Metode de precipitare

Precipitarea cu sulfat de amoniu

Fenomenul de salting-out = mărirea tăriei ionice a soluţiei determină o reducere a efectelor de respingere dintre moleculele identice ale unei proteine datorită încărcării electrice similare. Totodată se reduc şi forţele ce menţin stratul de hidratare din jurul moleculei proteice

Precipitarea izoelectrică

Se bazează pe faptul că proteinele precipită când prezintă sarcina electrice neta egala cu zero – ceea ce se întâmplă la pH izoelectric – deoarece reacţiile de respingere dintre sarcinile electrice de acelaşi fel sunt cele care menţin

proteinele în soluţie

Precipitarea cu solvenţiSolvenţii acţionează prin reducerea constantei dielectrice a mediului, ceea ce se traduce prin reducerea solubilităţii proteinelor datorită favorizării interacţiilor proteină-proteină în locul

interacţiilor proteină-solvent

Precipitarea la căldurăSe utilizează, în general, pentru îndepărtarea proteinelor contaminate şi se bazează pe stabilitatea diferită a

proteinelor la temperaturi ridicate

Proteine dizolvate in apa

Proteine in prezenta de sulfat de amoniu

gheata

magnet

vaslizat

agitator

vas pentru gheata

Protocol de lucru lizatul se supune operatiei de clarificare princentrifugare; supernatantul clarificat se transfera intr-un vas racit cu gheata si care este prevazut cu un agitator magnetic;Se noteaza volumul exact de supernatant;Se introduce vasul ce contine supernatantul intr-o baie de gheata;Se cantareste cantitatea de sulfat de amoniu ce urmeaza a fi adaugata, calculata conform % de saturatie stabilit si volumului de supernatant;Se adauga sulfatul de amoniu in stare solida, in portii mici, sub agitare continua;

Adaugarea unei portii noi din cantitatea cantarita de sulfat de amoniu se face dupa dizolvarea portiei anterioare;Dupa adaugarea intregii cantitati de sulfat de amoniu corespunzatoare % de saturatie, agitarea suspensiei se continua inca o ora, la rece, pana la definitivarea precipitarii;Se centrifugheaza la 10.000g, timp de 15 min, la 40C ;Depozitul contine proteine precipitate ce pot fi dizolvate intr-un tampon adecvat in vederea analizei si , eventual, purificarii ulterioare;Pentru a precipita,, si alte proteine din lizat, supernatantul este supus, in continuare, fractionarii, urmandu-se aceleasi etape,

Proteine extracelulare

Mediu+celule

supernatant celule

concentrare

EXTRACT BRUTExtract proteic total

EPT

separare

Proteine intracelulare

Mediu+celule

supernatantcelule

dezagregare

Omogenizat brut

separare

debriuri supernatant

clarificare

concentrare

EXTRACT BRUTExtract proteic total

EPT

Extract proteic brutAdaugare (NH4)2SO4 solidsaturatie 0-X%

centrifugare

Precipitat I

Supernatant saturatie 0-X%

Adaugare (NH4)2SO4 solidsaturatie X-Y%

centrifugare

Precipitat II

Supernatant saturatie X-Y%

centrifugare

Precipitat III

Supernatant saturatie Y-90%

Adaugare (NH4)2SO4 solidsaturatie Y-90%

Fracţiesaturaţie

(NH4)2SO4(%)

% activ. enzim.

precipitată

% proteină precipitată

Factor purificareper etapă de fracţionare

0-40 4 25 4/25 = 0,2

40-60 62 22 62/22 = 2,8

60-80 32 32 32/32 = 1,0

supernatant 80%

2 21 2/21 = 0,1

Fracţie % activ. enzim.

% proteină Factor purificare

0-45% 6 32 6/32 = 0,2

45-70% 90 38 90/38 = 2,4

supernatant 70%

4 30 4/30 = 0,1

Fracţie % activ. enzim.

% proteină Factor purificare

0-48% 10 35 10/35 = 0,3

48-65% 75 25 75/25 = 3,0

supernatant 65%

15 40 15/40 = 0,4

Experiment 1

Experiment 2

Experiment 3

DIALIZA

Sisteme apoase bifazice

Exemple :•agar amestecat cu amidon sau gelatina solubila;•dextran-polietilen glicol (e.g. 10% PEG 4000/2% dextran T500), unde dextranul formeaza faza mai hidrofila, cu densitate mai mare (faza din partea inferioara) si PEG reprezinta faza

mai hidrofoba, mai putin densa (faza din partea superioara) •10% PEG 4000/12.5% tampon fosfat de potasiu

Avantaje:•Separare rapida a materialului biologic;•Foarte mica probabilitate de denaturare a materialului biologic;•Tensiunea interfazica este foarte mica (de aprox.400ori mai mica decat cea dintre apa si un solvent nemiscibil cu apa) ;•Suprafata interfaciala mare•Amestecare eficienta in conditii blande de agitare a sistemului;•Partitie rapida;•Polimerii au influenta de stabilizare asupra proteinelor

Cromatografia pe hartie si in strat subtire

Definitie=este o procedura folosita pentru a separa substantele dintr-un amestec pe baza mobilitatii diferite a componentelor

Componente:•Faza stationara: hartia poroasa•Faza mobila: solventul (apa, alcool, eter, acetona,etc)

Mecanismul de distribuţie este de tip lichid-lichid

Procedee experimentale

Tratamentul pregătitor Aplicarea probei Developarea tehnica descendentă; tehnica ascendentă; tehnica orizontalăVizualizarea (revelarea)

)mobilã(h faza de parcursa distanta

(solut de parcursã distanta

m

Z

f

hR

Metode cromatografice pe coloana

Cromatografie de schimb ionic

Cromatografie de excludere din gel (gel-cromatografia)

Cromatografie de afinitate

Cromatografia pe coloana= fractionare sau purificarePrincipiul de baza consta in trecerea unui amestec de proteine printr-o coloana de sticla sau

de plastic ce contine o matrice (suport) solida, de obicei Pregatirea coloanei1. Se suspenda matricea (rasina, schimbatorul de ioni, suport) in tampon de echilibrare;2. Se umple coloana de sticla cu tampon de echilibrare, avand robinetul coloanei inchis;3. Se deschide robinetul, permitand curgerea cu viteza foarte mica a tamponului;4. Cu ajutorul unei pipete se incarca coloana cu suspensia de rasina;5. Se permite depunerea libera a rasinii pana la nivelul necesar;6. Se spala coloana cu 2-3 volume de tampon de echilibrare, inainte de a aplica proba.Realizarea cromatografiei pe coloana• Diferitele proteine strabat matricea cu viteze diferite datorate caracteristicilor lor chimice

si felului in care aceste caracteristici determina interactia lor cu matricea• Atat amestecul de proteine cat si matricea sunt imersate in solvent.• Proba (amestecul de proteine in solvent) este aplicat la capatul superior al coloanei, iar

solventul permite strabaterea lenta a coloanei umplute cu suport.• Odata ce proba a patruns in interiorul matricei, solventul continua sa fie adaugat (nu este

permis ca suportul sa fie in stare uscata).• Solventul este colectat in eprubete separate (fractionare) pe la partea inferioara a coloanei.• Diferitele componente ale amestecului de proteine parcurg coloana cu viteze diferite in

functie de proprietatile chimice si pot fi astfel fractionate in probe separate.