şi (2) derivate de la octapeptida nativă NAP, peptidă cu rol

neuroprotector în patologia Alzheimer, utilizând metoda de sinteză de peptide în fază solidă,

SPPS, prin strategia Fmoc. Sintezele propuse au presupus modificarea proprietăților chelatante

și a structurii spațiale prin înlocuirea celui de-al cincilea aminoacid din secvența peptidei native

21

NAPV5SIPQ cu histidină, tirozină, glicină sau alanină.

(ii) Purificarea și caracterizarea peptidelor nou sintetizate prin diverse metode instrumentale.

Stabilirea randamentului de reacție și a purității compușilor obținuți prin cromatografie de

lichide de înaltă performanță. Pentru inverstigări de natură structurală, peptidele obținute au

fost analizate prin spectrometrie de masă de tip MALDI-ToF, spectrometrie de rezonanță

magnetică și nucleară, spectroscopie de UV-vis și experimente de modelare moleculară.

(iii) Generarea de complecși ai peptidelor nou sintetizate cu diverși ioni metalici, cum ar fi

cupru, zinc, fier, argint etc. Reacțiile de complexare realizate pot facilita investigarea

interacțiunilor dintre peptide și ionii metalici în decursul unor boli degenerative. Asemenea

procese au loc în organismul uman, astfel că valoarea pH-ului la care se desfășoară etapa de

complexare trebuie să fie apropiată celui fiziologic. Această etapă a presupus utilizarea de

soluții de peptide și ioni metalici la pH apropiat de pH-ul fiziologic și incubarea acestora la

temperatura camerei.

Proiectul a fost realizat în colaborare cu grupul de Biochimie al Universităţii Alexandru Ioan

Cuza din Iaşi, iar rezultatele cercetării au fost diseminate prin două lucrări ştiinţifice [3, 4].

Parte din rezultatele cercetărilor care au utilizat infrastructura de spectrometrie de masă de tip

MALDI-ToF din cadrul Centrului TRANSCEND au fost incluse în două teze de doctorat

susţinute public în decursul acestui an: Dr. Ancuţa Lupăescu -Februarie - 2020 şi Dr. Monica

Iavorchi - Noiembrie -2020).

Elucidarea dependenţei structurale pentru studiul tirozinelor nitrate

în peptide

Stadiu avansat

Modificările structurale introduse în proteine prin oxidarea catenelor laterale ale aminoacizilor

pot duce la agregarea, fragmentarea, denaturarea și implicit la distrugerea structurii secundare

și terțiare, crescând astfel susceptibilitatea proteolitică a proteinelor modificate. Nitrarea

proteinelor este cunoscută în literatură ca un biomarker al prezenţei stresului oxidativ. În

decursul anului 2020 am finalizat şi diseminat [5] studiul de specificitate a unui anticorp anti-

3NO2-tirozină început spre finalul anului 2019, care nu a fost inclus la raportarea precedentă.

Afinitatea a patru peptide modificate cu nitro-tirozină a fost evaluată prin tehnica ELISA în

raport cu legarea lor specifică de un anticorp monoclonal anti-3NO2-tirozină. Mai mult decât

atât, particularităţile structurale ale secvenţei de peptide native cu situs activ de tirozină şi cele

modificate prin nitrare au fost studiate prin spectroscopie de dicroism circular cu ajutorul

colaboratorilor de la UAIC. Dr. Neamţu (Laboratorul de Bioinformatică) a efectuat

experimentele de modelare moleculară a structurii peptidelor luate în studiu, atât ca structuri

independente peptidice, cât şi ca modele de interacţiune cu anticorp.

În continuare, având evaluată specificitatea anticorpului, dorim să iniţiem studii avansate de

cercetare pentru a obţine noi evidenţe pentru implicarea nitrării în procesul neurodegenerativ

de agregare a polipeptidei Aβ 1-40, studii efectuate în colaborare cu Prof. dr. Lucian Hriţcu,

Facultatea de Biologie/ UAIC.

Investigarea alterărilor profilului peptidomului salivar determinate de

patologia orală

Stadiu incipient

Analiza MS a permis decelarea a 356 de specii distincte peptide (număr total, toți pacienții

incluși). În urma analizei bioinformatice (Principal Component Analysis, dendrograme, analiză

de agregare) au fost identificate un numar de 68 de specii cu expresie diferențiată între cele trei

grupuri de pacienți. Utilizând tehnica MS/MS pe probele fracționate, a fost până acum

identificată secvența aminoacidică a peste 40 din aceste specii, majoritatea fiind reprezentată

de peptide rezultate din clivarea proteolitică a proteinelor salivare (proteine acidice bogate în

prolină, proteine bazice bogate în prolină, staterine, histatine și proteine salivare reglate de

androgeni). Contextul epidemiologic actual nu a permis colectarea de noi probe salivare de la

pacienţi, astfel că au fost continuare studiile demarate în 2019, utilizând probe prelevate în

perioada 2018-2019 și stocate la -150°C.

Identificarea rolului peptidelor salivare bogate în prolină

Stadiu incipient

Deși rolul proteinelor salivare bogate în prolină în legarea și precipitarea taninilor alimentari

este cunoscut, nu se știe dacă peptidele rezultate prin clivarea proteolitică a acestor proteine la

nivelul cavității orale păstrază această capacitate și sau dacă joacă un rol fiziologic la nivelul

cavității orale. Scopul acestui proiect este de a identifica peptidele salivare care intră în

compoziția plăcii dentare, dintre peptidele prezente în secreția salivară. Ipoteza pe care o vom

testa este că acele fragmente peptidice cu secvențe repetitive de prolină (P4-6) interacționează

favorabil cu regiunea C-terminală a proteinelor componente ale placii dentare dobândite,

stabilizând astfel structura acesteia. Am identificat până acum două peptide provenite din

PRPC care împărtășesc structura repetitivă de prolină (P6) și care sunt prezente exclusiv în

placa dentară dar nu și în saliva recoltată de la același pacient. Am realizat studii de modelare

moleculară preliminare care indică legarea preferențială a domeniilor peptidice bogate în

prolină la regiunile bogate în prolină/glutamină ale PRPC prin interacțiuni hidrofobe. Vom

investiga și posibilitatea, bazată pe observațiile preliminare a secvențelor N- și C-terminale, ca

aceste peptide să fie generate de proteaze/ convertaze specifice (la nivelul glandelor salivare) și

nu de proteaze bacteriene nespecifice de la nivelul cavității orale.

