Analiza K-RAS si mutatiile P53 in probele de sputa

Tehnici speciale utilizate n biologia molecularStudiul ADN-ului Electroforeza n gel de agarozELECTROFOREZA ADN

Asist.univ.dr.Covaci AureliaLab 22LABORATORUL DE GENETIC DIN CADRUL ISV

STRUCTURA CHIMIC A ACIZILOR NUCLEICIAcizii nucleici (ADN i ARN) sunt molecule informaionale care permit stocarea, transmiterea i exprimarea mesajului genetic Acizii nucleici sunt formai din catene polinucleotidice realizate prin stabilirea de legturi covalente ntre nucleotide. Prin hidroliza acizilor nucleici n mediu acid se formeaz baze azotate, pentoze i acid fosforic.

Structura nucleotidelor 3Bazele azotate care intr n compoziia acizilor nucleici pot fi baze purinice (adenina, guanina) sau baze pirimidinice (uracil, timin, citozin). ADN conine timin, iar ARN conine uracil.Pentozele se gsesc sub form ciclic, -furanozic. ADN conine D2-deoxiriboz, iar ARN conine D2-riboz.

Toate legturile internucleotidice au aceeai orientare de-a lungul unui lan polinucleotidic, astfel c fiecare caten are o anumit polaritate. In ADN cele dou lanuri polinucleotidice sunt antiparalele, adic unul evolueaz n direcia 5'3', iar cellalt evolueaz n direcia 3'5'.

5

- n mod convenional, monomerii din secvena ADN sau ARN sunt reprezentai prin literele A, T, G, C, U- structura unei catene este scris ntotdeauna n direcia 5' 3' (captul 5' la care gruparea OH de la C5' este liber i captul 3' la care gruparea OH de la C3' nu este angajat ntr-o legtur internucleotidicELECTROFOREZA ADNMoleculele de ADN la pH fiziologic sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat Aceste molecule de ADN bicatenar vor migra ctre polul pozitiv la aplicarea unui cmp electric Densitatea de sarcin este uniform de-a lungul secvenei astfel c n cazul fragmentelor liniare migrarea va fi invers proporional cu mrimea acestor fragmente7Fragmentele de ADN de dimensiuni mici (mai mici de 500 de nucleotide) pot fi separate prin electroforez n gel de poliacrilamid. Fragmentele de ADN mai mari se pot separa prin electroforez n gel de agaroz, evidenierea fcndu-se cu ajutorul bromurii de etidiuBromura de etidiu are proprietatea de a se insera ntre bazele azotate i de a forma complexe necovalente de ADNBromura de etidiu poate fi vizualizat cu o lamp UVLimita de detecie a ADN este de 0,1 0,5 ng

Solubilitatea ADN-ului n ap Inelele glucidice, legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublului helix, n timp ce bazele azotate hidrofobe, sunt orientate spre interior i perpendicular pe axa helixuluiSolubilitatea ADN-ului n ap se datoreaz tocmai orientrii gruprilor fosfat spre exteriorul duplexuluiToate gruprile fosfat la pH = 7 sunt ionizate i ncrcate negativ

9AND ELECTROFOREZA N GEL DE AGAROZ Electroforeza este o metod simpl i eficient pentru separarea, identificarea i purificarea fragmentelor de ADN de 0,5-25 Kb. La aplicarea unui cmp electric moleculele de ADN vor migra ctre anod (polul ncrcat pozitiv) datorit sarcinii negative a gruprilor fosfat. 10MaterialeTampon pentru electroforez Soluie de bromur de etidiumAgaroz Loading bufferMarker de mas

11

Tampon pentru electroforezTAE sau TBE

TAE - Tris/Acetat/EDTA TBE - Tris/Borat/EDTA

14Bromura de etidiu agent mutagen i cancerigen (se insereaz ntre bazele azotate din structura ADN-ului) sarcina global a moleculei este pozitivse adaug n gel pn la o coloraie slab roz15Agaroza polimer linear compus din reziduuri alternative de D i L-galactoz reunite prin legturi (1-3) i (1-4) glicozidice

16Loading buffer-ul conine sucroz si glicerol care vor creste greutatea probei cu ADN si o vor mentine in gel albastru de brom fenol la adaugarea soluiei care conine ADN se coloreaz n albastru datorit schimbrii de pH permite vizualizarea frontului de migrare n gel17Protocolul de lucruProtocolul de lucru cuprinde patru etape:

1.Prepararea gelului 2. Incrcarea probelor de ADN n godeuri 3.Migrarea gelului la un anumit voltaj i o anumit perioad de timp 4.Vizualizarea ADN-ului18 Prepararea gelului se prepar volumul necesar de tampon pentru electroforez TAE 1x(dintr-o soluie stoc TAE 50x ) se cntrete cantitatea necesar de agaroz gel de concentraie 2% se dizolv agaroza n tamponul de electroforez pn la fierbere se toarn gelul n cuva de migrare i se ndeprteaz eventualele bule de aer, nainte de ntrirea gelului19ncrcarea probelor de ADN n godeuri- submers

20Migrarea gelului 80 V90 min21 Vizualizarea ADN-ului Colorarea gelului Expunere direct la UV a gelului, n care a fost ncorporat bromura de etidium22TRANSILUMINATOR UV

Vizualizarea probelor Nr. Crt.RecipientOperaiavolum/timpObs.1.Aparatul de electroforezn lumin alb (de ziu sau bec incandescent/cu fluorescen)-- linia frontului2. Transluminator n lumin UV-- benzi fluorescente roz

