U�IVERSITATEA DE MEDICI�Ă ŞI FARMACIE „GR. T. POPA” FACULTATEA DE MEDICI�Ă DISCIPLI�A DE FIZIOLOGIE

Implicarea angiotensinelor şi a receptorilor recent dezorfanizaţi

în modularea reactivităţii vasculare

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Îndrumător Ştiinţific, Prof. Dr. GHEORGHE PETRESCU Doctorand, Dr. MADIA DI�CĂ

--IAŞI 2011--

1

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

I. I�TRODUCERE 1I.1. Scopul cercetării 2I.2. Motivaţia alegerii temei 2II. STADIUL ACTUAL AL CU�OAŞTERII 3II.1. SISTEMUL RENINA ANGIOTENSINA VASCULAR 3II.1.1. Introducere 3II.1.2. Componentele SRA vascular 4II.1.3. Rolul SRA vascular 6II.2. TONUSUL VASCULAR 9II.2.1. Introducere 11

II.2.2. Importanţa fiziologică şi fiziopatologică a tonusului vascular 11II.2.3. Reglarea tonusului vascular 12

II.3. RECEPTORI ORFANI CUPLAŢI CU PROTEINE G 21

II.3.1. Evoluţia studiului receptorilor orfani cuplaţi cu proteine G 22

II.3.2. De-orfanizarea receptorilor cuplaţi cu proteine G 23II.3.3. Implicaţii farmacologice ale receptorilor orfani 24

II.3.4. Roluri ale receptorilor orfani APJ şi GPR14 la nivelul circulaţiei pulmonare 25

II.4. Participarea ţesutului adipos perivascular în reglarea reactivităţii vasculare 28II.4.1. Adipokinele 29

II.4.2. Mecanisme implicate în disfuncţia vasculară asociată obezităţii 42III. CO�TRIBUŢII PERSO�ALE 50III.1. Materiale şi metode 50III.1.1. Sensibilizare la ovalbumina 51III.1.2. Miografie 51

2

III.1.3. Inregistrarea eliberarii de NO la nivelul inelelor vasculare de şobolan 52

III.1.4. Leziune pulmonară acută indusă de lipopolozaharide 53

III.1.5. Efectele intracelulare ale peptidelor studiate (administrate cu ajutorul lipozomilor) la nivelul muschiului neted vascular 54III.2. Rezultate 57III.2.1. Efectele vasomotorii ale apelinului 57III.2.2. Implicarea oxidului nitric si a prostaglandinelor in efectele vasodilatatorii ale ghrelinului 67

III.2.3. Efectele duale vasoconstrictoare / vasodilatatoare ale urotensinului 73

III.2.4. Efectele amplificatoare ale relaxinului asupra relaxarii induse de apelin sunt partial mediate de oxidul nitric sintetizat de atat Nitric Oxid Sintaze (NOS) inducibile cat si de cele constitutive 75

III.2.5. Efectele vasomotorii ale urotensinului II sunt mediate de radicalii liberi de oxigen 78

III.2.6. Ghrelin si Ang 1-7 au efecte vasodilatatoare cumulative 80III.2.7. Interactiuni intre apelin, urotensin si angiotensina II la nivelul arterei pulmonare de sobolan 84

III.2.8. Participarea urotensin II la activarea Sistemului Renină Angiotensină vascular 88

III.2.9. Influenţa obezităţii asupra interactiuni dintre ghrelin şi angiotensine 98

III.2.10. Implicarea sistemelor ligand – receptor dezorfanizat studiate în modificările reactivităţii vasculare asociate obezităţii la şobolan 108III.3. Discuţii 144IV. CO�CLUZII 200V. BIBLIOGRAFIE 201

3

I�TRODUCERE

Sistemul renină angiotensină (SRA) deţine un rol important în controlul hemodinamicii intervenind atât asupra conţinătorului (inimă şi vase sanguine) cât şi asupra conţinutului (sânge). Astfel, acţiunile SRA pentru menţinerea homeostaziei hemodinamicii sunt complexe şi influenţează atât inima şi vasele cât şi volumul sanguin antrenând intervenţia rinichiului, corticosuprarenalei şi sistemului nervos. Iniţial SRA a fost asociat numai cu activitatea rinichiului, ulterior datele acumulate au impus acceptarea existenţei componentelor SRA şi în alte teritorii, dovedindu-se capacitea şi a altor structuri, extrarenale, de a genera angiotensine. Pe de altă parte, componentele SRA circulant (renină de origine renală şi angiotensinogen de origine hepatică) pot fi transferate din circulaţie în ţesuturi şi celule unde vor intra în alcătuirea SRA tisulare. Drumul poate fi parcurs şi în sens invers din ţesuturi în circulaţie, dar din punct de vedere fiziologic această cale este nesemnificativă datorită cantităţilor mici de substanţe generate. Excepţie fac rinichiul şi ficatul care sintetizează majoritatea reninei şi respectiv angiotensinogenului circulant. Localizarea la nivelul vaselor a tuturor componentelor SRA: renină, enzimă de conversie a Ang I (ECA), angiotensinogen (AOGEN), receptori angiotensinergici – (AT) certifică existenţa unui SRA local şi deschide noi direcţii în studiul implicării angiotensinelor atât sistemice cât şi locale în reglarea tonusului vascular. SRA participă la modularea tonusului vascular prin intermediul peptidelor angiotensinice atât circulante (SRA circulant) cât şi sintetizate local, în peretele vaselor (SRA local). Modificările fiziologice şi patologice care apar în activitatea SRA tisular determină modificări ale concentraţiei tisulare de Ang II şi resectiv a tonusului vascular. Creşterea activităţii ezimatice locale sau creşterea producţiei de angiotensinogen tisular oferă posibilitatea creşterii nivelului angiotensinergice în organul respectiv. De obicei aceste creşteri ale sintezei locale de Ang II sunt mici întrucât efectele lor se

4

realizează autocrin, paracrin sau chiar intracrin, cum ar fi declanşarea şi/sau modularea cascadei apoptozei celulare în insuficienţa cardiacă sau modularea circulaţiei locale. Sinteza locală a angiotensinelor rezultă din interacţiunea dintre AOGEN şi renină sau izo-renine sintetizate în peretele vascular; acestea pot însă deveni active la nivel tisular şi după captarea lor din plasmă. Întrucât Aogen –ul şi ARN-ul său mesager a fost detectat (şi chiar evaluat cantitativ) şi la nivelul peretelui vascular, este lesne de înţeles că tetradecapeptidul poate fi transformat în Ang I atât sub acţiunea reninei cât şi sub acţiunea altor enzime renin - like (catepsină D, tonine, chimaze, aspartil proteaze). Ang I poate fi convertită în Ang II atât de câtre ECA cât şi de către alte enzime, cum ar fi: chimază,catepsină B şi D, elastază sau tonină. Aogen-ul poate fi scindat direct în Ang II sub acţiunea elastinei, toninei şi catepsinei G, prezente la rândul lor în peretele vascular. Receptorii cuplati cu proteine G(GPCRs) s-au dovedit a fi o tinta terapeutica pentru o larga clasa de afectiuni. Descifrarea genomului uman a permis identificarea mai multor proteine ce pot indeplini rolul receptorilor cuplati cu proteine G si care pot oferi o alternativa pentru medicatia actuala sau solutii pentru noi terapii. Receptorii cuplati cu proteine G a caror functii si liganzi nu au fost inca identificate au fost denumiti receptori orfani. Receptorii orfani cuplati cu proteinele G (oGPCRs) apartin superfamiliei de receptori cu sapte domenii transmembranare. Tinand cont de faptul ca aproape 40% din subtantele prezente in farmacii actioneaza prin intermediul receptorilor cuplati cu proteine G (GPCR) receptorii orfani reprezinta un imens potential pentru obtinerea unor noi compusi farmacologici si aparitia unor noi metode terapeutice. In prezent, dupa unii autori, exista sute de astfel de receptori. “De-orfanizarea” acestor receptori a dat startul unei adevarate competitii in precizarea implicatiilor functionale si cailor de semnalizare intracelulara ale acestor receptori.

5

I.1. Scopul lucrării

Proiectul de față își propune investigarea implicării și interacțiunilor dintre SRA și sistemelor ligand ale receptorilor orfan în diverse condiţii fiziologice sau patologice, hipertensiunea pulmonară monocrotalin - indusă, sensibilizare la ovalbumină, administrarea de lipopolizaharide, obezitate. Deși ARNm al APJ și AP au fost identificate la nivel vascular, nu se cunosc pe deplin rolurile sistemului AP - APJ în circumstanțe fiziologice au patologice. În ceea ce privește UII, datele existențe în literatură prezintă efecte vasoconstrictoare în timp ce datele noastre preliminare sugerează implicarea UII și în relaxarea dependentă de endoteliu. Deși se știe că disfuncția endoteliala reprezintă una dintre principalele complicații ale obezității în literatură nu se găsesc suficiențe date despre variațiile reactivității vasculare datorate modificării concentrației plasmatice a adipokinelor, cum ar fi angiotensinogen și apelin, sau a variațiilor efectelor unui alt ligand al receptorilor orfani implicat în echilibrul foame - sațietate, ghrelin. Am utilizat modele experimentale ale inflamaţiei acute sau cronice: hipertensiune pulmonară, alergie la ovalbumină, injectare de lipopolizaharide bacteriene, și obezitate. Un element de noutate îl constituie înregistrarea simultană modificărilor de tonus și a eliberării de oxid nitric induse de apelin, urotensin și angiotensină la nivelul inelelor vasculare. Rezultatele in vitro vor fi întregite de studiul reactivității vasculare în absența sau după administrarea sistemica (de ex.: intraperitoneala) de blocanți ai SRA. După cum se poate remarca din cele prezentate mai sus temă propusă completează masiv și integrează informațiile destul de reduse privind afectarea vasculară în obezitate. Considerăm că datele obținute în legătură cu acțiunile ghrelinului, urotensinului și apelinului la nivelul vaselor, precum și interacțiunea acestor peptide cu angiotensinele pot constitui punctul de plecare a unor noi atitudini terapeutice în hipertensiunea arterială sau disfuncția endotelială asociată cu obezitatea.

6

I.2. Motivaţia alegerii temei

Receptorii orfani cuplați cu proteinele G aparțin superfamiliei de receptori cu șapte domenii transmembranare. Receptorii orfani au fost recent clonați și încă nu au liganzi sau funcții bine cunoscute. Ținând cont de faptul că aproape 40% din subtantele prezente în farmacii acționează prin intermediul receptorilor cuplați cu proteine G (GPCR) receptorii orfani reprezintă un imens potențial pentru obținerea unor noi compuși farmacologici și apariția unor noi metode terapeutice. În prezent, după unii autori, există sute de astfel de receptori. Recent, apelin și urotensin II au fost identificați că fiind liganzii specifici ai receptoriilor APJ și respectiv - GPR14. “De-orfanizarea” acestor receptori a dat startul unei adevărate competiții în precizarea implicațiilor funcționale și cailor de semnalizare intracelulară ale acestor receptori. Lucrarea urmărește (i) identificarea efectelor vasculare mediate de receptorii orfani și (ii) modularea acestor efecte de către angiotensine. Informațiile preconizate a fi obținute sunt utile dezvoltării de noi tehnici de diagnostic sau terapeutice. Studii recente au arătat că atât AP13 cât și U-II pot stimula sinteză de NO la nivelul musculaturii netede modificând, funcție de circumstanțele experimentale, tonusul bazal sau efectele contractile ale altor principii bioactive între care angiotensinele ocupă un loc central. Ultimii ani au strămutat centrul de greutate al studiilor asupra SRA din circulație în țesuturi. Identificarea tuturor componentelor SRA la nivel tisular a indicat existența SRA locale ce pot funcţiona independent de SRA sistemic. De importantă deosebită este implicarea SRA local în modularea tonusului musculaturii netede vasculare. Se știe că interacțiunile dintre SRA pulmonar și sistemele peptidergice ligand ale receptorilor orfani, ce implică modificarea sintezei de NO, pot avea răsunet atât asupra tonusului cât a hipertrofiei musculaturii netede din vasele pulmonare. Deoarece disfuncția endoteliala este asociată fenomenelor inflamatorii locale sau sistemice, am utilizat sensibilizarea la ovalbumină, administrarea de lipopolizaharide bacteriene și obezitatea că modele experimentale pentru studiul interacțiunilor dintre angiotensine și oGPCRs. Având în vedere largă utilizare în terapeutică medicală a modulatorilor

7

GPCRs, consideră că rezultatele obținute vor putea contribui la înțelegerea rolului sistemelor ligand ale oGPCRs în fiziologia normală și patologică.

STADIUL ACTUAL AL CU�OAŞTERII La mai mult de un secol de la descoperirea reninei (Tigerstedt

şi Bergmann, 1898) studiile asupra SRA au dezvăluit noi componente, funcţii şi subsisteme. Aceste noi date au permis mai târziu înţelegerea mecanismelor fiziopatologice şi un mai bun managent al afecţiunilor cardiovasculare şi metabolice. Tradiţional, SRA este cunoscut ca un sistem circulator implicat în reglarea de scurtă durată a volumului sanguin şi în homeostazia presiunii arteriale.

