Metode şi tehnici de purificare

1. Metode de precipitare sunt utile pentru concentrarea probelor supuse prificării şi sunt ideale pentru etapele iniţiale de purificare. Pot fi folosite la scară mare şi nu sunt influenţate de prezenţa compuşilor de interferenţă, ca în cazul metodelor cromatografice.

In solutie , moleculele de proteina sunt foarte puternic hidratate, gruparile ionice de la suprafata acesteia atragand si fixand foarte puternic numeroase molecule de apa.

Adaugarea unei cantitati semnificative de saruri , ex. sulfat de amoniu, in solutia ce contine proteina are ca rezultat aparitia unei interactii puternice dintre ionii sarurilor respective si moleculele de apa, inclusiv a celor din vecinatatea moleculelor proteice, efectul final fiind de indepartare a moleculelor de apa din jurul proteinelor aflate in solutie. Acest efect se datoreaza, in parte, densitatii mari de sarcini electrice din compozitia sarurilor comparativ cu cea din structura proteinelor.

Aparitia interactiilor dintre ionii sarurilor adaugate in solutia proteica cu moleculele de apa, va elimina in buna parte stratul de hidratare din jurul fiecarei molecule proteice si va favoriza, de data aceasta, interactia dintre moleculele proteice si, implicit, aparitia fenomenului de agregare proteica. Prin adaugarea de cantitati suficient de mari de saruri, acest fenomen se va concretiza prin precipitarea proteinei din solutia apoasa.

Proces se numeste “salting out” si este caracteristic anionilor sarurilor divalente, cum ar fi sulfatul de amoniu.

In cazul in care precipitarea se realizeaza la temperaturi scazute (ex. in gheata), proteina va precipita fara a se produce denaturarea acesteia, respectiv mentinerea conformatiei acesteia. Proteina precipitata se poate colecta prin centrifugare.

Precipitatul proteic poate fi redizolvat in solutie cu ajutorul unei solutii cu continut scazut de saruri.

In acest caz are loc fenomenul invers, respectiv “salting in”, si anume scaderea concentratiei de saruri din mediu va favoriza stabilirea de interactii intre moleculele de proteina si moleculele de apa, va separa moleculele de proteina unele de celelalte si va restabili solubilitatea proteinei in solutie.

1.1. Precipitarea cu sulfat de amoniuFenomenul de salting-out în prezenţa sărurilor în mod particular a

sulfatului de amoniu, se explică prin faptul că mărirea tăriei ionice a soluţiei determină o reducere a efectelor de respingere dintre moleculele identice ale

1

unei proteine datorită încărcării electrice similare. Totodată se reduc şi forţele ce menţin stratul de hidratare din jurul moleculei proteice. Când aceste forţe sunt suficient de reduse, proteina va precipita, proteinele hidrofobe precipitând la concentraţii de săruri mai mici decât cele hidrofile.

Sulfatul de amoniu este cel mai des folosit, fiind preferat datorită solubilităţii mari, lipsei de toxicitate faţă de cele mai multe enzime, efectului de stabilizare asupra activităţii acestora şi datorită preţului redus al reactivului.

Folosirea acestuia la scară mare este, totuşi, limitată datorită efectului de coroziune, problemelor legate de colectarea precipitatului după centrifugare şi posibilităţii de a elibera în mediu amoniac gazos, la valori alcaline de pH.

Rezultatele reproductibile pot fi obţinute numai în cazul în care se menţin constante valorile de pH, temperatură şi concentraţie proteică.

Fracţionarea amestecurilor de proteine prin creşterea tăriei ionice este o metodă eficientă de purificare parţială.Ex. Dozare în supernatant

Sulfat de amoniu(% de saturaţie) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90Determinare (A280nm) proteină

1000 900 600 200 100 75 50 40 25 20

Determinare specifică (unităţi)

200 200 200 190 170 100 30 5 0 0

Observaţii

Concentraţia de sulfat de amoniu se referă la % de saturaţie şi nu de concentraţie procentuală a unei soluţii obişnuite. Pentru a determina aceste procente de saturaţie se folosesc tabele speciale sau nomograma lui Dixon. Rezultatele acestui experiment arată că:

- la 30% (NH4)2SO4 precipită aproximativ 80% din totalul de proteină din probă, dar aproximativ 95% din proteina ţintă se află încă în soluţie;

-la 80% (NH4)2SO4 întreaga cantitate de proteină-ţintă este precipitată.Concluziile experimentului:- se adaugă 30% (NH4)2SO4, se centrifughează şi se îndepărtează precipitatul ce conţine ~80% din proteina-contaminantă;- se adaugă în supernatantul de la prima etapă de fracţionare (NH4)2SO4 până se atinge 80% saturaţie. Se centrifughează şi se reţine precipitatul ce conţine 95% din proteina-ţintă.