24Migrarea probelor Nr. Crt.RecipientOperaiavolum/timpObs.1.Aparatul de electroforez 80 V60 min. Se are grij ca probele s fie la polul negativ [-]

25FACTORI CARE INFLUENEAZ MIGRAREA ADN N GELUL DE AGAROZMrimea fragmentelor de ADN - fragmentele de ADN linear migreaz n gelul de agaroz cu o mobilitate care este invers proporional cu masa molecularConcentraia gelului de agaroz gelurile mai concentrate sunt folosite pentru migrarea fragmentelor de ADN mai mici Tamponul TAE este cel mai folosit

26Bromura de etidiu molecul ncrcat pozitiv, se intercaleaz ntre bazele azotate din AND modificnd mobilitatea acestuia, prin scderea sarcinii negative a ADN-uluiVoltajul odat cu creterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra proporional mai rapid dect cele mai mici.Rezoluia cea mai bun la migrarea fragmentelor mai mari de 2 kb se obine prin mentinerea unui voltaj de max. 5 V/ cm (valoarea n cm se refer la distana dintre electroziPrepararea gelului de agaroz 2% Nr. Crt.RecipientOperaiavolum/timpObs.1.ErlenmeyerAgaroz 1 g-2. ErlenmeyerTAE 1x50 mL-3.Erlenmeyernclzire pe flacr-Fr fierbere pn la dizolvarea complet a agarozei4.ErlenmeyerBromura de etidiu4 LAdugare la ni28Turnarea gelului n camera de migrare Nr. Crt.RecipientOperaiavolum/timpObs.Cuva de migrareSe fixeaz suportul pentru gel n cuv n poziia nchis200 L-Cuva de migrareSe fixeaz pieptenele-Cu grij, frformare de spumCuva de migrareSe toarn gelului n cuva de migrare cu piepten03 min.-Cuva de migrareRcire la temperatura camerei600 LLa temperaturacamereiCuva de migrareSe ntoarce suportul pentru gel n poziia de lucru--Cuva de migrareSe scoate pieptenele--Cuva de migrareSe toarn tamponul n cuv pn la semnul Fill max.01 min.-29Pregtirea i aplicarea probelor Nr. Crt.RecipientOperaiavolum/timpObs.1.Microtuburi EpendorffSe aleg eprubete Ependorff de mrimea necesar i n numrul egal cu numrul de dini ai pieptenelui (numrul de godeuri formate)--2. Microtuburi EpendorffADN (genomic/frunz/marker de mas) 20 L-3.Microtuburi EpendorffLoading buffer5 L-4.Microtuburi EpendorffAplicare submers n godeuri a probelor 25 L-30gradul mare de rezoluie, specificitate i sensibilitaterapiditatea, conferit de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independenei totale a celor dou module (de migrare i colorare)gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minim a factorului uman la metodele manuale)Electroforeza n gel de agaroz prezint cteva avantaje, cele mai importante fiind:diversificarea parametrilor investigai (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale i patologice)aplicabilitatea n cazul mai multor lichide biologice (ser dar i urin, LCR i altele), precum i faptul c pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel nlaturat un neajuns important care fcea, de multe ori, impracticabil metoda pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR i din alte fluide hipoproteice

Separarea ADN-ului prin electroforez

Electroforeza n geluri de agaroz reprezint metoda standard de analiz a acizilor nucleici.Deplasarea moleculelor se face n prezena unui curent electric (acizii nucleici sunt ncrcai negativ datorit prezenei gruprilor fosfat imigreaz spre electrodul ncrcat pozitiv).Mobilitatea electroforetic este influenat de urmtorii factori: concentraiade agaroz, conformaia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrsucit), prezena compusului fluorescent n gel, tamponul utilizat, tipul de agaroz i voltajul aplicat.

Tehnica de separare a acizilor nucleici prinelectroforeza orizontal (de tip submarin)

tehnica se folosete pentru determinarea puritii ADN-ului sau ARN-ului,la verificarea existenei produilor rezultai n urma PCR-ului (reacie de polimerizare a nucleotidelor) sau la analiza fragmentelor rezultate dup clivarea enzimatic (cu ajutorul enzimelor de restricie) a ADN-uluifragmentele analizate pot avea mrimi ntre 1000 i 23000 pb (pb perechi de baze)unul dintre avantajele acestei tehnici este acela c ADN-ul nu este denaturat, pstrndu-i intact elementele structurale.pentru a evita fragmentarea ulterioar a ADN-ului

manipularea trebuie fcut n aa fel nct s se evite contaminarea cu amprente, picturi, saliv sau microorganisme din acest motiv se prefer utilizarea de materiale sterile (vrfuri etc.). Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza n geluri de agaroz sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM),TBE (Tris borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM).soluiile tampon pentru electroforez se pstreaz sub forma unor stocuriconcentrate (10X-50X) i pstrate la temperatura camereitamponul de ncrcare are n componen un colorant (albastru de bromfenol sau rou de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare i zaharoz (40%) sau glicerin(30%) pentru a asigura o vscozitate corespunztoare la aplicarea probei.

benzile sunt vizualizate cu compui fluoresceni (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere cu lumin UV sensibilitatea variaz ntre 100 pg i 1 ng/band datorit faptului c aceti colorani se intercaleaz ntre bazele ADNului dublu catenar, sensibilitatea deteciei depinde de lungimea lanului acizilor nucleici.