Modificările metabolismului cardiac induse de medicația simpatolitică

la un model de obezitate genetică

Stadiu incipient – postulare metode de lucru

În cadrul unui studiu experimental în care a fost evaluat efectul hemodinamic și metabolic al

administrării de clonidină (agonist alpha-2 adrenergic, simpatolitic central) la animale cu

obezitate genetică determinată de disfuncția receptorului de leptină (șobolani Zucker fa/fa),

am observat că utilizarea metabolică a glucozei de către mușschiul cardiac scade în timpul

tratamentului cu clonidină (studii PET-CT cu captare de 18FDG). Acest efect s-ar putea datora

creșterii metabolismului oxidativ cardiac pe seama lipidelor circulante, în detrimentul

utilizării glucozei. Utilizând matrici care favorizează ionizarea lipidelor în MALDI, construim

profilul lipidomic plasmatic la animale obeze în comparație cu animalele normoponderale.

Vom utiliza apoi tehnici de imagistică prin spectrometrie de masă (IMS) pentru a identifica

profilul lipidomic tisular la aceste animale.

Concomitent acestor cercetări, în anul 2020 Laboratorul de Proteomică a răspuns

solicitărilor de colaborare cu:

1. Lector univ. Dr. Leontina Gurgu, de la Centrul de cercetare, expertiză și transfer

tehnologic, Facultatea de Știința și Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunărea de Jos din

Galați, România, participant la Scoala de vara de Proteomica (2019) organizată de IRO în

parteneriat cu UAIC, care a adus probe biologice pentru măsurători de spectrometrie de

23

masă de tip MALDI-ToF. În colaborare cu Dr. Gurgu am publicat două articole ştiinţifice

în reviste de mare impact [6, 7] .

2. Prof. univ. Dr. Lucian Hriţcu, de la Facultatea de Biologie, UAIC cu care colaborăm încă

din anul 2017. Colaborarea şi studiile de cercetare abordează patologia Alzheimer,

bazându-ne pe un model animal AD stimulat cu peptida Aβ 25-35, cea mai agregantă parte

a secvenţelor Aβ 1-40/Aβ 1-42 observate ca material agregant major la nivelul cortexului

în boala Alzheimer. Rezultatul acestei colaborări a fost fructificat într-o lucrare ştiinţifică

[8].

3. Prof. univ. Dr. Costel Darie de la Universitatea din Postdam, NY, USA care ne-a invitat să

ne alaturăm la scrierea a două articole de tip review, care s-au materializat in decursul

acestui an [9, 10].

Publicații: 1. M-C Sardaru, A-M Crăciun, C-M Al Matarneh,IA Sandu, R-M Amărandi, L

Popovici,CI Ciobanu,D Peptanariu, M Pinteala, II Mangalagiu, R Danac (2020) Cytotoxic

substituted indolizines as new colchicine site tubulin polymerisation inhibitors, Journal of

Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 35(1):1581-1595, DOI:

10.1080/14756366.2020.1801671

2. A Neamțu, R Iliescu, R-M Pomohaci, BA Petre, E Carasevici (2020) In silico design

of new neutralizing peptides against SARS-CoV-2 Spike protein, manuscris în curs de

pregătire

3. A-V Lupaescu, I Humelnicu, BA Petre, CI Ciobanu, G Drochioiu (2020) Direct

evidence for binding of aluminum to NAP anti-amyloid peptide and its analogs”, Eur. J. Mass

Spectrom., 26(2):106-116, DOI: 10.1177/1469066719877714

4. L Habasescu, M Jureschi, BA Petre, M Mihai, RV Gradinaru, M Murariu, G Drochioiu

(2020) Histidine-Lacked A beta(1-16) Peptides: pH-Dependent Conformational Changes in

Metal Ion Binding, International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 26:2529–

2546, DOI: 10.1007/s10989-020-10048-0

5. L Ion, A-V Lupaescu, A Neamtu, G Drochioiu, BA Petre (2020) Binding affinities

studies of nitrated tyrosine containing peptides to an anti 3-nitro-tyrosine antibody, Rev. Chim.

71(1): 259-265, DOI: 10.37358/RC.20.1.7843

6. L Grigore-Gurgu, O Crăciunescu, I Aprodu, CA Bolea, A Iosăgeanu, BA Petre, GE

Bahrim, A Oancea, N Stănciuc (2020) Tailoring the Health-Promoting Potential of Protein

Hydrolysate Derived from Fish Wastes and Flavonoids from Yellow Onion Skins: From

Binding Mechanisms to Microencapsulated Functional Ingredients. Biomolecules, 10(10):1416.

doi: 10.3390/biom10101416

7. NN Condurache, I Aprodu, L Grigore-Gurgu, BA Petre, E Enachi, G Râpeanu, GE

Bahrim, N Stănciuc (2020) Fluorescence spectroscopy and molecular modeling of

anthocyanins binding to bovine lactoferrin peptides, Food Chemistry, 318:126508,

DOI:10.1016/j.foodchem.2020.126508

8. RS Boiangiu, M Mihasan, LD Gorgan, BA Stache, BA Petre, L Hritcu (2020) Cotinine

and 6-hydroxy-L-nicotine reverses memory deficits and reduces oxidative stress in Aβ25-35-

https://doi.org/10.37358/RC.20.1.7843

induced rat model of Alzheimer’s disease, Antioxidants (Basel), 9(8): 768, DOI:

10.3390/antiox9080768

9. EJ Dupree, M Jayathirtha, HY, BA Petre, M Mihasan, CC Darie (2020) A critical

review of bottom-up proteomics: the good, the bad, and the future of this field, Proteomes,

8(3):14, DOI: 10.3390/proteomes8030014

10. M Jayathirtha, EJ Dupree, Z Manzoor, B Larose, Z Sechrist, A Neagu, BA Petre, CC

Darie (2020) Mass Spectrometric (MS) Analysis of Proteins and Peptides, Current Protein &

Peptide Science; DOI: 10.2174/1389203721666200726223336;

Prezentări susţinute în cadrul manifestărilor ştiinţifice: 1. Al Matarneh MC, Danac R, Amărandi R-M, Mangalagiu II - "Novel cyano substituted

pyrroloquinoline and pyrroloisoquinoline compounds as potential anticancer agents",

7th INTERNATIONAL CONFERENCE ON COMPUTATIONAL AND

EXPERIMENTAL SCIENCE AND ENGINEERING (ICCESEN-2020) 21-25 October

2020, ANTALYA-TURKEY, poster (ID 151) – online

2. Danac R, Al Matarneh MC, Amărandi R-M, Mangalagiu II - Design, synthesis,

anticancer evaluation and docking of new pyrrolo-fused heterocycles, 7th

INTERNATIONAL CONFERENCE ON COMPUTATIONAL AND EXPERIMENTAL

SCIENCE AND ENGINEERING (ICCESEN-2020) 21-25 October 2020, ANTALYA-

TURKEY poster (ID 152) – online

3. Pomohaci R-M, Al Matarneh MC, Danac R - "Insights into the molecular determinants

of anticancer activity of novel quinoline and isoquinoline compounds", CONFER 2020,

18-21 Noiembrie 2020, Iași, România, prezentare orală – online

4. Al Matarneh MC, Danac R, Amărandi R-M, Mangalagiu II - "Synthesis and

anticancer evaluation of new cyano substituted pyrrolo(iso)quinoline derivatives",