2

În acest caz concret, factorul de purificare este 5, iar randamentul de purificare 95%.Calculul Activitate specifică iniţială = 200U/1000mg prot = 0,2U/mg

Activitate specifică 80% = 190U/175mg prot = 1,08U/mg

Factor purificare = 5Exemplul prezentat reprezintă un caz ideal deoarece la concentraţii

relativ mici de saturaţie în (NH4)2SO4 precipită cea mai mare parte dintre proteinele-balast.

De obicei, însă, la concentraţii mici de (NH4)2SO4 precipită cantităţi mici de proteine, cea mai mare parte dintre proteine fiind precipitate la concentraţii mai mari.

Abordarea prezentată, care se bazează pe dozarea cantitativă a proteinei şi a activităţii specifice în supernatantul obţinut pe parcursul etapelor de fracţionare cu (NH4)2SO4 este folosită mai rar, datorită interferenţelor dintre metodele de dozare (inclusiv metoda Lowry) şi ionul de amoniu din soluţie.

O altă modalitate de abordare, cea mai des folosită, este precipitarea succesivă, dintr-un domeniu de saturaţie în altul, şi determinarea atât a parametrilor de monitorizare, cât şi ai parametrilor purificării prin dozarea proteinei şi a activităţii specifice în precipitatul obţinut la fiecare etapă de fracţionare.

Ex.Fracţie

saturaţie(NH4)2SO4

(%)

% activ. enzim. precipitată

% proteină precipitată

Factor purificareper etapă de fracţionare

0-40 4 25 4/25 = 0,2

40-60 62 22 62/22 = 2,860-80 32 32 32/32 = 1,0

supernatant 80%

2 21 2/21 = 0,1

În domeniul 40-80% saturaţie (NH4)2SO4 se regăseşte 94% din activitatea enzimatică şi 54% din proteina totală, cu un factor de purificare de 1,7.

Deoarece în fracţia 40-60% se obţine un factor de purificare mai bun decât în fracţia 60-80%, iar activitatea enzimatică recuperată în această fracţie este aproape de 2 ori mai mare, se trece la o altă variantă, modificând domeniile de fracţionare.

3

Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare0-45% 6 32 6/32 = 0,2

45-70% 90 38 90/38 = 2,4supernatant 70% 4 30 4/30 = 0,1

În fracţia 45-70% se recuperează 90% din activitatea enzimatică şi 38% din proteina totală, cu un factor de purificare de 2,4, obţinându-se o probă mai înalt purificată decât în cazul precedent.

Factorul de purificare din fracţia 45-70% este însă inferior celui din fracţia 40-60%. De aceea, dacă se doreşte îmbunătăţirea acestuia se poate continua optimizarea fracţionării.

Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare0-48% 10 35 10/35 = 0,3

48-65% 75 25 75/25 = 3,0supernatant 65% 15 40 15/40 = 0,4

Se obţine fracţia cu cea mai mare puritate, factorul de purificare fiind de 3, dar recuperarea este de doar 75%.

În funcţie de scopul urmărit se poate alege între:- varianta cu puritate mare şi randamentul mic (în cazul procesul de purificare se opreşte în această fază, puritatea fiind suficient de mare pentru scopul propus);- varianta cu randament mare şi puritate mică (în cazul în care se continuă procesul de purificare folosind alte metode).

1.2 Precipitarea izoelectricăSimilară cu precipitarea cu sulfat de amoniu, această metodă se bazează

pe faptul că proteinele precipită când nu prezintă sarcini electrice la suprafaţa moleculei – ceea ce se întâmplă la pH izoelectric – deoarece reacţiile de respingere dintre sarcinile electrice de acelaşi fel sunt cele care menţin proteinele în soluţie. În general, fiecare proteină este caracterizată de o singură valoare a pH-ului izoelectric. De aceea, această metodă poate realiza o separare eficientă şi rapidă a proteinelor balast.

