8/13/2019 Metode de Extractie Si Purificare a Arn-ului

1/3

Extracia ARN total din celule sau esuturi se realizeaz cu reactiv TRIzol, conform cu

instruciunile productorului; alternativ, prin alte proceduri convenionale pot fi folosit. Preparatul

din care se doreste extractia ARN-ul ar trebui s fie de bun calitate.

La sfritul procedurii, se dizolv ARN-ul total n RNaz ap liber i magazin la -20 C.

Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai enzimelor utilizate (inhibitori ai Taq

polimeraz), nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este n special sensibil).

Frecvent sunt probe totale de snge ele pot fi separate n plasma , ser i leucocite. Alte medii

curent folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urin, lichid cefalorahidian, expectoraii, probe

rezultate prin puncionare i biopsie.

ARN este o molecul fragil, foarte sensibil la RN-azele care sunt frecvente n mediu pn i

pe degete. n cazul studiilor de ARN probele sau fraciunile lor trebuiesc congelate la -80C n primele

3 ore dup recoltare.

Probele pot fi expediate n ghea carbonic. n timpul manipulrii este indispensabil s

evitm contaminarea probei i ARN s fie conservat. Se recomand: purtarea mnuilor,

autoclavarea materialelor, utilizarea de pipete special rezervate acestui scop la capete cu filtre

sterile.

Extracia ARN

Eliberarea ribonucleazelor

RN-azele sunt ubicvitare i dificil de inactivat, deoarece spre deosebire de ADN-aze

funcionarea lor nu necesit cofactori. Unele esuturi ca pancreasul, sunt foarte bogate n RNaze.

Dei nu este posibil s le eliminm, ele sunt capabile s se denatureze dup supunerea la oc

termic. Totui dup nczire adaosul de -mercapto-etanol agent reductor, ajut la pstrarea RN-

azelor n stare denaturat mpiedicnd reformarea punilor disulfidice.

Este indispensabil neutralizarea aciunii lor n lizatul celular tratnd proba cu detergeni i

ageni ca -mercapto-etanol i tiocianat de guanidin. n laborator sunt dou surse de contaminare

cu RN-aze: minile operatorului i germenii n suspensie din aer care se depun pe sticlrie i

consumabile.

Deci este esenial s se lucreze permanent cu mnui, s se utilizeze materiale de unic

folosin, sticlria s fie tratat cu dietilpirocarbonat (DEPC 0,1%) inhibitor puternic de RN-az - apoi

autoclavat (DEPC intr n reacie cu bazele purinice), fie s fie supus la temperaturi foarte mari

(200C) la autoclav fr tratament cu DEPC. Materialul plastic este decontaminat cu sod caustic

0,1N i EDTA 1mM apoi splat cu DEPC. Reactivii i tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi

autoclavate.

Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se utilizeaz ap tratat cu DEPC pentru

prepararea tamponului. Apa deionizat este n principiu lipsit de ARN-az. Sunt necesare trei etape

succesive pentru obinerea ARN purificat.

8/13/2019 Metode de Extractie Si Purificare a Arn-ului

2/3

1. Liza celular. Se folosesc dou grupe de detergeni puternici care inhib RNazele. n prima

grup agentul disociant utilizat este tiocianatul de guanidin (GTC) iar n a doua se asociaz cu

mercaptoetanol. Ambii sunt inhibitori de RNaz.

Utilizarea combinat permite disocierea proteinelor liza celulelor, inactivarea RNazelor i

denaturarea ARN.

Dac se dorete eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesar tratarea cu DNaz.

Tehnica unete metode care necesit utilizarea fenolului i a detergentului. Adesea se adaug un

inhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas de bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu

SDS, proteinaza K.

2. Extracia propriu zis a ARN

ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se face pe baza precipitrii diferite a ARN i ADN n

funcie de pH. n condiii de pHacid ARN rmne n soluie apoas.

n mediu alcalin ADN rmne n soluie apoas.

250l material patologic (sange integral, ser, lichid de ascita) + 1000l ARN + 250l cloroform in

tuburi eppendorf de 1,5 ml;

pentru fecale se dilueaza o cantitate de 1 ml apa D, se vortexeaza foarte bine, apoi se centifugheaza,

iar lichidul clar se repartizeaza in tuburi si se prelucreaza la fel ;

se agita foarte bine si se cenrifugheaza 15 minute / 12000 rpm, la +40C . Dupa centrifugare se

observa aparitia a doua faze (una guanidinica la baza tubului si una apoasa, in care se gaseste ARN-ul

in alt tub eppendorf de 1,5 ml se recolteaza cu atentie faza apoasa (lichid foarte clar), in cantitate

aproximativa de 700l ;

peste aceasta se adauga 700l izopropanol se introduc tuburile la congelator la -200C, unde se lasa

pana a doua zi;

se centrifugheaza 20 de minute / 12000 rpm, la +40C, dupa care se poate observa la fundul tubului,

ARN-ul precipitat sub forma unui buton, cu o marime direct proportionala cu cantitatea de ARN din

proba ;

se indeparteaza izopropanolul si se inlocuieste cu 1000l etanol 60% si se centrifugheaza 20 minute

la 12000 rpm, la +40C ;

se indeparteaza toata faza lichida din tub, ramanand doar depozitul de ARN ;

se introduce la termostat la 370C pentru uscare (10-15 minute), pana cand depozitul devine

translucid ;

se adauga 50l apa distilata si se omogenizeaza foarte bine si se conserva la -800C .

8/13/2019 Metode de Extractie Si Purificare a Arn-ului

3/3

Pentru determinarea concentratiei de ARN din proba se detemina densitatea optica (DO) a unui

amestec ce contine 95l apa distilata si 5l ARN. Lungimea de unda la care se face citirea este de 260

nm. Formula dupa care se calculeaza cantitatea de ARN este urmatoarea :

[ARN] = DO(260 nm) x 40 x 20

40 factor de corectie

20 dilutia

Rezultatul se exprima in g/ml .

[ADNds] = DO(260 nm) x 50 x 20

50 factor de corectie

20 dilutia

Rezultatul se exprima in g/ml .

3.Precipitarea ARN. Se efectueaz similar cu a ADN cu izopropanol sau etanol de asemenea se face

splare cu etanol 70%.

ARN se mai poate obine cu bile magnetice.

Exist numeroase kituri de extracie rapid.

Dozarea ARN. Poate fi necesar n Northern blot, RNazin Protein Assey.

Spectrofotometria. Este cea mai utilizat i msoar densitatea optim la 260-280 nm a unei diluii

de ARN.