Merged Document 2

MetodeMetode enzimaticeenzimatice sisiimunochimiceimunochimice dede analizaanaliza

-- BIOANALIZABIOANALIZA --

TITULARI DISCIPLINAProf.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU

S.l.Dr. Emanuela CRACIUN

Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi lafinal, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicareîn activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finalăPerformanţa în activităţile aplicative 40% din nota finalăExamen 50% din nota finală

a) Activităţile evaluate şi ponderea:10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen

b) Cerinţele minimale pentru promovare:Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;Obţinerea a 50% din punctajul total;Obţinerea a 50% din examenul final.

c) Calculul notei finale:Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.

EVALUARE

Domenii de aplicabilitateDomenii de aplicabilitate

monitorizareamonitorizarea calitatiicalitatii vietiivietii sisi mediuluimediului

valorificareavalorificarea deseurilordeseurilor

iindustriandustria chimicochimico--farmaceuticafarmaceutica

biologiebiologie--bbiotehnologieiotehnologie

medicinamedicina

aparareaparare

INSTRUMENTUL BIOANALITICINSTRUMENTUL BIOANALITICidealideal

selectivselectiv

specificspecific

reproductibilreproductibil

utilizareutilizare simplasimpla

compactcompact

rapidrapid

ieftinieftin

fiabilfiabil

AlegereaAlegereametodeimetodei sisi instrumentuluiinstrumentului

probaproba

instrumentinstrument

metodametoda

**stareastarea dede agregareagregare

**omogenitateaomogenitatea

**istoriaistoria probeiprobei

**securitateasecuritatea

**sensibilitateasensibilitatea

**mediumediu (t, p, etc.)(t, p, etc.)

**acceptabilitateaacceptabilitatea

ProbaProba PreparareaPrepararea probeiprobei AparaturaAparatura

gaz

lichid

solid

TEHNICATEHNICAMETODAMETODA

PROCEDEUPROCEDEUPROTOCOLPROTOCOL SP

ECIF

ICIT

ATEA

•• CALITATIVACALITATIVA•• SEMISEMI--CANTITATIVACANTITATIVA

•• CANTITATIVACANTITATIVA

INFORMATIAANALITICA

•• SCREENINGSCREENING

•• RUTINARUTINA•• RECUNORECUNOASTEREASTERE

•• STANDARDSTANDARD•• REFERINTAREFERINTA

•• PRIMARAPRIMARA

INCR

EDER

EA

Clasificarea metodelor analitice în funcţie decantitatea de determinat

10-2μgSub-micro1 μgUltra-micro1 mgMicro10 mgSemi-micro100 mgMacro

Marimeaaproximativa

Metoda

TEHNICATEHNICA

M E T O D AM E T O D A

ProceduraProcedura

ProtocolProtocol

ProcesulProcesul bioanaliticbioanaliticPrelucrareaPrelucrarea

datelordatelorOperatiiOperatii

preliminarepreliminare

RezultateRezultateProbaProbabrutabruta

MasurareaMasurarea sisitrasabilitateatrasabilitatea

Tehnicile de analiză si principalele aplicatii

Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.

Caracteristicile radiaCaracteristicile radiaţţiiloriilorionizante nucleare emise deionizante nucleare emise deanalitanalit

Analizaradiochimica

Calitativa si cantitativa pentruCalitativa si cantitativa pentrumajoritatea.majoritatea.

Proprietatile electrice aleProprietatile electrice aleanalitului in solutieanalitului in solutie

Analizaelectrochimica

Caracterizarea compusilorCaracterizarea compusilormajoritari sau minoritari singurimajoritari sau minoritari singurisau in amestecsau in amestec

Schimbări fizice sau chimiceSchimbări fizice sau chimice îînnanalit atunci când esteanalit atunci când este îîncălzitncălzitsau răcitsau răcit

Analiza termica

Separarile cantitative siSepararile cantitative sicalitative ale amestecurilorcalitative ale amestecurilor

Diferite proprietăDiferite proprietăţţi fizicoi fizico--chimicechimiceale analiale analiţţilor separatiilor separati

Cromatografia sielectroforeza

Calitativa sau structurala pentruCalitativa sau structurala pentrumajoritatea majoremajoritatea majore îîn jos pentrun jos pentrua urmări componentele nivela urmări componentele nivelizotop raporturiizotop raporturi

Masa analitului sau fragmenteMasa analitului sau fragmentedin eadin ea

Spectrometria demasa

Calitativa,cantitativa sauCalitativa,cantitativa saustructurala pentru componentelestructurala pentru componentelemajoremajore

Lungimea de undăLungimea de undă şşi intensitateai intensitatearadiaradiaţţiilor electromagneticeiilor electromagneticeemise sau absorbite de analitemise sau absorbite de analit

Spectrometriamoleculara si defluorescenta

AAplicareplicareProprietatea masurataProprietatea masurataTehnicaTehnica

ComponentComponentele de baza aleele de baza ale unuiunuiiinstrumentnstrument analiticanalitic

GENERATOR

SEMNAL

Detector

Tranductor

Procesor

SemnalInregistrator

SURSA DECURENT

Semnal

analitic

SemnalSemnal

electricelectricmecanicmecanicopticoptic

Semnal

iesire

TendinteleTendintele inin domeniuldomeniul dezvoltariidezvoltariiinstrumentelorinstrumentelor bioanaliticebioanalitice

prezentprezent

viitorviitor multinivelmultinivel

multimod

multimod

modmod

dimensiunedimensiune

mul

tidi

men

sion

alm

ulti

dim

ensi

onal

com

plex

itat

eco

mpl

exit

ate

MULTIFUNCTIONALMULTIFUNCTIONAL

hardware

marimeamarimea ((u.au.a.).)

inte

rfet

ein

terf

ete

elec

tron

ice

elec

tron

ice software

ConceptulConceptul generalgeneralbiobio--detectiedetectie

datedate

analitanalitinputinput

traductor

receptor

outputoutput

MicrosistemeMicrosisteme analiticeanaliticeconjugate/integrateconjugate/integrate

(lab on a chip)(lab on a chip)

ChimieChimie BiologieBiologie

TehnologieTehnologiemedicalamedicala

ElectronicaElectronica

MecanicaMecanica

OpticaOptica

TehnologiaTehnologiainformatieiinformatiei

BiotehnologieBiotehnologie

SistemSistem

BIOCHIPULBIOCHIPUL--lab on a chiplab on a chip--

MODEL

PROBA

ANALIZA

PLAN

EVALUARE

Defineste scopul

Selecteaza procesul analitic,numarul analizelor si centrele deanaliza pe baza scopurilor sicosturilor

Colecteaza probele, testepreliminare

Efectueaza operatii de ajustareaconditiilor, separarea intereferente,efectueaza masurarile siachizitioneaza datele

Selecteaza dintre date valoarea ceamai buna, estimeaza sigurantavalorii, revizuieste si repeta daca estenecesar

REPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBALREPREZENTAREA PROCESULUI ANALITIC GLOBAL

RaportulRaportul SemnalSemnal // ZgomotZgomotSemnalSemnal == informainformattiaia despredespre analitanalit carecare

este de interes pentru chimisteste de interes pentru chimistZgomotZgomot == informainformattiaia externexternaa care nucare nu

esteeste necesarnecesaraa deoarecedeoarece degradeazdegradeazaaacurateacuratetteaea ssii precizia analizeiprecizia analizei ssiimicmicssoreazoreazaa cantitatea decantitatea de analitanalit carecarepoate fipoate fi detectatdetectatS/Z = meS/Z = mediadia//deviadeviaţţiaia standard = x/sstandard = x/sS/Z = 1/ RSDS/Z = 1/ RSD

undeunde RSD =>RSD => deviadeviaţţiaia standardstandard relativărelativă, s/x, s/x

Surse deSurse de zgomotzgomotîîn analizelen analizele intrumentaleintrumentale

•• Zgomot chimicZgomot chimic•• rezultă din variabilerezultă din variabile iincontrolabilencontrolabile

ccareare afectează analiza chimică afectează analiza chimică•• Zgomot instrumentalZgomot instrumental•• TTipuriipuri•• Zgomot termicZgomot termic•• ZgomotZgomot ţţintăintă•• Zgomot slabZgomot slab•• Zgomot de mediuZgomot de mediu

ModalităModalităţţi pentru reducereai pentru reducerea zzgomotuluigomotuluiÎÎmpământarempământare şşi protejarei protejareAmplificatori diferiAmplificatori diferiţţiiFiltrareFiltrareModulareModulare““TăiereaTăierea”” semnaluluisemnaluluiBlocarea amplificatorilorBlocarea amplificatorilor

MetodeMetode SoftwareSoftware-- S/ZS/Z intensitatea laintensitatea la nn0.50.5,, undeunde nn este mediaeste media

mmaasursuraarilorrilor-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor

Media semnalelor 1Media semnalelor 1--3, 53, 5--7,etc7,etc..-- FiltrareFiltrare DigitalDigitalaa-- Metode de CorelareMetode de Corelare-- AdunareaAdunarea intensitatiiintensitatii medii amedii a semnalelorsemnalelor

Adunarea intensităţii medii a semnalelor

Se observă că scalaverticală este maimică decât numărulscanărilor. Astfel,zgomotul creşte învaloare absolutăodată cu creştereanumărului scanărilor.Totusi, valoarearelativă a semnaluluianalitic creşte.

Efectul medierii semnalelor

Metode enzimatice si imunochimice deanaliza

2

Sursele de eroare in bioanaliza

100%100%

10%10%

1%1%

samplingsampling analizaanalizapropriupropriu--zisazisa

prelucrareaprelucrareadatelordatelor

coeficientcoeficientdede variatievariatie

timptimp40%40% 30%30%20%20%

Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilorce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.

Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numericadintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarearelativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.

Erori determinate: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, eleaparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc lavarierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.

Erori nedeterminate: Sunt cunoscute si sub numele de erori aleatorii,ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza mici variatiialeatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de unnumar de ori.

Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru acalcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurariindividuale contribuie la erori totale sau acumulate.

ERORI IN MASURARILE ANALITICE

Sursele de erori (I)

Erorile de la reactivi- Reactivii si solvenţii sunt impuri.- Depozitarea improprie de reactivi.- Neglijarea datei de expirare a reactivului.- Evaporarea reactivilor.- Respectare gradelor si puritaţilor diferite.

Erorile materialului de referinţă- Impuritatea materialelor de referinţă.

- Erorile de la introducerea unor substanţe.- Schimbările datoritã depozitãrii necorespunzãtoare.- Erorile în pregãtirea materialul de referintă.- Utilizarea materialul de referintă expirat.

Sursele de erori (II)

Generarea erorilor- Devierea de la procedura de analiza.- Neluarea in seama a limitei de detectie.- Neluarea in seama a spatiului de colectare.- Calcularea erorilor (diluari, amestecuri,adaugari).

- Folosirea unor proceduri analitice incorecte.

Erorile de calibrare- Erorile ale masurarilor volumetrice.- Erorile de cantarire.- Reglarea inexacta a echipamentului.

Sursele de erori (III)

Erorile de la echipamentEchipamentul nu este curat.Intretinerea lui este neglijata.Influenta temperaturii, electricitatii si influenta

magnetica.Erori în folosirea auto-pipetelor necalibrate, pipetele nu

sunt atasate in mod corect sau sunt contaminate.Erori in folosirea pipetelor de sticla (se pot deterioara,

materiale de calitate mai slaba, ele pot fi contaminateanterior).

Erorile la spectrometru (lungimea de undã greşita, lampã de intensitateinsuficientã, optica murdară, ignorarea efectului de deviaţie, în mod incorectzeroul configurat, introducerea probei într-o camera luminoasa).

Erorile cuvei (defecte ce nu sunt luate în consideraţie,sticla necorespunzãtoare decuva, cantitate insuficienta, umedã pe exterioar, bulele de aer, contaminare).

Sursele de erori (IV)Erorile de la inregistrarea semnalelor- Domeniul incorect de raportare.- Erorile de citire.- Erorile de scriere.- Schimburile de informaţii.

Erorile din calculul- Erorile aritmetice, erorile de virgula, unitati

incorecte.- Erorile circulare.- Neluarea in calcul a valorilor volumului de reactiv

adaugat.- Erorile in factorul de diluare.