În practică, dependenţa de pH a stabilităţii proteinei-ţintă este factorul determinant în utilizarea metodei. Pe de altă parte, o serie de limitări ale utilizării acesteia sunt impuse de posibilitatea de redizolvare a proteinei precipitate la pH izoelectric.

4

O variantă a acestei metode presupune existenţa în mediul de reacţie a unor factori (substraturi sau alţi liganzi) care măresc stabilitatea la pH a proteinei-ţintă.

1.3. Precipitarea cu solvenţiSolvenţii acţionează prin reducerea constantei dielectrice a mediului,

ceea ce se traduce prin reducerea solubilităţii proteinelor datorită favorizării interacţiilor proteină-proteină în locul interacţiilor proteină-solvent.

Solvenţii utilizaţi în astfel de purificări sunt metanol, etanol, propan-2-ol, acetonă.

La fel ca în cazul precipitării izoelectrice, sunt posibile două abordări:- precipitarea proteinei-ţintă;

- precipitarea prin denaturare şi inactivare în prezenţa solvenţilor a proteinelor nedorite, ce sunt apoi îndepărtate.

Solvenţii organici sunt puţin folosiţi la scară mare datorită costului lor, inflamabilităţii, precum şi tendinţei proteinelor de a se denatura rapid în prezenţa solvenţilor, când temperatura depăşeşte 00C.

1.4. Precipitarea la căldurăSe utilizează, în general, pentru îndepărtarea proteinelor contaminate şi

se bazează pe stabilitatea diferită a proteinelor la temperaturi ridicate. Metoda este valabilă în cazul în care proteina dorită prezintă o stabilitate mare la temperaturi ridicate comparativ cu contaminanţii, pentru perioade de timp de la câteva minute la câteva ore. Şi în acest caz, se preferă prezenţa unor substanţe care să protejeze proteina-ţintă.

Dializa

După precipitarea cu (NH4)2SO4 proteina-ţintă se găseşte precipitată. Pentru a putea fi analizată şi, eventual, continuat procesul de purificare, trebuie îndepărtată concentraţia mare de săruri ce se regăseşte în soluţie. Pentru aceasta, se foloseşte dializa cu membrane semi-permeabile sub formă de săculeţe (membrana se livrează sub formă de tuburi, din care se vor realiza săculeţe în funcţie de dimensiunile necesare).

Principala caracteristică a acestor membrane este porozitatea, dar care au dimensiuni ale porilor astfel încât ioni de săruri cu mase moleculare mici pot să treacă prin membrană, pe când moleculele proteice mari nu pot (sunt reţinuţi în săculeţ).

5

Astfel, membranele de dializă sunt caracterizate prin masa moleculară a celor mai mici proteine globulare pe care le reţin (cutoff al membranei).

Ex: cut-off pentru Spectrapore 6 este 1.000 Da → prin membrană trec soluţii cu mase moleculare mai mici de 1.000 Da.

Săculeţul de dializă, ce conţine proba cu concentraţie mare de săruri, este introdus într-un tampon cu tărie ionică mică. În timp, se atinge un echilibru între concentraţia soluţiilor din interiorul şi din exteriorul săculeţului.

La echilibru, concentraţia de săruri din probă se calculează astfel:

conc. finală săruri =

Notă: deoseori concentraţia de săruri a tamponului este 0M, respectiv dializa se face faţă de apă distilată.

Volumul de tampon pentru dializă este determinat de concentraţia finală de săruri pe care dorim să o avem în probă.Ex: probă 10 ml ce conţine 1,0 M NaCl, necesar pentru următoarea etapă de purificare o concentraţie de maxim 1mM NaCl.

volum total =

Volumul de tampon necesar = 10L – 0,01L = 9,99LDeci, pentru a dializa 10ml probă cu concentraţia de 1,0M NaCl este

necesar un volum de aprox. 10L pentru ca proba să aibă concentraţia finală de săruri de 1,0mM. (1:1.000 dializă).

Se preferă, însă, dializa secvenţială pentru a evita folosirea unor volume atât de mari.Ex. I etapă: dializă 1:32

310ml tp:10ml probă (1,0M)→ 31mM conc. finalăII etapă: dializă 1:32

310ml tp:10ml probă 31mM→ 0,97 mMÎn loc de a se folosi 10L de tampon, se pot folosi numai 620 ml, atingând

aceeaşi concentraţie de săruri în probă. În schimb, timpul de dializă este de 2 ori mai mare (în general, pentru cele mai multe tipuri de membrane, dializa este completă după 4 ore).

