8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

1/10

IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE

EFECTE CITOPATICE

Direciile diagnosticului virusologic1. Izolare virala in:

Culturi de celule Ou de gaina embrionat Animal de laborator

2. Detectia directa a : Particulelor virale EM , IEM Antigene virale ELISA, IF Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:a. Ac virus- specifici tip IgM

b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgGAlegerea sistemului de izolare viralaAVANTAJE DEZAVANTAJE

Animalul de laborator Infectie naturala Cost crescut

Oul de gaina embrionat Cost scazut Susceptibilitate variabila

Culturi de celule Sensibilitate buna,

disponibilitate

Susceptibilitate variabila,

Infectie nenaturala

Definitie culturi celulare

Metodologia propagarii in vitro a unui fragment de tesut sau a unor celule dispersateobtinute din tesuturi cu ajutorul unor enzime proteolitice si introduse intr-un mediu

nutritiv capabil sa le asigure homeostazia si proliferarea.

CLASIFICAREA CULTURILOR CELULARE CULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a unor fragmente de organ in vederea

pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu cultiva

decat pe culturi de trahee

CULTURI DE CELULE DISPERSATE = provin din disocierea tesuturilor intr-osuspensie de celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare mecanica. Se clasifica

dupa timpul de supravietuire in vitro:

CULTURI PRIMARE

TULPINI CELULARE LINII CELULARECulturi primare

Direct din dispersia enzimatica a unui tesut proaspat recoltat

Formeaza monostrat

Celulele tind sa mentina caracteristicile organului din care deriva

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

2/10

Pot apare proprietati de suprafata noi (devin susceptibile pentru infectii virale noi) ex:

v. polio care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar creste si distrugeaceleasi

celule renale separate si aderente la sticla

Se mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)

Tulpinile celulare

Omogene, durata de viata 50-60 de pasaje

V. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini derivate din piele, intestin si amigdale

Cariotipul cromozomial este cel de origine diploid

Pot fi utilizate in producerea de vaccinuri virale si pentru diagnosticul virusologic

Liniile celulare

Populatii de celule derivate dintesut normal sau malign ce pot fi subcultivate un timp

nelimitat

Au caracter heteroploid (numar variabil de cromozomi)

Nu pot fi folosite in producerea de vaccinuri din cauza instabilitatii genomului.

Celule vii dispersate:-reflecta tesutul de provenienta TESUT EMBRIONAR

TESUT ADULT

TESUT TUMORAL

Mediu nutritiv:Sruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5)

NaH2PO4 6) D-glucoz;Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5) CaCl2;

6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz;

Substante nutritive:Aminoacizi eseniali:

1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6)L-izoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) L-treonin;12) L-triptofan; 13) L-valin.

SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit:factori de creterei factori de adeziune

Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4)

Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7)Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl: 0,01 g.

Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin // griseofulvinaSER DE VIEL 2-10%

pentru cultivarea celulelor renale de maimu si liniei celulare ICRM23 seadaug 2% ser de viel,

pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i unele linii celulare (BSC, Vero,FL etc.), se adaug 5% ser de viel,

pentru cultivarea celulelor embrionare de hamster, rinichi de hamster, alte linii

celulare (KB, HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser de viel.

De importan deosebit este calitatea serului de viel utilizat, care trebuie testat nprealabil.Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular:

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

3/10

pH adecvat

temperatur constant

atmosfer cu 10% CO2

condiii aseptice

Obtinerea unei culturi celulare-se prelev esutul surs n condiii aseptice

- se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin tamponat

- disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de tripsin 0,25%

-suspendarea celulelor n mediu nutritiv

-controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de tripan

- repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi celulare

-incubare n poziie culcat

- urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

Subcultivarea culturilor celulareDup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele deenergie, se acidific mediul.

Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate, subcultivate.

Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de tripsina siEDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i se resuspendeaz nmediu nutritiv.

Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la concentraiaoptim.

Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.

Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.

Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Culturi provenite din celule

- normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se multiplic pn acoperperetele flaconului, realizeaz o cultur monostrat

- tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile, cresc n maimulte straturi i n suspensie

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

4/10

CELULELE TRANSFORMATESunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana sau prin expunere ladiferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare care este mentinuta indefinit princultivare in vitro sau transplant in vivo.

Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat Inoculate la animale produc tumori Multiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera la substratul de izolare Cerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de ser fetal de vitel Prezinta antigene de suprafata diferite de celulele normale Prezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid

Inocularea virusurilor n culturile celulare Se arunca mediul nutritiv i se introduce suspensia viral. Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele receptive). Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz. n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura celular.

Izolare:urmrirea efectelor citopatice = ECP

EFECTE CITOPATICE SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS PICNOTIC LITIC: enterovirusuri INCLUZIONAR:

Intranuclear acidofil: papovavirusuri Intranuclear bazofil: adenovirusuri

Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccina Mixt: v herpetice, v rujeolos

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

5/10

ECP SINCITIAL

Binding

Fusion

Reverse transcription

Nuclearlocalization

Uncoating

Integration

Transcription

SplicingRNA

export

GenomicRNA

mRNA

Translation

ModificationBudding

Assembly

Maturation

Endocytosis

Lysosome

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

6/10

INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)Sus - neuron fara incluzii Negri

Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

7/10

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

8/10

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)

HSV corpii Cowdry tip A

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

9/10

Infectia CU adenovirusuri

se multiplica in nucleu unde proteinele capsidare, produse in exces, formeaza

incluziile intranucleare

Reovirus

8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

10/10

HPV

ECP picnotic litic