PROTEINELE

Proteina Trivia

Cea mai abundenta molecula organica din celula(50% din greutate)

30-50K - codul genelor structurale pentruproteine

Fiecare celula contine 3-5K proteine distincte Circa 300 de proteine au fost identificate in

plasma

Diversitatea functionala a proteinelor

Structura Keratina, colagen, actina, miozina

Transport Hemoglobina, transferina, ceruloplasmina

Hormonal Insulina, TSH, ACTH, PTH, GH

Reglator Enzime

Dimensiunile proteinelor

Limita inferioara este arbitrara, in jurulvalorii de 5.000 MW

Proteinele pot avea o dimensiune mai mare de1 milion MW, desi cele mai multe proteine seincadreaza in intervalul 12-36 K Aminoacizi 100-300 Albumina ( ce mai abundenta proteina la om) este

de 66K si contine 550 de aminoacizi (reziduuri)

Compozitia proteinelor

Aminoacizi (proteine simple) 20 aminoacizi comuni (standard)

Proteinele compuse contin un grup proteic: Metaloproteine Glicoproteine Fosfoproteine Lipoproteine Nucleoproteine

CLASIFICAREAAMINOACIZILOR COMUNI

Catene laterale unice, care difera in polaritate:- Hidrofilic

- neincarcat- relativ solubil in apa

- incarcat- acid, baza

- Hidrofobic- relativ insolubil

HIDROFOBIC Alanine Ala

-CH3

Valine Val-CH(CH3)2

Leucine Leu-CH2CH(CH3)2

HIDROFOBIC Isoleucine Ile

- CH(CH3)(CH2CH3) Metionine Met

- CH2SCH2CH3

Fenilalanine Phe- CH2(C6H5)

Aminoaciziesentiali

De obicei, organismuluman nu poatesintetiza : Leu, Ile, Val, Met,

Phe, Trp, Thr, Lys,His (Arg)

Proteinele provenitedin dietele alimentaresunt principala sursade aminoaciziesentiali

Stereochimia aminoacizilor

Toti aminoacizii gasiti in proteine au configuratie “L”

R

NH2 COOHH

R

HOOC NH2

H

L-Alanine D-Alanine

Legatura peptidica

H2N CH C

R

OH

O

H2N CH C

R

OH

OH2O

Legatura peptidica

H2N CH C

R

O

N CH

R

C

O

OH

H

Dipeptide

ELEMENTELE STRUCTURIIPROTEINELOR

Primara- > 200 kJ/mol

Secundara- 10 kJ/mol

Tertiara- < 5 kJ/mol

Cuaternara – doar oligomeric (> 1 lant)

STRUCTURA PROTEINELOR Primara

- Numarul aminoacizilor in catena lineara• N - terminal (pornit, prin conventie)• C - terminal (sfarsit)

Secundara- Portiunile catenei laterale se indoaie inconformatiile regulate

• -helix• -sheet• Alte structuri: cicluri inverse sau , bucle

omega, spirala aleatorie

STRUCTURA PROTEINELOR Structura tertiara Forma generala

Structuracuaternara In proteinele cu mai

multe lanturipeptidice

Exemple:hemoglobina

1A3O: de la Homo Sapiens

STRUCTURA SECUNDARA - -HELIX

Forma cilindrica Stabilizata de legaturile de H intre C=O a

rezidurilor i si a rezidurilor i+3 a protonuluiamida

Specifica rezidurilor celor 10 -15 aminoacizi sicelor 3-4 cicluri- Fiecare ciclu:

• contine 3.6 reziduri de aminoacizi• acopera distanta de 5.41 Å

STRUCTURA SECUNDARA - -HELIX

Aminoacizi cu catenelaterale prelungite.

Aminoacizi hidrofilicisi hidrofobici pe feteleopuse ale cilindrului.

1IRL: from Homo sapiens; Mott, H. R., Baines, B. S., Hall, R. M., Cooke, R. M., Driscoll,P.C., Weir, M. P., Campbell, I. D.: The solution structure of the F42A mutant of humaninterleukin 2. J Mol Biol 247 pp. 979 (1995).

STRUCTURA SECUNDARA - -SHEET

Structura gen coala (sheet)Alcatuit din 2-6 lanturi (3-10 aminoacizi

pe fiecare), stabilizate cu legaturi dehidrogen- Parelele- Neparalele (cele mai intalnite cazuri)Contin aminoacizi ramnificati la -C- izoleucine, treonine, valine

STRUCTURA SECUNDARA - -SHEET

CONTINUAREFibroin de matase (poli Ala-Gly) (teoretic)Continut ridicat de -sheet400,000 Da

STABILIZAREAINTERACTIUNILOR

INTRAMOLECULARE

Legaturi de H- 3 kcal/mol

Interactii electrostatice – intre catenelelaterale incarcate ale aminoacizilor

- punti de sareLegaturi disulfidice

- 2 S-H = S-S + 2H+

Interactii hidrofobice- 3-5 kcal/mol (entropic)

PROTEINELEProteina MW Numarul de

reziduriNumarul desubunitati

Insulina(bovine)

5,733 51 2

Mioglobina(cai)

16,890 153 1

Acidul grassintetizat(ferment)

2,300,000 20,000 21

Virusulmozaic altutunului

40,000,000 336,500 2,130

PROTEINELE – DIVERSEFUNCTIONALITATI

Proteina Functie

Citocrom P450 Detoxifiere (ficat)

Clostridium botulinum Provoaca intoxicatiealimentatra bacteriana

Hormonul de crestere Stimuleaza crestereaoaselor

Ubiquitin Elimina proteineledegradate

Protamine Sperma pestilor

E. coli - 1000 proteine diferiteNumarul total de proteine > 1010

STABILITATEA CHIMICA

Proteoliza- Digestia legaturilorpeptidice de catre proteaze

Hidroliza- Enzimatica- Chimica

Oxidare- serina- cisteina

Agregare Adsorbtie

Dezaminarea- asparagina

Fosforilarea si glicarea Eliminarea Formarea isopeptidelor Decarboxilare Chimia Maillard

- reactia aminelor cuzaharurile reducatoare

STABILITATEACONFORMATIONALA AFECTATA

DE CATRE pH Agregarea hidrofobica Presiunea Forfecare (amestecare, debit, UF) Temperatura Interfete de sorbtie Legaturile metalului Efectele soventului

DENATURAREA PROTEINELOR- INACTIVAREA TERMICA -

Hidroliza- De evitat pH-ul acid/alcalinOxidare sulfhidrilica- Agenti reducatori, ex: ditiotreitol (DTT) sau -

mercaptoetanolRearanjarea disulfida- De evitat pH>10- t1/2 (S-S) = 10 ore la temperatura camerei

STABILIZAREA STOCARIIPROTEINELOR

Aditivi chimici- 50% glicerol- 50% metanol Adaugarea de saruri- 3M(NH4)2SO4- <0.15M (izotonice in organismele vii) Inghetare/Topire

STABILIZAREA STOCARIIPROTEINELOR

LiofilizareModificare chimica Reticulare (gluteraldehida)

- Cristalografie de raze X

Dializa- Indeparteaza impuritatile cu MW micUltra-filtrare

PROTEINELE SI pH-UL

Avand in vedere ca proteinele sunt constituitedin aminoacizi:- la orice pH mai mare ca pKa, molecula va fi

incarcata negativ (R-COO-)- la orice pH mai mic decat pKa, molecula va fi

incarcata pozitiv (R-NH3+)

- la orice pH la o distanta mai mare de o unitatede pKa, grupul functional poate fi considerat afi complet ionizat

PI

pH-ul la care proteina nu are o sarcina neta

proteinele au o solubilitate slaba langavaloare pI

PROTEINELE BAZICE

sunt proteinele care au pI-ul la pH mare.

R-NH3=R-NH2+H+

la pH neutru, proteina este incarcata pozitiv

pentru HPLC se foloseste schimbul de cationi

PROTEINELE ACIDE

pI-ul la pH mic

R-COOH = RCOO- + H+

la pH neutru proteina este incarcata negativ

pentru HPLC se foloseste schimbul de anioni

SOLUBILITATEA PROTEINELOR

Variaza destul de mult- depinde de hidrofilia si hidrofobia catenelor

laterale reziduale ale aminoacizilor

Daca se variaza pH-ul- proteinele mai putin solubile langa pI pot fi

afectate• proteinele animale cu pI intre 5.5 si 6• proteinele din plante sau bacterii cu pI

intre 4.5 si 5

SOLUBILITATEA PROTEINELOR

solubilitatea poate creste putin prin adaugareaunui solvent sau detergent

se dizolva sau se precipita prin adaugarea deacetona sau etanol

dezavantajul principal este acela ca substanteleadugate in acest caz trebuiesc indepartatedeoarece pot denatura

IMUNOCHIMIE

ANTICORPI-ANTIGENISI INTERACTIUNILE LOR

REACTII IN-VITRO AG-AC (antigen-anticorp)

Antigen: (greacă: anti=contra si geano=a naste, agenera)

Defineste orice substanta de origine endogena sauexogena, care, odata ajunsa in organism, nu esterecunoscuta ca proprie si determina aparitia unuiraspuns imun, ce vizează neutralizarea si eliminarea ei.

Odata patrunse in organism antigenele pot determina: Sinteza de molecule de anticorpi, care le recunosc

specific. Instalarea memoriei imunologice ("amintirea"

organismului despre întalnirile anterioare avute cuacelasi antigen).

Aparitia eventuala a unor reactii imune aberante:reactii alergice, autoimune etc.

ANTIGENII

Un imunogen este un tip specific de antigen, deci osubstanta care este capabila de a provoca un raspunsimun adaptativ, daca este injectat pe cont propriu. Unimunogen este capabil de a induce un raspuns imun,intrucat un antigen este capabil sa combine cu produsecu un raspuns imun odată ce acestea sunt făcute.

Conceptele suprapuse aleimunogenitate si antigenicitate sunt, prin urmare,subtil diferit. In mod curent:

Imunogenitatea este capacitatea de a induce unraspuns umoral si / sau celule-mediate imun

Antigenitatea este abilitatea de a se combina in modspecific cu produsele finale ale raspunsului imun (deexemplu, anticorpi secretati si/sau receptorii desuprafata celulelor T). Desi toate moleculele care auproprietatea de imunogenitate au, de asemenea,proprietatea antigenitatii, invers nu este adevarat ".

ANTIGENII La nivel molecular, un antigen poate fi, uneori,

caracterizat prin capacitatea sa de a fi "legat" la site-ulantigen-legare al unui anticorp. Anticorpii au tendința dea discrimina intre specifice structurile moleculareprezentate pe suprafața de antigen. Antigenele sunt deobicei proteine sau polizaharide . Aceasta include parti(capsule, peretii celulelor, flagella, si toxine)de bacterii, virusuri si alte microorganisme etc.

Lipidele si acizi nucleici sunt antigenice numai atunci candsunt combinate cu proteinele si polizaharidele. Non-microbiene exogene (non-auto) antigene pot include polen,albus de ou, si proteine din tesuturi siorganetransplantate sau pe suprafata celulelor sanguinetransfuzate.

Vaccinurile sunt exemple de antigene administrate inmod intentionat imunogene pentru a induce imunitatedobandită in destinatar.

Caracteristicile antigenuluiConventional, antigenele se definesc ca substante straine, care,consecutiv introducerii in organismul uman sau animal pe o caleparenterala (alta decat cea digestiva), declanseaza sinteza anticorpilorcu care se combina specific.

•Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeaunaposibilitatea declansarii raspunsului imun. Pentru agentii infectiosicare se multiplica in tractul digestiv, administrarea orala asigura obuna imunizare.

- Fata de unele antigene, organismele nu declanseaza raspunsul imun,ci manifesta o stare de toleranta.

- Unele molecule in stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numaidupa cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa isipastreaza proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizati.Astfel de molecule se numesc haptene.

Aminobenzen sulfonat,o Haptena

Haptena este un antigen incomplet, arespecificitate dar nu are imunogenitate.

NH2 NH2NH2

SO3

SO3

SO3Orto Meta Para

ANTICORPII Anticorp se numeste o molecula de natura proteica

(globuline), produsa in organitele limforeticulare sanguinedenumite limfocite, capabila sa recunoasca o subtanta

straina de organism, denumita antigen, si sa declanseze oreactie imunologica, care are ca rezultatindepartarea/blocarea/anihilarea respectivei

componente Unitatea structurala a anticorpului este o proteina

tetracatenara, denumita monomer. Anticorpii se leaga de markeri specifici - antigene - care

se gasesc pe suprafata virusurilor, bacteriilor, sau aunor toxine si le aglutineaza.

Sistemul imunitar poate fabrica milioane de anticorpidiferiti, care "lupta“ impotriva unei largi varietati de“invadatori” potentiali

ANTICORPII

IgG IgM IgA IgD IgE

ANTICORPII

oo imunoglobulinaimunoglobulina capabilacapabila de a sede a se combinacombina specificspecificcu un antigencu un antigen

Afinitatea anticorpilor

AgAbAgAb

]][[

][

AgAb

AgAbKa

Proprietatile legaturii Anticorp-Antigen

Ne -covalente Reversibile Forte intermoleculare Interactiuni coulombice (legaturi de hidrogen) Interactiuni hidrofobe Legaturi van der WaalsVariatia clonala

Proprietati principale: specificitatea si reversibilitatea.Interactiunea primara se datoreaza legarii efective Ag-Ac si depinde

in mod direct de cantitatea si afinitatea Ac. Reactiile Ag-Ac in carereactantii se afla in interactiune primara pot fi puse in evidentaprin nefelometrie.