INTERNATIONAL EUROASIA CONGRESS ON SCIENTIFIC RESEARCHES AND

RECET TRENDS VII, 6-9 December 2020, Baku, Azerbaijan, poster – online

5. Neamțu A – “Peculiar thermal properties of EF-SAM may explain the thermal

sensitivity of STIM1”, al XIII-lea congres Național al Societății Române de Fiziologie,

Tg. Mureș, România, 20-24 Octombrie 2020 – online

6. Iliescu R – Renal and global sympathetic activation in hypertension, al XIII-lea

congres Național al Societății Române de Fiziologie, Tg. Mureș, România, 20-24

Octombrie 2020 – online

Proiecte: 1. Membrii celor două Laboratoare de Proteomică şi Bioinformatică din cadrul

TRANSCEND au depus la data de 14. Decembrie 2020, o propunere de proiect pentru

dezvoltarea componetei cercetare-inovare în cadrul apelului RIS3 lansat de Agenţia de

dezvoltare Regionala ARD-Nord-EST. Având ca partener Universitatea Alexandru Ioan

Cuza din Iaşi propunerea de proiect are ca principal scop dezvoltarea unui nou Centru

Regional de Cercetare - Inovare pentru Peptidomică Biomedicală Integrată.

2. R-M Pomohaci a depus un proiect pentru programul “Bursele UNESCO L’Oréal

pentru femeile din ştiinţă” cu titlul “In vitro assaying of enzyme inhibitors for

antineoplastic agent identification” la data de 25 August 2020, care nu a fost acceptat

pentru finanţare.

Indicatori de personal instruit şi beneficiari ai facilităţilor de cercetare ȋn centru

TRANSCEND IRO, Iaşi :

Studenţi – doctoranzi (au beneficiat de acces la infrastructura de spectrometrie de masă de tip

25

MALDI-ToF din cadrul TRANSCEND):

Chimist Ancuța-Veronica LUPĂESCU, “Analogi ai peptidei neuroprotectoare NAP:

sinteză, caracterizare și interacțiune cu ionii metalici”, sub conducerea Prof. Dr. Gabi

DROCHIOIU, susţinere publică Februarie 2020 - UAIC.

Chimist Monica JURESCHI, “Peptide amiloidice: sinteză, caracterizare și aplicații

biomedicale”, sub conducerea Prof. Dr. Gabi DROCHIOIU, susţinere publică

Noiembrie 2020 - UAIC.

Studenţi – master (au beneficiat de acces la infrastructura de spectrometrie de masă de tip

MALDI-ToF din cadrul TRANSCEND):

„Metode avansate de spectrometrie de masă pentru caracterizarea polimerilor cu

activitate biologică, realizată de studenta Blaj Diana-Andreea, de la secția „Chimia

mediului și siguranță alimentară”, a Facultății de Chimie din cadrul Universității „Al.

I. Cuza” din Iași sesiunea iulie 2020.

Studenţi – licenţă (au beneficiat de acces la infrastructura de separare a proteinelor şi

spectrometrie de masă de tip MALDI-ToF din cadrul TRANSCEND):

„Caracterizarea proteinelor prin metode electroforetice și spectrometrie de masă”,

realizată de studenta Medeia Pascu, de la secția „Biochimie medicală”, a Facultății de

Chimie din cadrul Universității „Al. I. Cuza” din Iași. – sesiunea iulie 2020.

„ Izolarea și separea proteinelor din amestecuri biologice complexe”, realizată de

studenta Tanasă Raluca-Elena, de la secția „Biochimie medicală”, a Facultății de

Chimie din cadrul Universității „Al. I. Cuza” din Iași. – sesiunea iulie 2020.

Cursuri de formare profesională/workshopuri - Demystifying Biomedical Big Data: A User’s Guide, oferit online de Georgetown

University, Washington DC, SUA, pe platforma edX (BIOX-201-01x) în perioada Mai-

Iunie 2020. Beneficiar: Pomohaci Roxana-Maria, Certificate of achievement

035bd567d77b41199d76d6a502d2606e din 2 Iulie 2020.

- Introduction to Statistics, oferit online de Bioinformatics Institute, Sankt-Petersburg,

Rusia, pe platforma stepik.org în perioada septembrie-octombrie 2020. Beneficiar:

Pomohaci Roxana-Maria, Certificat nr. 789113 din 2 Octombrie 2020.

V. Departamentul de biomateriale

Maria Daniela VLAD Cercetător științific III

TRANSCEND, Institutul Regional de Oncologie, Iași

TEMA DE CERCETARE:

Evaluarea profilului molecular asociat diferențierii / caracterului osteogenic al celulelor

HOS (linie celulară de osteosarcom uman) co-cultivate cu structuri 3D ceramo-metalice

compozite destinate restaurării tisulare osoase în cazul pierderii de masă osoasă de cauză

oncologică.

Activități: Evaluarea profilului de proliferare si a morfologiei celulelor HOS cultivate în

prezenţa eșantioanelor studiate. Evaluarea caracterului osteogenic: Culturi celulare; Extracție

ARN; Evaluarea prin Real Time-PCR a nivelelor de expresie genica a unor markeri osteogenici

specifici liniilor celulare cu fenotip osteoblastic (fosfataza alcalină, colagen, osteocalcină,

sialoproteina osoasă, factorul de transcripție Runx2).

ARTICOLE PUBLICATE:

Novel titanium-apatite hybrid scaffolds with spongy bone-like micro architecture intended for

spinal application: In vitro and in vivo study. Autori: Maria Daniela Vlada,b,⁎ , Enrique

Fernández Aguadoc , Sergio Gómez Gonzálezc , Iuliu Cristian Ivanovb , Eusebiu Viorel

Şindilard , Ion Poeatăe , Andrei Ştefan Ienceane , Maria Butnarua , Elena Roxana Avădăneie ,

José López Lópezc. *Autor corespondent. Revista: Materials Science & Engineering C:

Materials for Biological Applications, 110 (2020) 110658. DOI: 10.1016/j.msec.2020.110658.

Factor de impact (2019) = 5,88.

ABSTRACT Suporturile-3D din aliaj de titan cu noi arhitecturi poroase interconectate și neperiodice,

asemănătoare osului, au fost printate 3D și umplute cu matrice bioactivă de hidroxiapatită.

