Metode de analiza ale secventelor ADN si ARN

Electroforeza pe gel de agaroza

Structura acizilor nucleici poate fi studiata in prezent utilizand diverse metode

Scopul analizarii secventelor acizilor nucleici este complex: in vederea studierii, sintetizarii si multiplicarii genelor, dar si pentru detectarea mutatiilor

Ingineria genetica reprezinta un ansamblu de tehnici de laborator folosite pentru modificarea ADN-ului organismelor vii

ADN-ul poate fi extras din sange total, dar si din diferite celule sau tesuturi

Pentru extragerea ADN-ului se folosesc diverse metode chimice

Izolarea ADN-ului constituie si ea o etapa importanta in cadrul inginerie genetice

Clonarea ADN-ului semnifica amplificarea unei molecule sau a unei catene; o clona reprezentand un numar mare de molecule sau celule identice, provenind dintr-o celula sau molecula initiala

Clonarea unui fragment de ADN se realizeaza fie prin insertia acestuia intr-un vector care se va multiplica intr-o celula gazda, fie prin metoda PCR

Vectorii frecvent utilizati sunt: plasmidele, cosmidele si bacteriofagii

Metoda PCR are ca finalitate obtinerea intr-un timp scurt a unui numar foarte mare de copii ale unei gene sau a unui anumit fragment de ADN

Aceasta se realizeaza printr-o amplificare enzimatica, ce are loc in mod exponential

PCR cuprinde 30-40 de cicluri realizate cu un aparat automat

In vederea detectarii mutatiilor se utilizeaza metode diferite

Pentru a detecta mutatiile cunoscute se folosesc urmatoarele metode: PCR si separarea pe baza marimii fragmentului de ADN; PCR si digestia cu enzime de restrictie sau metoda amplificarii cu alele specifice.

Pentru detectarea mutatiilor necunoscute se folosesc metode precum: metoda FISH, electroforeza in camp pulsatil sau, in cazul mutatiilor punctiforme, metoda clivarii cu ribonucleaze, metoda proteinelor functionale ori analiza polimorfismelor conformationale monocatenare.

Secventializarea ADN-ului uman permite: finalizarea secventei complete a genomului uman(PGU), clonarea genelelor localizate, precum si punerea la dispozitia publicului a intregii secvente de ADN in mod gratuit

Secventializarea ADN

Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat

In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie chimic prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger

Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la unul din capetele sale, denaturarea, urmata de de separarea prin electroforeza in gel a celor doua catene

Are loc apoi taierea ADN-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de ADN cu lungime varibila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de poliacrilamida

Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta in secventa de analizatde catre dideoxinucleotide

Metode de separare ale acizilor nucleici

In functie de scopul urmarit, pentru separarea acizilor nucleici se pot utiliza: centrifugarea, cromatografia sau electroforeza

Metoda centrifugarii ofera posibilitatea obtinerii de ARN in cantitati considerabile si de inalta puritate

Din cadrul metodelor cromatografice, pentru separarea acizilor nucleici se utilizeaza cromatografia de gel filtrare, cromatografia de schimb ionic si metoda dHPLC

Cromatografia de gel filtrare se foloseste pentru purificarea produsilor PCR

Cromatografia de schimb ionic se utilizeaza pentru extractia rapida de ADN si ARN din diverse probe biologice, in cantitati suficiente

dHPLC este o metoda de screening a mutatiilor punctiforme

Electroforeza fragmentelor ADN si ARN

Electroforeza fragmentelor de ADN este o metoda analitica folosita pentru separarea acestor fragmente in functie de marimea lor

In solutie libera, la pH neutru sau alcalin, acizii nucleici nu pot fi separati

Pentru separarea lor se se folosesc matrici de gel de agaroza sau poliacrilamida

Gelurile de agaroza sunt folosite pentru separarea acizilor nucleici cu mase mari, in timp ce diferentierea moleculelor de acizi nucleici cu mase moleculare mici se face in geluri de poliacrilamida

Un camp electric determina migrarea lor prin gel

Datorita numarului mare de resturi fosfat, acizii nucleici au o puternica incarcatura negativa, migrand in campul electric spre anod

Fragmentele se separa sub forma unor benzi electroforetice

Mobilitatea unui fragment de ADN este invers proportionala cu masa moleculara, fiind de asemenea influentata de o serie de factori

In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct proportionala cu tensiunea aplicata

Vascozitatea gelului se poate reduce in momentul cresterii temperaturii ceea ce produce distorsiuni ale procesului de migrare

Tampoanele de electroforeza au rolul de a mentine un pH si o putere ionica constante, la valori optime pentru separare

Agentii denaturanti(ureea, formamida, formaldehida) indeplinesc functia de combatere a fenomenelor de agregare si adsorbtie a moleculelor de acizi nucleici pe matricea de gel, dar si functia de inlaturare a diferentelor conformationale

Dupa ce separatia este completa, fragmentele ADN avand lungimi diferite sunt adesea vizualizate prin utilizarea unui colorant fluorescent precum bromura de etidiu

Marimea fragmentelor este exprimata in:”nucleotide”, perechi de baze” sau “kb”- pentru o mie de perechi de baze

Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu “DNA-ladders” ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute

Electroforeza acizilor nucleici este o etapa obligatorie in orice protocol de analiza a acizilor nucleici

Prin ea se realizeaza: separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu enzime de restrictie; verficarea amplificarii PCR; identificarea si/sau determinarea semicantitativa a fragmentelor ADN rezultate in urma amplificarii PCR; detectia si determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma extractiei din tesuturi

Analizele ADN si ARN au asadar roluri cruciale in detectarea mutatiilor, in diagnosticarea bolilor genetice, a cancerelor, in diagnosticul microbiologic

Dar si in cadrul testelor de paternitate si de identificare a persoanelor

In determinarea profilului genetic al bolilor

In teste de filogenie Toate aceste analize cuprind in

mod obligatoriu si etapa de electroforeza

De aici sesizam cu usurinta importanta functie a utilizarii tehnologiei ADN in prognosticare, diagnosticare, monitorizare si terapie

Tehnologia ADN dispune de un larg spectru de aplicabilitate, in cele mai diverse si complexe domenii ale medicinii, atat in cercetarea fundamentala ce ne ofera permanent noi date si informatii, cat si in cercetarea aplicativa ce ofera noi solutii terapeutice