Interactiuni secundare - apar la circa 30 min dupa cea primara.Datorita faptului ca Ag poate avea mai multi epitopi iar Ag areminim 2 paratopi, complexele primare mici solubileinteractioneaza intre ele formand complexe secundare, produsulfinal fiind o retea 3D insolubila. Pot fi evidentiate prin:imunofluorescenta, chemiluminiscenta, enzimatic si izotopic etc.

Ag-Ac1 - Diagnosticul de boli infecțioase:

preparatele antigenice cunoscute sunt folosite pentru adetecta anticorpii care circula in serul pacientului cadovadă a unei infecții anterioare sau actuale cu acelagent;SAU

anticorpi cunoscuti sunt folositi pentru a detectaantigene asociate cu un agent infecțios direct înfluidele corporale;

2 - Identificarea culturilor necunoscute:

anticorpi cunoscuti sunt folositi pentru a detectaantigenii omologi in diferite culturi;

REACTII IMUNOCHIMICEREACTII IMUNOCHIMICE1. REACTIA DE PRECIPITARE-Ag-solubil

2. REACTIA DE AGLUTINARE-Ag-particule

3. REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

4. REACTII CU REACTIVI MARCATIa) reactia de imunofluorescentab) analiza imunoenzimatica: TEHNICA ELISA, RIA etc.

METODE DE DETECTARE A REACTIILORAg-Ac (antigen-anticorp)

I

Metode imunochimicede analiza

Imunochimia

Disciplina de granitaa imunologiei si biochimiei

studiaza substantele si procesele chimicece participa la reactiile imunologice

REACTII ANTIGEN-ANTICORPREACTII IMUNOCHIMICEREACTII IMUNOCHIMICE

• REACTIA DE PRECIPITARE-Ag-solubil

• REACTIA DE AGLUTINARE-Ag-particule

• REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

• REACTII CU REACTIVI MARCATIa)reactia de imunofluorescentab)analiza imunoenzimatica: TEHNICA ELISA, RIA etc.

ImunochimiaReactivii imunochimici sunt produse biologice (Ac,

Ag, C, hematii etc.)ce se utilizează pentru determinări calitative sau/si

cantitative de Ag sau Ac

Tehnici:Fizico-chimice: - precizie

- acurateteImunochimice: - sensibiliate

- specficitate

Reactia Ag-Ac

Este determinata deinteractiunea specifica

dintreepitopii antigenului şi

paratopii anticorpilor

Intervin legaturio de hidrogen

o electrostaticeo forţe Van der Waals

o hidrofobe

REACTIA Ag-Ac este:- exoterma- specifica- reversibila

Afinitateaunui Ac pentru un Ag specific

Depinde de:- intensitatea fortelor delegatura a complexuluiAg-Ac- complementaritateasterica dintre paratop siepitop

Aviditateaunui Ac pentru un Ag specific

Reprezintarapiditatea aparitiei manifestarii

reactiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare)Depinde de

constanta de asociere valenta Ac

numarul de epitopi temperatura, pH

forta ionica a mediului

Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit“specific”

Reactia Ag-Ac

Are o mare putere de rezolutie/sensibilitate Selectivitatea fiecarei reactii nu este absolută Necesita obtinerea unui semnal secundar

pentru a fi detectabila si cuantificata Prezinta un domeniu de aplicare extrem de

larg

Reactii Ag-Ac

Seroidentificare: detectarea si dozarea Ag (componentnecunoscut) (medicamente,hormoni peptidici, antigene virale sau bacteriene) cu:

- Ac monoclonali- Ac policlonali

Serodiagnostic: detectarea si titrarea Ac din serulbolnavilor (component necunoscut) fata de un Ag specificcunoscut

REACTIILE DE PRECIPITARE

Ag = macromolecula solubila

Se produc in: mediu lichid (difuzia în gel) solidPot fi: Calitative CantitativeSunt: reactii specifice mai putin sensibile necesita cantitati importante de anticorpi

Precipitarea Formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac Conditiile de formare a reţelei de precipitare:

- Ac sa fie cel putin bivalent (Ac complet)- Ag sa fie multivalent

Precipitarea maximacorespunde cu zona de echivalenta(Ac si Ag sunt in raport optimal de concentratie) ce permite precipitarea

tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator* In exces de Ag sau de Ac precipitatul NU se formează

Formarea precipiatului depinde de: cantitatea si concentratia Ag,calitatea si concentratia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul dereactie, continutul in lipide al antiserului, etc.

Compozitia precipitatului imun, proportia de combinare a Ag cu Ac suntvariabile in functie de zona in care a avut loc precipitarea: exces de Ag,echivalenta sau exces de Ac.

Una dintre cele mai usoare teste serologice

Precipitarea in mediu lichid

Reactia de precipitare inelara (depistarea antigenelor microbiene):prot.M streptococi, Ag termostabil antrax (reactia Ascoli)

Precipitare inelara:- tuburi- capilare

Precipitarea in mediu lichidReactia de floculare (tehnica Ramon)

- Calitativa- Cantitativa

Se efectueaza dilutia succesiva a serului imunla care se adauga cantitati egale de Ag Se introduc probele in termostat

Periodic se examineaza pentru depistarea tubului in careapare precipitatul initial (zona de echivalenta)

Utilizare: determinarea cantitativa de toxina, antitoxinasau anatoxina,VDRL

Reactia de floculare

TUBURI GODEURI

Reactia de floculare

V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)

Precipitarea in mediu solid

Difuzia in gel

Difuzia simplaDifuzia dubla

Difuzia combinata cumigrarea in camp electric

Se utilizeaza gel de agar sau agaroza(concentratie de 0,8-1,6 g %)

Imunodifuzia radiala simpla

EXEMPLE DE REACTII DE PRECIPITARE

IMUNODIFUZIA SIMPLA RADIALA

Se efectueaza pe o placa acoperita cu geloza, in caresunt incorporati Ac specifici.

Ag este depus in godeuri din stratul de geloza sidifuzeaza radial in geloza pe parcursul a 48 deore.

Daca Ag corespunde Ac are loc formarea de discuride precipitare, cu suprafata proportionalaconcentratiei de Ag din godeu.

Se utilizeaza pentru identificarea si cuantificareahormonilor, enzimelor etc.

Precipitarea in mediu solidImunodifuzia radiala simpla

(Mancini, Carbonara, Heremans;1965)IDRS

Aplicaţii (cantitativ): IgG, IgA, IgM, C3,alfa-1 antitripsina, siderofilina,

proteina C-reactiva (CRP)

2. IMUNODIFUZIA DUBLA(TEHNICILE QUCHTERLONY SI ELEK)

Se acopera cu geloza o placa de sticla sau se toarna gelozain placa Petri.

A) In tehnica QuchterlonyQuchterlony Ag si Ac difuzeaza in godeurisituate la o distanta de 15 mm unul de altul.

B) In tehnica ElekElek cele doua substante reactive difuzezadin benzile de hartie plasate pe suprafata gelozei.

Moleculele difuzeaza in functie de greutatea lor si formeazalinii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac cecorespund in zona lor de echivalenta. Daca doua Ag suntidentice liniile lor se unesc daca sunt diferite seintersecteaza.

UTILIZARE: determinarea toxinelor (toxigeneza),antitoxinele, Ag proteice etc.

Precipitarea in mediu solidImunodifuzia dublă ( Elek, Ouchterlony; 1948 )

Aplicatii (calitative) : proteinele Bence-Jones(kappa şi lambda), crioglobuline

Imunodifuzia dublă

Testul Elek(toxinogeneza la C.diphteriae)

Metoda Elektest pozitiv formarea a patru liniiradiante care rezulta in urma

reactiei de precipitare

Metoda Ouchterlonya

Incubare

1h la 37°C

21

C 3

Ag

21

C 3

Ag

Difuzia combinata cumigrarea electroforetica

Imunoelectroforeza (IEF)Grabar si Williams (1953)

Scheidegge (1955)Imunoelectroforeza

bidimensionala cantitativaRessler (1960), Laurell (1965),

Clarke si Freeman (1968)

Imunoelectroforeza

Difuzia combinata cumigrarea electroforetica

Contra-imunelectroforeza (CIEF)Bussard (1959)

Difuzia combinată cumigrarea electroforetică

Electro-imunodifuzia (EID)

Electroimunodifuzia EID a fost imaginata de Laurell (1965).

Se realizeaza prin electroforeza Ag in strat de gel ce conţineAc monospecifici. Precipitatul Ag-Ac apare sub forma derachete (conuri) a caror inaltime este direct proportionala cuconcentratia Ag si invers proportionala cu cea a Ac.Reactia are sensibilitate mai mare decat IDRS. In cazul Ig seutilizeaza ca suport agarul sau agaroza. IgG migreaza anodicin gelul de agar. IgA si IgM migreaza catre anod in gelul deagaroza.

Reactia prezinta unele dificultati la efectuare. De ce s-a dorit combinarea imunodifuziei cu electroforeza?

Viteza Specificitatea

Carl-Bertil Laurell ( Universitatea Lund , Suedia) Tehnica Laurell (factori de coagulare) “ Electroforeza Rocket”

Electroimunodifuzia

+

-

Imunoelectroforeza

Imunoelectroforeza reprezinta asocierea electroforezei cu dubla difuzie.In prima etapa are loc electroforeza proteinelor, urmata de dubladifuzie cu un antiser corespunzator. Reactia Ag-Ac se vizualizeazaprin linii de precipitare corespunzatoare sistemelor Ag-Ac din reactie.

Imunoelectroforeza (IEF) ofera numai informatii calitative indiagnosticul gamapatiilor monoclonale. Metoda ilustreaza in cazulcomponente monoclonale a Ig, clasa si tipul de Ig patologice.

Metoda se foloseste pentru studiul puritatii unui Ag sau Ac.

Combina electroforeza proteinei serice cu detectia imunochimica Electroforeza face separarea Imunoprecipitarea produce detectia

Imunoelectroforeza

Specimen

ser -uman

+

-

Imunoelectroforeza

P C P C P C

+

-

Imunofixarea electroforetica

•Cuprinde un grup de tehniciimunochimice care au comun EFprobei in gel, combinata cuimobilizarea (fixarea) unui reactantde catre celalalt (imobilizarea Ag decatre Ac cunoscut, fie invers).Precipitatele se evidentiaza dupacolorare.•Metoda se utilizeaza pentrustabilirea clasei si tipului de Igmonoclonala, pentru diagnosticulimunochimic al bolii lanturilor grele şipentru diagnosticul diferential alhipergama-globulinemiilormonoclonale.

SPE IgG IgA IgM

•Metoda a fost imaginata de Alper şi Johnson (1969).

Reactia de aglutinare

DEFINITIEAgregarea antigenelor corpusculare

naturale sau fixate artificialpe suprafaţa unor particule

(bacterii, hematii, latex)/aglutinogeneprin Ac specifici completi/aglutinine


Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific Ac specifici sunt compleţi, cel puţin bivalenţi Ac pot fi:

- aglutinanţi- neaglutinanţi (blocanti sau incompleti)- care aglutinează numai la rece (+4°C)

Aglutinarea

Mecanism: scaderea fortelor de respingere electrostatice dintre particulesi aparitia unor punti de legătura prin intermediul Ac

Aglutinarea

Factori determinanti: Valenta Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanti

decat cei care aparţin clasei IgG) Densitatea determinantilor antigenici de la suprafata

particulei Forta ionica a mediului in care are loc reactia


Are sensibilitatea mai mare decat reactia de precipitare(Ag este o particula si nu o molecula solubila)

Excesul de Ag nu inhiba reactia Concentratiile mari de Ac pot inhiba reactia (fenomenul de

prozona) Raportul intre Ag-Ac este tot in favoarea Ac (ca si la

precipitare)

Clasificarea reactiilor de aglutinare

• Aglutinare “activa” sau “directa”, in care particulafigurata (Ag corpuscular) este el insusipurtator de determinante antigenicespecifice (hematii, leucocite,trombocite,spermatozoizi, bacterii etc.)