Aceste noi suporturi-3D hibride metalo-ceramice au fost testate in vitro prin culturi celulare de

osteoblaste prin contact direct, cu privire la adeziunea celulara, proliferarea, morfologia și

expresia genică a mai multor markeri osteogenici specifici. Suporturile-3D au fost, de

asemenea, evaluate in vivo prin implantarea lor pe procesele transverse și spinoase ale

vertebrelor de ovine, urmata de studiu histologic. Rezultatele in vitro au arătat că: (a)

adeziunea, proliferarea și viabilitatea celulelor nu au fost afectate negativ în timp de factorii

compoziționali (test cantitativ MTT); (b) celulele osteoblastice au fost capabile să adere și să

isi pastreze morfologia normală (microscopie de fluorescentă); (c) probele studiate au avut

capacitatea de a promova și susține diferențierea osteogenică, maturizarea matricei și

mineralizarea in vitro (real-time PCR cantitativ și colorare a matricei mineralizate produse). În

plus, rezultatele in vivo au arătat că suporturile-3D hibride au avut o infiltrare mai mare, cu os

complet mineralizat după 6 luni, decât suporturile-3D din titan fără matrice bioactivă. În

concluzie, aceste noi suporturi-3D hibride ar putea fi o alternativă la dispozitivele actuale de

fuziune spinala, datorită performanței lor osteogenice dovedite (adică comportament

osteoinductiv și osteoconductiv), dupa o ulterioara optimizare dimensională și biomecanică.

Synthetic open cell foams versus a healthy human vertebra: anisotropy, fluid flow and μ-CT

structural studies.Autori: Sergio Gómez González1, José Fernando Valera Jiménez1, Gerard

Cabestany Bastida1, Maria Daniela Vlad2,3, José López López1, Enrique Fernández Aguado1.

Revista: Materials Science & Engineering C: Materials for Biological Applications, 108 (2020)

110404. DOI: 10.1016/j.msec.2019.110404. Factor de impact (2019) = 5,88.

ABSTRACT Spumele comerciale sintetice cu pori deschisi sunt o alternativă la osul cadaveric uman pentru

a simula in vitro diferite scenarii legate de proprietățile de infiltrare osoasă. Din păcate, aceste

spume artificiale nu reproduc microstructura anizotropă a osului natural și, în consecință,

adecvarea lor în aceste studii este extrem de discutabilă. Pentru a realiza suporturi-3D care

imită cu succes osul uman, sunt necesare studii microstructurale atât ale mediilor poroase

naturale, cât și ale abordărilor sintetice actuale la scări de lungime diferite. În această linie,

prezenta cercetare a fost realizată pentru a îmbunătăți înțelegerea anizotropiei locale în osul

vertebral natural și spumelor poroase sintetice asemănătoare osului. Pentru a atinge acest

obiectiv, volume mici de interes din aceste materiale au fost reconstruite prin tomografie

micro-computerizată. Anizotropia microstructurilor a fost analizată atât prin intermediul

http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2020.110658

http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2019.110404

27

principalelor caracteristici histomorfometrice locale, cât și prin comportamentul unui flux

intern calculat prin dinamica computerizata a fluidelor. Rezultatele au arătat că informațiile

obținute pentru fiecare dintre micro-volumele de interes ar putea fi extinse pentru a înțelege nu

numai comportamentul izotrop și / sau anizotrop macroscopic mediu al probelor studiate, ci și

pentru a îmbunătăți proiectarea implanturilor macroscopic poroase, mai potrivite conditiilor

histomorfometrice locale specifice. Rezultatele clarifică, de asemenea, discrepanțele în

permeabilitatea obținută în diferitele micro-volume de interes analizate.

S-a realizat un studiu comparativ profund de perspectivă între microstructura poroasă a osului

vertebral sănătos și cea a spumei rigide cu celule deschise asemănătoare oaselor utilizate în

studiile de permeabilitate in vitro ale cimentului osos. Rezultatele obținute au o relevanță

fundamentală pentru studiile de calcul/simulare, deoarece, pentru a obține valori convergente,

procesul de calcul ar trebui să fie limitat la domenii mici de calcul sau micro-volume de

interes. Acest lucru face ca rezultatele să fie dependente de spațiu și din acest motiv studiile de

calcul nu pot surprinde direct comportamentul macroscopic mediu al unei structuri poroase

anizotrope, precum cea observată în oasele naturale. Rezultatele obținute din acest studiu sunt,

de asemenea, importante, deoarece am putut arăta că informațiile spațiale specifice conținute

într-o singură vertebră sănătoasă sunt suficiente pentru a capta, din punct de vedere geometric,

aceleași informații despre „suprafața specifică vs. porozitate”- cu alte cuvinte, aceeași lege de

bază - care poate fi găsită și în alte oase umane pentru pacienți diferiți, chiar și la vârste

biologice diferite. Aceasta este o constatare importantă care, în ciuda eforturilor depuse și a

controverselor formulate de alți autori, ar trebui studiată mai amănunțit cu alte specii și țesuturi

osoase (sănătoase și / sau bolnave). Mai mult, rezultatele noastre ar trebui să ajute la

înțelegerea faptului că, odată cu capacitățile extinse ale tehnologiilor actuale de imprimare 3D,

există un potențial enorm în proiectarea suporturilor-3D biomimetice poroase asemănătoare

oaselor pentru aplicații de inginerie a țesutului osos.

Dr. Brindusa Dragoi, CSII

Studii privind dezvoltarea de nanoparticule lamelare teranostice pe baza de MnAl si

flurorouracil (FU).

Sinteza: Materiale de tip hidroxizi dublu lamelari de tip NO3-/FU-MnAl obtinute prin sinteza

directa (coprecipitare) in aceleasi conditii ca si cele de tip SO42-/MnAl. Scopul a fost de a

observa influenta naturii anionului anorganic asupra schimbului ionic intre anionul anorganic si

FU dar si asupra structurii lamelare a materialului final.

Sintezele au fost realizate la Facultatea de Chimie de la Universitatea Al.I Cuza din Iasi.

Observatii: Interesant, comportamentul probei obtinuta cu Mn(NO3)2 a fost complet diferit de

cel al probelor cu SO42- implicand reducerea anionilor NO3- la NO2- de catre Mn2+ care a fost

oxidat la o stare de oxidare mai mare, cel mai probabil Mn4+ (s-a obtinut o pudra neagra). In

acelasi timp, pH-ul a scazut de la 10 to 7. In acest caz, este posibil sa nu se fi obtinut un

material lamelar, ci un oxid sau amestec de oxizi pe care sunt adsorbite molecule de FU. In

plus, randamentul de produs a fost inferior fata de cel obtinut cu MnSO4. Acest rezultat

confirma necesitatea realizarii sintezelor in conditii de atmosfera controlata atunci cand

Mn(NO3)2 este folosit ca sursa de Mn. In plus, se poate afirma ca in cazul probelor obtinute cu

MnSO4, anionii SO42- au jucat rol de „agent de gonflare” permitand incorporarea partiala a FU

in spatiul interlamelar.

Caracterizare fizico-chimica: Materialele au fost caracterizate din punct de vedere structural

prin DRX la Ecole Normale Superior de Chimie de Montpellier, Franta. Analiza calitativa si

cantitativa a compozitiei la suprafata (mangan, aluminiu si FU la o adancime de ~ 10 nm) a

materialelor de tip MnAl si SO42-/FU-MnAl s-a efectuat prin XPS. Experimentele s-au realizat

la Institutul de Chimie Macromoleculara P Poni si Universite Claude Bernard Lyon 1-

IRCELYON, Franta.