Figura SRA1: Schema sistemului renină angiotensină: ATR: receptorul angiotensinei II; MAS: receptorul pentru proto-oncogena Mas; ACE: enzima de conversie a angiotensinei

Recent, au fost descrise SRA locale implicate în modularea

cronică a unor procese fiziologice şi fiziopatologice tisulare. Ultimii ani au evidenţiat şi existenţa unor SRA intracelulare cu acţiuni

8

intracrine. SRA este implicat în iniţierea şi progresia aterosclerozei contribuind la dezvoltarea bolilor cardiovasculare. Ang II este implicată în patogeneza aterosclerozei prin contribuţiile sale la procesele de disfuncţie endotelială, proliferare celulară şi inflamaţie. Studii recente aduc în discuţie implicarea parţială a SRA vascular în aterosclerozei prin intermediul speciilor reactive de oxigen. Peretele vascular este organul efector pentru SRA plasmatic (endocrin), receptorii AT1 localizaţi la nivelul celulelor musculare netede vasculare mediind vasoconstricţia. Conceptul de SRA vascular a fost generat când s-a dovedit că Ang II poate modula creşterea celulelor vasculare şi că elementele SRA pot fi sintetizate la nivelul peretelui vascular, intracelular (figura SRA1).

Figura SRA2. Calea de transductie a semanlului biologic active mediate de receptorul (Pro)reninei.

În timp ce unele studii nu au găsit renină în peretele vascular (Fordis CM şi colab., 1983), alţi autori au putut evidenţia expresia ARNm al reninei în vasele de conductanţă sau de rezistenţă umane

9

(Paul M şi colab., 1993) şi de şobola (Samani NJ şi colab., 1987). Aceaste date pot fi explicate dacă se consideră că sinteza de renină la nivel vascular este insignifiantă în condiţii fiziologice şi se amplifică devenind semnificativă în anumite situaţii patologice (Von Lutterotti N şi colab., 1994). De altfel, inducţia sintezei de renină a fost demonstrată la şobolan la nivelul neointimei (Iwai N şi colab., 1997). Alături de sinteza locală o altă sursă de renină este reprezentată de captarea de renină din circulaţie mediată de receptori nespecifici de pe suprafaţa celulelor endoteliale sau receptori specifici pentru prorenină (fig. SRA2) sau renină (Catanzaro OF, 2005; Jan Danser AH şi Saris JJ, 2002; Nguyen G şi colab., 2004; 2002). Receptorul pentru manozo-6 fosfat leagă renina sau prorenina la nivelul membranelor celulelor endoteliale umane (Admiraal PJ şi colab., 1999). Studiile efectuate utilizând celule endoteliale au sugerat că preluarea reninei direct din sânge ar putea reprezenta un mecanism de clearance pentru prorenin (Van den Eijnden MM şi colab., 2001). Aceasta ar putea reprezenta şi un mecanism protectiv în timpul activării SRA sistemic sau tisular. Importanţa acestui mecanism a fost arătată prin utiliarea unui model de şoban transgenic ce hiperexprimă prorenină la nivelul ficatului. Prorenia produsă şi eliberată de la nivelul ficatului determină creşterea concentraţiei proreninei plasmatice de până la 400 de ori. Cu toate acestea şobolanii nu prezintă hipertensiune arterială. În schimb prezintă leziuni severe vasculare ceea ce sugerează că prorenina este captată din circulaţie şi stimulează SRA intracelular ceea ce are ca urmare efecte trofice patologice (Veniant M şi colab., 1996). La om, creşterea proreninei circulante a fost asociată cu situaţii patologice cum ar fi cele ce duc la apariţia leziunilor microvasculare diabetice (Deinum J şi colab., 1999; Luetscher JA şi colab., 1985; Naruse M şi colab., 1995). Sunt necesare studii suplimentare pentru a putea preciza rolul funcţional al clearance-ului proreninei şi captarea în endoteliu via receptorilor M6P sau a altor mecanisme. Aceste mecanisme de clearace ar trebui opuse cuplării proreninei cu receptorii pentru renină/prorenină (Ngnyen G şi colab., 2002) sau activării non-proteolitice a reninei (Ichihara A şi colab., 2004; Suzuki F şi colab., 2003) ce duc la activarea SRA (Catanzaro OF,

10

2005; Jan Danser AH şi Saris JJ, 2002; Ngnyen G şi colab., 2004; 2002). La nivelul peretelui vascular ECA este localizată în special la nivelul polului apical al celulelor endoteliale (Falkenhahn MFF şi colab., 1995; Zhuo J şi colab., 1998). Wilson şi colab. (1987) au identificat ECA în special la nivelul endoteliului şi adenticei. Datele au fost confimate de Rogerson şi colab. (Rogerson FM şi colab., 1992) la nivelul arterelor umane şi de animal (câine, iepure, oaie). Arnal şi colab. (Arnal JF şi colab., 1994) au arătat că la nivelul aortei de şobolan atât ECA cât şi ARNm specific se găsesc în special la nivelul mediei şi intimei şi mai puţin la nivelul adventicei. Există date ce indică faptul că celulele musculare netede vasculare care par să nu exprime ECA în condiţii normale, pot să exprime ECA în anumite stări patologice (ex: formarea neointimei) (Fernandez-Alfonso şi colab., 1997). Expresia ARNm al ECA2 este ubicuitară în celulele endoteliale arteriale şi venoase şi în celulele musculare netede vasculare arteriale (Hamming I şi colab., 2004). Date recente atestă participarea ECA şi ECA2 din peretele vaselor pulmonare şi din celulele epiteliale alveolare în mecanismele fiziopatologice din timpul infecţiei virale (SRAS = sindrom respirator acut sever) (Imai Y şi colab., 2005; Kuba K şi colab., 2005; Nicholls J şi Peiris M, 2005). Studii suplimentare sunt necesare pentru a identifica tipurile celulare responsabile de expresia componentelor SRA şi acţiunile acestuia la nivel pulmonar (Morishita R şi colab., 1993). ARN-ul mesager specific angiotensinogenul (substratul iniţial al cascadei SRA) a fost detectat în pereţii vaselor de sânge (Campbell DJ şi Habener JF, 1986; Hellmann W şi colab., 1988). De asemenea este abundent exprimat în grăsimea periadventiceală (Campbell DJ şi Habener JF, 1987; Cassis LA şi colab., 1988). Aceaste date sugerează că aogenul este secretat de aceste celule şi apoi difuzează în peretele vascular unde vine în contact cu renina vasculară. La nivel vascular au fost identificaţi atât receptorii AT1 cât şi receptorii AT2 (Bonnet F şi colab., 2001; Murphy TJ şi colab., 1991). Celulele musculare netede vasculare în cultură exprimă doar receptorii AT1 în timp ce la nivelul celulelor endoteliale în cultură au fost identificate ambele subtipuri de receptori angiotensinergici (Stoll M şi colab., 1995). Ang II stimulează creşterea celulelor musculare netede

11

vasculare dar inhibă creşterea celulelor endoteliale inactive ca răspuns la stimularea cu factori de creştere fibroblastici (Stoll M şi colab., 1995). Antagoniştii receptorului AT2 abolesc acest efect al Ang II ceea ce sugerează că receptorii AT2 au rol inhibitor al creşterii celulare (Stoll M şi colab., 1995). Acest rol al receptorilor AT2 a fost dovedit şi în cadrul experimentelor in vivo la şobolan. Transferul de gene ce codează receptorii AT2 reduce formaea neointimei în carotidele de şobolan, efect neutralizat de antagoniştii receptorilor AT2 (Morishita R şi colab., 1994). Localizarea receptorilor AT2 la nivel vascular reprezintă un subiect aflat încă în dezbatere (Batenburg WW şi colab., 2005. Studii funcţionale efectuate la nivelul arterelor de om şi de la animale au arătat că endoteliul este de departe tunica cu cea mai bogată expresie a receptorilor AT2 (Batenburg WW şi colab., 2004; 2005, Bergaya S şi colab., 2004; Gohlke P şi colab., 1998; Hannan RE şi colab., 2003; Schuijt MP şi colab., 2001). De asemenea, deoarece receptorii AT2 se heterodimerizează cu receptorii AT1 (AbdAlla S şicolab., 2001), se poate sugera că există o colocalizare a ambelor subtipuri de receptori la nivelul celulelor musculare netede vasculare (Batenburg WW şi colab., 2000). SRA tisular contribuie la menţinerea homeostaziei cardiovasculare prin acţiunea duală asupra vaselor mediată de efectele opuse determinate de activarea a două tipuri de receptori. Studiile in vivo nu au izolat efectele mediate de Ang II generată în plasmă de cele ale Ang II sintetizată local, în peretele vascular. Generarea Ang II la nivel vascular a fost evidenţiată de numeroşi autori. Sinteza locală de Ang II la nivel vascular a fost demonstrată la nivelul labei posterioare perfuzate de şobolan (Hilgers KF şi colab., 1989). Hillgers şi colab. (1989) au arătat că 50% din Ang I poate fi convertită în Ang II la primul pasaj. Această conversie a Ang I a fost abolită de inhibitorii ACE. Aceste date sugerează prezenţa unui SRA vascular în care sinteza Ang II este dependentă de ECA. Experimente ulterioare au arătat că sinteza vasculară de Ang II este mediată de endoteliu, deoarece îndepărtarea acestuia blochează transformarea Ang I în Ang II (Hilgers KF şi colab., 2001). Alături de acţiunile binecunoscute pe termen lung ale SRA asupra remodelării vasculare ce sunt mediate de efecte proliferative asupra

12

celulelor vasculare netede şi fibroblastelor (Alexander RW şi Griendling KK, 1996; Campbell-Boswell M şi Robertson AL Jr., 1981; Geisterfer AA şi colab., 1988; Gibbons GH şi colab., 1992; Schelling P şi colab., 1979), creşterea sintezei de SRO prin stimularea NADPH-oxidazei de către Ang II a fost demonstrată ca fiind un mecanism important ce asigură conexiunea între activarea SRA şi evenimente cum ar fi inflamaţia, aterosclezoza, hipertofia, remodelarea şi angiogeneza (Cai H şi colab., 2003; Hanna IR şi colab., 2002; Schulman IH şi colab., 2005). Sinteza de ROS de către NAD(P)H oxidază ca răspuns la stimularea de către Ang II a celulelor endoteliale şi musculare netede vasculare activează căi de semnalizare cum ar fi: MAP kinaze, tirozin kinaze şi factori de creştere implicate în aceste fenomene patologice (Cai H şi colab., 2003; Griendling KK şi colab., 1994; Hanna IR şi colab., 2002; Schulman IH şi colab., 2005). În apariţia leziunilor vasculare şi aterosclerozei determinate de Ang II/ AT1 prin amplificarea căii NAD(P)H/ ROS sunt implicate şi alte mecanisme, cum ar fi: oxidarea şi captarea LDL (Keidar S, 1998; Nickenig G şi colab., 1997), creşterea expresiei mediatorilor inflamaţiei cum ar fi: NF[kappa]B sau a moleculelor de adeziune celulară cum ar fi VCAM-1 (molecule ale adeziunii celulelor vasculare) sau ICAM-1 (molecule de adeziune intercelulare) (Aguilera G, 1995; Diep QN şi colab., 2002; Luft FC, 2002; Pastore L şi colab., 1999). Pe lângă aceasta sunt activate chemokinele şi citokinele proinflamatorii (Chen CY şi Huang WC, 2000; Luft FC, 2002). Modificările apoptotice induse de Ang II la nivelul peretelui vascular au fost bine documentate (Diep QN şi colab., 1999). Aceastea de mai sus, alături de modularea indusă de Ang II a componentelor matricei extracelulare prin intermediul metaloproteinazelor (MMP) şi a inhibitorilor tisulari ai MMP (TIMP), pot participa la remodelarea vasculară (Bode W şi colab., 1999; Jacob MP, 2003) incluzând procese cum ar fi ruperea stratului endotelial nomal în stadiile incipiente ale aterosclerozei sau ruptura plăcii de aterom în stadiile avansate ale aterosclerozei (Cipollone F şi colab., 2004). Receptorii AT1 şi AT2 au efecte contrare asupra creşterii vascuare (Hutchinson HG şi colab., 1999). Receptorii AT2 sunt consideraţi ca un factor de