Aglutinare “pasiva” sau “indirecta”, in careparticula serveste doar de suport pentru undeterminant antigenul solubil fixat artificial pesuprafata sa (hematii, particule de latex saumicrocristale de colesterol)

Aglutinarea directă “activa”

Poate fi:- Calitativa

- CantitativaUtilizare: ex. determinarea grupelor sanguine,

seroidentificarea Ag bacteriene saudepistarea si titrarea Ac din serul pacientilor (ex. bruceloza)

Sensibilitatea poate fi crescuta prin:- tratarea celulelor cu enzime

- executarea reactiei in mediul cu vascozitate crescuta

Reactia de aglutinare directacalitativa

LAMA

(4+) (-)

(4+)(-)

Reactia de aglutinare directacalitativa

TUBURI

(4+) (-)

R. aglutinare directacantitativa

METODA DILUTIILOR SUCCESIVETITRUL AGLUTINANT AL SERULUI

(3+)

Aglutinarea indirecta “pasiva“

Particula serveste doar ca suport pentru undeterminant antigenul solubil fixat artificial pesuprafaţa sa

Sunt utilizate ca suport hematii formolate, tanate particule de latex microcristale de colesterol proteina A stafilococ

Poate fi:- Calitativa- CantitativaSensibilitate mai inalta fata de aglutinarea directaCitire mai usoara

Hemaglutinarea indirecta (pasiva)RHAI/RHAP

TUBURI

Fixarea pe hematii:- Ag.polizaharidice: scurta

incubatie- Ag.proteice: hematii tanate,

formolate


GODEURI


Tehnica se bazeaza pe o reactie dehemaglutinare pasiva pentruevidentierea anticorpilor specificianti-treponemici

Principiu: hematii de cocossensibilizate cu antigenetreponemice se pun in contact cuserurul pacientului; daca serulcontine anticorpi specifici, acestiadetermina aglutinarea hematiilor

±1+2+3+

4+

Treponema pallidumhaemagglutination assay

(TPHA)


TPHA / MHA-TP(microhaemagglutination assay for antibody to

Treponema pallidum )

Reactia de latex-aglutinare

Ac sau Ag sunt fixaţipe particule de latex

Reacţia se efectuează pe:- lame de sticla

- slide-uri cartonate

Utilizare:- Identificare Ag din

prelevate patologice- Serodiagnosticul unor

infectii


NEREACTIV REACTIV


POZITIV / REACTIV

Reactia de Co-aglutinare

Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC12498) prezinta un continut ridicat de proteina A de suprafata

Proteina A din peretele celular al stafilococului aureus se leagade fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulina, lasand liberfragmentul Fab pentru legarea antigenului

Aglutinarea vizibila a stafilococilor reprezintă un test pozitiv careindica legatura antigen-anticorp

Reactia de co-aglutinare este utilizata in detectarea antigenelordiferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şiNeisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcuspneumoniae

Reactia de Co-aglutinare

TESTUL COOMBS

Tehnica Coombs directa(test antiglobulinic direct)La un nou-nascut: prezenta Acmaterni anti-Rh fixaţi pe hematii(dacă mama este Rh-)Tehnica: La aceste hematiisuspecte se adaugă un ser anti-IgumanăMetoda: hemaglutinare pe lama

TESTUL COOMBS

Testul Coombs indirect(detecteazz anticorpii circulanti

anti-eritrocitari)Tehnica: - serul pacintului se

pune în contact cu eritrociteleunui donator Rh+- se adauga antiglobulinaumana (poli/monospecific)

Metoda: hemaglutinare pe lama

Reactia de inhibare a aglutinării

Reactia de aglutinare a particulelor incarcate cuAg solubil

este inhibata in cazul în careAc reacţioneaza in prealabil cu Ag omolog

(Exemplu:Testul inhibarii hemaglutinarii virale HAI)

Reactia de inhibare a aglutinarii

Reactia de inhibare ahemaglutinării

III


REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC)

Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cuparticiparea C.

-participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG.- se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc.

Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate înprealabil pentru aprecierea dozelor de lucru.

Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor.

Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2sisteme.

I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Agnecunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement îndoza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut 16-18ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C(efect frecvent invizibil).

II etapă – la sistemul de bază se adaugă sistemul indicator(hemolitic),constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici – serulhemolitic(Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată.

Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primulsistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nucorespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pesistemul indicator Ag2 Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)

REACTII ANTIGEN-ANTICORP CUCOMPONENTE MARCATE

Marcarea componentelor de reactie:

sa permita detectarea unor cantitati infime de substanta sa nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag

corespunzatoare se monteaza pe suport solid (lame, placi din plastic)

Tehnici serologicecu componente marcate

Marcanţii utilizaţi:

Fluorocromi (rodamina, fluoresceina): emit lumină roşu-oranj sauverde-galbenă la tratarea cu raze UV(Reacţia de Imuno-Fluorescenţă) Coons,1942

Radio-izotopi (125 I sau 3H): emit raze gamma sau beta(Analiza Radio-Imună) Zalow şi Berson, 1960

Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza): capabile să modificeculoarea unui substrat(Reacţia Imuno-enzimatică) Engwall şi Perlman, 1972

Analiza imunochimica in fazaheterogena

Competitiv Exces de antigen De obicei implica

antigene concurentemarcate

RIA este prototipul

Ne-competitiv Exces de anticorp Implica de obicei

anticorpi secundarmarcati

ELISA este prototipul

Analiza imunochimica in fazaheterogena

Care este trasatura distinctiva a imunodozariiin faza heterogena ? Necesita separarea de liganzii legati sau liberi

Au metodele heterogene vreun avantaj fata demetodele omogene? Da

Care sunt acestea? Sensibilitatea Specificitatea

Marcare fluorescenta

Advantaje Dimenisune Specificitate Sensibilitate

Dezavantaje Complet Limita de selectie Fundal/Zgomot

Marcare chemiluminescenta

+ 2 H 2 O 2 + O H -

C O O -

C O O -

O -

O -

+ h ( m a x = 4 3 0 n m )

+ N 2 + 3 H 2 O

N H 2

L u m i n o l

P e r o x i d a s e

O

O

N

NH

N H 2

H

O

O *N H 2

C H 3N +

CO 2 H

O O

B r -

A c r i d i n i um e s t e r

O -

CO 2 H

+ H 2O 2 + O H -+ + CO 2 + h

O

C H 3N

Reacţia de imunofluorescenţă(RIF)

Coons,1942


Se prepară un frotiu dinmaterialul ce conţine Ag

(material nativ, cultură pură,biopsie tisulară)

Colorare cu ser conjugatIncubare în cameră umedă 20 min

SpalareExaminare la microscopul cu fluorescenta

Metoda directă (IFD)(seroidentificare)


Metoda indirectă(IFI)(sero-identificare şi

sero-diagnostic)

Pe frotiul ce conţine Agse aplică Ac specifici nemarcaţi

Peste 20 min se spală preparatulColorare cu Ac policlonali anti-Ig

marcati fluorescent

Metoda directă (IFD)

• test pozitiv pentru turbare • test negativ pentru turbare

Teste pentru molecule mici

Analiza de chemiluminescență pentru testosteronÎn urma acestei analize se obţine o curbă:

Chemiluminescenta pentru molecule mari

testele de chemiluminescentă pentru imunoglobulina G- aufost unele dintre primele teste care a implicat cuplarea directă aluminolului cu un antigen proteic. Cea mai mică concentratiestandard de imunoglobulină G folosită a fost 5 ug/tub.

prepararea anticorpilor marcati- această procedură areprezentat prima folosire pe scară largă a anticorpilor marcatiîntr-un test cu 2 situri.Randamentul cuantic al luminolului a fost redus în aceastăreactie la mai putin de 1% din valoarea sa originală, datorităformării de polimeri si pierderea randamentului prin modificăristructurale.

Marcarea cu enzime

Advantaje Diversitate Dezvoltare Adaptabilitate

Dezavantaje Instabilitate Dimensiune Heterogenitate

Reacţia Imuno-Enzimatică(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Marcarea Directa a Anticorpului


Marcarea Indirecta a Antigenului

Aceasta tehnica este: Foarte sensibila Nu necesita echipament specializat Evita pericolele de radioactivitate

Metoda de conjugare depinde de o enzima demarcare a Ag sau Ac, apoi se adauga substratulpentru a se masura cantitativ in functie de activitateaenzimatica


ELISA


Ac cunoscuţi sunt fixaţi in godeurile placiiSe adauga soluţia de Ag necunoscut

Incubare1hSpălare

Se adaugă Ac marcaţi cu enzimeIncubare de 30 min-1h

SpalareAdaugare substrat cromogen

Metoda sandwich(seroidentificare)

ELISA direct (tehnica dubla Ac):folosita pentru detectarea de Ag. Cunoscutul Ac este imobilizat prin adsorbtie pe

o suprafata din material plastic Se adauga esantionul clasic (in cazul in care este

prezent Ag si se va lega la Ac imobilizat) Se spala excesul Se adauga substratul

Ac specific pentru Ag Se schimba culoarea Daca nu este Nu schimba culoarea

Galben inchis extrem ++ve Galben moderat +ve Culoare mai putina --ve

Dezavantaje: metoda scumpa(pentru fiecare Ag avem nevoie de Acspecific marcat)

AntigeniAntigeni

++

AnticorpAnticorp marcatmarcat cucu enzimeenzime

spalatspalat

++

substratsubstrat

ELISA indirect In acesta varianta, o enzima marcata lg anti-uman

este utilizata pentru a detecta prezenţa de ABSspecifica in serurile de analizat

Cunoscutul Ag este fixat prin adsorbtie pe osuprafata din material plastic

Proba de ser, se adauga (in cazul in care Abspecific este prezent, acesta se va lega fix de Ag).

Se spala Se adauga enzima marcata lg anti-uman Se spala excesul Se adauga substrat, apoi se masoara cantitativ prin

determinarea spectrometrica a gradul de schimbarea culorii.

AntigeniAntigeni

++

AnticorpiAnticorpi

==spalarespalare

++

EnzimeEnzime marcatemarcate lglg

== ++

substratsubstrat

==

ELISA aplicatii

Screening-ul donatorilor de sange pentru evidentiereacontaminarii:

- HIV-1 si HIV-2 (prezenta anticorpilor anti-HIV) hepatita C (prezenta anticorpilor) hepatita B (testarea anticorpilor si antigenilor virali)

Masurarea nivelului hormonilorHCG (test de graviditate)LH (determinarea timpului de ovulatie)TSH, T3 si T4 ( functiunea tiroidei)Hormoni (steroizi anabolizanti, HGH) sportiviDetectarea infectiilor: sifilis, chlamydia,Toxoplasma gondii

Detectarea alergenilor si toxinelor din alimenteMasurarea auto-anticorpilor in bolile autoimmune (lupus erythematosus)Detectarea drogurilor ilicite (cocaina, opiacee, marijuana)

Analize heterogeneautomatizate

Metoda ELISA poate fi automatizataSepararea este un elementcheie în proiectarea testelorimunochimice heterogeneautomatizate

Abordari pentru separarea automatizata Anticorpi imobilizati Captare/filtrare Separare magnetica

Metode de separare magnetica

Fe

Fe

FeFe

Fe

Fe

FeFe

Fe

Metode de separare magnetica

Fe Fe FeFe Fe

Aspirat/spalat

Metode de imobilizare aanticorpilor

Tuburi filmate (acoperite) Bile filmate (acoperite) Metodele anticorpilor in faza solida

Metoda cu tuburi filmateSpecimen Antigen marcat

Spalat

Metoda cu bile filmate

Microparticle enzyme immunoassayMEIA

MEIA este o tehnica in caresuportul fazei solide consta dinmicroparticule foarte mici de lichidin suspensie.

Anticorpii specifici reactiv suntcovalent legati de microparticule

Antigenul, dacă este prezent esteca un “ sandwich”, intre anticorpiilegati si antigenii specifici,anticorpii marcati cu enzima.

Complexele antigen-aticorp suntdetectate prin analiza defluorescenta prin interactiuneaenzima-substrat.

E

E ES P

Matrice fibra de sticla

Anticorp marcat

Analiza imunochimica in fazaomogena

Care este trasatura distinctiva a detectie prin imunochimieomogena Nu necesita separarea liganziilor legati sau liberi

Au metodele omogene vreun avantaj fata de metodeleheterogene? Da

Care sunt acestea? Viteza Adaptabilitate

Analize imunochimiceomogene

Toate imunotestele omogene sunt peprimul loc

Toate imunotestele omogene suntcompetitive

Toate imunotestele omogene suntconcepute pentru antigenii mici Terapeutic/medicamente Steroizi/hormonii peptidici

Proiectarea tipica a analizelorimunochimice in faza omogena

Enzima

S

S P

Fara semnal

Cu semnalEnzima

S

Tehnica imunologica deamplificare cu enzime (EMIT)enzyme multiplied immunoassay technique

Dezvoltata de Corporatia Syva (Palo Alto, CA) in1970s—detinuta in prezent de Behring Diagnostics.

A oferit o alternativa la RIA sau HPLC pentrudeterminarea medicamentelor in urmarirea unor terapii.

A declansat utilizarea pe scara larga a TDM (therapeuticdrug monitoring).

Adaptabila pentru aproape orice analizor de chimie. Are atat aplicatii cantitative (TDM) cat si calitative

(DAU). Testarea antidrog in criminalistica este cea mai

comuna utilizare a metodei EMIT.

Curba semnalul/ concentratie EMITSe

mna

lul(

activ

itate

aen

zim

ei)

Concentratia antigenului

Intervalul deconcentratie functional

Electrochemiluminiscentaimunologica( sistemul Elecsys™ )

Fluxul celulei

Fe

Oxidat

RedusRedus

Imunologia imprastierii luminiiin faza solida

Polarizarea de fluorescenta in analizaimunologica (FPIA)

Dezvoltata de Abbott Diagnostics, aproximativ in acelasitimp cu EMIT care a fost dezvoltata de Syva

O tehnica, care foloseste cresterea polarizarii (depropagarea non-aleatoare de emisie) din emisiilede lumină fluorescenta atunci când un antigen marcatfluorescent este legat de un anticorp reactiv.