Observatii: Rezultatele DRX pentru proba obtinuta cu Mn(NO3)2 confirma lipsa structurii

lamelare si prezenta oxidului de tip Mn3O4. Rezultatele XPS confirma prezenta la suprafata a

Mn2+ pentru probele de MnAl cu FU si a Mn4+ pentru proba de MnAl fara FU. De asemenea,

pentru probele cu FU este dovedita si prezenta FU prin semnalele specifice azotului si fluorului

din compozitia acestei molecule.

Studii asupra prepararii de suspensii de tip (FU)MnAl-LDH

Aceste studii au fost centrate pe prepararea de suspensii de nanoparticule de LDH stabile,

necesare studiilor in vitro pe celule. Conform raportarilor din literatura, o dimensiune medie a

NPs pe baza de LDH intre 100 - 200 nm reprezinta dimensiunea optima care asigura

internalizare a NPs in celule. Obtinerea de suspensii de nanoparticule cu stabilitate coloidala

este o activitate laborioasa care implica un efort consistent, deoarece tendinta nanoparticulelor

este de a agrega datorita necesitatii minimizarii energiei de suprafata, fenomen care implica

interactiuni intre particule precum forte van der Walls, hidrofobe, legaturi de hidrogen. Acestea

sunt corelate si cu incarcarea electrica, proprietate care se evalueaza pe baza potentialului Zeta.

Ca urmare, separarea acestor nanoparticle pentru a obtine suspensii stabile implica

impiedicarea fortelor de atractie dintre nanoparticule prin inglobarea lor in diferite matrici

polimerice, surfactanti, proteine, polizaharide etc.

Prima etapa a studiului a constat in identificarea dispersantului/stabilizantului corespunzator

(apa, BSA, sufactatnti anionici si cationici). S-a observat ca cel bun dispersant, din pacate nu si

stabilizant, a fost un polimer cationic. De asemenea, s-au investigat concentratia de dispersant

la o concentratie constanta de nanoparticule, modul si timpul de dispersare. Materialele de tip

MnAl (preparat prin coprecipitare) si SO42-/FU-MnAl (preparat prin coprecipitare si

coprecipitare combinata cu schimb ionic) dispersate intr-un polimer cationic (1%) prin agitare

magnetica (2 h) si ultrasonare (20 min) au fost caracterizate prin DLS (diffuse light scattering)

pentru determinarea dimensiunii hidrodinamice si a stabilitatii colidale (potential zeta).

Pregatirea probelor s-a realizat la centrul de cercetari (CEMEX) al Universitatii de Medicina si

Farmacie Gr. T. Popa din Iasi, iar caracterizarea prin DLS si a potentialului zeta s-a realizat la

Institutul de Chimie Macromoleculara P Poni.

Experimentele s-au realizat in centrul de cercetari TRANSCEND al IRO.

Rezultate reprezentative ale studiilor asupra nanoparticulelor teranostice pe baza de MnAl si

FU fac obiectul a doua manuscrise care sunt in curs de evaluare la reviste cotate ISI. Unul

dintre articole era in stadiul de redactare in raportul din 2019 (etapa de revizie extrem de lunga

este datorata crizei mondiale din cauza carei s-a identificat cu greu un laborator deschis pentru

efectuarea analizei XPS solicitata de catre referenti), iar al doilea a fost redactat anul acesta.

Nanoantibiotice sau nanomateriale cu proprietati « antibiotice »

Evaluarea preliminara a activitatii antibiotice a nanoparticulelor pe baza de silice

mezostructurata (SBA-15), cu si fara heteroatom (Mn), precum si a celor de tip MnAl LDH.

Testele antibacteriene au fost facute pe diferite bacterii de referinta standard (Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212 si

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), precum si MRSA, bacili cu ESBL, Klesiella

pneumoniae folosind o gama larga de concentratii de Mn. Au fost realizate si teste blank

utilizand doar SBA-15 si solutie tampon fosfat. Testele preliminare au dovedit o

biocompatibilitate crescuta a nanomaterialelor preparate. Aceste rezultate sunt asociate fie cu

dimensiunea particulelor de Mn-SBA-15, fie cu concentratia de Mn. In primul caz, desi

nanoparticulele de Mn sunt doar de cativa nm, granula de Mn-SBA-15 este de aproximativ 1

29

priveste concentratia, este posibil ca valorile sa fie inferioare concentratiei minime necesare

pentru manifesta o activitate antimicrobiana.

Testele au fost realizate in cadrul Laboratorului de Microbiologie pentru diagnostic al IRO.

Proiecte de cercetare castigate

H2020 - Coordination and support action, WIDESPREAD-06-2020 (ERA-Chairs)

Enhancing and Strengthening the Excellence in Interdisciplinary Biomedical Research at

TRANSCEND – proiect acceptat la finantare (https://cordis.europa.eu/project/id/952390). Este

al doilea proiect castigat de Romania pana in acest moment. Completarea Grant Agreement-

ului in martie 2020. Contractul cu nr. 952390 a fost semnat la 09.06.2020. Proiectul va incepe

la 01 ianuarie 2021 si se va desfasura pe o perioada de 6 ani, cu un buget de 2.500.000,00 Euro.

PN-III-P3-3.6-H2020-2020 (support pentru proiecte H2020)

Redactarea unui proiect suport pentru ERA-Chairs. Proiectul, in valoare de 1.827.037,50 lei

(15 din bugetul proiectului ERA-Chairs) este deja acceptat la finantare. Contractul cu nr 35 va

incepe la 04 ianuarie 2021 pentru o perioada de trei ani.

Aplicatii de proiecte de cercetare

PNIII, Programul 2: Creşterea competitivitatii economiei romanesti prin cercetare, dezvoltare

si inovare, domeniul de prioritate publica „Sanatate” – Solutii (SOL)

Acest program a fost deschis de catre UEFISCDI in contextul pandemiei CoVid.

In urma trimiterii intentiilor de participare, IRO-TRANSCEND fost selectat pentru a trimite

oferte de proiecte de cercetare care sa se finalizeze cu transfer de tehnologie la agent economic

pentru trei competitii dupa cum urmeaza.

In calitate de coordonator: Solutii 2 - T5- Dezvoltarea de solutii inovative pentru decontaminare impotriva virusului

SARS-CoV-2 (suprafete, echipamente, spatii inchise si deschise).

In calitate de partener: Solutii 2 - T4. Dezvoltarea de solutii inovative pentru protectia personalului (expus

profesional) si a populatiei impotriva contaminarii cu virusul SARS-CoV-2.

Solutii 1 - T6 - ,,Abordari inovative in tratamentul si controlul pacientilor infectati cu virusul

SARS-CoV-2".