O consecinţă a faptului că are loc dializa, în timp ce sărurile difuzează spre exteriorul săculeţului, moleculele de apă pătrund în interiorul acesteia. De aceea, volumul săculeţului creşte („se umflă”), iar concentraţia de proteină scade.

6

Notă – în cazuri extreme, umflarea săculeţului poate duce la spargerea acestuia, de aceea săculeţul nu se umple niciodată la volumul maxim, lăsând un spaţiu gol pentru a permite umflarea acestuia.

În cazul în care prin dializă concentraţia de proteină a scăzut prea mult se impune concentrarea acesteia, care se poate realiza, tot folosind membrane semi-permeabile.

Cea mai simplă metodă constă în a acoperi săculeţul de dializă cu un solut cu masă moleculară mare care poate fi dizolvat cu uşurinţă de tamponul din săculeţ.

Ex: polietilenglicol sau polivinilpirolidona (m.m. 20.000 Da) sunt uşor dizolvaţi de apă. Astfel, săculeţul de dializă acoperit cu polimeri aflaţi în stare uscată va pierde din apă datorită tendinţei apei de a hidrata polimerii, proba concentrându-se.

O altă variantă de concentrare presupune ca săculeţii de dializă, sub formă de disc, ce conţin probele să fie supuşi unor forţe de presiune, prin care apa să fie îndepărtată din interiorul acestora în timp ce proteinele rămân în interior. Acelaşi lucru se poate obţine prin centrifugarea discului din membrană semipermeabilă.

Atât în cazul dializei, cât şi al concentrării, este esenţial ca membrana să nu interacţioneze cu proteina-ţintă (de ex. să nu aibă afinitate cu aceasta şi să lege proteina de pereţii săculeţului).

2.Metode cromatograficePreparatele proteice clarificate şi concentrate pot fi folosite pentru

purificare prin metode cromatografice.Pentru purificarea proteinelor/enzimelor există trei tipuri principale de

metode cromatografice: metode de schimb ionic, de afinitate şi de excludere din gel (gel-cromatografia), care se folosesc, în general, în această ordine.

Metodele de schimb ionic şi de afinitate cromatografică pot prelucra rapid cantităţi mari de extracte brute; prima metodă este, însă, mai ieftină şi de aceea este preferată pentru primele etape de purificare în care scara de operare este destul de mare.

Gel-filtrarea este o metodă relativ lentă şi are cea mai mică rezoluţie şi capacitate, fiind utilizată pentru etapele finale de purificare, dar şi ca metodă de schimbare a tamponului de lucru înaintea etapelor de concentrare, stabilizare şi comercializare.

Pentru orice metodă cromatografică sunt necesare:- amestecul de proteine: tamponat corespunzător

7

- faza staţionară: răşină sau matricea- faza mobilă: tampon

TerminologieVolum total (Vt) (Bed volume) – volumul total de solvent şi material

absorbant din coloană;Volum excludere (V0) (Void volume) – volumul fazei lichideVolum de eluţie (Ve) (Elution volume) – volumul de solvent necesar

pentru a scoate un anumit solut din coloană.Răşină – materialul adsorbant, ce se prezintă sub formă de pudră uscată

sau de suspensie (50% lichid, 50% răşină).Mărimea în mesh – se referă la numărul de pori din răşină per inch2. Cu

cât numărul este mai mare, cu atât porii sunt mai mici şi rezoluţia este mai mare. În aplicaţii de tipul purificării proteinelor se folosesc, în general, 100-200 mesh.

Matricele cromatografice adecvate separării şi purificării proteinelor trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:- să aibă suprafeţe disponibile moleculelor de proteine;- să se menţină rigide şi incomprensiblie în timpul eluţiei;- să fie hidrofile şi inerte;- să aibă dimensiuni standardizate (pentru separări obişnuite dimensiunile sunt în domeniul 50-150μm; pentru HPLC acestea sunt de 4-6μmdiametru).Prepararea răşinilor

Etape de pregătire a răşinilor pentru utilizare presupun:- hidratarea răşinilor;- decantarea particulelor fine;- echilibrarea răşinei şi prepararea suspensiei;- degazarea suspensiei.

Hidratarea este necesară în cazul răşinilor ce se prezintă sub formă uscată, de pudră, şi se realizează prin suspendare în tampon, şi hidratare lentă peste noapte.