Ca si EMIT, primele aplicatii au fost pentru medicamenteutilizate in terapii

In prezent este metoda cea mai utilizata pe scara larga Necesita intrumentul specific

Radiatia polarizata

z

y

z

y

x

z

y

x

Filtrul polarizatorului

Polarizarea de fluorescenta

OHO OH

C

O

O

Fluoresceinain

Orientarea radiatiilor polarizate este mentinuta

out(10-6-10-9 sec)

Polarizarea de fluorescenta

OH O

OH

CO

O

Frecventa de rotatie 1010 sec-1

in

Orientarea radiatiei polarizate NU este mentinuta

out(10-6-10-9 sec)

Dar. . . Fluoresceina

Polarizarea de fluorescenta in analizaimunochimica

OHO OH

C

O

O

Polarizarea mentinutaRotatie lenta

OHO OH

C

O

O

Rotatie rapida

Polarizarea pierduta

Curba semnalul/concentratie FPIASe

mna

l(I /

I )



Cloned enzyme donorimmunoassay (CEDIA)

Dezvoltata de Microgenics (achizitionat deBMC, si cesionate de Roche)

Ambele aplicatii TDM si DAU suntdisponibile

Adaptabil la orice analizor chimic Sunt in prezent cereri de patrundere pe

piata de noi aplicatii EMIT and FPIA

CEDIA™ semnalul/concentratieSe

mna

lul(

activ

itate

aen

zim

ei)



Alte abordari ale analizelorimunologice omogene Metode fluorescente Metode electrochimice Metode enzimatice Imunologia directionata pe enzime

Substrat marcat prinfluorescenta

Enzima

S

S Fluorescenta

Fara semnal

CusemnalEnzima

S

Grupuri imunologice proteice

Enzima

Enzima

P

P

S P

Cu semnal

Fara semnal

Directionarea enzimatica in analizaimunochimica

Ag

E1

E2

Substrat

Produsul 1

Produsul 2

IV


Reacţia Imuno-Enzimatică

Tehnica imunoblot (western blot)(identificarea Ag sau Ac dintr-un amestec)

• I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag• II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de

nitroceluloză• III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv:

- Ac dirijaţi contra Ag- conjugatul marcat cu enzimăSpălareSe adaugă substratul cromogen

western blot

RADIO IMUNO-ANALIZA(RIA)

Marker de reactieizotop radioactiv (I125, P32 etc.)

Detectarea activităţii radioactivecontor de scintilaţie (sesizează emisiile β si γ)

Contor deradiatii gamma

picograme (10−12 g) de antigen

Marcarea radioizotopilor

• Advantaje– Flexibilitate– Sensibilitate– Dimensiune

• Dezavantaje– Toxicitate– Perioada de viata– Eliminarea

costurilor

resturile de tirozina dinproteine,

isotopii radioactivi125 I sau 131 I

RIA

Rosalyn YalowRosalyn Yalow sisiSolomonSolomon BersonBerson in 1957in 1957

auau descrisdescris primiiprimii RIARIA


Testul cantitativ pentru anticorpi

Suportul solid este standardizat prin legarea unui Ag nemarcat şi oconcentraţie standard pentru Ac (marcat cu o substanţăradioactivă)

Proba (necunoscută) care conţine Ac ce trebuie determinat(nemarcat) se adaugă la mediul de reacţie

Concentraţia Ac în proba necunoscută este determinată princitirea comparativă a valorilor pe o curbă standard

Curba este funcţie de gradul de inhibiţie a legării Ac marcat,combinat cu valorile diluţiilor în serie ale cantităţilor cunocute deAc nemarcat

RADIO IMUNO ANALIZA(RIA)

Testul cantitativ pentruantigeni

Metoda de lucru estesimilară

Excepţie: cand antigenulmarcat este folositpentru dozareaantigenului liber dinprobă


Testul RAST (radioallergosorbent test)

Este o variantă specializată a RIA utilizată pentru a determina

cantitatea de anticorpi IgE sericicare reacţionează cu un alergen cunoscut

PRODUCEREA ANTICORPILORMONOCLONALI

Plasmociteproducatoare de Ac

Antigen

FuzionareacelulelorHIBRIDOM Mielom

Anticorpii monoclonalisunt purificati

Cloneledorite secultiva sausecongeleaza

Testarea clonelor

Hibridoamele se separasi se cultiva

Cultivareahibridoamelor

Mentinereahibridoamelor insoareci

PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI

Antigenul (celule, componente ale membraneicelulare, microorganisme etc.) se injecteazasoarecelui

Cand titrul de anticorpi serici a crescutcorespunzator, se realizeaza splenectomia si secolecteaza LB

Inginerie geneticaSoareci transgenici

(gene pentru Ig umane)

PROBLEME

• HAMA = human anti-mouse antibodies– Dupa 10-14 zile– Eruptie cutanata (urticarie)– Bronhospasm– Hipotensiune– Soc anafilactic

APLICATIILE ANTICORPILORMONOCLONALI

• Diagnostic– Imunohistochimie– Imunofluorescenta– Radioimunodetectie (RIA)

• Medicamente• Hormoni• Proteine• Toxine• Droguri

– Imunoanaliza enzimatica (ELISA)

Procedee analitice cu anticorpi

• Anticorpii pot fi folositi pentru a detecta patogeni șiorganisme, cum ar fi virusuri, bacterii și mucegaiuri, dar, deasemenea, si la analiza contaminanților alimentari cugreutate moleculară mică.

• Specificitatea unei imunodetectii este în mare măsurădeterminată de specificitatea intrinsecă utilizata pentrudetectarea anticorpilor.

• Există trei tipuri diferite de anticorpi disponibili pentrudezvoltarea metode de analiza: anticorpii policlonali,anticorpii monoclonali si anticorpii recombinanti

Foarte reproductibilReproductibilitatea sistandardizarea dificila

Se poate obtine unanticorp specific plecandde la un antigen impur

Se poate obtine unanticorp specific doarplecandu-se de la unantigen foarte pur

Se produce o singura clasade anticorpi

Exista clase variate deanticorpi policlonali(IgG, IgM etc.)

Contin un sigur anticorp cerecunoaste un singurdeterminant

Contin mai multi anticorpicare recunosc mai multideterminatii aiantigenului

MonoclonaliPoliclonaliA N T I C O R P I I

Ce sunt anticorpi monoclonali si care estescopul lor

• În plus față de sonde genetice, oamenii de stiinta folosescanticorpii monoclonali pentru a dezvolta teste de siguranțăalimentară.

• Anticorpii sunt proteine produse de organism pentru aeticheta/marca “invadatorii” straini.

• Anticorpii monoclonali sunt anticorpi identici produsi încantități mari, în condiții de laborator.

• Atunci cand sunt aplicati la analiza esantioanelor/probelorde produse alimentare, anticorpii pot fi utilizati pentru amarca sau a identifica microbii dăunători și toxinele.

Antigen (Ag) = o substanţă străină capabilă săinducă un răspuns imun

Virusuri Bacterii Fungi Paraziţi Polen Alimente Medicamente

• Un bun antigen:– Are masa moleculară mare

(>5.000 Da)

– este organic

– are structură complexă– este non-self

ANTIGENEANTIGENE –– substansubstanţţee străinestrăine ((nonnon--selfself)) de natură de naturăendoendo-- sau exogenă capabile să sau exogenă capabile să declandeclanşşezeeze ununrăspunsrăspuns imun (umoral, celular, toleranimun (umoral, celular, toleranţţăăimunologicăimunologică, m, memorie imunologicăemorie imunologică, paralizie, paralizieimunologicăimunologică).).

ProprietăProprietăţţileile de bază ale de bază ale AgAg::1.1. ImunogenitateaImunogenitatea –– capacitateacapacitatea AgAg de ade a fifi

recunoscutrecunoscut caca strstrăăinin şşi de ai de a induceinduce răspunsrăspunsimun specificimun specific

2.2. AntigenitateaAntigenitatea (specificitatea)(specificitatea) –– capacitateacapacitateaAgAg de ade a interacinteracţţionaiona specific cu Ac sau cuspecific cu Ac sau cureceptorul pentrureceptorul pentru AgAg complementar alcomplementar allimfocitelor sensibilizatelimfocitelor sensibilizate

In functie de natura chimica:GlucideLipideProteineAcizi nucleiciCompusi sintetici

HAPTENA = o substanţă străină cu masa molecularăsuficient de redusă ca să nu poată produce răspunsimun

• Pentru a produce răspuns imun trebuie să se lege deun carrier - prin cuplare cu haptena → imunogena

Exemplu: Medicamentele = haptene, fiind suficient demici ca să nu fie recunoscute ca fiind străine deorganism. Uneori, acestea se pot lega de exemplu deeritrocite şi devin imunogene.

Exemple de hapteneExemple de haptene:: săruri ale metalelor grelesăruri ale metalelor grele (Cr, Ni),(Cr, Ni),substansubstanţţe de origine vegetalăe de origine vegetală, medicamente, coloran, medicamente, coloranţţi,i,oligonucleotide.oligonucleotide.Superantigene –– molecule proteice particularemolecule proteice particulare(enterotoxinele stafilococice, toxina(enterotoxinele stafilococice, toxina şşocului toxicocului toxicstafilococicstafilococic, t, toxina exfoliativă a stafilocociloroxina exfoliativă a stafilococilor,,nucleocapsida virusului rabic), capabilenucleocapsida virusului rabic), capabile să stimuleze unsă stimuleze unnumăr mare de limfocite Tnumăr mare de limfocite T (10(10--40%). N40%). N –– 0 0.01%..01%. SuperAgSuperAgprovoacă reacprovoacă reacţţii imunopatologiceii imunopatologice..

Se disting arbitrar:Se disting arbitrar:-- AgAg solubilesolubile: proteine plasmatice,: proteine plasmatice, toxinetoxine,, enzime, hormoni,enzime, hormoni, etcetc-- AgAg figuratefigurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii,(celulare, corpusculare): celule, bacterii, paraziparaziţţii,,

etc.etc.ÎÎnn funcfuncţţieie dede provenienprovenienţţăă se deosebesc:se deosebesc:-- AgAg heterofileheterofile –– AgAg comune mai multor specii animale. Ex.:comune mai multor specii animale. Ex.: AgAg

polizaharidicepolizaharidice ForssmanForssman, prezent, prezentee îîn hematiile de cal,n hematiile de cal, câinecâine,,oaie, cobai;oaie, cobai; sistemulsistemul RhRh al eritrocitelor seal eritrocitelor se îîntâlnentâlneşştete la omla om şşiimaimumaimuţţeleele MacaccusMacaccus rrhesushesus,, etcetc

Anticorpii artificiali• Imunoglobulinele au o durata de viata

limitata.– Necesita intotdeauna refrigerare– Denaturarea afecteaza afinitatea, aviditate

• Putem crea anticorpi “artificiali” mai stabili?– Recunoasterea moleculara a moleculelor– Amprenta moleculara

Istoria amprentei moleculare

• Linus Pauling (1901-1994)a sugerat mai intai

posibilitatea de obtinere aanticorpilor artificiali in 1940

Bazele interactiunii antigen/anticorp

O

O-

O

O-

NH 3

+CH2-CH2-CH2-CH3

OH

N

NH2

Cl

Amprenta moleculara (Step 1)

N

NO N

NH

O

H 3 C

CH3

N

NO N

N H

O

H 3 C

CH3

Acid metacrilic+ Porogen


N

NO N

NH

O

H3C

CH3

N

NO N

NH

O

H3C

CH3


N

NO N

NH

O

H3C

CH3

N

NO N

NH

O

H3C

CH3

Monomer-reactiv initiatorde cross-linking

Compararea MIP cu anticorpii

• In pregatirea “in vivo”

• Limitat de stabilitate

• Specificitate variabila

• Aplicabilitate generala

• In pregatirea “in vitro”

• Nelimitat de stabilitate

• Specificitate previzibila

• Aplicabilitate limitata

Anticorp MIPs

Analiza Imunochimica utilizandMIPs

• Medicamente in terapii: Teofilina, Diazepam,Morfine, Propranolol, Yohimbine (2-adrenoceptor antagonist)

• Hormoni: Cortisol, Corticosteron

• Neuropeptide: Leu5-enkephalin

• Altele: Atrazina, Methyl--glucoside

FIAFIA -- ANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXSIASIA -- ANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALA

SISTEME DE ANALIZA IN FLUX

FIAFIA –– DEFINITIIDEFINITII

DEFINITIADEFINITIA ((ACADEMICAACADEMICA)):: informatiile adunateinformatiile adunate dedela un gradient dela un gradient de concentratieconcentratie formatformat intrintr--oo zonazonainjectatainjectata,, binebine definitadefinita aa fluxuluifluxului,, dispersatdispersat intrintr--unun curentcurent continuucontinuu,, nesegmentatnesegmentat alal unuiunuipurtatorpurtator..