13

contrabalansare/ modulare a mecanismelor prezentate mai sus şi care sunt mediate de receptorii AT1. La om, leziunile produse de angioplastia coronariană transluminală percutană (PTCA) rezultă în amplificarea expresiei ECA la nivelul zonei în care au loc procesele de reparare / vindecare (Ohishi M şi colab., 1997). Tratamenul cu perindopril reduce formarea neointimei la iepurii cu leziuni carotidiene produse de PTCA (Janiak P şi colab., 1994). Walsh şi colab., (Walsh DA şi colab., 1997) lucrând pe un model experimental de granulom spongios subcutanat la şobolan au arătat că Ang II poate stimula angiogeneza acţionând via receptorilor AT1 şi că receptorilor AT1 şi AT2, precum şi că expresia receptorilor menţionaţi şi ECA creşte secvenţial pe parcursul maturării vasculare. Aceste date confirmă studiile precedente efectuate pe embrionul de găină ce demonstrau că Ang II stimulează angiogeneza (Le Noble FAC şi colab., 1991). Aceeaşi autori au sugerat că efectele stimulatoare ale Ang II asupra angiogenezei sunt modulate de un nou subtip de receptori angiotensinergici (Le Noble FAC şi colab., 1993). Nu se cunoaşte dacă acest mecanism alternativ poate fi explicat prin efectele anti-angiogenice ale Ang-(1-7) care poate stimula eliberarea de NO prin interacţiunea cu un receptor angiotensinergic non AT1, non AT2 (Machado RD şi colab., 2001). Studiile efectuate pe şoareci transgenici deficitari în receptorilor AT2 sau şobolani cu ischemie a membrului posterior indusă chirurgical au arătat că receptorilor AT2 mediază efecte anti-angiogenice asociate cu activarea apoptozei (Silvestre JS şi colab., 2002). Acest experiment ridică semne de întrebare asupra rolului benefic al stimulării receptorilor AT2 în contextul blocadei receptorilor AT1 în ţesuturile ischemice (Levy BI, 2004). Wang D şi colab. (2004) au arătat că ECA inactivează Ac-SDKP cunoscut pentru efectele sale de a promova neovascularizaţia la nivelul corneei şi creşterea densităţii capilare la nivel cardiac. SRA tisular joacă un rol important în organele sistemului reproducător, iar componentele SRA sunt influenţate de către hormonii sexuali (Fischer M şi colab., 2002). În literatură există numeroase referinţe obţinute din studii pe animale, ce indică diferenţele semnificative între componentele SRA la nivel tisular funcţie de sex (Armando I şi colab., 2002; Ellison KE şi

14

colab., 1989; Freshour JR şi colab., 2002; Gallagher PE şi colab., 1999; Gordon MS şi colab., 1992; Hinojosa-Laborde C şi colab., 2004; Nickenig G şi colab., 1998; 2000), în timp ce studiile clinice au evaluat predominant diferenţele funcţie de sex ale componentelor SRA circulant (Chidambaram M şi colab., 2002; Danser AH şi colab., 1998; Goldhaber SZ şi colab., 1984; Harvey PJ şi colab., 2005; 1987; Laragh JH şi colab., 1967; Schunkert H şi colab., 1997; Seely EW şi colab., 2004). S-a încercat identificarea rolului SRA în explicarea diferenţelor legate de sexexistente în homeostazia hemodinamicii atât la oameni, cât şi la animale. Caracterizarea unei secvenţe estrogen sensibile la nivelul genei ce codează angiotensinogenul a reprezentat o primă dovadă a interacţiunii dintre hormonii sexuali şi SRA la nivel molecular (Feldmer M şi colab., 1991; Gordon MS şi colab., 1992). De asemenea expresia angiotensinogenului la nivel hepatic este diminuată prin castrare şi crescută prin adminisrare de testosteron la şobolani (Ellison KE şi colab., 1989). În timp ce studiile iniţiale au sugerat activitatea plasmatică a reninei este stimulată de estrogeni, studiile din ultimii ani au indicat că activitatea plasmatică a reninei este suprimată de estrogeni (Fischer M şi colab., 2002; Oelkers WK, 1996; Schunkert H şi colab., 1997). Castrarea şobolanilor masculi determină reducerea activitatăţii plasmatice a reninei în timp ce tratamentul cu testosteron a femelelor de şobolan ovariectomizate are efecte contrare (Ellison KE şi colab., 1989). Toate aceste studii sunt în acord cu observaţia că nivelele plasmatice ale reninei sunt mai reduse la femei decât la bărbaţi (Fischer M şi colab., 2002; Schunkert H şi colab., 1997). Expresia ARNm al ECA a fost semnificativ redusă de către estradiol la nivelul rinichiului, plămânului şi aortei de şobolan (Gallagher PE şi colab., 1999). La nivel miocardului ventricular ECA este mai abundentă la şoarecii masculi decât la femele atât din punct de vedere al ARNm specific, cât şi a expresiei. Diferenţele apar după atingerea maturităţii sexuale şi cresc cu vârsta (Freshour JR şi colab., 2002).. Ovarectomia este urmată de o uşoară creştere a nivelului ECA la femele, în timp ce la şoriceii masculi lipsiţi de androgeni, nivelele ECA scad semnificativ (Freshour JR şi colab., 2002). Deci modificările contrare ale abundenţei ECA la nivelul miocardului

15

ventricular observate la şoarecii masculi şi femele după castrare sugerează că atât testosteronul cât şi estrogenii participă la reglarea expresiei ECA la nivel cardiac (Freshour JR şi colab., 2002). La om nivelele plasmatice ale ECA par a fi de asemenea reduse ca răspuns la administrarea de estrogeni (Proudler AJ şi colab., 1995; Schunkert H şi colab., 1997; Seely EW şi colab., 2004). Au fost înregistrate modificări în acelaşi sens ale receptorilor AT1: estrogenii determină fenomene de down-regulation ale receptorilor AT1, în timp ce deficitul de estrogeni are efecte contrare (Nickenig G şi colab., 1998). Tratamentul cu estrogeni are efecte protective de prevenire a apariţiei hipertensiunii arteriale la şobolanii transgenici femelă cu SRA tisular activat posibil prin amplificarea contribuţiei Ang-(1-7) ce are efecte vasodilatatoare în acelaşi timp cu reducerea formării şi acţiunilor vasoconstrictoare ale Ang II independent de modificarea activităţii plasmatice a reninei (Brosnihan KB şi colab., 1997). Cumulând datele existente estrogenii par a induce supresia SRA atât la nivel sistemic, cât şi la nivel tisular (Fischer M şi colab., 2002). Rolul testosteronului şi androgenilor a fost bine caracterizat, inclusiv de studii recente (Baltatu O şi colab., 2003) care au demostrat că administrarea antagoniştilor receptorilor androgenici (flutamid) oferă protecţie împotriva hipertensiunii şi a leziunilor organice terminale nu doar la şobolani transgenici (TGR(mREN2)27) masculi, ci şi la femele. Cu toate că există date clare ce dovedesc că atât activitatea SRA cât şi mortalitatea şi morbiditatea cardiovasculară prezintă diferenţe legate de sex, nu se cunoaşte clar nici în ce măsură sexul sau hormonii sexuali reglează SRA şi nici mecanismele implicate în medierea efectelor la nivel cardiovascular la bărbat, precum şi la femeie pre/post menopauză în diverse situaţii fiziologice (Fischer M şi colab., 2002). Mai mult decât atât, studiile ulterioare ce vor încerca să dezlege aceste enigme prezintă interes pentru mai multe domenii din medicină cum ar fi: studiul fenomenelor de remodelare cardiacă şi vasculară în bolile cardiovasculare şi la vârstnici, precum şi intervenţia terapiei hormonale de substituţie în aceste procese (Rossouw JE şi colab., 2002). Un interes deosebit îl au datele unui studiu recent asupra variaţiilor activităţii şi componentelor SRA în timpul fazelor ciclului menstrual normal la femei fertile sănătoase

16

(Chidambaram M şi colab., 2002). Acest studiu a arătat că presiunea arterială în condiţii de repaus a avut valori mai reduse în timpul fazei luteale a ciclului menstrual cu valori ridicate ale estrogenului (zilele 15 - 24) comparativ cu perioada cu concentratii reduse de estrogen în pofida creşterii bruşte şi tranzitorii ale reninei şi aldosteronului (Chidambaram M şi colab., 2002). De asemenea, la femeile sănatoase şi normotensive tratamentul de substituţie hormonală cu estrogeni în perioada post – menopauză continuă să menţină presiunea arterială la valori reduse în pofida creşterii nivelului de Ang II ceea ce sugereaza existenta unui mecanism compensator probabil la nivel tisular ce poate oferi protecţie împotriva activării SRA sistemic (Harvey PJ şi colab., 2005). Apelinul este ligandul specific al receptorului recent dez-orfanizat denumit APJ, receptor cuplat cu proteine G (Charles CJ, 2007) prezent pe celulele endoteliale, celulele musculare netede vasculare şi cardiomiocite (Kleinz MJ şi colab., 2005). Apelinul determină vasorelaxare dependentă de NO la nivelul arterelor umane atât in vitro cât şi in vivo (Salcedo A şi colab., 2007; Japp AG şi colab., 2008). In vivo, administrarea de apelin provoacă o scădere rapidă a tensiunii arteriale dependentă de NO la un model la rozătoare (Japp AG şi colab., 2008). Cu toate acestea, unele studii au asociat apelinul cu creşterea valorilor tensiunii arteriale (Kagiyama S şi colab., 2005). S-a constatat că modificările tensiunii arteriale induse de apelin sunt dependente de doză, timp (Charles CJ, 2007), căt şi de specie şi de teritoriul vascular studiat. Alte date sugerează de asemenea că apelinul are potential vasoconstrictor, acţionând direct asupra celulelor musculare netede vasculare. În venele umane izolate fără endoteliu, apelinul s-a dovedit a fi un puternic vasoconstrictor administrat în doze de ordinul nanomolilor, cu un răspuns maxim comparabil cu cel determinat de Ang II (Katugampola SD şi colab., 2001). În prezenţa endoteliului funcţional, acest efect vasoconstrictor poate fi contrabalasat sau chiar mascat prin activarea receptorilor APJ din celulele endoteliului vascular şi rezultă eliberarea de substanţe vasodilatatoare endoteliale, cum ar fi NO (Kleinz MJ şi Davenport AP, 2004). Toate aceste date,

17

luate împreună subliniază rolul funcţional al sistemului apelin-APJ ca şi modulator al tonusului vascular. Sinteza de apelin la nivelul ţesutului adipos este puternic stimulată de insulină, iar concentraţiile plasmatice ale apelinului sunt crescute în obezitatea cu hiperinsulinemie atât la şoareci, cât şi la om (Boucher J şi colab., 2005). Spre deosebire de expunerea acută, expunerea pe termen lung la apelin nu afectează tensiunea arterială (Ashley EA şi colab., 2005), efect ce ar putea fi explicat prin rezistenta la efectul său hipotensiv. Un alt studiu demonstrează contrariul, adică nivelul ridicat de apelin a fost responsabil de creşterea tensiunii arteriale în obezitate prin stimularea fluxului simpatic, în sistemul nervos central la trecerea barierei hemato-encefalice (Higuchi K şi colab., 2007). In ateroscleroză, apelinul ar putea avea efecte benefice, datorită faptului că apelinul stimulează sinteza de NO endotelială şi antagonizează astfel formarea leziunilor aterosclerotice induse de Ang II, precum şi a anevrismelor aortice într-un model murin de ateroscleroza (Chun HJ, 2008).Ţesutul adipos constituie o bogată sursă de de angiotensinogen, peptid precursor al Ang II, o cunoscută proteină cu puternice proprietăţi vasoconstrictoare (Zhang CH şi colab., 2003), şi de asemeni, acest tip de ţesut posedă toate enzimele necesare pentru a produce Ang II (Engeli S şi colab., 2005). Aceste constatări sugerează existenţa unui sistem renină-angiotensină local, la nivelul tesutului adipos. În plus, cantitatea de ARNm corespunzător angiotensinogenului in tesutul adipos este de 68% la nivelul ficatului, ceea ce arată rolul important al angiotensinogenului din ţesutul adipos în sinteza de Ang II (Lu H şi colab., 2007). Importanţa acestei surse de angiotensinogen în reglarea presiunii arteriale, în cadrul sistemului renină-angiotensină a fost demonstrat pe modele experimentale murine ce au utilizat soareci de tip sălbatic şi şoareci lipsiti de gena pentru angiotensinogen. S-a constatat că la ultimul tip de şoareci, adipocitele au avut o expresie mult crescută a angiotensinogenului ceea ce a menţinut nivelul plasmatic al angiotensinogenului în limite normale şi animalele au prezentat valori ale tensiunii arteriale în limite normale. Şoarecii de tip salbatic cu obezitate au fost hipertensivi din cauza cantităţii

18

suplimentare de angiotensinogen derivată din ţesutul adipos (Massiéra F şi colab., 2001). Un alt efect important al Ang II constă în faptul că aceast peptid amplifică metabolizarea NO în radicalii liberi de oxigen, care afectează ţesutul vascular (Cai H şi colab., 2002). Prin urmare, un dezechilibru între Ang II şi NO duce la disfuncţie endotelială şi la pierderea capacităţii vasodilatatoare asigurată prin componenta endotelială. S-a constatat o expresie crescută a moleculelor de adeziune şi a citokinelor proinflamatorii la nivelul celulelor endoteliale, care promovează aderarea monocitelor şi a leucocitelor, precum şi migrarea lor în peretele vascular (Verdecchia P şi colab., 2008). Mai mult, Ang II exercită efecte negative asupra progresului şi destabilizării plăcilor aterosclerotice prin eliberarea crescută de PAI-1, ceea ce conduce la tromboză şi prin amplificarea expresiei factorilor de creştere, ceea ce duce la proliferarea celulelor musculare netede (Verdecchia P şi colab., 2008). Sunt mai multe studii care susţin expresia crescută a ARNm a angiotensinogenului in tesutul adipos din obezitate (Thatcher S şi colab., 2009).