Echilibrarea răşinei se face în tamponul ce va fi folosit pentru analize. Nu se foloseşte un magnet pentru agitare, deoarece agitarea mecanică poate produce la spargerea perlelor de răşină.

După echilibrarea răşinei şi depunerea ei, se adaugă un volum egal de tampon pentru a obţine o suspensie 50%, care este suficientă pentru a elibera bulele de gaz în timpul împachetării coloanei.

În final, suspensia este degazată înainte de împachetarea coloanei pentru a minimaliza formarea bulelor de aer.

8

Împachetarea coloaneiColoanele ce sunt folosite la presiuni mici sunt, de obicei, obţinute prin

împachetare sub acţiunea gravitaţiei.- se adaugă o cantitate mică de tampon;- se plasează un rezervor la capătul superior al coloanei, deoarece se

foloseşte o suspensie de răşină de 50%, ce este preferabil să se adauge dintr-o singură manevră, volumul coloanei trebuie să fie suficient de mare pentru ca întregul volum de suspensie să fie turnat dintr-o dată;

- adăugarea răşinei sub formă de suspensie trebuie făcută cu grijă pentru a nu se introduce prea multe bule de aer;

- se lasă coloana 5 min pentru a se elima bulele mari de aer;- se deschide valva de la baza coloanei şi se permite împachetarea

coloanei sub acţiunea gravitaţiei;- pe parcursul împachetării, nivelul superior al stratului de răşină va

scădea; împachetarea este finalizată când acest nivel rămâne constant.Colectarea probelor

Sistemele cromatografice funcţionează, de obicei, numai sub acţiunea gravitaţiei, colectându-se fracţiile. Cele mai obişnuite sisteme presupun existenţa următoarelor componente:

- pompa peristaltică, cu debit variabil, care, în mod obişnuit, introduce tamponul în coloană şi nu trage probele din coloană.

- detector, de obicei, de ultraviolete.- colector de fracţii, care permite colectarea fracţiilor fie după numărul de

picături (~30/ml) sau după timp (corelat cu o pompă controlabilă, timpul de colectare poate fi tradus în volum colectat).

- recorder ce imprimă continuu markerul fracţiilor colectate.Probele ce se cromatografiază sunt, de obicei, în soluţii cu tării ionice mici, eluţia proteinelor legate fiind realizată prin mărirea tăriei ionice fie în gradient, fie în etape (trepte).

Eluţia în gradient – se referă la faptul că trecerea de la o concentraţie mică de săruri la o concentraţie mare se realizează printr-o tranziţie lentă şi continuă. Proteinele slab legate vor elua primele, pe când proteinele puternic legate de răşină se vor elua ultimele, necesitând concentraţii mari de săruri care să competiţioneze cu ele pentru ocuparea răşinii ionice.

În cea mai simplă formă tehnică, realizarea unui gradient de concentraţie presupune existenţa a 2 vase identice, conectate printr-un tub la baza vaselor. Tamponul din vasul cu concentraţia cea mai mică este trimis către coloană; pe măsură ce acesta părăseşte vasul, tamponul cu concentraţie mare va intra în acest vas, concentraţia mărindu-se treptat şi linear:

9

Coloană

Eluţia în trepte – se realizează prin eluarea succesivă a coloanei cu volume de tampoane cu diferite concentraţii de săruri. O astfel de eluţie este mai rapidă şi realizează eluţia proteinelor în volume mai mici decât prin eluţie în gradient. Se recomandă în cazul în care contaminanţii se eluează la ţintă sau în cazul în care cunoaşte concentraţia de săruri la care eluează concentraţii de săruri foarte diferite de cea la care se face eluţia proteinei-aceasta.

Eluţia în gradient

Eluţia în trepte

10

agitator magnetic

Con

c. s

ăru

ri

Volum0

Volum

Con

c. s

ăru

ri

1

2

3

2.1. Cromatografia de schimb ionic

Enzimele posedă o anumită sarcină electrică în soluţie, în funcţie de valoarea de pH, structura lor şi pH izoelectric. În soluţii cu valori de pH sub valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea încărcare pozitivă şi se vor lega de schimbători cationici, pe când în soluţii cu pH mai mare de punctul izoelectric vor fi încărcate negativ şi se vor lega de schimbători anionici. Valoarea de pH trebuie să fie astfel aleasă încât să menţină încărcarea electrică opusă a proteinei/enzimei şi a schimbătorului de ioni, iar tăria ionică trebuie să fie suficientă pentru a asigura solubilitatea proteinei, fără ca sarcinile să competiţioneze cu proteina pentru situsurile schimbătorului de ioni.