DEFINITA (PRACTICA):DEFINITA (PRACTICA): oo tehnologietehnologie analiticaanaliticasimplasimpla sisi multilateralamultilaterala pentrupentru analizeanalize chimicechimiceumedeumede automatizateautomatizate,, bazatabazata pepe manipulareamanipulareafizicafizica sisi chimicachimica aa uneiunei probeprobe dispersatedispersate intrintr--oozonazona,, formataformata prinprin injectiainjectia probeiprobei intrintr--unun curentcurentpurtatorpurtator, fluid, fluid sisi detectatdetectat inin avalaval..

DIAGRAMA FIADIAGRAMA FIAANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUXANALIZA PRIN INJECTIE IN FLUX

COMPONENTE:COMPONENTE: 1. POMPA:1. POMPA: 2.2. DETECTOR:DETECTOR: 3. TUB INGUST, PERFORAT;3. TUB INGUST, PERFORAT; 4. VALVA DE INJECTIE.4. VALVA DE INJECTIE. ATRIBUTE:ATRIBUTE: 1)1) principiiprincipii fundamentalefundamentale

usorusor dede intelesinteles sisi dedeimplementatimplementat;;

2)2) aparateaparate sisi instrumenteinstrumenteusorusor dede asamblatasamblat sisimanipulatmanipulat;;

3)3) automatizareautomatizare manualamanuala aamultormultor proceseprocese analiticeanaliticechimicechimice umedeumede..

DIAGRAMA SIADIAGRAMA SIAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALAANALIZA PRIN INJECTIE SECVENTIALA

COMPONENTE:COMPONENTE: 1. POMPA BI1. POMPA BI--

DIRECTIONALA;DIRECTIONALA; 2. VALVA DE SELECTIE;2. VALVA DE SELECTIE; 3. DETECTOR.3. DETECTOR. ATRIBUTE:ATRIBUTE: 1) hardware1) hardware maimai simplusimplu

decatdecat la FIA (ola FIA (o pompapompa, o, ovalvavalva sisi un detector);un detector);

2)2) uzuz eficienteficient dede reactivireactivi sisiminimizareaminimizarea deseurilordeseurilor;;

3)3) manipularemanipulare sisiimplementareimplementare simple.simple.

ETAPELE FIAETAPELE FIA 1.1. PREPARAREA PROBELORPREPARAREA PROBELOR:: probaproba esteeste masuratamasurata sisi

injectatainjectata inin curentulcurentul purtatorpurtator fluidfluid –– prinprin valvavalva dedeinjectieinjectie..

CalitatileCalitatile uneiunei valvevalve:: - precizie;- schimbarea rapida asensului;- limite de presiune (cca. 100 psi);- abilitateade a injecta volume mici de proba.

2.2. PROCESAREA PROBEIPROCESAREA PROBEI –– ETAPA CHEIEETAPA CHEIE::transformarea analitului intr-o specie masurabila dedetector, a carei concentratie poate fi manipulata intr-un interval compatibil cu detectorul.

DilutiaDilutia:: 1.1. dispersiadispersia;;•• 2.2. dilutiadilutia electronicaelectronica;;•• 3.3. preparareaprepararea pepe zone;zone;•• 4. camera cu gradient;4. camera cu gradient;•• 5.5. dispozitivedispozitive dede preparareaprepararea membranelormembranelor (MSD(MSD).).

3.3. DETECTIA: analitul genereaza un pic-semnal, folositpentru a cuantifica compusul care trebuie determinat.

DISPERSIADISPERSIA Proces complex, definit ca un amestec dinamic siProces complex, definit ca un amestec dinamic si

reproductibil de probe cu un reactiv si/sau purtator,reproductibil de probe cu un reactiv si/sau purtator,datorat modelelor debitului, creat de dinamicadatorat modelelor debitului, creat de dinamicafluidelor prin tubul ingust.fluidelor prin tubul ingust.

TipuriTipuri dede dispersiedispersie FIA/SIA:FIA/SIA:• 1. axiala – are loc in directia fluxlui si determina o dilutie si o

largire a picului mai mare decat cea radiala;• 2. radiala – este determinata de modelele fluxului/debitului in

curentul care circula normal in directia fluxului, datoritaacestuia avand loc o dilutie si o largire a picului minime.

EfectulEfectul geometrieigeometriei reactoruluireactorului asupraasupra dispersieidispersiei:: esteestedramaticdramatic asupraasupra piculuipicului..

DILUTIA ELECTRONICADILUTIA ELECTRONICA DILUTIA ELECTRONICADILUTIA ELECTRONICA

SIMPLASIMPLA –– tehnicatehnica dede masuraremasurareaa semnaluluisemnalului analiticanalitic inainteinainte dedeaparitiaaparitia piculuipicului detectoruluidetectorului..SemnalulSemnalul esteeste masuratmasurat lala piculpiculmaxim (tmaxim (t11).).

TimpulTimpul masurariimasurarii semnaluluisemnaluluitrebuietrebuie sasa fiefie controlatcontrolat cucuprecizieprecizie pentrupentru caca aceastaaceastatehnicatehnica sasa meargamearga binebine..

DEZAVANTAJDEZAVANTAJ:: datoritaerorilor inerente care apar lamasurarea semnalului (eroridatorate schimbarilor slabe inpozitia picurilor), aceastatehnica este cea mai putinprecisa.

PREPARAREA PE ZONEPREPARAREA PE ZONE PRINCIPIUL 1PRINCIPIUL 1–– cu primacu prima valvavalva esteeste injectatainjectata oo probaproba relativrelativ

mare, caremare, care curgecurge inin avalulavalul curentuluicurentului,, dispersatdispersat inin zonazona dedereactiereactie.. PePe masuramasura cece probaproba dispersatadispersata umpleumple celcel maimai micmicorificiuorificiu alal celeicelei dede--aa douadoua valve, un altvalve, un alt volumvolum dede probaproba esteesteinjectatinjectat inin curentulcurentul purtatorpurtator, care, care trecetrece prinprin zonazona dede reactiereactiepentrupentru oo viitoareviitoare dispersiedispersie sausau dilutiedilutie..

PRINCIPIUL 2PRINCIPIUL 2 –– indepartareaindepartarea uneiunei partiparti dindin piculpicul primeiprimei injectiiinjectiisisi injectareainjectarea luilui in alin al doileadoilea purtatorpurtator.. SincronizareaSincronizarea celorcelor 2 valve2 valveesteeste deosebitdeosebit dede importantaimportanta..

CAMERA CU GRADIENTCAMERA CU GRADIENT CAMERA CU GRADIENTCAMERA CU GRADIENT ––

dispozitivdispozitiv simplusimplu pentrupentrudilutiadilutia in FIAin FIA sisi SIA. CameraSIA. Cameracu gradientcu gradient esteeste un vasun vas micmicdede amestecareamestecare ((volumvolum de 1de 1mLmL sausau maimai putinputin), cu o), cu o barabaraagitatoareagitatoare, o, o guragura dede admisieadmisiesisi unauna dede evacuareevacuare pentrupentrucurentulcurentul purtatorpurtator..

PRINCIPIULPRINCIPIUL -- probaproba esteesteinjectatainjectata inin purtatorpurtator sisi trecetreceprintrprintr--oo dispersiedispersie largalarga,,deoarecedeoarece sese amestecaamesteca cucu celcelmaimai maremare volumvolum dede purtatorpurtatorin camera cu gradient.in camera cu gradient.

TIPURI DE MEMBRANETIPURI DE MEMBRANE 1.1. MEMBRANELE POROASEMEMBRANELE POROASE –– transportultransportul

dede masamasa are locare loc prinprin difuziadifuzia analituluianalitului prinprinporipori. Se. Se folosescfolosesc membrane cumembrane cu analitianalitivolatilivolatili: NH: NH33, H, H22SS sisi HCN.HCN.

2.2. MEMBRANELE NEPOROASEMEMBRANELE NEPOROASE –– analitulanalitul sesedizolvadizolva inin membranamembrana sisi difuzeazadifuzeaza prinprinstructurastructura pereteluiperetelui,, panapana lala curentulcurentulreceptor.receptor. ConditieConditie:: analitulanalitul trebuietrebuie sasa aibaaibaoo solubilitatesolubilitate maimai mare inmare in curentulcurentulreceptorreceptor decatdecat inin membranamembrana. Tip de. Tip demembranamembrana:: cauciuculcauciucul siliconicsiliconic..

3.3. MEMBRANELE IONICEMEMBRANELE IONICE –– transportultransportulionicionic miscamisca analitulanalitul dede--aa lungullungulmembraneimembranei.. MembranaMembrana ceacea maimai desdesfolositafolosita esteeste NAFION (NAFION (polimerpolimer perfluoroperfluoro--hidrocarbonathidrocarbonat cucu grupegrupe de acidde acid sulfonicsulfonic),),carecare transportatransporta cationiicationii micimici,, monovalentimonovalenti::NHNH44

++ sisi HH++..

DISPOZITIVE DE PREPARAREADISPOZITIVE DE PREPARAREAMEMBRANELOR (MSD)MEMBRANELOR (MSD)

MSD – sunt proiectate cucanale pentru 2 curentifluizi, un curent donor siunul acceptor, separati deo membrana subtire.TIPURI:

1. MSD TIP PLANSAINTINSA –pe fetele planseiintinse sunt taiate canalepentru curentii donor siacceptor, iar membranaeste introdusa intrecanalele plansei.

DISPOZITIVE DE PREPARAREADISPOZITIVE DE PREPARAREAMEMBRANELOR (MSD)MEMBRANELOR (MSD)

2. MSD TIP TUB IN2. MSD TIP TUB INCOAJACOAJA – membranadin fibre, cu o “coaja”concentrica in jurulei. Curentul receptoreste pompat prinscobitura de fibre, iarcurentul donor princoaja.

DISPOZITIVE DE IMBOGATIRE ADISPOZITIVE DE IMBOGATIRE AMEMBRANELORMEMBRANELOR

ImbogatireaImbogatirea sisi analizeleanalizele presupunpresupun 22 etapeetape::

1.1. COLECTARECOLECTARE –– valva estemutata in pozitia care directioneazacurentul purtator prin deschidereaby-pass; in aceasta faza, purtatoruleste stationar in tubul MSD si iipermite analitului sa se acumuleze sisa se concentreze in purtator. DupaDupatrecereatrecerea unuiunui timptimp adecvatadecvat pentrupentruimbogatireaimbogatirea suficientasuficienta aa purtatoruluipurtatoruluicucu analitanalit,, valvavalva esteeste schimbataschimbata pentrupentruceacea dede--aa douadoua etapaetapa..

2.2. REVARSAREREVARSARE –– purtatorulpurtatorulcurgecurge prinprin MSD,MSD, revarsandurevarsandu--seseinin zonazona probeiprobei dindin avalaval,, pentrupentruaa aveaavea locloc reactiilereactiile chimicechimice sisi aafifi detectatadetectata..

DISPOZITIVE DE IMBOGATIRE ADISPOZITIVE DE IMBOGATIRE AMEMBRANELORMEMBRANELOR

MiniMini--coloanacoloana esteeste instalatainstalatadede--aa lungullungul orificiilororificiilor opuseopuseuneiunei valve devalve de injectieinjectie cu 6cu 6orificiiorificii. Se. Se pozitioneazapozitioneazavalvavalva,, curentulcurentul cucu probaprobacurgecurge prinprin coloanacoloana panapana lalairosireirosire,, iariar analitulanalitul esteesteantrenatantrenat pepe coloanacoloana.. ValvaValvaesteeste schimbataschimbata sisi eluentuleluentulcurgecurge prinprin coloanacoloana,,antrenandantrenand analitulanalitul cece curgecurgeinin avalaval undeunde fuzioneazafuzioneaza cucuunun curentcurent dede reactivreactiv pentrupentru aaaveaavea locloc reactiilereactiile chimicechimice sisidetectiadetectia..

CHIMISMUL FIACHIMISMUL FIA--FIA CU UN SINGUR CURENTFIA CU UN SINGUR CURENT--

UnUn curentcurent continandcontinandreactivulreactivul esteeste pompatpompatprinprin sistemsistem. Un. Un volumvolum dedeprobaproba esteeste injectatinjectat inincurentcurent sisi dispersiadispersiadeterminadetermina amestecareaamestecareareactivuluireactivului cucu probaproba,,conducandconducand lala reactiireactiiintreintre analitanalit sisi reactivreactiv inintimptimp cece probaproba trecetrece prinprinreactorreactor sisi apoiapoi prinprindetector.detector.

FIA CU DOI CURENTIFIA CU DOI CURENTI

Proba este injectata inprimul curent, continandreactivul R1. Analitulreactioneaza cu reactivulgenerand un intermediar.La amestecarea cucurentul in aval,intermediarul reactioneazacu reactivul R2, formandprodusul care estemasurat in detector.

EXEMPLU: determinareacianurii prin reactia Konig.

FIA CU TREI CURENTIFIA CU TREI CURENTI

Proba este injectata intr-un purtator ce continereactivul R1. Produsulacestei reactii seamesteca cu reactivul R2,in aval pentru a forma unal doilea intermediar.Acest intermediar seamesteca cu reactivul R3in aval formandu-seprodusul final, ce estemasurat de detector.