PARTE PERSO�ALĂ

1. Material şi metode Pentru realizarea studiului au fost utilizaţi şobolani masculi, rasa Wistar, cu greutate cuprinsă între 150–200g achizitionati de la Institutul Cantacuzino Bucuresti. De asemeni au fost utilizate linii de şobolani de laborator importate de la Charles River Laboratories International, Inc. (MA, USA), achiziţie realizată din fondurile grantului CNCSIS IDEI 2670/2008. Aceste linii sunt: şobolani Sprague-Dawley (şobolani normali ce constituie lotul de control), şobolani cu tendinţă la obezitate (OP, obese prone, şobolani obezi) şi şobolani rezistenţi la obezitate (OR, obese resistent, şobolani control). Şobolanii OP şi OR au fost hraniţi cu hrană standard Research Diets 12266 (32% grăsimi). La 12 săptămâni, diferenţa de greutate era de aproximativ 100g (398±12g pentru OP şi 302±24g pentru OR). Animalele au fost crescute in custi de polietilena, cu acces liber la hrana si apa respectand un ciclu zi/noapte de 24 de ore.

19

Şobolanii au fost menţinuţi în condiţii standard identice cu hrană şi lichide ad libitum.

2. Rezultate şi Discuţii

Administrarea de apelin 13 (AP13; 10 nM, 0.1 uM, 1 uM) în pretratament reduce efectele contractile ale Ang II atât în inelele cu endoteliu cât şi în inelele fără endoteliu. Efectul inhibitor maxim a fost obţinut pentru 0.1 uM AP13 (86.96 ± 7.28% în cazul inelelor fără endoteliu şi 96.19 ± 6.28% în cazul inelelor cu endoteliu). AP13 are efecte inhibitorii mai reduse asupra contracţiilor induse de Ang II în prezenţa emdoteliului decât în absenţa endoteliului dar aceste diferenţe nu sunt semnificative statistic (p>0.05). Deşi receptorii APJ au fost localizaţi în special în celulele endoteliale (Tatemoto K şi colab., 1998; Kleinz MJ şi Davenport AP, 2004; Chen MM şi colab., 2003; Tatemoto K şi colab., 2001) în cazul nostru diferenţele dintrre rezultatele obţinute în cazul utilizării inelelor cu endoteliu nu sunt semnificativ diferite de rezultatele obţinute de la inelele fără endoteliu ceea ce sugerează că receptorii APJ nu sunt esenţiali pentru efectele inhibitoare ale AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul venei porte izolate de şobolan.Unii autori sugerează că apelinul ar putea acţiona prin stimularea sintezei de oxid nitric. Am investigat acestă ipoteză blocând nitric oxid sintaza (NOS) prin administrarea de L-NAME cu 15 minute înaintea administrării de AP13 şi Ang II. Am constatat că pretratarea cu L-NAME aboleşte total efectele inhibitoare ale AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu sau fără endoteliu. Deci efectele AP13 pot fi mediate de un mecanism dependent de NO aceste rezultate fiind în deplină concordanţă cu datele existente în literatură (Tatemoto K 1998; Tatemoto K 2001; Ishida J 2004). În concluzie, AP13 nu modifică tonusul venei porte de şobolan prin el însuşi dar inhibă semnificativ efectele contractile ale Ang II printr-un mecanism dependent de oxidul nitric.

20

Figura A1: Administrarea de L-�AME (10µM, L�) previne

efectele inhibitorii ale AP13 (0.1µM) asupra contracţiei induse de

Ang II la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu endoteliu

intact (A) şi reduce parţial efectele AP13 (0.1µM) asupra

contracţiilor induse de Ang II la nivelul inelelor de venă portă fără

endoteliu (B). Rezultatele sunt exprimate procentual fătă de

contracţia control (K+, 40 mM; medie ± E.S.M.). *p<0.05

21

comparativ cu rezultatele obţinute în absenţa L-�AME. LPS:

şobolani trataţi cu lipopolizaharide. OVA: şobolani sensibilizaţi la

ovalbumină.

Efectele AP13 nu sunt semnificativ modificate de prezenţa sau absenţa endoteliului intact ceea ce sugerează că AP13 acţionează în special asupra receptorilor APJ din celulele musculare netede vasculare pentru a inhiba efectele contractile ale Ang II, rolurile receptorilor APJ endoteliali necesitând viitoare clarificări. În figura A1 sunt prezentate efectele contractile ale Ang II (0.1 uM) la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu endoteliu intact sau dez-endotelizate. Contracţia indusă de Ang II 0.1 uM este semnificativ mai puternică la nivelul inelelor de venă portă de şobolan fără endoteliu (121.43 ± 6.83%) decât la nivelul inelelor cu endoteliu intact (115.43 ± 7.96%) (n=7, p<0.05, comparativ cu contracţia control indusă de K+ 40 mM). Nu am înregistrat efecte vasomotorii semnificative ale AP13 administrat în diverse concentraţii (10nM, 100nM, 1µM) la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu sau fără endoteliu. Pentru a investiga substratul efectelor inhibitoare ale AP13 asupra contracţiei induse de Ang II am administrat diferite concentraţii ale AP13 cu 15 minute înaintea Ang II. Am constatat că efectele inhibitorii ale AP13 sunt dependente de doză aşa cum reiese din figura A1. Cel mai puternic efect inhibitor asupra contracţiei iniţiate de Ang II a fost produs de 0.1µM AP13 atât la nivelul inelelor cu endoteliu intact (93.58 ± 5.41%) câ şi la nivelul inelelor dez-endotelizate (86.96 ± 7.28%). Unii autori sugerează implicarea oxidului nitric (NO) în realizarea efectelor inhibitorii ale AP13. Pentru a verifica această ipoteză am administrat 10µM L-NAME, un inhibitor neselectiv al nitric oxid sintazei (NOS) înaintea 0.1µM AP13. Am constatat că L-NAME previne efectele inhibitorii ale 0.1µM AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul venei porte izolate de şobolan (Figura A1). Aceste efecte sunt mai puternice la nivelul inelelor fără endoteliu (122.46±7.09%, n=7,

22

*p<0.05, comparativ cu contracţia indusă de Ang II după pre-tratamentul cu AP13). Am constatat că L-NAME previne efectele inhibitorii ale 0.1µM AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul venei porte izolate de şobolan (Figura A1). Aceste efecte sunt mai puternice la nivelul inelelor fără endoteliu (122.46±7.09%, n=7, *p<0.05, comparativ cu contracţia indusă de Ang II după pre-tratamentul cu AP13). În cazul inelelor lipsite de endoteliu (-E în figura A1), contracţia Ang II – indusă nu este modificată de administrarea de AP13 (129.31±10.29% vs. 130.88±9.05%). De asemenea, pre-trarea cu L-NAME nu are efecte semnificative la nivelul inelelor fără endoteliu (137.14±5.43% vs. 130.88±9.05%) dar amplifică semnificativ (116.34±8.04% vs. 130.45±4.83%) efectele contractile ale Ang II la nivelul inelelor cu endoteliu (+E în figura 1) Administrarea intraperitoneală de lipopoplizaharide bacteriene elimină atât efectele AP13 (129.22±13.83% vs. 125.79±10.79%) cât şi ale L-NAME (137.13 ±7.30 vs. 125.79±10.83) confirmând datele din literatură ce susţin apariţia disfuncţiei endoteliale ce însoţeşte inflamaţia acută. Efectele AP13 evidenţiate anterior dispar la nivelul venei porte de la şobolanii sensibilizaţi la ovalbumină (figura A1). La nivelul inelelor cu endoteliu nu exista diferenţe semnificative între contracţia indusă de Ang II în absenţa AP13 (136.17±10.72%) comparativ cu răspunsul contractil al inelelor în prezenţa AP13 (132.43±15.03%). Deci, AP13 reduce efectele contractile ale Ang II al nivelul venei porte de şobolan, prin stimularea eliberării de NO din endoteliu. Disfuncţia endotelială ce însoţeste fenomenele inflamatorii acute sau cronice reduce/ blochează efectele AP13. Pe de altă parte, aminoguanidina (AG) un inhibitor selectiv al formei indicibile a nitric oxid sintazei (NOS) blocheză complet efectele inhibitoare ale 0.1µM AP13 asupra contracţiei induse de Ang II în inelele cu endoteliu (112.16±6.48%, n=7, #p<0.05, comparativ cu efectele contractile ale Ang II după pretratamentul cu 0.1µM AP13). În figura 2 sunt prezentate comparativ efectele contractile ale Ang II la nivelul inelelor de venă portă cu endoteliu în absenţa sau în prezenţa aminoguanidinei.

23

Figura A2. Aminoguanidina (AG; 10µM) previne efectele

inhibitoare ale AP13 (0.1µM) asupra contracţiei induse de Ang II

la nivelul inelelor de venă portă de şobolan normal cu endoteliu

intact [VP+E(AngII)]. Rezultatele sunt exprimate procentual fătă

24

de contracţia control (K+, 40 mM; medie ± E.S.M.). *p<0.05

comparativ cu rezultatele obţinute în absenţa L�AME.

Figura A6. Efectele relaxante ale AP (doze cumulative 1nM-

10microM) la nivelul inelelor de vena renală de şobolan

precontractate cu 10 microM Phe (+E, pătrate) sau fără (-E,

cercuri) endoteliu, în absenţa (cercuri sau pătrate goale) sau în

prezenţa (cercuri sau pătrate pline) 10 microM L-�AME. *:

P<0.05 comparativ cu efectele AP13 în absenţa L-�AME.

25

Aminoguanidina nu modifică per se contracţia indusă de Ang II (124.34±11.42% vs. 116.34±8.04%) la şobolanii normali, trataţi cu lipopolizaharide (125.79±10.38% vs. 129.11±7.46%) sau sensibilizaţi la ovalbumină (136.17±10.72% vs. 131.88±13.48%) dar reduce semnificativ efectele AP13 doar la nivelul venei porte de la şobolanii normali (103.45±9.15% vs. 112.64±6.37%). Nu am gasit modificari semnificative ale contracţiei induse de Ang II în prezenţa AP13 la nivelul venei porte de la şobolani sensibilizaţi (132.43±15.03% vs. 138.31±8.39%) sau trataţi cu lipopolizaharide (129.22±13.83% vs. 124.25±16.34%). Deci, inhibarea NOS inducibile nu modifică semnificativ contracţia indusă de Ang II singură la nivelul inelelor cu endoteliu de la şobolanii normali, alergici sau trataţi cu lipopolizaharide. De asemenea, inhibiarea NOS inducibile nu modifică efectele contractile ale Ang II în prezenţa AP13 la şobolanii cu disfuncţie endotelială asociată inflamaţiei acute sau cronice. Doar la şobolanii normali, sănătoşi, cu endoteliu indemn, blocarea NOS inducibile reduce efectele AP13 şi restabileşte contracţia indusă de Ang II. Datele anterior prezentate au fost obţinute la nivelul venei porte de şobolan tratate cu Ang II. Dar acesta este un model particular, în primul rând datorită particularităţilor funcţionale ale venei porte de şobolan. Am continuat experimentele utilizând inele de arteră aortă, arteră pulmonară, venă portă şi venă renală. Am măsurat efectele contractile iniţiate de 10 µM fenilefrină în absenţa şi în prezenţa apelin 13 (dozele cumulative). Relaxarea indusă de AP a fost maximă la nivelul inelelor de venă portă (A3) şi minimă la nivelul inelelor de arteră aortă (A2). Absenţa endoteliului intact sau pretatarea cu L-NAME previne efectele AP la nivelul arteri aorte şi venei renale. La nivelul inelelor de arteră pulmonară fără endoteliu sau a inelelor de arteră pulmonară intacte dar fără pretatarea cu L-NAME efectele relaxante ale AP sunt încă semnificative, dar de 2,5 şi respectiv 1,7 ori mai mici. Blocarea sintezei NO reduce relaxarea AP-indusă a inelelor de venă portă precontractate cu Phe, L-NAME fiind semnificativ mai puternic la nivelul inelelor fără endoteliu (reducerea efectelor AP cu aproape 90%) decât la nivelul inelelor cu

26

endoteliu intact (reducerea efectelor AP cu maxim 60%). Dependenţa efectelor AP de stimularea formării NO a fost susţinută prin monitorizarea eliberărilor de nivelul inelelor vasculare studiate cu ajutorul unui NO-metru (figura NO2).

Figura �O2. Eliberarea de �O la nivelul venei porte (VP), arteră

aortă Ao), venă renală (VR) şi arteră pulmonară (AP).

III.2.2. Implicarea oxidului nitric si a prostaglandinelor in efectele

vasodilatatorii ale ghrelinului

Rezultatele obţinute prin această metodă au arătat că la nivelul inelelor de aortă, venă renală şi venă pulmonară

27

administrarea de AP (doze cumulative) determină eliberarea susţinută şi progresiv crescândă de NO. La nivelul inelelor de arteră pulmonară, AP determină doar creşteri tranzitorii (“burst”) ale eliberărilor de NO ceea ce sugerează implicarea şi a altor factori derivaţi din endoteliu (EDHF, PGI2) în realizarea efectelor relaxante ale AP. În concluzie, putem spune că, în funcţie de tipul de vas, AP poate relaxa inelele precontractate cu Phe prin: mecanisme dependente de NO şi endoteliu (aortă şi venă renală), mecanisme NO-dependente şi parţial endotelio-independente (venă portă) şi mecanisme dependente de endoteliu şi doar parţial dependente de NO (arteră pulmonară). Ghrelinul reduce efectelele vasoconstrictoare ale Ang II la nivelul venei porte de şobolan.