Legarea de schimbătorul de ioni este reversibilă, iar tăria legăturii este determinată de valoarea de pH şi tăria ionică a soluţiei, ca şi structura enzimei şi a schimbătorului de ioni.

În mod obişnuit, se menţine constantă valoarea de pH, enzima fiind eluată prin creşterea tăriei ionice a soluţiei.

Schimbătorii de ioni sunt, în general polimeri insolubili în apă, ce conţin grupări cationice sau anionice.

- schimbătorii cationici conţin grupări anionice: SO3-, -OPO3

-, COO-;- schimbătorii anionici conţin grupări cationice: grupări terţiare şi

cuaternare de amoniu, cu formula generală –NHR2+ şi +NR3

+.Răşini schimbătoare de ioni de natură polistirenică sunt adecvate mai ales

utilizării la scară mare a cromatografiei, dar au capacitate mică de reţinere a proteinelor datorită dimensiunilor mici ale porilor. Legarea este, ades, puternică datorită hidrofobicităţii răşinei, iar condiţiile necesare pentru eluarea proteinelor sunt destul de severe, ceea ce poate determina denaturarea acestora. Cu toate acestea, răşinile polistirenice au un mare potenţial în concentrarea sau purificarea enzimelor.

Răşini schimbătoare de ioni de natură celulozică sunt, în general, mai adecvate purificării enzimelor, putând fi introduse diferite grupări anionice sau cationice. Practic, nivelul de substituţie al celulozei nu poate să depăşească 1 mol/kg, limită peste care are loc dizolvarea celulozei.

11

Principalele tipuri de schimbători de ioni

Tip de schimbător Grupare funcţională Contra-ion Denumire

Schimbător cationic slab

carboximetil-O-CH2-COO-

Na+ CM(celuloză, sephadex)

Schimbător cationic puternic

sulfopropil-O-CH2- CH2- CH2-SO3-

Na+ SP(sephadex)

Schimbător anionic slab

dietilaminoetil Cl- DEAE(celuloză, sephadex)

Schimbător anionic puternic

amină cuaternară(dietil-(2-hidroxipropil) amino etil)

  QAE(sephadex)

Tăria unui schimbător de ioni se referă la gradul de ionizare într-un domeniu de pH. Schimbătorii puternici sunt complet ionizaţi la cele mai multe valori de pH, pe când ionizarea celor slabi variază cu pH-ul.

Totodată, schimbătorii puternici au, în general, o capacitate mai mare de reţinere.

Exemplificare a folosirii schimbătorilor de ioni pentru un amestec de proteină, care la pH 7,0 au următoarele sarcini electrice:

poteina 1 +4proteina 2 +2proteina 3 0proteina 4 -2proteina 5 -4Se urmăreşte purificarea proteinei 4.Etapele procesului de schimb ionic sunt:

a) – se alege faza staţionară (răşina) cu încărcare pozitivă, şi se utilizează un tampon de tărie ionică mică ce conţine grupări negative

12

b) – când se adaugă amestecul de proteine, proteinele încărcate negativ (4 şi 5) vor înlocui ionii negativi ai tamponului şi se vor lega de răşină

c) – proteine încărcate pozitiv şi neutre nu vor interacţiona cu faza staţionară şi vor trece în volumul de lichid V0 prin eluţie;d) – după legarea proteinelor, se adaugă un tampon (faza mobilă) ce are tărie ionică mare (se foloseşte de obicei NaCl);e) – ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiţiona cu proteina pentru sarcinile electrice pozitive ale răşinii;f) – când tăria ionică este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta va fi eliberată, putând fi eluată din coloană;g) – cu cât sarcina electrică negativă a proteinei este mai mare, cu atât concentraţia ionică a tamponului de eluţie este mai mare.

În mod obişnuit, gradientul de NaCl începe de la 0,1M şi creşte gradual la 0,5 M.