EXEMPLU: determinareaurmelor de amoniac.

COMPARATIECOMPARATIE 1. FIA1. FIA folosestefoloseste oo valvavalva dedeinjectieinjectie,, pepe candcand SIASIA folosestefolosesteunauna dede selectieselectie..

2. FIA face2. FIA face uzuz de ode o pompapompaperistalticaperistaltica, in, in timptimp cece la SIAla SIAaceastaaceasta esteeste inlocuitainlocuita dede unaunapentrupentru irigatiiirigatii sisi oo serpentinaserpentina dedesustineresustinere..

3. La FIA, o3. La FIA, o prizapriza dede probaprobanedispersatanedispersata esteeste introdusaintrodusaintrintr--unun curentcurent purtatorpurtator, in, in timptimpcece la SIAla SIA dispersiadispersia incepeincepe sasaaibaaiba loc inloc in timpultimpul aspirariiaspirariiprobeiprobei inin serpentinaserpentina dedesustineresustinere. In. In acestacest cazcaz,,schimbareaschimbarea fluxuluifluxului ininmomentulmomentul trimiteriitrimiterii probeiprobei sprespredetectordetector joacajoaca unun rolrol importantimportantinin amestecareaamestecarea probeiprobei cucupurtatorulpurtatorul..

DISPERSIA IN FIA SI SIADISPERSIA IN FIA SI SIA DiagramaDiagrama descriedescrie cece sese

petrecepetrece inin momentulmomentul injectariiinjectariiprobeiprobei (1)(1) intrintr--unun procesproces FIAFIAsisi inin timpultimpul inversariiinversarii fluxuluifluxuluiintrintr--unun procesproces SIA,SIA, precumprecum sisilala catevacateva secundesecunde dupadupa cecepurtatorulpurtatorul aa inceputinceput sasa mistemisteprobaproba sprespre detector (2).detector (2).

AcestAcest fenomenfenomen poatepoate face caface caunun picpic in SIAin SIA sasa aratearate putinputindiferitdiferit dede unulunul din FIA.din FIA.

DacaDaca intreintre probaproba sisi reactivreactiv aaavutavut loc oloc o amestecareamestecare bunabuna,,cuantificareacuantificarea vava aveaavea locloccorespunzatorcorespunzator. In plus,. In plus,inversareainversarea fluxuluifluxului contribuiecontribuiesemnificativsemnificativ lala amestecareaamestecareazonelorzonelor dede interesinteres..

AVANTAJELE SIAAVANTAJELE SIA CantitateaCantitatea dede reactivreactiv folositfolosit esteeste redusaredusa drastic.drastic. VarietateaVarietatea dede debitedebite esteeste simplasimpla sisi robustarobusta,, incluzandincluzand oo

pompapompa, o, o valvavalva dede selectieselectie sisi un detectorun detector conectatconectat printrprintr--un tub.un tub. AceastaAceasta configuratieconfiguratie poatepoate fifi folositafolosita prinprinschimbareaschimbarea programuluiprogramului dede debitaredebitare la ola o multitudinemultitudine dedereactiireactii chimicechimice maimai degrabadegraba decatdecat prinprin schimbareaschimbareainstalatiilorinstalatiilor dede apaapa, a, a tevilortevilor; de; de aceeaaceea,, mentinereamentinereaanalizoruluianalizorului esteeste simplificatasimplificata..

ValvaValva dede selectieselectie inlocuiesteinlocuieste valvavalva dede injectieinjectie sisi asiguraasiguraselectiaselectia diferitilordiferitilor curenticurenti dede probaproba sisi calibranticalibranti,, acestacestlucrulucru facandfacand posibilaposibila folosireafolosirea unorunor metodemetode automatizateautomatizatedede calibrarecalibrare..

ComponenteleComponentele utilizateutilizate in SIA sein SIA se preteazapreteaza lala operatiioperatii dedelaboratorlaborator, camp de, camp de lucrulucru sisi proceseprocese dede fabricarefabricare..

ECHIPAMENT PENTRU SIAECHIPAMENT PENTRU SIA COMPONENTECOMPONENTE:: 1.1. POMPA – Tipuri: a) pompe de

irigatie; Cerinte: precizie, reproductibilitate,

bi-directionale, capabile sa masoarevolume mici de proba;

• b) pompe peristaltice.

2. VALVA DE SELECTIE2. VALVA DE SELECTIE –– tip multitip multi--pozitionalepozitionale..

3. REACTORUL SI BOBINA DE3. REACTORUL SI BOBINA DESUSTINERE;SUSTINERE;

4. DETECTORUL4. DETECTORUL –– trebuietrebuie sasa fiefiedotatdotat cu ocu o celulacelula de debit (flux).de debit (flux).

5. SOFTWARE5. SOFTWARE -- punctulpunctul cheiecheie esteesteprogramulprogramul dede reglarereglare aa debitelordebitelor..

TIPURI DE DETECTORI SI TEHNICI SIATIPURI DE DETECTORI SI TEHNICI SIA

DETECTORIDETECTORI:: FOTOMETRICI UV, VIZ, IRFOTOMETRICI UV, VIZ, IR FLUORESCENTAFLUORESCENTA CHEMILUMINESCENTACHEMILUMINESCENTA pHpH ELECTROZI ION SELECTIVIELECTROZI ION SELECTIVI CONDUCTIVITATECONDUCTIVITATE AMPEROMETRIEAMPEROMETRIE ANALIZE DE STRIPINGANALIZE DE STRIPING

POTENTIONOMETRICPOTENTIONOMETRIC ALTE TEHNICIALTE TEHNICI

ELECTROCHIMICEELECTROCHIMICE

TEHNICI:TEHNICI: DILUTIADILUTIA IMBOGATIREA URMELORIMBOGATIREA URMELOR MASCAREA CHIMICAMASCAREA CHIMICA AJUSTAREA pHAJUSTAREA pH--ULUI;ULUI; COLOANE IN MINIATURACOLOANE IN MINIATURA

PENTRU SCHIMBAREAPENTRU SCHIMBAREAMEDIULUIMEDIULUI

SCHIMBAREA DE FAZESCHIMBAREA DE FAZEFOLOSIND MSDFOLOSIND MSD

FOLOSIREA DE REACTIVIFOLOSIREA DE REACTIVISOLIZISOLIZI

TITRAREATITRAREA

VALIDAREA METODELOR ANALITICEVALIDAREA METODELOR ANALITICE

ValidareaValidarea MetodeiMetodei AnaliticeAnalitice CeCe reglementarireglementari,, ghidurighiduri proceduriproceduri seseaplicaaplica?? CeCe anumeanume sese valideazavalideaza?? CeCe implicaimplica validareavalidarea metodeimetodei?? CeCe impactimpact vava aveaavea validareavalidarea ((sausau lipsalipsaeiei)?)? CandCand esteeste obligatorieobligatorie validareavalidarea??

ConcepteConcepte** ValidareaValidarea esteeste unun procesproces dede determinaredeterminare aapotriviriipotrivirii (suitability)(suitability) uneiunei proceduriproceduri datedate pentrupentrufurnizareafurnizarea dede rezultaterezultate analiticeanalitice utile.utile.** ValidareaValidarea uneiunei metodemetode analiticeanalitice esteeste ininprincipalprincipal legatalegata de:de: identificareaidentificarea surselorsurselor dede erorierori potentialepotentiale cuantificareacuantificarea erorilorerorilor potentialepotentiale aleale metodeimetodei* O* O validarevalidare descriedescrie inin termenitermeni matematicimatematici sisicuantificabilicuantificabili performanteleperformantele caracteristicecaracteristice alealeuneiunei masurarimasurari..* O* O metodametoda carecare esteeste validavalida intrintr--oo situatiesituatie poatepoatefifi invalidatainvalidata inin altaalta situatiesituatie

DefiniţiiValidarea(a) Confirmare prin furnizare de dovezi obiective că aufost îndeplinite cerinţele pentru o anumită utilizare sau oaplicaţie intenţionată.Note: 1. Termenul „validat” este utilizat pentru adesemna această stare.

2. Cerinţele de utilizare pentru validare pot fi realesau simulate.

Standardul SR EN ISO 9000:2001, ASRO, Bucureşti, 2001

(b) Este o evaluare sistematică a unei proceduri analiticeîn scopul determinării faptului că are suport/bazaştiinţific/a în condiţiile în care va fi aplicată.

Ghidul Eurachem/WELAC „Acreditarea pentru laboratoarele chimice”, 1993

NeintelegeriNeintelegeri CurenteCurente

ValidareaValidarea masurariimasurarii OptimizareaOptimizareamasurariimasurarii CuantificareaCuantificarea masurariimasurarii

OO metodametoda validatavalidata NUNU esteeste in modin mod necesarnecesaroo metodametoda performantaperformanta

RepetareaRepetarea uneiunei masurarimasurari de unde un numarnumar dedeoriori nunu constituieconstituie validareavalidarea eiei

CumCum evolueazaevolueaza oo metodametoda analiticaanalitica

Optimization

Validare

Implementare

Elaborare

Revalidare

Pre-Validare

Frecvent, dezvoltarea metodei poate implica activitatea pe un numărmare de idei diferite, simultan şi, în final, se alege ce mai bună.

Studiul de literaturăStudiul compuşilor, caracteristici,

reactivi etc.

Primirea cerinţelorclientului

Dezvoltarea metodei

Pregătirea schiţei metodeiPregătirea protocolului de

validare

Validarea metodei urmândprotocolul

Revizuirea datelor devalidare

Întocmirea raportului de validare ametodei

Trimiterea raportuluide validare şi adatelor la client

Etapele procesului de validare a unei metode analiticeelaborate la solicitarea unui client

În afara acestor etape principale mai pot exista două etapesecundare: modificarea şi testarea. Toate aceste etape au la bazăînregistrări care le permit trecerea de la o etapă la alta.

Plan de re(validare)

Metodadezvoltată

/extinsă

Decide potrivireapentru scop

Implementarea/Verificareaperformanţelor locale (EQ)

Verificarea continuă aperformanţei (QC/QA)

Modificareautilizării

Metoda nouă

OO altă formulare a ciclului de altă formulare a ciclului de vviaiaţţăă al unei metode analitice validateal unei metode analitice validate

Organismelor de reglementare europene şi internaţionale şi ghidurile şistandarde lor pe diferite aspecte ale AQA.

TestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAcreditareaAcreditarea

International Laboratory Accreditation CooperationInternational Laboratory Accreditation CooperationILACILAC

Organization Codex Committee on Method of AnalysisOrganization Codex Committee on Method of Analysisand Samplingand Sampling

CODEX/ CCMASCODEX/ CCMASValidarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeInternational Conference on HarmonizationInternational Conference on HarmonizationICHICH

Japanese PharmacopoeiaJapanese PharmacopoeiaJPJPUnited States PharmacopoeiaUnited States PharmacopoeiaUSPUSP

Validarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeFood and Agricultural Organization/ World HealthFood and Agricultural Organization/ World HealthFAO/WHOFAO/WHOValidarea metodeiValidarea metodeiUnited States Foods and Drug AdministrationUnited States Foods and Drug AdministrationFDAFDA

Controlul intern al calităControlul intern al calităţţiiiiTestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAcreditareAcreditare

Association of Official Analytical ChemistsAssociation of Official Analytical ChemistsAOACAOACInternationalInternational

StandardizareStandardizareInternational Standardization OrganizationInternational Standardization OrganizationISOISOValidarea metodei analiticeValidarea metodei analiticeInternational Union of Pure and Applied ChemistryInternational Union of Pure and Applied ChemistryIUPACIUPACStandardizareStandardizareEuropean Committee for NormalizationEuropean Committee for NormalizationCENCENAcreditareAcreditareEuropean Cooperation for AccreditationEuropean Cooperation for AccreditationEAEA

TestareaTestarea capabilităcapabilităţţiiiiAsigurarea calităAsigurarea calităţţiiii

Cooperation of International Traceability in AnalyticalCooperation of International Traceability in AnalyticalChemistryChemistry

CITACCITACValidarea metodeiValidarea metodeiAsociationAsociation ofof European AnalyticalEuropean Analytical ChemistsChemistsEurachemEurachem

DomeniulDomeniulDenumirea completă a organismuluiDenumirea completă a organismuluiOrganismulOrganismul(abreviat)(abreviat)

ParametriiParametrii esentialiesentiali aiai validariivalidarii

ValidareaValidareaMetodeiMetodei

BioanaliticeBioanalitice

Exactitatea

Precizia

Liniaritatea

Efectul de matrice

Integritatea

Specificitatea

Robustetea

Reproductibilitatea

CriteriileCriteriile dede AcceptareAcceptare

TrebuieTrebuie stabilitestabilite criteriilecriteriile specificespecifice dedeacceptareacceptare pentrupentru fiecarefiecare parametruparametru

CriteriulCriteriul dede acceptareacceptare vava fifi diferitdiferit pentrupentruprobeprobe diferitediferite

CriteriileCriteriile dede acceptareacceptare trebuietrebuie sasa fiefiestabilitestabilite inin pespectivapespectiva utilizariiutilizariirezultatelorrezultatelor