Depunerea de proiect s-a concretizat doar pentru Solutii 1, T6 - ,,Abordari inovative in

tratamentul si controlul pacientilor infectati cu virusul SARS-CoV-2". Proiectul isi propunea

dezvoltarea si producerea unui material cu activitate antivirala, care sa poata fi utilizat pentru

prevenirea si limitarea raspandirii agentului patogen SARS-CoV-2. Proiectul era complex

deoarece pornea de la un TRL1/TRL2 (cercetare fundamentala) si trebuia sa ajunga la un TRL

5 (furnizarea unui prototip si transferul tehnologiei, la nivel pilot, catre compania partener in

proiect). Desi comentariile si punctajul (92) a fost bune, proiectul nu a fost acceptat la

finantare.

Pentru celelalte doua competitii nu s-au mai depus proiectele din cauza caracterului prea

accentuat de transfer tehnologic, proiectul trebuind sa porneasca de la un TRL4 pentru a ajunge

la un TRL8. De asemenea, timpul avut la dispozitie in cazul acceptarii la finantare a proiectelor

era mult prea scurt, de doar 3 luni.

PN-III-P4-ID-PCE-2020-2 (Cercetare fundamentala si de frontiera)

Participare la aceasta competitie cu proiectul “Nanostructuri teranostice 2D proiectate pentru

terapia si diagnosticul glioblastomului”. In momentul intocmirii raportului, s-au afisat

rezultatele preliminare ale evaluarii. Prima parte a evaluarii a constat in vizualizarea

comentariilor referentilor urmata de posibilitatea formularii unui raspuns. Dat fiind ca aceste

comentarii trebuiau sa refletce punctele tari si punctele slabe ale propunerii de proiect, fara sa

fie insotie si de un punctaj, a fost greu de apreciat punctajul final. Totusi, comentariile facute

anuntau un punctaj final in jur de 90, nu 77.4. Deoarece punctajul primit nu reflecta

comentariile in timp ce vicii de procedura au fost identificate (considerarea completa a

comentarilor unui singur evaluator si selectiva si subiectiva a comentariilor celorlalti doi

evaluatori, precum si a depunctarii de doua ori a aceluiasi comentariu), urmeaza sa depun o

constestatie.

Alte activitati

Primele demersuri pentru organizarea si echiparea Laboratorului de Chimie pentru dezvoltarea

de nanomateriale in cadrul TRANSCEND:

Identificarea spatiului si a necesarului (echipamente mari, echipamente mici, sticlarie, diverse

materiale si consumabile de laborator).

Identificarea si contactarea firmelor de distributie in vederea intocmirii referatelor de necesitate

si a caietelor de sarcini.

Identificarea si stabilirea echipei de implementare a proiectului de dezvoltare a laboratului de

nanomateriale (proiect PNIII suport).

Primele activitati asociate proiectului H2020-ERA-Chairs (ESEI-BioMed)

09.09.2020, Bucuresti, Romania: Prezentarea proiectului castigat in cadrul evenimentului

online de prezentare a noului program Orizont Europa, organizat de catre Ministerul Educatiei

si Cercetarii.

22-24.09.2020, Bruxelles, Belgia: participare la evenimentul online “European Research and

Innovation Days” organizat de catre Comisia Europeana. In cadrul evenimentul a fost publicat

un anunt de promovare a proiectului castigat.

06.10.2020, Bucuresti, Romania: participarea la evenimentul online “Open Science strategic

approaches and the importance of open research data” organizat de catre UEFISCDI.

31

05.11.2020, Bucuresti, Romania: invitatie la dezbaterea online “Rolul cercetarii si inovarii in

oncologie”, organizata de catre Ministerul Educatiei si Cercetarii pentru a prezenta partea

stiintifica a proiectului (05.11.2020).

24.11.2020, Bruxelles, Belgia: participare la evenimentul online "ERA-Chairs Coordinators'

Day" organizat de catre Comisia Europeana.

27.11.2020, Bruxelles, Belgia: participare la evenimentul online "Horizon 2020 Coordinators'

Day (Amendments and Reporting)" organizat de catre Comisia Europeana.

Activitati organizatorice si de management:

a.i. stabilirea leader-ilor pentru pachetele de lucru Comunicare si Etica,

a.ii. stabilirea, impreuna cu Mangerul IRO, a echipei adiministrative implicata in

proiect.

a.iii. discutii cu echipa administrativa a IRO in legatura cu procedura de angajare si

intocmirea dosarelor pentru angajarea echipei de management

Activitati legate de crearea site-ului proiectului si a materialelor promotionale; identificarea

agentiei responsabila cu realizarea acestor activitati.

Referent stiintific pentru revistele Industrial & Engineering Chemistry (ACS), Catalysis Letters

(Elsevier) si Arabian Journal of Chemistry (Elsevier).

VI. Departamentul de Radiofarmacie

Introducere

Activitatea de cercetare a Laboratorului de Radiofarmacie a urmărit să continue

obiectivele propuse în anul precedent, și anume, studierea metodelor curente de sinteză și

analiză a radiofarmaceuticelor cu cea mai largă utilizare în cadrul laboratoarelor de medicină

nucleară în vederea elaborării unor proceduri adecvate noilor compuși sintetizați.

Activitate Studierea radiofarmaceuticelor utilizate în imagistica medicală modernă reprezintă o

primă etapă în elaborarea unor produse noi, care să crească capacitatea de diagnosticare a

laboratoarelor de medicină nucleară. Noii compuși trebuie să satisfacă rigorilor impuse în

practica medicală (activitate specifică mare, eliminare biologică comparabilă cu durata

necesară investigației, marcare rapidă și eficientă din punct de vedere al costurilor, localizare

rapidă în țesutul investigat) dar urmând un proces de sinteză caracterizat printr-un randament

mai mare sau care să ofere noi posibilități de diagnosticare. Din acest motiv

Fluorodeoxiglucoza marcată cu izotopul de fluor-18 ([18F]-FDG) reprezintă un

radiofarmaceutic model, fiind cel mai comun radiotrasor utilizat în imagistica medicală cu

emisie de pozitroni (PET). Caracteristicile fizice, chimice și biologice ale FDG-ului cât și

particularitățile procesului de fabricație reprezintă un reper față de care dezvoltarea oricărui

nou produs cu aplicații în imagistica medicală trebuie raportat.

Suplimentar, utilizarea izotopilor + radioactivi produși în ciclotroane de mici

dimensiuni (18F, 11C, 13N, 15O) cât și a altor izotopi cu aplicații medicale (99mTc și 123I) poate fi

extinsă în vederea marcării unor compuși noi cu aplicații biologice și medicale, aflați în faze

inițiale de cercetare și dezvoltare, cum ar fi cele terapeutice sau de studiere a proceselor

biomoleculare. Marcarea cu izotopi radioactivi ar permite evaluarea eficacității și specificității

acestor noi compuși cu ajutorul tehnicilor actuale de detecție. Studierea proceselor de fabricație

specifice radiofarmaceuticelor, cum sunt cele pentru [18F]-FDG, ar putea oferi posibilitatea de

realizare a etapelor de marcare prin intermediul echipamentelor automate de sinteză specifice

domeniului, în condiții aseptice și în conformitate cu reglementările GMP.