28

Figura G1. Pretratarea cu ghrelin (10 microM) redice efectele

contractile ale Ang II la nivelul venei porte de şobolan. *: p<0.05

comparativ cu vasoconstrcţiaindusă de Ang II singură. Pretratarea cu ghrelin reduce efectele contractile ale Ang II (1 nM, 10 nM, 0.1 uM): 55.35±8.01% vs. 32.66±5.53%, 98.54±15.37% vs. 57.05±12.14% şi respectiv 135.14±9.48% vs. 79.60±8.44% (fig G1). Acţiunile vasorelaxante ale ghrelinului sunt reduse de L-NAME sugerâd implicarea NO în relaxarea ghrelin-indusă.

Figura G2. Efectele ghrelinului asupra Ang II în prezenţa L-

�AME (L�, 100uM) şi indometacin (Indo, 10 uM). *: comparativ

cu contracţia iniţiată de Ang II în aceleaşi condiţii.

29

La nivelul venei porte de şobolan normal, adminstrarea de ghrelin în prezenţă de L-NAME şi Indometacin are efecte mult mai reduse ceea ce sugerează implicarea NO şi a prostaglandinelor în efectele vasorelaxante ale ghrelinului (fig G2). Administrarea de ghrelin, (doze cumulative) în platou la Phe (10 microM) determină relaxarea dependentă de doză. Pretratarea cu L-NAME şi indometacin reduc, iar co-administrarea acestora blochează total efectele ghrelinului sugerâd implicarea NO şi a PG vasodilatatorii în relaxarea ghrelin-indusă a acest nivel. Efectele relaxante maxime ale ghrelinului sunt: 16.34±0.12 (% din precontracţie) la nivelul arterei aorte (10 µM ghrelin), 18.46±0.40 (% din precontracţie) la nivelul arterei pulmonare (10 µM ghrelin), 23.48±0.11 (% din precontracţie) la nivelul venei porte (1µM ghrelin) şi, respectiv, 16.34±0.11 (% din precontracţie) la nivelul venei renale (0.1 µM ghrelin).

Figura G3. Efectele relaxante

ale ghrelinului asupra

contractiei induse de fenilefrină

la nivelul artertei aorte (Ao),

arteră pulmonară (AP), venă

portă (VP) şi venă renală (VR).

Figura G5. Efectele ghrelinului

asupra contractiei induse de

fenilefrină la nivelul artertei

aorte (Ao), arteră pulmonară

(AP), venă portă (VP) şi venă

renală (VR), în prezenţa

indometacin (10µM).

30

Figura G6. Pretratarea cu ghrelin inaintea expunerii la extract de

fum de motor diesel a arterelor de şobolan. *: p<0.05

31

Figura G7. Pretratarea cu ghrelin inaintea expunerii la extract de fum de motor diesel a arterelor de şobolan sensibilizate la ovalbumină după provocare. *: p<0.05 Pentru a vedea dacă aceate efecte ale ghelinului pot avea importanţa funcţională am utilizat un model experimental bine cunoscut: contracţia arterei pulmonare declanşată de incubarea în prezenţa extractului de fum de motor diesel. Am constatat că prezenţa în baia de organ a ghrelinului (0.1µM, 1µM, ) reduce (32.81±2.27%, 22.61±2.02%, 20.35±1.72%), dependent de doză, contracţia iniţiată de extractul de fum de motor diesel. După sensibilizarea la ovalbumină, numai 1µM ghrelin are efecte semnificative (57.74±6.51%) de reducere a contracţiei iniţiate de extractul de fum de motor diesel (62.81±7.70%). Deci, ghrelinul reduce vasoconstricţia iniţiată de fenilefrină prin mecanisme dependente de NO şi prostaglandine secretate de endoteliu. De asemenea, ghrelinul poate preveni parţial vasoconstricţia pulmonară declanşată de expunerea la poluaţi.

3. Discuţii În lucrarea de faţă am studiat implicarea unor sisteme ligand – receptor orfan în funcţionalitatea căilor aeriene. Receptorii orfani cuplaţi cu proteinele G aparţin superfamiliei de receptori membranari, cu şapte domenii transmembranare, sunt recent clonaţi dar au funcţii insuficient cunoscute. Ţinȃnd cont de cercetările deja existente asupra participării unor liganzi ai receptorilor orfani în modularea reactivităţii musculaturii netede vasculare/ bronşice am utilizat în studiul de faţă agonişti şi antagonişti ai receeptorilor orfani cuplaţi cu proteine G APJ (receptor al apelin), GPR14 (receptor al urotensin II) şi GHSR (ghrelin). Receptorii cuplati cu proteine G(GPCRs) s-au dovedit a fi o tinta terapeutica pentru o larga clasa de afectiuni. Descifrarea genomului uman a permis identificarea mai multor proteine ce pot indeplini rolul receptorilor cuplati cu proteine G si care pot oferi o alternativa pentru medicatia actuala sau solutii pentru noi terapii. Receptorii cuplati cu proteine G a caror functii si

32

liganzi nu au fost inca identificate au fost denumiti receptori orfani. In această lucrare sunt prezentate rezultatele obtinute prin utilizareaineleor vasculare de şobolan. Ligandul specific al receptorului APJ a fost identificat recent si a fost denumit apelin. In tesutul de sobolan atat receptorul APJ cat si ARNm al apelinului s-au gasit in plaman, creier, inima, muschiul scheletic, rinichi, ficat (Katugampola SD si colab., 2001). Mai mult studiile de imunohistochimie si hibridizare in situ au aratat ca la nivel pulmonar genele ce codeaza receptorul APJ sunt intens exprimate (Ocarrol si colab., 2000). La sobolani cea mai puternica expresie a ARNm a receptorului APJ a fost gasita la nivel pulmonar sugerand un rol important al apelinului si receptorului APJ in activitatea sistemului respirator (Hosoya M si colab., 2000). Pe de alta parte, studii recente au aratat ca nivelul plasmatic al AP este redus la pacientii cu boli pulmonare parenchimatoase cronice (Goetze JP si colab., 2006). Cu toate acestea, nu se cunoaste nimic despre rolul sistemului AP – APJ la nivel pulmonar. Apelinul (AP) este un peptid recent identificat ca fiind ligandul endogen al receptorului APJ cuplat cu proteinele G. Receptorul APJ aparţine familiei receptorilor cu şapte domenii transmembranare a fost considerat până nu demult ca fiind un receptor „orfan”. Deşi receptorul APJ prezintă o identitate structurală de 40 - 50% pentru regiunile hidrofobe transmembranare cu receptorul angiotensinergic AT1, totuşi receptorii APJ nu leagă Ang II. (Tatemoto K şi colab., 1998; O’Dowd BF şi colab., 1993). Apelinul este rezultatul procesării porţiunii carboxi-terminale a unei preproproteină cu 77 aminoacizi şi care poate exista în multiple forme (De Falco M şi colab., 2003). Există multiple similarităţi şi între Ang II şi APJ. Atât AP cât şi Ang II reprezintă substratul fiziologic al enzimei de conversie de tip 2. (ACE2, angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase) (Vickers C şi colab., 2002). Distribuţia tisulară este aproape identică la AP şi APJ cu cea a Ang II şi receptorilor AT1 (Kleinz MJ şi colab., 2004; Chen MM şi colab., 2001; Tatemoto K şi colab., 2001). De asemenea, apelinul la fel ca şi Ang II este implicat în reglarea homeostaziei circulatorii. Astfel apelinul este capabil să reducă tonusul vascular, are efect inotrop pazitiv, şi a participă la reglarea hipotalamică a aportului de

33

lichide şi a activităţii endicrine (Kleinz MJ şi Davenport AP, 2004; Chen MM şi colab., 2003; Foldes G şi colab., 2003; Szokodi I şi colab., 2002; Taheri S şi colab., 2002; Lee DK şi colab., 2000). Totuşi, funcţiile precise ale apelinului nu au fost încă bine stabilite. De altfel, nu este clar dacă apelinul funcţionează ca hormon circulant sau ca mediator local. Apelinul a fost identificat iniţial în celulele endoteliului vascular din vasele sanguine ale cordului, rinichiului, glandei suprarenale şi plămânului uman precum şi în celulele endoteliale ale vaselor mari de conductanţă (vena safenă) (Tatemoto K 1988; Kleinz MJ, Davenport AP, 2004; Chen MM 2003; Tatemoto K 2001). În ceea ce priveşte localizarea apelinului în celulele musculare netede vasculare există mai multe opinii. Unii autori au arătat că imunoreactivitatea apelin-like nu este prezentă sau este prezentă sub limitele detectabile în celulele vasculare netede vasculare (Kleinz MJ, Davenport AP. 2004). Alţii autori au arătat că apelinul există în celulele musculare nedetede vasculare atât din cordul normal cât şi în cordul patologic (Chen MM 2003). Katugampola şi colab. (2001) au localizat receptorii APJ în cordul şi tesutul vascular uman (artere coronare normale şi aterosclerotice, aortă, artera mamară internă, artera pulmonară, grefoanele de venă safenă). Dind punct de vedere cantitativ, autoradiografic nu s-au înregistrat deosebiri majore între legarea [125I]-(Pyr1)Apelin-13 (densitatea receptorilor APJ) între media şi intima arterelor musculare, arterelor elastice şi venelor mari umane (Katugampola SD şi colab., 2001). Există numeroase date asupra implicaţiilor apelinului în reglarea tonusului vascular. Administrarea sistemică a AP13 la şobolani are ca rezultata reducerea imediată a presiunii arteriale cu o uşoară creştere a frecvenţei cardiace (Lee DK 2000). La şobolanii anesteziaţi administrarea sistemică a AP12, AP13 şi AP36 are ca rezultat reducerea presiunii arteriale medii. S-a costatat că administrarea sistemică a AP12 este urmată de creşterea tranzitorie a nitriţilor/nitraţilor plasmatici şi că inhibarea nitric oxid sintazei (NOS) previne efectele AP12 asupra presiunii arteriale ceea ce sugerează implicarea unui mecanism dependent de NO în reducerea presiunii arteriale (Tatemoto K 2001). Şobolanii trataţi cu mecamilamină (blocant ganglionar) prezintă o reducere a presiunii

34

arteriale medii şi a mean circulatory filling pressure după administrarea de AP ceea ce sugerează existenţa unei vasodilataţii arteriale şi venoase in vivo (Cheng X 2003). Informaţiile existente în literatură asupra efectelor apelinului la nivelul venelor sunt destul de reduse. (Pyr1)Apelin-13 (administrat în doze cumulative, de la 0.1 nM la 0.3 �M) produce contracţii ale venei safene umane fără endoteliu (Katugampola SD şi colab., 2001). Rezultatele nosatre arată că AP13 (doze unice cuprinse între 10 nM şi 1 �M) produc modificări semnificative ale venei porte izolate de şobolan. Diferenţele dintre rezultatele noastre şi cele obţinute de Katugampola (2001) se pot datora fie densităţii reduse de receptori APJ în celulele musculare netede portele de şobolan comparativ cu vena safenă umană, fie variaţiei efectelor AP cu specia şi/ sau ţesutul studiat. Administrarea de AP13 în pretratament reduce efectele contractile ale Ang II atât în inelele cu endoteliu cât şi în inelele fără endoteliu. AP13 are efecte inhibitorii mai reduse asupra contracţiilor induse de Ang II în prezenţa emdoteliului decât în absenţa endoteliului dar aceste diferenţe nu sunt semnificative statistic (p>0.05). Deşi receptorii APJ au fost localizaţi în special în celulele endoteliale (Tatemoto K şi colab., 1998; Kleinz MJ şi Davenport AP, 2004; Chen MM şi colab., 2003; Tatemoto K şi colab., 2001) în cazul nostru diferenţele dintrre rezultatele obţinute în cazul utilizării inelelor cu endoteliu nu sunt semnificativ diferite de rezultatele obţinute de la inelele fără endoteliu ceea ce sugerează că receptorii APJ nu sunt esenţiali pentru efectele inhibitoare ale AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul venei porte izolate de şobolan. Unii autori sugerează că apelinul ar putea acţiona prin stimularea sintezei de oxid nitric. Am investigat acestă ipoteză blocând nitric oxid sintaza (NOS) prin administrarea de L-NAME cu 15 minute înaintea administrării de AP13 şi Ang II. Am constatat că pretratarea cu L-NAME aboleşte total efectele inhibitoare ale AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu sau fără endoteliu. Deci efectele AP13 pot fi mediate de un mecanism dependent de NO aceste rezultate fiind în deplină concordanţă cu datele existente în literatură (Tatemoto K 1998;