CandCand esteeste necesaranecesara validareavalidareacompletcompletăă, par, parţţialialăă,, îîncrucincrucişşatatăă

efecteleefectelecong./cong./decongelariidecongelarii duratadurata dede incubareincubare temperaturatemperatura dedeincubareincubare vechimeavechimea reactivilorreactivilor preparareaprepararea probeiprobei stocareastocarea probeiprobei

numarulnumarul dede pasajepasajecelularecelulare

loturileloturile dedemedicamentemedicamenteadministrateadministrate

variabilitateavariabilitateaserumuluiserumului provenindprovenindde lade la diferitediferite animaleanimale

variabilitateavariabilitatea dintredintrepacientipacienti

Reproductibilitatea: modificari nedoriteStabilitatea: modificari deliberate

CCaandnd esteeste necesaranecesara validareavalidareacompletcompletăă, par, parţţialialăă,, îîncrucincrucişşatatăă

CandCand sese dezvoltadezvolta oo metodametodapentrupentru primaprima oaraoara

PentruPentru unun nounou medicamentmedicament DacaDaca unun metobolitmetobolit sese

adaugaadauga la ola o metodametodaexistentaexistenta

TransferulTransferul intreintre laboratoarelaboratoare TransferulTransferul intreintre analistianalisti MatriciMatrici rarerare SchimbariSchimbari lala nivelulnivelul matriciimatricii ((urinaurina--plasma; plasmaplasma; plasma

umanaumana--plasmaplasma animalaanimala))

SchimbareaSchimbarea procesuluiprocesului dedesamplingsampling

SchimbareaSchimbarea inin volumulvolumul probeiprobei SchimbariSchimbari inin domeniuldomeniul de conc.de conc. SchimbareaSchimbarea instrumentuluiinstrumentului

analiticanalitic (GC/MS(GC/MS--LC/MS)LC/MS)

SchimbareaSchimbarea sistemuluisistemului dededetectiedetectie (UV(UV--MS)MS)

AdministrareaAdministrarea concomitentaconcomitenta dedemedicamentemedicamente

DiferiteDiferite metodemetode analiticanalitic utilizateutilizateprentruprentru acelasiacelasi componentcomponent intrintr--unun singursingur studiustudiu sausau inin diferitediferitestudiistudii

(Bio)(Bio) StandardeStandarde CareCare vava fifi standardulstandardul dede lucrulucru ?? AcestAcest standardstandard vava fifi suficientsuficient pentrupentru aa fifi facutefacute toatetoate

activitatileactivitatile de prede pre--validation,validation, protocolulprotocolul dede validarevalidare sisitoatetoate analizeleanalizele probelorprobelor pentrupentru prepre--clinicclinic sisi clinic ?clinic ?

CareCare esteeste stabilitateastabilitatea standarduluistandardului ?? CandCand trebuitrebui preparatpreparat standardulstandardul ? de? de fiecarefiecare datadata candcand sese

faceface analizaanaliza sausau poatepoate fifi utilizatutilizat dupadupa stocarestocare ((prinprininghetareinghetare) ?) ?

SeSe poatepoate masuramasura standardulstandardul pentrupentru fiecarefiecare tip detip de probaproba ininmatriceamatricea respectivarespectiva ??

Cum seCum se coreleazacoreleaza concentratiaconcentratia standarduluistandardului ? Cum se? Cum sepoatepoate determinadetermina lala inceputinceput, la, la mijlocmijloc sisi lala sfarsitulsfarsitultrasarariitrasararii curbeicurbei standard ?standard ?

AdaugareaAdaugarea standarduluistandardului inin probaproba farafara diluarediluare poatepoate fififacutafacuta directadirecta ??

PreciziaPrecizia StandardelorStandardelor IndustrialeIndustriale((EuropeneEuropene))

Enzyme based assayEnzyme based assay <10%<10% ELISAELISA 1010--20%20% Cell based assayCell based assay aproxaprox. 25%. 25% Animal assayAnimal assay 2020--50%50% Virus plaque assayVirus plaque assay 330% (0.5 log)330% (0.5 log) Target for cell basedTarget for cell based <50%<50%

TestulTestul pentrupentru PParalelismaralelism

Cand se traseazagraficul logaritmic alraspunsului analitic alunei serii de dilutii alesubstantei de referinta(standardului) si a uneiserii de dilutii aleprobei trebuie saobtinem curbe paralele

ParametriParametri SSpecificipecifici lala AnalizaAnaliza CCelulelorelulelor

-- sursasursa dede celulecelule((inceputulinceputul,, mijloculmijlocul sausau sfarsitulsfarsitul inghetariiinghetarii))

-- nivelulnivelul pasajuluipasajului utilizatutilizat-- densitateadensitatea celulelorcelulelor stocstoc

(cat(cat timptimp pentrupentru sedimentaresedimentare))-- varstavarsta celulelorcelulelor (de(de catecate zilezile suntsunt inin culturacultura))-- timpultimpul dede incubareincubare-- recipientulrecipientul-- lotullotul dede mediumediu dede culturacultura folositfolosit-- sursasursa dede reactivireactivi

Rolul validării în asigurarea calităţii în laboratoareleanalitice de măsurare şi încercare

Validarea unei metode analitice este o investigaţie în ceea ce priveştefaptul că scopul analitic al unei metode este atins, obţinându-serezultate analitice cu un nivel de incertitudine acceptabil.

Validarea analitică (validarea metodei, validarea instrumentaţiei,validarea soft-urilor, validarea personalului) reprezintă primul nivel alasigurării calităţii (QA) în laborator.

Validarea este necesară pentru orice metodă nouă; pentru un anumit tipde material şi un anumit domeniu de concentraţii de operare, metodatrebuie să fie capabilă să rezolve o problemă analitică etc.

Revalidarea este necesară ori de câte ori un component al sistemuluianalitic este modificat sau dacă există indicaţii că metoda stabilită nufuncţionează corect.

a. Laboratorul utilizează o metodă validată complet.Metoda a fost studiată într-un studiu colaborativ şi, din acest motiv,laboratorul trebuie să verifice dacă este capabil să asigurecaracteristicile de performanţă ale metodei publicate (sau altfel spus,dacă este capabil să îndeplinească cerinţele sarcinii analitice). Înacest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie, studiide adecvare (incluzând studii de variaţie ale matricei) şi posibil studiide liniaritate, iar anumite teste, cum ar fi cel de robusteţe, ar putea fiomise.

b. Laboratorul utilizează o metodă o metodă validatăcomplet, dar apare o nouă matriceMetoda a fost studiată într-un studiu colaborativ şi din acest motiv,laboratorul trebuie să verifice dacă nu cumva noua matrice nuintroduce noi surse de erori în sistem. În acest caz, laboratorul artrebui să efectueze studii de adecvare (incluzând studii de variaţii alematricei) şi posibil studii de liniaritate.

c. Laboratorul utilizează o metodă bine stabilită, darnestudiată colaborativÎn acest caz laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare şi posibil, studii de liniaritate.

d. Metoda a fost publicată în literatura de specialitateîmpreună cu câteva caracteristici analiticeÎn acest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare (incluzând studii de variaţii ale matricei), studii deliniaritate şi robusteţe.

e. Metoda a fost publicată în literatura de specialitate fărăcaracteristici analitice sau a fost dezvoltată „in house”.În acest caz, laboratorul ar trebui să efectueze studii de precizie,studii de adecvare (incluzând studii de variaţii ale matricei), studii deliniaritate şi robusteţe.

f. Metoda este empiricăO metodă empirică este aceea în care cantitatea estimată esterezultatul găsit prin aplicarea procedurii stabilite ca atare. Aceasta sedeosebeşte de metodele în care măsurările care au drept scop de aevalua cantităţi independente, cum ar fi concentraţia unui anumitanalit într-o probă, la care potrivirea (adecvarea) metodei esteconvenţional zero şi variaţia matricei este irelevantă (aceea este înclasa definită).

g. Analiza ad-hocAnaliza ad-hoc este necesară ocazional pentru a stabili, în general,domeniul unei valori fără prea mari cheltuieli şi cu exigenţă scăzută.Efortul care trebuie făcut pentru validare este în consecinţă strictlimitat. În acest caz, adecvarea trebuie studiată prin metode cum ar fiestimarea recuperării sau adiţiilor multiple de analit, iar precizia dinmăsurări repetate.

h. Modificări ale analitului sau echipamentului

Având în vedere activitatea complexă dintr-un laborator, pot existaurmătoarele situaţii care să impună efectuarea de studii de validare:-modificări majore pe care le suferă instrumentele;-loturi noi sau foarte variabile de reactivi;-schimbări efectuate în încăperile laboratorului;-metode utilizate pentru prima dată de către analişti noi;-metodă validată folosită după o perioadă de întrerupere.

În acest caz acţiunea esenţială este să se demonstreze că nici oînrăutăţire nu s-a produs. Verificarea minimă constă într-un test depotrivire singular ce presupune un experiment de verificare înainteşi după modificarea survenită pe un material de control sau detestare.

Selectivitatea = abilitatea metodei analitice sau bioanalitice de adiferenţia şi măsura analiţii în prezenţa componenţilor care suntaşteptaţi a fi prezenţi.Specificitatea = abilitatea de a evalua, fără echivoc, analitul înprezenţa componenţilor care sunt aşteptaţi a fi prezenţi.

Un alt termen înrudit este confirmarea identităţii = dovada căsemnalul măsurat, care a fost atribuit, se datorează numai analitului şinu prezenţei a ceva chimic sau fizic similar sau nu apare ca ocoincidenţă.Precizia unei metode analitice exprimă apropierea de, potrivireasau gradul de concordanţă între o serie de măsurări obţinute de lamai multe probe provenite de la aceeaşi probă omogenă subcondiţii de specificitate. Aceasta se exprimă ca abatere standardsau ca abatere standard relativă procentuală, RSD%.Precizia poate fi de trei feluri:

repetabilitaterepetabilitate intermediarăreproductibilitate

Exactitatea = apropierea între valoarea acceptată ca o valoare dereferinţă şi valoarea găsită.Exactitatea exprimă “apropierea rezultatelor măsurărilor de o valoareadevărată” sau „exactitatea reprezintă gradul de concordanţă întrerezultatul unei încercări şi valoarea de referinţă acceptată (adevărată) amăsurandului/analitului”.

Domeniul de lucru = intervalul dintre concentraţia (cantitatea)superioară şi inferioară a analitului din probă (incluzând acesteconcentraţii) pentru care s-a demonstrat că procedura are un nivelpotrivit de precizie, exactitate şi liniaritate.

Limita de cuantificare (LC)Limita de cuantificare (LC) - cea mai joasă concentraţie saucantitate de analit care poate fi determinată cantitativ cu un nivelacceptabil de fidelitate a repetabilităţii şi exactităţii.

Limita de detecLimita de detecţţie (LD)ie (LD) -concentraţie netă minim detectabilă (ISO)-valoare minim detectabilă (IUPAC).

LD = cea mai mică concentraţie de analit dintr-o probă care poate fidetectată cu o certitudine statistică rezonabilă, dar nu neapăratcuantificată ca o valoare exactă în condiţiile stabilite ale încercării.

Pentru determinarea practică a celui mai mic semnal detectabilpot fi aplicate două metode:

a. 10 probe oarbe independente măsurate o singură datăfiecare:

xLD = xm(blanc) + 3blanc,unde blanc este abaterea standard a blancului;

b. 10 probe oarbe independente fortificate la cea mai scăzutăconcentraţie acceptată, măsurate o singură dată fiecare:

xLD = 0 + 3probă.

Media şi abaterea standard a probelor oarbe este posibil să depindăde matricea probelor oarbe, LD va fi astfel dependentă de matrice. Înacest caz se va aplica la determinare prima variantă (a).

Limita de detecLimita de detecţţie nu trebuie confundatăie nu trebuie confundatăcu sensibilitatea metodei.cu sensibilitatea metodei.

Pentru determinarea practică a celui mai mic semnalcuantificabil pot fi aplicate, de asemenea, două metode:

a. 10 probe oarbe independente măsurate o singurădată fiecare:

xLQ = xm(blanc) + 10blanc,unde blanc este abaterea standard;

b. 10 probe oarbe independente fortificate la cea maiscăzută concentraţie acceptată, măsurate o singură datăfiecare:

xLQ = 0 + 10probă.

Robusteţea = o măsură a capacităţii metodei analitice dea rămâne neafectată de variaţii mici, dar deliberate aleparametrilor metodei şi oferă o indicaţie privind siguranţametodei pe parcursul unei utilizări în condiţii normale.

Trebuie luati în considerare 3 tipuri diferite de parametripentru evaluarea robusteţii şi rezistenţei:- parametri interni (temperatură, pH etc., în cazul HPLC);- parametri externi (analişti, echipamente, laboratoarediferite etc.)- parametri fundamentali (stabilitatea soluţiilor de testareetc.)

Merged Document 2

Documents

Transcript of Merged Document 2