Se pot folosi 2 tehnici diferite de operare: I – cromatografie pe coloană II – operare tip batch

I – proba se aplică direct pe coloanăII- după pre-echilibrarea schimbătorului de ioni, acesta este amestecat cu soluţia de enzime într-un vas răcit. Adsorbţia este de obicei rapidă (30 min). Agitarea amestecului este esenţială pentru adsorbţia la capacitatea maximă a răşinei, dar aceasta nu trebuie să conducă la degradarea mecanică a răşinii. Materialul neadsorbit este îndepărtat, iar eluţia proteinei/enzimei se face prin adăugarea de tampon concentrat direct peste răşină. După 20-30 minute, se decantează tamponul ce conţine proteina eluată.

13

+ + + +

-

-

-

-

+ ++ +

-

P - -

-- -

Avantajul folosirii tehnicii batch comparativ cu cea pe coloană, constă în faptul că se evită problemele legate de compresibilitatea răşinii şi scăderea vitezei de eluţii, mai ales în cazul aplicaţiilor la scară mare.

Avantajul folosirii tehnicii pe coloană este rezoluţia mult mai bună.Tampoane ce se utilizează în mod preferenţial:

- pentru răşini anionice: TRIS-HCl- pentru răşini cationice: HEPES-NaCl

Se adaugă azidă de sodiu 0,02% (antibacteriană)

2.2. Gel-cromatografiaDenumită şi „sitare moleculară”, metoda se bazează pe diferenţele de

mărime ale proteinelor. Perlele de răşină prezintă mici pori, în care pot difuza moleculele de proteină ce sunt suficient de mici. Cele cu dimensiuni mai mari vor rămâne în faza mobilă şi vor fi eluate din coloană.

Timpul de retenţie al unei proteine depinde de mărimea acesteia. Proteinele cele mai mari vor fi eluate primele, pe când cele mai mici, ultimele.

Limita de excludere – proteina mai mare decât această limită nu va penetra în perle şi va rămâne în faza mobilă.

Domeniul de fracţionare – domeniul de mase moleculare ce pot fi fracţionate prezintă o limită superioară şi una inferioară. Se preferă ca eluţia proteinei-ţintă să se facă cât mai rapid pentru ca să nu se dilueze staţionând un timp mare în coloană.

Mărimea particulelor de gel – determină viteza cu care funcţionează coloana, ceea ce este determinant pentru rezoluţie.

Mărimea coloanei – lungimea trebuie să fie de 20-40 ori mai mare decât diametrul (cu cât este mai lungă coloana cu atât gel filtrarea se realizează mai bine)

Mărimea probei – volumul maxim de probă este de 1-2% Vt

Viteza de curgere – cu cât viteza este mai mică cu atât rezoluţia este mai bunăAplicaţii ale gel filtrării

1) Purificarea unei proteine dintr-un amestec2) Determinarea masei moleculare a unei proteine- un amestec cunoscut de proteine, având mase moleculare bine

determinate se aplică pe o coloană (ex. Sephacryl S 100)1. Ribonuclează A 13.7002. Chimotripsinogen A 25.0003. Ovalbumina 43.000

14

4. Albumină serică bovină 67.0005. Blue Dextran 2.000.000

- V0 se determină folosind Blue Dextran ca marker- Vl se determină pentru fiecare din celelalte proteine- Vt se calculează din formula Vt = πr2xh- constanta de difuzie, kav se calculează pentru fiecare proteină după

formula kav=

- valorile kav obţinute se reprezintă grafic în funcţie de logaritmul masei moleculare a proteinelor, obţinându-se curba standard a coloanei.

- proteina cu masă moleculară necunoscută este trecută pe aceeaşi coloană, calculându-se kav şi raportându-se valoarea obţinută pe curba standard se extrapolează valoarea masei moleculare.

3) Îndepărtarea sărurilor dintr-o probă – se foloseşte o coloană cu limită de excludere foarte mică, cum ar fi G10 (limita 700 Da), astfel încât orice proteină cu masa moleculară de 1000 Da va trece prin coloană, fără să fie reţinută. În schimb, sărurile, ce au kav mari, se vor elua foarte încet.

2.3 Cromatografia de afinitateÎn prezent, este un termen ce defineşte generic o varietate de metode de

purificare a enzimelor ce au în comun faptul că se stabilesc interacţii mai mult sau mai puţin specifice între enzimă şi un ligand imobilizat.

Cea mai specifică formă de ligand este substratul enzimei sau un inhibitor competitiv.

Ca o alternativă, se poate folosi drept ligand un anticorp.Matricile specifice sunt costisitoare şi nu pot fi folosite pe scară mare. În

general, prin cromatografie de afinitate se obţin valori mari ale factorului de purificare (în medie, x10).