35

Tatemoto K 2001; Ishida J 2004). În concluzie, AP13 nu modifică tonusul venei porte de şobolan prin el însuşi dar inhibă semnificativ efectele contractile ale Ang II printr-un mecanism dependent de oxidul nitric. Efectele AP13 nu sunt semnificativ modificate de prezenţa sau absenţa endoteliului intact ceea ce sugerează că AP13 acţionează în special asupra receptorilor APJ din celulele musculare netede vasculare pentru a inhiba efectele contractile ale Ang II, rolurile receptorilor APJ endoteliali necesitând viitoare clarificări. Contracţia indusă de Ang II este semnificativ mai puternică la nivelul inelelor de venă portă de şobolan fără endoteliu decât la nivelul inelelor cu endoteliu intact. Nu am înregistrat efecte vasomotorii semnificative ale AP13 administrat în diverse concentraţii la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu sau fără endoteliu. Pentru a investiga substratul efectelor inhibitoare ale AP13 asupra contracţiei induse de Ang II am administrat diferite concentraţii ale AP13 cu 15 minute înaintea Ang II. Am constatat că efectele inhibitorii ale AP13 sunt dependente de doză aşa cum reiese din figura A1. Cel mai puternic efect inhibitor asupra contracţiei iniţiate de Ang II a fost produs de 0.1µM Ap13 atât la nivelul inelelor cu endoteliu intact cât şi la nivelul inelelor dez-endotelizate. Unii autori sugerează implicarea oxidului nitric (NO) în realizarea efectelor inhibitorii ale AP13. Pentru a verifica această ipoteză am administrat 10µM L-NAME, un inhibitor neselectiv al nitric oxid sintazei (NOS) înaintea 0.1µM AP13. Am constatat că L-NAME previne efectele inhibitorii ale 0.1µM AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul venei porte izolate de şobolan. Pe de altă parte, aminoguanidina (AG) un inhibitor selectiv al formei indicibile a nitric oxid sintazei (NOS) blocheză complet efectele inhibitoare ale 0.1µM AP13 asupra contracţiei induse de Ang II atât în inelele cu endoteliu cât şi la nivelul inelelor fără endoteliu. Relaxarea indusă de AP13 a fost maximă la nivelul inelelor de venă portă şi minimă la nivelul inelelor de arteră aortă. Absenţa endoteliului intact sau pretatarea cu L-NAME previne efectele AP la nivelul arteri aorte şi venei renale. La nivelul inelelor de arteră pulmonară fără endoteliu sau a inelelor de arteră pulmonară intacte dar fără pretatarea cu L-NAME efectele relaxante ale AP sunt

36

încă semnificative, dar de 2,5 şi respectiv 1,7 ori mai mici. Blocarea sintezei NO reduce relaxarea AP-indusă a inelelor de venă portă precontractate cu Phe, L-NAME fiind semnificativ mai puternic la nivelul inelelor fără endoteliu (reducerea efectelor AP cu aproape 90%) decât la nivelul inelelor cu endoteliu intact (reducerea efectelor AP cu maxim 60%). Dependenţa efectelor AP de stimularea formării NO a fost susţinută prin monitorizarea eliberărilor de nivelul inelelor vasculare studiate cu ajutorul unui NO-metru. Rezultatele obţinute prin această metodă au arătat că la nivelul inelelor de aortă, venă renală şi venă pulmonară administrarea de AP (doze cumulative) determină eliberarea susţinută şi progresiv crescândă de NO. La nivelul inelelor de arteră pulmonară, AP determină doar creşteri tranzitorii (“burst”) ale eliberărilor de NO ceea ce sugerează implicarea şi a altor factori derivaţi din endoteliu (EDHF, PGI2) în realizarea efectelor relaxante ale AP (figura A4). În concluzie, putem spune că, în funcţie de tipul de vas, AP poate relaxa inelele precontractate cu Phe prin: mecanisme dependente de NO şi endoteliu (aortă şi venă renală), mecanisme NO-dependente şi parţial endotelio-independente (venă portă) şi mecanisme dependente de endoteliu şi doar parţial dependente de NO (arteră pulmonară). Ghrelinul a fost initial descoperit la nivelul stomacului şi apoi identificat ca ligand endogen al unui receptor orfan cuplat cu protein G numit GHR-S (Kojima M şi colab., 1999). Studiile ce au urmat au arătat că acest peptid este un puternic stimulator al secreţiei hormonului de creştere (Nagaya N şi colab., 2001) , şi participă la reglarea metabolismului glucidic şi a celui energetic (Ruskoaho H şi colab. 1997). Studii recente au prezentat ghrelinul ca reglator al dezechilibrelor metabolice din cordul insufucient precum şi a presiunii arteriale (Nagaya N şi colab., 2001). Receptorul specific este localizat la nivelul următoarelor organe: plămân, intestin, pancreas, cord/coronare preum şi la nivelul ţesutului adipos (Katugampola SD şi colab., 2001; Kojima M şi colab., 1999). Pemberton şi colab. (2004) au arătat că la nivelul coronarelor de şobolan ghrelinul este sintetizat la nivel cardiac şi are efecte vasoconstrictoare dependente de Ca2+ şi PKC comparatie cu cele ale endotelinului. Studii realizate utilizându-se vase umane au arătat că

37

in vivo ghrelinul poate acţiona ca vasorelaxant, efectele sale putând fi NO-independente (Okumura H şi colab., 2002; Nagaya N şi colab., 2001). In vitro, la nivelul arterei mamare interne isolate şi dezendotelializate, ghrelinul este capabil să antagonizeze vasoconstricţia ET-1 – indusă (Wiley KE şi Davenport AP, 2002). De asemenea, administrarea de ghrelin în bolus, la om, determină reducerea presiunii arteriale medii (Nagaya N şi colab., 2001). La pacienţii cu sidrom metabolic injectarea de ghrelin amplifică eliberara endotelială Ach – indusă de NO (Tesauro şi colab., 2005). Rezultatele noastre au arătat că ghrelinul reduce efectelele vasoconstrictoare ale Ang II la nivelul venei porte de şobolan. Acţiunile vasorelaxante ale ghrelinului sunt reduse de L-NAME sugerâd implicarea NO în relaxarea ghrelin-indusă. La nivelul venei ombilicale umane, adminstrarea de ghrelin în platou la Phe determină relaxarea dependentă de doză. Pretratarea cu L-NAME şi indometacin reduc, iar co-administrarea acestora blochează total efectele ghrelinului sugerâd implicarea NO şi a PG vasodilatatorii în relaxarea ghrelin-indusă a acest nivel. Urotensin-II (U-II) este un peptid vasoactiv ciclic‚ somatostatin-like’ identificat iniţial în măduva peştilor. Ames şi colab. (1999) au stabilit că U-II este ligandul endogen al receptorului orfan GPR14 exprimat în principal la nivel cardiovascular, dar şi a nivelul vezicii rinare şi sistemului nervos. Cuplarea U-II – GPR-14 este cuplată cu mobilizarea calcului. Recent U-II uman (hU-II) a fost identificat ca ligand selectiv al unui nou receptor cuplat cu proteinele G omolog (75%) receptorului “orfan” SENR sau GPR14 de la sobolan (Maguire JJ si Davenport AP, 2002). La om, receptorul pentru U-II si ARN-ul mesager specific sunt bine exprimati la nivelul inimii si vaselor, creierului, glandelor endocrine, plamanului, muschilor (Ames RS si colab, 1999, Li Q si colab, 1999, Maguire JJ si colab, 2000). Prin northen blot si reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) a fost pusa in evidenta prezenta ARN- ului mesager al receptorului U II la nivelul traheei, bronhiilor si parenchimului pulmonar al pisicii (Behm DJ si colab., 2005). Aceasta distributie a GPR14 sugereaza implicarea acestuia in multe procese fiziologice. U-II are efecte puternice vasoconstrictoare

38

asupra arterelor mari coronare, pulmonare si carotide izolate de la diverse specii cum ar fi sobolani, caini, porci si maimute (Maclean MR si colab., 2000, Douglas SA si colab., 2003). Se presupune ca U-II influenteaza functia pulmonara prin modularea tonusului muschiului neted al bronhiilor (Maguire JJ si Davenport AP, 2002; Behm DJ si colab., 2005). S-a aratat ca la primate hU-II prezinta efecte contractile la nivelul muschilor netezi ai bronhiilor si vaselor pulmonare de la primate. Contractia maximala determinata de U-II este din ce in ce mai puternica pe masura ce diametrul cailor aeriene este mai mic. Astfel, efectele contractile ale U II variaza de la 9% din contractia produsa de 10 microM carbacol la nivelul traheei la 41% la nivelul bronhiilor mici. hU II contracta puternic si cu o eficacitate similara atat arterele pulmonare cat si ramurile acestora. hU II contracta inele de vena pulmonara cu o eficacitate din ce in ce mai redusa pe masura ce ne departam de atriul stang (Hay DW si colab., 2000). Recent, Chen YH si colab (2004) au aratat ca, la nivelul celulelor musculare netede de sobolan, U-II este un mitogen puternic. La om, hU-II se găseşte la nivelul cordului, peretelui vascular, sistemului nervos şi ţesutului endocrin şi are efect vasoconstrictor. In vivo, hU-II creşte rezistenţa vasculară periferică. Contracţia indusă de 10 nM U-II la nivelul aortei de şobolan este amplificată de pretratarea cu 10(-8) M ET-1 prin mecanisme independente de Ca+2 extracelular (Itoh şi colab., 1999). Yano K Şi colab. (1994) au raportat efecte constrictoare ale UII şi la nivelul musculaturii netede digestive sau de la nivelul tractului urinar de broască. U-I are efcte vasodilatatoare la nivelul vaselor placentare fetale umane in vitro (Leitch şi colab., 1998). U-II are efecte contractile la nivelul aterelor pulmonare de şobolan. Contracţia U-II – indusă este amplificată de lipsa endoteliului, pretratarea cu ET1 sau cu L-NAME (MacLean şi colab., 2000). De asemenea, contraţa U-II – indusă este mai puternică la nivelul arterelor pulmonare provenite de la şobolanii cu HTP, după 2 saptamani de hipoxie. Bottrill şi colab. (2000) au arătat că la nivelul arterelor mezenterice mici cu endoteliu intact, precontractate cu metoxamina, U-II are efecte relaxante endotelio-dependente, potenţate de L-NAME şi abolite de KCl (inhibitor al EDHF). U-II ese un puternic constrictor al aortei de şobolan. Efectele

39

contractile nu sunt semnificativ modificate de prezenţa L-NAME sau îndepărtarea endoteliului. U-II nu modifică tonusul inelelor de aortă precontratactate cu serotonină. hU-II contractă inelele de arteră coronară stângă descendentă cu endoteliu intact atât în condiţii bazale cât şi după precontracţia cu 5HT. Efectul contractil a fost amplificat de îndepartarea endoteliului. Studiile noastre au arătat că (fig U1) la nivelul venei ombilicale umane cu endoteliu precontractate cu 10 microM Phe, hU-II (doze cumulative) are efecte relaxante. Aceste efecte relaxante sunt amplificate de SOD (superoxid dismutază) şi reduse de L-NAME şi AG (aminoguanidină). La nivelul venei porte de şobolan fara endoteliu U-II amplifică contracţia Ang II – indusă. Deci, in lipsa endoteliului, efectelor contractile proprii li se poate adauga si amplificarea efectelor altor substante vasoconstrictoare. Administrarea de U_II (1 µM) este urmata de eliberarea de NO. Îndepărtarea endoteliului sau pretratarea cu indometacin şi/sau L-NAME releva efectele U-II sugerând dependenţa de endoteliu a efectelor vasomotorii ale U-II înregistrate la acest nivel. Aceste rezultate sunt în concordanţa cu cele obţinute de Katano (2000) la nivelul arterelor coronare umane. Pe de altă parte am constatat că U-II are efecte contractile marcate la nivelul arterelor pulmonare fara endoteliu provenite de la şobolanii sensibilizaţi la ovalumină. Se pare că, hU-II reuşeşte sa adauge la disfuncţia endotelială (scăderea eliberărilor de NO) şi creşterea sintezei de ROX evidenţiată atât indirect prin utilizarea SOD. .

4. Concluzii

1. Apelin 13 (AP13), urotensin II sau ghrelin nu au efecte vasoconstrictorii semnificative ale la nivelul inelelor de arteră aortă sau venă portă de şobolan cu endoteliu intact.

2. Administrarea de AP13 reduce efectele contractile ale Ang II atât în inelele cu endoteliu cât şi în inelele fără endoteliu. Pretratarea cu amonoguanidină sau L-NAME aboleşte total efectele inhibitoare ale AP13 asupra contracţiilor induse de Ang II la nivelul inelelor de venă portă de şobolan cu sau fără endoteliu. Dependenţa efectelor AP de stimularea formării NO a fost susţinută prin monitorizarea

40

eliberărilor de nivelul inelelor vasculare studiate cu ajutorul unui NO-metru. La nivelul inelelor de aortă, venă renală şi venă pulmonară administrarea de AP13 determină eliberarea susţinută şi progresiv crescândă de NO.

3. La nivelul inelelor de arteră pulmonară, AP determină doar creşteri tranzitorii (“burst”) ale eliberărilor de NO ceea ce sugerează implicarea şi a altor factori derivaţi din endoteliu (EDHF, PGI2) în realizarea efectelor relaxante ale AP.

4. În funcţie de tipul de vas, AP poate relaxa inelele precontractate cu fenilefrină prin mecanisme dependente de NO şi endoteliu (aortă şi venă renală), mecanisme NO-dependente şi parţial endotelio-independente (venă portă) şi mecanisme dependente de endoteliu şi doar parţial dependente de NO.

5. Ghrelinul reduce efectelele vasoconstrictoare ale Ang II la nivelul venei porte de şobolan. Acţiunile vasorelaxante ale ghrelinului sunt reduse de L-NAME sugerâd implicarea NO în relaxarea ghrelin-indusă.