Având în vedere cele enumerate, s-a propus un studiu asupra aspectelor teoretice și

practice ale [18F]-Fluorodeoxiglucozei, a cărui rezultate au fost integrate în cadrul unui articol

publicat (Theoretical and Practical Aspects of 18F-FDG PET, C. P. Măirean, A. Ciucă, A. F.

Spac, G. M. Dimofte & M. Hăncianu, The Medical-Surgical Journal, 2020, Vol. 124, 2).

Formare profesională Personalul laboratorului de radiofarmacie, responsabil cu activitatea de sinteză, CS III

dr. Adrian Florin Șpac, și cu analiza fizico-chimică, ACS Ciprian-Paul Măirean, au obținut

permisul nivel II în domeniul nuclear specific activităților desfășurate (SD, SD) în urma

susținerii unei examinări la Comisia Națională pentru Controlul Activității Nucleare (CNCAN).

Alte activități În vederea calificării instalației HVAC (Heating Ventilation Air Conditioning) și a

camerelor pe clase de curățenie conform standardelor ISO-14644 și a reglementărilor GMP

(Good Manufacturing Practices) s-a propus monitorizarea continuă a parametrilor de mediu

critici pentru procesul de cercetare și fabricație: presiune, temperatură și umiditate. Studierea

stabilității acestor parametri în timp permite evaluarea performanței sistemului de ventilație în

condiții atmosferice variate (sezon cald/sezon rece, vreme stabilă/instabilă) și condiții diferite

de activitate (în operare/în repaus). Pentru a evalua această stabilitate s-au utilizat o serie de

parametri specifici controlului statistic al procesului: valoarea medie a parametrilor, deviația

standard, valoarea medie, valorile de minim și maxim, limitele specificate (LSL, USL), limite

de control(LCL, UCL) și indicele de capabilitate al procesului (Cpk).

Temperatura Măsurarea temperaturii și a umidității s-a realizat cu ajutorul instrumentelor de tip E+E

Elektronik, montate în grilele de evacuare aferente fiecărei camere, integrate în două

înregistratoare numerice multicanal ISU-MMC-24C.Temperatura ambientală în interiorul

camerelor curate destinat cercetării, fabricării și analizei produselor farmaceutice a fost aleasă

în funcție de mai mulți factori cum ar fi: parametrii de operare a aparaturii de laborator,

stabilitatea materiilor prime și a produsului final, etapele de analiză fizico-chimică și nu în

ultimul rând confortul personalului. Prin analiza acestor factori s-a stabilit o temperatură

nominală de 22 °C cu o deviație maximă de ± 2 °C. Stabilitatea temperaturii a fost analizată pe

toate camerele din cadrul laboratorului, în condiții extreme de temperatură atmosferică (min: -5

°C și max: +35 °C). Data analiza: 17.01.2020 17.07.2020

Parametri listați: T T MINIM 20,62 19,76 MAXIM 21,44 21,17 MEDIA 21,32 20,87

DEVIATIE STANDARD 0,19 0,23 LSL(lower specification

limit) 20,00 20,00

USL(upper specification

limit) 24,00 24,00

LCL(lower control limit) 20,76 20,18 UCL(upper control limit) 21,87 21,56 CPK(process capability) 2,36 1,26

33

Umiditatea Umiditatea relativa (RH%) ambientală optimă pentru operațiunile specifice fabricației

farmaceutice este în jurul valorii de 50%, luându-se în calcul următorii factori:

la valori mai mici electricitate statică este generată ușor și disipată lent, ceea ce ar duce

la perturbarea procesului prin deteriorarea echipamentelor electronice sensibile și

prin atragerea particulelor din aer și contaminarea suprafețelor.

la valori mai mari se vor accelera procesele de condensare și corodare ce ar duce la

deteriorarea echipamentelor electronice.

Astfel pentru procesele specifice domeniului radiofarmaceutic am stabilit o valoare

nominala de 50 ± 15 % RH. Această valoare este menținută prin intermediul a două procese ce

funcționează în paralel, în funcție de condițiile atmosferice. În condiții de umiditate

atmosferică relativă mare (RH > 50%), predominant în sezonul cald, aerului este dezumidificat

prin scăderea temperaturii sub valoarea punctului de rouă și condensarea vaporilor de apă în

interiorul instalației HVAC. În sezonul rece, când aerul este uscat (RH < 50%), umiditatea este

crescută cu ajutorul unor umidificatoare, care injectează în aerul introdus în camera vapori de

apă la temperatură ridicată. Aceste două procese permit păstrarea condițiilor optime necesare

activității laboratorului. Monitorizarea este realizată de aceeași senzori ca și în cazul

temperaturii dar, aceste valori sunt integrate într-un ISU-MMC dedicate și prelucrate de

sistemul informatic Citect SCADA.

Studiul asupra valorile înregistrate de sistem în sezonul rece și sezonul cald ne arată

modul de operare și limitările celor două mecanisme descrise anterior prin faptul că valorile

medii ale umidității relative sunt mai mari în sezonul cald (17.07.2020) decât în sezonul rece

(17.01.2020). Data analiza: 17.01.2020 17.07.2020

Parametri listați: U U MINIM 43,25 52,12 MAXIM 45,39 57,11

MEDIA 44,15 53,69 DEVIATIE STANDARD 0,44 1,03 LSL(lower specification

limit) 35,00 35,00


limit) 65,00 65,00

LCL(lower control limit) 42,83 50,60 UCL(upper control limit) 45,46 56,78 CPK(process capability) 6,96 3,66

Presiunea Presiunea în camere a fost monitorizată cu ajutorul senzorilor diferențiali Siemens,

având ca referință comună presiunea atmosferică din afara laboratorului. Alegerea referinței de

presiune trebuie sa fie de așa natură încât sa asigure o raportare imparțiala, indiferent de stările

de funcționare ale sistemelor de ventilație din dotarea laboratorului. Astfel orice perturbație

locală, datorată funcționării echipamentelor, a accesului în camere, a utilizării sistemelor de

transfer materiale sunt corect observate.