O abordare mai puţin specifică, dar adecvată pentru multe enzime este folosirea de analogi ai coenzimelor, cum ar fi NAD+, drept ligand. În unele cazuri se folosesc în loc de coenzime diferiţi coloranţi drept liganzi, care prezintă avantajul că sunt mult mai ieftini şi prezintă, în mod surprinzător, specificitate pentru diverse enzime.

O altă variantă de cromatografie de afinitate, este cromatografia interacţiilor hidrofobice, în care caz ligandul este un „spacer arm” de natură hidrofobică, cum ar fi grupări octil sau fenil. Interacţiile hidrofobice sunt puternice la tării ionice mari, de aceea trebuie să fie dializate înainte de a fi aplicate pe adsorbant. Eluţia se realizează prin modificarea de pH sau tărie ionică sau a constantei dielectrice (ex: prin adăugare de etandiol).

15

Testarea purităţii proteinei purificate

a) La sfârşitul procesului de purificare, se testează gradul de puritate al proteinei prin electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE – polyacrylamide gel electrophoresis). Metoda realizează separarea proteinelor pe baza încărcării electrice a acestora, în condiţiile menţinerii activităţii lor biologice, ceea ce permite evidenţierea acesteia prin metode colorimetrice.

În acest mod, se relevă activitatea specifică a enzimei purificate. Prin compararea poziţiei benzii acesteia cu benzile evidenţiate prin colorare pentru proteinele totale din probă, se poate determina dacă proteina/enzima este pură sau nu. Astfel, dacă apare o singură bandă pe gel de electroforeză, care corespunde atât colorării specifice proteinei, cât şi a activităţii enzimei, atunci proteina purificată este omogenă. În cazul în care apar maimulte benzi proteice, dar o singură bandă enzimatică înseamnă cî proteina/enzima-ţintă mai este însoţită, încă, şi de alte proteine contaminate.b) Determinarea proprietăţilor biochimicec) Determinarea masei moleculare a subunităţilor prin SDS-PAGE sau PAGE-denaturat: metoda presupune denaturarea proteinei în prezenţa unui detergent, SDS (sodium dodecilsulfat) şi a unui reducător tiol (2-mercaptoetanol) care scindează punţile disulfurice (Cys-S-S-Cys). Detergentul SDS se leagă de catena polipeptidică, ceea ce îi conferă o sarcină electrică negativă uniformă. În acest fel, toate proteinele vor avea aceeaşi încărcare electrică, iar în timpul electroforezei SDS-PAGE singurul criteriu de separare a proteinelor va fi mărimea acestora datorită efectului de sitare al gelului. Astfel, polipeptidele cu mase moleculare mari, respectiv subunităţile proteinei denaturate, se vor regăsi în capătul superior al gelului PAA deoarece vor migra foarte puţin în timpul PAGE, pe când polipeptidele cu mase moleculare mici se vor regăsi spre capătul inferior. Mărimea subunităţilor proteinei testate poate fi determinată prin folosirea unei curbe de calibrare, realizată prin migrarea în gel, în condiţii experimentale identice, a unor proteine standard, cu mase moleculare ale subunităţilor lor cunoscute.d) Compoziţia în subunităţi a proteinei: se determină prin împărţirea masei moleculare a proteinei native la masa moleculară a subunităţilor. (masa moleculară a proteinei native se determină prin gel-filtrare).

Ex: m.m. proteină nativă = 80.000 Da m.m. subunitate = 38.000 Da

În cazul în care proteina este un monomer, atunci m.m. proteină nativă = m.m. subunitate. Unele proteine sunt compuse din 2 subunităţi diferite şi, de aceea, prin analiza SDS-PAGE se vor regăsi 2 polipeptide.

16

→ proteina este undimer

Pentru analiza SDS-PAGE se foloseşte numai proteină pură.În concluzie:

Se folosesc 2 tipuri de PAGE:1) PAGE nativă – pentru determinarea purităţii2) SDS-PAGE – pentru determinarea masei moleculare a subunităţilor

Există 2 tipuri de mase moleculare:1) m.m. a proteinei native – determinată prin gel-filtrare2) m.m. a subunităţilor – determinată prin SDS-PAGE

Compoziţia în subunităţi a proteinei: m.m. proteină nativă/m.m. subunităţi = nr. subunităţi din proteină (nr. întreg)

17