6. La nivelul venei porte, adminstrarea de ghrelin în platou la feniefrină determină relaxarea dependentă de doză. Pretratarea cu L-NAME şi indometacin reduc, iar co-administrarea acestora blochează total efectele ghrelinului sugerâd implicarea NO şi a PG vasodilatatorii în relaxarea ghrelin-indusă a acest nivel.

7. Urotensina II (U-II) este un puternic constrictor al aortei de şobolan fără endoteliu. În aceste condiţii U-II amplifică vasoconstricţia Ang II-indusă. Deci, în lipsa endoteliului, efectelor contractile proprii li se poate adauga si amplificarea efectelor altor substante vasoconstrictoare.

8. La nivelul venei porte cu endoteliu intact precontractate cu feniefrină, U-II (doze cumulative) are efecte relaxante. Aceste efecte relaxante sunt amplificate de SOD (superoxid dismutază) şi reduse de L-NAME şi AG (aminoguanidină). La nivelul venei porte de şobolan fara endoteliu U-II amplifică contracţia Ang II – indusă. Îndepărtarea endoteliului sau pretratarea cu indometacin şi/sau L-NAME releva efectele U-II sugerând dependenţa de endoteliu a efectelor vasomotorii ale U-II înregistrate la acest nivel.

41

9. U-II are efecte contractile marcate la nivelul arterelor pulmonare fara endoteliu provenite de la şobolanii sensibilizaţi la ovalumină. Se pare că, U-II reuşeşte sa adauge la disfuncţia endotelială şi creşterea sintezei de ROX evidenţiată indirect prin utilizarea SOD.

10. Efectele relaxinului sunt dependente de eliberarea de NO sintetizat de NOS, atat de cele constitutive cât şi de cele inducibile iar pretratarea cu relaxin reuşeşte să amplifice durată emisiei de NO AP13 - induse.

11. Ţinând cont de implicarea radicalilor liberi de oxigen în vasoconstricţia indusă de Ang II, doctoranda a studiat efectele resistinului asupra contracţiei ANG II – induse şi eventuala implicare a radicalilor liberi de oxigen. Rezistinul amplifică contracţia Ang II – indusă, efecte anulate de prezenta SOD. Incubarea cu U-II restabileşte efectele rezistinului la nivelul arterei aorte de şobolan.

12. Atȃt Ang1-7 cȃt si ghrelin au efecte vasodilatatoare. Mai mult, efectele vasodilatatoare ale ghrelin sunt potenţate de Ang1-7 printr-un mechanism mediat de eliberarea locala de prostaglandine vasodilatatoare (in special) dar si de oxid nitric.

13. La nivelul arterelor pulmonare provenite de la sobolanii cu hipertensiune pulmonara monocrotalin – indusa s-a constatat o reducere semnificativa a eliberarii de NO sub actiunea U-II. La sobolanii cu hipertensiune pulmonara, reducerea cantitatii de NO eliberate poate fi explicata prin reducerea expresiei la nivel endotelial a receptorilor GPR14.

14. In cazul apelinului, nu a fost remarcata nici reducerea semnificativa a cantitatii de NO eliberate si nici a receptorilor APJ, ceea ce sugereaza ca efectele vasodilatatoare ale AP13 se datoreaza doar partial NO, rezultate ce confirma datele obtinute prin miografie. 15. Repetand experimentele la sobolanii astmatici sau cu hipertensiune pulmonara dar care au fost pretratati ci losartan am constatat ca nu mai exista diferente semnificative in eliberarea de NO de catre AP13 sau U-II, ceea ce confirma ipoteza unei interrelatii intre cele trei sisteme peptidergice studiate.

42

16. Pre-tratarea cu U-II determină cresterea amplitudinii contracţiilor induse de administrarea de angiotensinogen la nivelulvaselor pulmonare a şobolanilor sensibilizati.

17. Răspunsul contractil la Ang I şi Ang II a şobolanilor obezi este semnificativ crescut comparativ cu şobolanii normali în special la nivelul venei porte şi arterelor pulmonare. Deci, activarea SRA local, vascular, poate amplifica răspunsul vasoconstrictor al arterelor şi venelor, atât din circulaţia sistemică cât şi din circulaţia pulmonară, la şobolanii obezi.

18. Sistemul apelin - receptori APJ are un rol protectiv prin antagonizarea amplificării determinată de obezitate a vasoconstricţiei indusă de angiotensine.

19. Importanţa funcţională a sistemului AP/receptor APJ în reglarea tonusului vascular depinde de teritoriul vascular studiat, înregistrându-se diferenţe atât între artere şi vene cât şi între vasele circulaţiei pulmonare şi sistemice. Rezultatele obţinute indică o creştere a răspunsului contractil la fenilefrină a şobolanilor obezi comparativ cu şobolanii normali în special la nivelul venei porte şi arterelor pulmonare.

20. Efectele benefie ale apelin şi ghrelin sugerează posibila utilizare a sistemelor apeli/receptor APJ şi ghrelin/receptor GHSR în prevenirea efectelor activării SRA local vascular în diferite circumstanţe patologice ce asociază procese inflamatorii acute sau cronice.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Adya R, Tan BK, Punn A, Chen J, Randeva HS: Visfatin induces human

endothelial VEGF and MMP-2/9 production via MAPK and PI3K/Akt signalling pathways: novel insights into visfatin-induced angiogenesis. Cardiovasc Res 2008, 78:356-365.

Andersen CU, Markvardsen LH, Hilberg O, Simonsen U. Pulmonary apelin levels and effects in rats with hypoxic pulmonary hypertension. Respir Med. 2009;103(11):1663-1671.

Andraws R, Brown DL. Effect of inhibition of the renin-angiotensin system on development of type 2 diabetes mellitus (meta-analysis of randomized trials). Am J Cardiol 2007;99:1006–1012.

43

Andreas F, D´Agostino R, Howard G, Mykkanen L, Russel T, Haffner S. Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome: the insulin resistance atherosclerosis study (IRAS). Circulation. 2000;102:42-47.

Anghel SI, Wahli W. Fat poetry: a kingdom for PPAR gamma. Cell Res. 2007;17(6):486-511.

Antoniades C, Antonopoulos AS, Tousoulis D, Stefanadis C: Adiponectin: from obesity to cardiovascular disease. Obes Rev 2009, 10:269-279.

Ardanaz N, Pagano PJ: Hydrogen peroxide as a paracrine vascular mediator: regulation and signaling leading to dysfunction. Exp Biol Med (Maywood) 2006, 231:237-251.

Asferg C, Møgelvang R, Flyvbjerg A, Frystyk J, Jensen JS, Marott JL, Appleyard M, Jensen GB, Jeppesen J: Leptin, not adiponectin, predicts hypertension in the Copenhagen City Heart Study. Am J Hypertens 2010, 23:327-333.

Avram AS, Avram MM, James WD: Subcutaneous fat in normal and diseased states: 2. Anatomy and physiology of white and brown adipose tissue. J Am Acad Dermatol 2005, 53:671-683.

Bahia L, Aguiar LG, Villela N, Bottino D, Godoy-Matos AF, Geloneze B, Tambascia M, Bouskela E. Relationship between adipokines, inflammation, and vascular reactivity in lean controls and obese subjects with metabolic syndrome. Clinics (Sao Paulo). 2006;61(5):433-440.

Barak Y, Nelson MC, Ong ES, Jones YZ, Ruiz-Lozano P, Chien KR, Koder A, Evans RM: PPARγ is required for placental, cardiac, and adipose tissue development. Mol Cell 1999, 4:585-595.

Barter PJ, Kastelein JJ. Targeting cholesteryl ester transfer protein for the prevention and management of cardiovascular disease. J Am Coll Cardiol 2006;47: 492–499.

Beltowski J: Role of leptin in blood pressure regulation and arterial hypertension. J Hypertens 2006, 24:789-801.

Bluher M, Williams CJ, Klo¨ ting N, Hsi A, Ruschke K, Oberbach A, Fasshauer M, Berndt J, Scho¨n MR, Wolk A, Stumvoll M, Mantzoros CS. Gene expression of adiponectin receptors in human visceral and subcutaneous adipose tissue is related to insulin resistance and metabolic parameters and is altered in response to physical training. Diabetes Care 2007;30:3110–3115.

Bots ML, Visseren FL, Evans GW, Riley WA, Revkin JH, Tegeler CH, Shear CL, Duggan WT, Vicari RM, Grobbee DE, Kastelein JJ RADIANCE 2 Investigators. Torcetrapib and progression of carotid intima-media thickness in mixed dyslipidemia. The RADIANCE II study. Lancet 2007;370:153–160.

Brian JE Jr, Faraci FM: Tumor necrosis factor-α-induced dilatation of cerebral arterioles. Stroke 1998, 29:509-515.

Bulló M, García-Lorda P, Megias I, Salas-Salvadó J: Systemic inflammation, adipose tissue tumor necrosis factor, and leptin expression. Obes Res 2003, 11:525-531.

44

Buras, J., Reenstra, W. R., Orlow, D., Horton, E. S. and Veves, A. (2005) Troglitazone-induced changes in adiponectin do not affect endothelial function in diabetes. Obes. Res. 13, 1167–1174

Burnett MS, Devaney JM, Adenika RJ, Lindsay R, Howard BV: Cross-sectional associations of resistin, coronary heart disease, and insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab 2006, 91:64-68.

Buyse M, Viengchareun S, Bado A, Lombès M: Insulin and glucocorticoids differentially regulate leptin transcription and secretion in brown adipocytes. FASEB J 2001, 15:1357-1366.

Cai RC, Wei L, DI JZ, Yu HY, Bao YQ, Jia WP: Expression of omentin in adipose tissues in obese and type 2 diabetic patients. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2009, 89:381-384.

Cannon B, Nedergaard J: Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev 2004, 84:277-359.

Cao Y, Tao L, Yuan Y, Jiao X, Lau WB, Wang Y, Christopher T, Lopez B, Chan L, Goldstein B, Ma XL: Endothelial dysfunction in adiponectin deficiency and its mechanisms involved. J Mol Cell Cardiol 2009, 46:413-419.

Charles CJ: Putative role for apelin in pressure/volume homeostasis and cardiovascular disease. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2007, 5:1-10.

Chen C, Jiang J, Lü JM, Chai H, Wang X, Lin PH, Yao Q: Resistin decreases expression of endothelial nitric oxide synthase through oxidative stress in human coronary artery endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2010, 299:H193-H201.

Chen MP, Tsai JC, Chung FM, Yang SS, Hsing LL, Shin SJ, Lee YJ. Hypoadiponectinemia is associated with ischemic cerebrovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:821–826.

Chen, H., Montagnani, M., Funahashi, T., Shimomura, I. and Quon, M. J. (2003) Adiponectin stimulates production of nitric oxide in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 278, 45021–45026

Cheranov SY, Jaggar JH: TNF-α dilates cerebral arteries via NAD(P)H oxidase-dependent Ca2+ spark activation. Am J Physiol Cell Physiol 2006, 290:C964-C971.

Chow WS, Cheung BMY, Tso AWK, Xu A, Wat NMS, Fong CHY, Ong LHY, Tam S, Tan KCB, Janus ED, Lam TH, Lam KSL: Hypoadiponectinemia as a predictor for the development of hypertension: a 5-year prospective study. Hypertension 2007, 49:1455-1461.

Chudek J, Wiecek A: Adipose tissue, inflammation and endothelial dysfunction. Pharmacol Rep 2006, 58(Suppl):81-88.

Cypess AM, Lehman S, Williams G, Tal I, Rodman D, Goldfine AB, Kuo FC, Palmer EL, Tseng YH, Doria A, Kolodny GM, Kahn CR: Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med 2009, 360:1509-1517.

Dahl TB, Yndestad A, Skjelland M, Øie E, Dahl A, Michelsen A, Damås JK, Tunheim SH, Ueland T, Smith C, Bendz B, Tonstad S, Gullestad L, Frøland

45

SS, Krohg-Sørensen K, Russell D, Aukrust P, Halvorsen B: Increased expression of visfatin in macrophages of human unstable carotid and coronary atherosclerosis: possible role in inflammation and plaque destabilization. Circulation 2007, 115:972-980.

Das UN: Is angiotensin-II an endogenous pro-inflammatory molecule? Med Sci Monit 2005, 11:RA155-RA162.

de Souza Batista CM, Yang RZ, Lee MJ, Glynn NM, Yu DZ, Pray J, Ndubuizu K, Patil S, Schwartz A, Kligman M, Fried SK, Gong DW, Shuldiner AR, Pollin TI, McLenithan JC: Omentin plasma levels and gene expression are decreased in obesity. Diabetes 2007, 56:1655-1661.

Dick GM, Katz PS, Farias M, Morris M, James J, Knudson JD, Tune JD: Resistin impairs endothelium-dependent dilation to bradykinin, but not acetylcholine, in the coronary circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006, 291:H2997-H3002.

Dumitriu IL, Petrescu BC, Gurzu MB, Gurzu B, Slatineanu SM. New insight into nitric oxide involvement in regulation of airways smooth muscle tone. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2007; 111(2): 454-459

Eckel RH, Yost TJ, Jensen DR. Alterations in lipoprotein lipase in insulin resistance. Int J Obes Relat Metab Disord 1995;19(Suppl. 1):S16–S21.

