Download - Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

Transcript
  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    1/10

    IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE

    EFECTE CITOPATICE

    Direciile diagnosticului virusologic1. Izolare virala in:

    Culturi de celule Ou de gaina embrionat Animal de laborator

    2. Detectia directa a : Particulelor virale EM , IEM Antigene virale ELISA, IF Genom viral PCR; Rt-PCR

    3. Teste Serologice:a. Ac virus- specifici tip IgM

    b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgGAlegerea sistemului de izolare viralaAVANTAJE DEZAVANTAJE

    Animalul de laborator Infectie naturala Cost crescut

    Oul de gaina embrionat Cost scazut Susceptibilitate variabila

    Culturi de celule Sensibilitate buna,

    disponibilitate

    Susceptibilitate variabila,

    Infectie nenaturala

    Definitie culturi celulare

    Metodologia propagarii in vitro a unui fragment de tesut sau a unor celule dispersateobtinute din tesuturi cu ajutorul unor enzime proteolitice si introduse intr-un mediu

    nutritiv capabil sa le asigure homeostazia si proliferarea.

    CLASIFICAREA CULTURILOR CELULARE CULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a unor fragmente de organ in vederea

    pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu cultiva

    decat pe culturi de trahee

    CULTURI DE CELULE DISPERSATE = provin din disocierea tesuturilor intr-osuspensie de celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare mecanica. Se clasifica

    dupa timpul de supravietuire in vitro:

    CULTURI PRIMARE

    TULPINI CELULARE LINII CELULARECulturi primare

    Direct din dispersia enzimatica a unui tesut proaspat recoltat

    Formeaza monostrat

    Celulele tind sa mentina caracteristicile organului din care deriva

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    2/10

    Pot apare proprietati de suprafata noi (devin susceptibile pentru infectii virale noi) ex:

    v. polio care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar creste si distrugeaceleasi

    celule renale separate si aderente la sticla

    Se mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)

    Tulpinile celulare

    Omogene, durata de viata 50-60 de pasaje

    V. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini derivate din piele, intestin si amigdale

    Cariotipul cromozomial este cel de origine diploid

    Pot fi utilizate in producerea de vaccinuri virale si pentru diagnosticul virusologic

    Liniile celulare

    Populatii de celule derivate dintesut normal sau malign ce pot fi subcultivate un timp

    nelimitat

    Au caracter heteroploid (numar variabil de cromozomi)

    Nu pot fi folosite in producerea de vaccinuri din cauza instabilitatii genomului.

    Celule vii dispersate:-reflecta tesutul de provenienta TESUT EMBRIONAR

    TESUT ADULT

    TESUT TUMORAL

    Mediu nutritiv:Sruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5)

    NaH2PO4 6) D-glucoz;Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5) CaCl2;

    6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz;

    Substante nutritive:Aminoacizi eseniali:

    1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6)L-izoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) L-treonin;12) L-triptofan; 13) L-valin.

    SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit:factori de creterei factori de adeziune

    Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4)

    Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7)Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl: 0,01 g.

    Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin // griseofulvinaSER DE VIEL 2-10%

    pentru cultivarea celulelor renale de maimu si liniei celulare ICRM23 seadaug 2% ser de viel,

    pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i unele linii celulare (BSC, Vero,FL etc.), se adaug 5% ser de viel,

    pentru cultivarea celulelor embrionare de hamster, rinichi de hamster, alte linii

    celulare (KB, HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser de viel.

    De importan deosebit este calitatea serului de viel utilizat, care trebuie testat nprealabil.Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular:

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    3/10

    pH adecvat

    temperatur constant

    atmosfer cu 10% CO2

    condiii aseptice

    Obtinerea unei culturi celulare-se prelev esutul surs n condiii aseptice

    - se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin tamponat

    - disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de tripsin 0,25%

    -suspendarea celulelor n mediu nutritiv

    -controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de tripan

    - repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi celulare

    -incubare n poziie culcat

    - urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

    Subcultivarea culturilor celulareDup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele deenergie, se acidific mediul.

    Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate, subcultivate.

    Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de tripsina siEDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i se resuspendeaz nmediu nutritiv.

    Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la concentraiaoptim.

    Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.

    Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.

    Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

    Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

    Culturi provenite din celule

    - normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se multiplic pn acoperperetele flaconului, realizeaz o cultur monostrat

    - tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile, cresc n maimulte straturi i n suspensie

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    4/10

    CELULELE TRANSFORMATESunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana sau prin expunere ladiferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare care este mentinuta indefinit princultivare in vitro sau transplant in vivo.

    Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat Inoculate la animale produc tumori Multiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera la substratul de izolare Cerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de ser fetal de vitel Prezinta antigene de suprafata diferite de celulele normale Prezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid

    Inocularea virusurilor n culturile celulare Se arunca mediul nutritiv i se introduce suspensia viral. Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele receptive). Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz. n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura celular.

    Izolare:urmrirea efectelor citopatice = ECP

    EFECTE CITOPATICE SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS PICNOTIC LITIC: enterovirusuri INCLUZIONAR:

    Intranuclear acidofil: papovavirusuri Intranuclear bazofil: adenovirusuri

    Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccina Mixt: v herpetice, v rujeolos

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    5/10

    ECP SINCITIAL

    Binding

    Fusion

    Reverse transcription

    Nuclearlocalization

    Uncoating

    Integration

    Transcription

    SplicingRNA

    export

    GenomicRNA

    mRNA

    Translation

    ModificationBudding

    Assembly

    Maturation

    Endocytosis

    Lysosome

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    6/10

    INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)Sus - neuron fara incluzii Negri

    Jos neuron cu incluzii Negri (col HE)

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    7/10

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    8/10

    INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)

    HSV corpii Cowdry tip A

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    9/10

    Infectia CU adenovirusuri

    se multiplica in nucleu unde proteinele capsidare, produse in exces, formeaza

    incluziile intranucleare

    Reovirus

  • 8/4/2019 Izolarea Virusurilor in Culturi Celulare Lp1

    10/10

    HPV

    ECP picnotic litic