Configurarea cascadelor de presiune în laboratoarele de cercetare și producție de

radiofarmaceutice trebuie să ia în considerare atât normele de securitate radiologică cât și

cerințele GMP. Radioprotecția urmărește să protejeze mediul de contaminarea cu materiale

radioactive, pe când normele GMP urmăresc să protejeze produsul farmaceutic de contaminanți

externi ce provin din mediu. Pentru a proteja camerele de aerul viciat din jur s-a implementat

un sistem de presurizare progresivă ce asigură presiuni ale aerului mai mare cu 15 Pa față de

spațiile adiacente și față de atmosferă. În camerele în care există un risc ridicat de contaminare

radioactivă a personalului sau a spațiilor învecinate s-a implementat o presiune mai mică decât

35

spațiile adiacente dar totuși mai mare decât atmosfera. În acest fel contaminarea nu poate să fie

propagată de personal sau de fluxurile interne de aer în afara camerei în care s-a produs. Pe

baza acestor considerente s-au creat următoarele cascade de presiune:

Cod

camera

Denumire cameră Presiune

diferențială (Pa)

RF-16 Zona controlata 10

RF-17 SAS Personal 20

RF-18 Zona curata 25

RF-19 Microbiologie 2 40

RF-20 SAS Personal 40

RF-21 Microbiologie sterila 55

RF-22 Camera curățenie 25

RF-23 Microbiologie 2 40

RF-24 Preparare medii/soluții 40

RF-25 Acces HOTLAB 40

RF-26 Hotlab Cercetare 55

RF-27 Hotlab Producție 55

RF-28 Etichetare 25

RF-29 Distribuție 10

RF-30 Control calitate 10

RF-31 Echipamente schimb 25

RF-32 Pregătire materie prima 25

RF-33 Decontaminare 10

RF-34 Carantina deșeuri 10

Referința atmosferică, atât pentru sistemul de monitorizare cât și pentru sistemele de

automatizare ale instalației HVAC este comun pentru a nu se crea discrepanțe între valorile

înregistrate de sistemul de monitorizare și valorile în jurul căruia sistemul își realizează

automat regimul de funcționare. Pentru a filtra variațiile de presiune atmosferică, datorate

fenomenelor meteorologice, variațiilor locale de temperatură și cele induse de succesiunea zi-

noapte, referința atmosferică a fost integrate într-un sistem de protecție.

Într-o primă fază, s-a putut observa, în condiții de repaus, o stabilitate mare a

presiunilor înregistrate, cu avariații de ± 2 Pa, aflate în interiorul limitelor de alertă. Fluctuațiile

observate caracterizează funcționarea normală a instalației HVAC și modul de circulare al

aerului în interiorul spațiilor, antrenat de frecvența regulatoarele de debit pentru introducerea și

extracția aerului, de clapetele de debit variabil (VAV) și de poziționare clapetelor de debit

constant (CAV).

A doua etapă a fost studierea presiunilor în momentul realizării accesului în diferitele

compartimente, pentru a evalua timpii de revenire a presiunilor la valorile nominale în

condițiile introducerii unei perturbații semnificative. Realizarea accesului între zone în care

există o cădere de presiune a indus o perturbație observabilă dar de o durată scurtă de timp,

comparabilă cu timpul de tranzit între spații.

37

Cu excepția acestui proces, activitatea personalului în interiorul camerelor și utilizarea

echipamentelor nu a introdus perturbații semnificative în valorile presiunilor înregistrate și în

stabilitatea acestora. Sistemul de monitorizare Citect realizează o filtrare și o prelucrare a

datelor înregistrate

O etapă suplimentară în evaluarea stabilității cascadelor de presiune din interiorul

laboratorului a fost în momentul apariției instabilităților atmosferice, sub forma de furtuni,

vijelii și alte fenomene meteorologice caracterizate prin variații rapide ale maselor de aer la

nivelul referinței atmosferice. Aceste fenomene au fost înregistrate de sistem ca variații ale

presiunilor diferențiale din camere și astfel ar fi putut fi confundate cu scădere în performanța

instalației HVAC și în capacitatea acesteia de a păstra constante cascadele de presiune. În

realitate însă, această perturbație a fost doar la nivelul referinței atmosferice unde sistemul

pasiv de amortizare nu a mai putut amortiza mecanic variațiile bruște ale curenților de aer.

Pentru a confirma această ipoteza referința atmosferică a fost mutată pe holul de acces

al laboratorului, care este conectat la atmosferă dar care este protejat de instabilități prin natura

infrastructurii sale (pereți, uși, dimensiune, diferență de nivel). La realizarea acestui schimb de

referință, presiunile au înregistrat o scădere bruscă cu 5 Pa în valorilor înregistrate și o

dispariție completă a perturbațiilor observate anterior.

Acest lucru ne arată că mutarea referinței la o adâncime de 4 metri față de suprafață

(laboratorul fiind localizat la nivelul subsolului din considerente de radioprotecție) determină o

creștere a presiunii atmosferice locale, din considerente barometrice. Totodată, dispariția

perturbațiilor înregistrate odată cu îndepărtarea fenomenelor atmosferice confirmă ipoteza

inițială. Cu toate acestea utilizarea unei referințe interne, de la nivelul unui hol de acces nu

reprezintă o soluție ideală datorită faptului că aceasta este influențată de camerele și spațiile

adiacente și indirect de funcționarea instalației HVAC. Acest lucru ar masca orice

neuniformități ar putea apărea în funcționarea centralei și care ar duce la dispariția cascadelor

de presiune și la compromiterea proceselor din cadrul laboratorului.

39

În vederea filtrării suplimentar a referinței atmosferic s-a realizat o filtrare digitală a

valorilor oferite de traductorii diferențiali de presiune și o filtrare mecanică prin plasarea

sistemului vechi de amortizare într-un recipient suplimentar. Noul sistem a fost prevăzut cu o

izolare termică, urmată de o izolare cu materiale filtrante astfel încât referința să fie protejată

de orice fluctuații atmosferice. Suplimentar, tubul de legătura dintre sistemul de amortizare

exterior și senzorii de presiune a fost prevăzut cu încă un amortizor. Tot acest sistem de filtrare

în serie asigură o comunicare cu atmosfera în condiții optime pentru a se realiza o monitorizare

corectă a cascadelor de presiune din interiorul laboratorului. Parametri listați: P1 U T

MINIM 55,08 43,90 22,17 MAXIM 57,36 45,50 22,29 MEDIA 56,31 44,66 22,23

DEVIATIE STANDARD 0,42 0,34 0,03 LSL(lower specification

limit) 50,00 35,00 20,00


limit) 60,00 65,00 24,00

LCL(lower control limit) 55,06 43,64 22,14 UCL(upper control limit) 57,57 45,69 22,32 CPK(process capability) 2,95 9,42 20,61

În concluzie monitorizarea și analiză continuă a parametrilor de mediu din interiorul

laboratorului reprezintă doar o primă parte a procesul de calificare a instalației HVAC și a

camerelor curat potrivit standardele ISO dar critică pentru realizarea proceselor de producție,

sinteză, analiză și cercetare în conformitate cu reglementările GMP.

Data: Coordonator interimar IRO-TRANSCEND

I. Departament Culturi de Celule, Microscopie Digitala si ......Culturi de celule, Microscopie...

Documents

Transcript of I. Departament Culturi de Celule, Microscopie Digitala si ......Culturi de celule, Microscopie...