Engeli S, Bo¨hnke J, Gorzelniak K, Janke J, Schling P, Bader M, Luft FC, Sharma AM. Weight loss and the renin-angiotensin-aldosterone system. Hypertension 2005; 45:356–362.

Gentile MT, Vecchione C, Marino G, Aretini A, Di Pardo A, Antenucci G, Maffei A, Cifelli G, Iorio L, Landolfi A, Frati G, Lembo G: Resistin impairs insulin-evoked vasodilation. Diabetes 2008, 57:577-583.

Gil-Longo J, González-Vázquez C: Characterization of four different effects elicited by H2O2 in rat aorta. Vascul Pharmacol 2005, 43:128-138.

Goldstein BJ, Scalia RG, Ma XL. Protective vascular and myocardial effects of adiponectin. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2009;6(1):27-35.

Greenstein AS, Khavandi K, Withers SB, Sonoyama K, Clancy O, Jeziorska M, Laing I, Yates AP, Pemberton PW, Malik RA, Heagerty AM: Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation 2009, 119:1661-1670.

Gurzu B, Costuleanu M, Slatineanu SM, Ciobanu A, Petrescu G. Are multiple angiotensin receptor types involved in angiotensin (1-7) actions on isolated rat portal vein. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2005 Sep;6(2):90-95.

Gurzu B, Petrescu BC, Costuleanu M, Petrescu G. Interactions between apelin and angiotensin II on rat portal vein. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2006;7(4):212-216.

Gurzu B, Zugun FE, Costuleanu M, Mihaescu T, Carasevici E, Petrescu G. Adipokines involvement in lung function. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2008;112(3):719-725.

Gurzu B., Petrescu B.C., Dumitriu Irina Luciana, Mihai A.C., Slatineanu S.M. Local generation of angiotensin in isolated rat pulmonary vessels. In: Strbak V

46

(Ed). Selected Papers from the Joint Meeting of the Slovak Physiological Society, the Physiological Society and the Federation of European Physiological Societies, Bratislava, Slovak Republic, September 11- 14, 2007. Medimond International Proceedings 2007; 67-71.

Gustafson B: Adipose tissue, inflammation and atherosclerosis. J Atheroscler Thromb 2010, 17:332-341.

Hajer GR, van der Graaf Y, Olijhoek JK, Edlinger M, Visseren FLJ. Low plasma levels of adiponectin are associated with low risk for future cardiovascular events in patients with clinical evident vascular disease. Am Heart J 2007;154:750.e1–7.

Hajer GR, van Haeften TW, Visseren FL. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. Eur Heart J. 2008 ;29(24):2959-71.

Hajer GR, van Haeften TW, Visseren FL: Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. Eur Heart J 2008, 29:2959-2971.

Hector J, Schwarzloh B, Goehring J, Strate TG, Hess UF, Deuretzbacher G, Hansen-Algenstaedt N, Beil FU, Algenstaedt P: TNF-α alters visfatin and adiponectin levels in human fat. Horm Metab Res 2007, 39:250-255.

Hercule HC, Schunck WH, Gross V, Seringer J, Leung FP, Weldon SM, da Costa Goncalves AC, Huang Y, Luft FC, Gollasch M: Interaction between P450 eicosanoids and nitric oxide in the control of arterial tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009, 29:54-60.

Higuchi K, Masaki T, Gotoh K, Chiba S, Katsuragi I, Tanaka K, Kakuma T, Yoshimatsu H: Apelin, an APJ receptor ligand, regulates body adiposity and favors the messenger ribonucleic acid expression of uncoupling proteins in mice. Endocrinology 2007, 148:2690-2697.

Hopkins TA, Ouchi N, Shibata R, Walsh K. Adiponectin actions in the cardiovascular system. Cardiovasc Res 2007;74:11–18.

Hosogai N, Fukuhara A, Oshima K, Miyata Y, Tanaka S, Segawa K, Furukawa S, Tochino Y, Komuro R, Matsuda M, Shimomura I: Adipose tissue hypoxia in obesity and its impact on adipocytokine dysregulation. Diabetes 2007, 56:901-911.

Hosoya M, Kawamata Y, Fukusumi S, Fujii R, Habata Y, Hinuma S, Kitada C, Honda S, Kurokawa T, Onda H, Nishimura O, Fujino M. Molecular and functional characteristics of APJ. Tissue distribution of mRNA and interaction with the endogenous ligand apelin. J Biol Chem. 2000;275(28):21061-21067.

Japp AG, Cruden NL, Amer DAB, Li VKY, Goudie EB, Johnston NR, Sharma S, Neilson I, Webb DJ, Megson IL, Flapan AD, Newby DE: Vascular effects of apelin in vivo in man. J Am Coll Cardiol 2008, 52:908-913.

Japp AG, Newby DE: The apelin-APJ system in heart failure: pathophysiologic relevance and therapeutic potential. Biochem Pharmacol 2008, 75:1882-1892.

Kagiyama S, Fukuhara M, Matsumura K, Lin YZ, Fuji K, Iida M: Central and peripheral cardiovascular actions of apelin in conscious rats. Regul Pept 2005, 125:55-59.

47

Kasuga M, Accili D, Tobe K, Ueki K, Nagai R, Kadowaki T. Insulin/Foxo1 pathway regulates expression levels of adiponectin receptors and adiponectin sensitivity. J Biol Chem 2004;279:30817–30822.

Katugampola SD, Maguire JJ, Matthewson SR, Davenport AP. [(125)I]-(Pyr(1))Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in man. Br J Pharmacol. 2001;132(6):1255-1260.

Katugampola SD, Maguire JJ, Matthewson SR, Davenport AP: [125I]-(Pyr1)Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in man. Br J Pharmacol 2001, 132:1255-1260.

Ketonen J, Shi J, Martonen E, Mervaala E: Periadventitial adipose tissue promotes endothelial dysfunction via oxidative stress in diet-induced obese C57Bl/6 mice. Circ J 2010, 74:1479-1487.

Kim SR, Bae YH, Bae SK, Choi KS, Yoon KH, Koo TH, Jang HO, Yun I, Kim KW, Kwon YG, Yoo MA, Bae MK: Visfatin enhances ICAM-1 and VCAM-1 expression through ROS-dependent NF-κB activation in endothelial cells. Biochim Biophys Acta 2008, 1783:886-895.

Kimura K, Tsuda K, Baba A, Kawabe T, Boh-oka S, Ibata M, Moriwaki C, Hano T, Nishio I: Involvement of nitric oxide in endothelium-dependent arterial relaxation by leptin. Biochem Biophys Res Commun 2000, 273:745-749.

Kintscher U, Hartge M, Hess K, Foryst-Ludwig A, Clemenz M, Wabitsch M, Fischer-Posovszky P, Barth TFE, Dragun D, Skurk T, Hauner H, Bluher M, Unger T, Wolf A-M, Knippschild U, Hombach V, Marx N. T-lymphocyte infiltration in visceral adipose tissue: A primary event in adipose tissue inflammation and the development of obesity-mediated insulin resistance. Atertio Thromb Vasc Biol 2008;28(7):1304-1310.

Knock GA, Snetkov VA, Shaifta Y, Connolly M, Drndarski S, Noah A, Pourmahram GE, Becker S, Aaronson PI, Ward JP: Superoxide constricts rat pulmonary arteries via Rho-kinase-mediated Ca2+ sensitization. Free Radic Biol Med 2009, 46:633-642.

Lee DL, Sturgis LC, Labazi H, Osborne JB Jr, Fleming C, Pollock JS, Manhiani M, Imig JD, Brands MW: Angiotensin II hypertension is attenuated in interleukin-6 knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006, 290:H935-H940.

Lee JH, Chan JL, Yiannakouris N, Kontogianni M, Estrada E, Seip R, Orlova C, Mantzoros CS: Circulating resistin levels are not associated with obesity or insulin resistance in humans and are not regulated by fasting or leptin administration: cross-sectional and interventional studies in normal, insulin-resistant, and diabetic subjects. J Clin Endocrinol Metab 2003, 88:4848-4856.

Lee RM, Lu C, Su LY, Gao YJ: Endothelium-dependent relaxation factor released by perivascular adipose tissue. J Hypertens 2009, 27:782-790.

48

Lembo G, Vecchione C, Fratta L, Marino G, Trimarco V, d'Amati G, Trimarco B: Leptin induces direct vasodilation through distinct endothelial mechanisms. Diabetes 2000, 49:293-297.

Leung YM, Kwan CY: Dual vascular effects of leptin via endothelium: hypothesis and perspective. Chin J Physiol 2008, 51:1-6.

Li R, Lu W, Jia J, Zhang S, Shi L, Li Y, Yang Q, Kan H. Relationships between indices of obesity and its cardiovascular comorbidities in a chinese population. Circ J 2008;72:973–978.

Loffreda S, Yang SQ, Lin HZ, Karp CL, Brengman ML, Wang DJ, Klein AS, Bulkley GB, Bao C, Noble PW, Lane MD, Diehl AM: Leptin regulates proinflammatory immune responses. FASEB J 1998, 12:57-65.

Löhn M, Dubrovska G, Lauterbach B, Luft FC, Gollasch M, Sharma AM: Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB J 2002, 16:1057-1063.

Lolmède K, Durand de Saint Front V, Galitzky J, Lafontan M, Bouloumié A: Effects of hypoxia on the expression of proangiogenic factors in differentiated 3T3-F442A adipocytes. Int J Obes Relat Metab Disord 2003, 27:1187-1195.

Lu H, Boustany-Kari CM, Daugherty A, Cassis LA: Angiotensin II increases adipose angiotensinogen expression. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007, 292:E1280-E1287.

Lucchesi PA, Belmadani S, Matrougui K: Hydrogen peroxide acts as both vasodilator and vasoconstrictor in the control of perfused mouse mesenteric resistance arteries. J Hypertens 2005, 23:571-579.

Lumeng CN, Bodzin JL, Saltiel AR. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest 117(1):175-184, 2007.

Lumeng CN, Maillard I, Saltiel AR. T-ing up inflammation in fat. Nat Med 2009;15(8):846-847.

Luscher, T. F. (1994) The endothelium and cardiovascular disease: a complex relation. N. Engl. J. Med. 330, 1081–1083

Maenhaut N, Boydens C, Van de Voorde J: Hypoxia enhances the relaxing influence of perivascular adipose tissue in isolated mice aorta. Eur J Pharmacol 2010, 641:207-212.

Marvar PJ, Hammer LW, Boegehold MA: Hydrogen peroxide-dependent arteriolar dilation in contracting muscle of rats fed normal and high salt diets. Microcirculation 2007, 14:779-791.

Massiera F, Bloch-Faure M, Ceiler D, Murakami K, Fukamizu A, Gasc JM, Quignard-Boulange A, Negrel R, Ailhaud G, Seydoux J, Meneton P, Teboul M. Adipose angiotensinogen is involved in adipose tissue growth and blood pressure regulation. FASEB J 2001;15:2727–2729.

Massiéra F, Bloch-Faure M, Ceiler D, Murakami K, Fukamizu A, Gasc JM, Quignard-Boulange A, Negrel R, Ailhaud G, Seydoux J, Meneton P, Teboul M: Adipose angiotensinogen is involved in adipose tissue growth and blood pressure regulation. FASEB J 2001, 15:2727-2729.

49

Matsuda K, Teragawa H, Fukuda Y, Nakagawa K, Higashi Y, Chayama K: Leptin causes nitric-oxide independent coronary artery vasodilation in humans. Hypertens Res 2003, 26:147-152.

Miller M, Seidler A, Moalemi A, Pearson TA. Normal triglyceride levels and coronary artery disease events: the Baltimore Coronary Observational Long-Term Study. J Am Coll Cardiol 1998;31:1252–1257.

Minghini A, Britt LD, Hill MA: Interleukin-1 and interleukin-6 mediated skeletal muscle arteriolar vasodilation: in vitro versus in vivo studies. Shock 1998, 9:210-215.

Mitu F, Dima-Cozma C, Leon M, Jaba I. Inflammation and the metabolic syndrome. Medicina Interna. 2009;3:33-38.

Mohamed-Ali V, Pinkney JH, Coppack SW: Adipose tissue as an endocrine and paracrine organ. Int J Obes Relat Metab Disord 1998, 22:1145-1158

Momin AU, Melikian N, Shah AM, Grieve DJ, Wheatcroft SB, John L, El Gamel A, Desai JB, Nelson T, Driver C, Sherwood RA, Kearney MT: Leptin is an endothelial-independent vasodilator in humans with coronary artery disease: evidence for tissue specificity of leptin resistance. European Heart Journal 2006, 27:2294-2299.

Moreno JM, Rodriguez Gomez I, Wangensteen R, Perez-Abud R, Duarte J, Osuna A, Vargas F: Mechanisms of hydrogen peroxide-induced vasoconstriction in the isolated perfused rat kidney. J Physiol Pharmacol 2010, 61:325-332.

Moreno-Navarrete JM, Catalán V, Ortega F, Gómez-Ambrosi J, Ricart W, Frühbeck G, Fernández-Real JM: Circulating omentin concentration increases after weight loss. Nutr Metab (Lond) 2010, 7:27.

Motoshima, H., Wu, X., Mahadev, K. and Goldstein, B. J. (2004) Adiponectin suppresses proliferation and superoxide generation and enhances eNOS activity in endothelial cells treated with oxidized LDL. Biochem. Biophys. Res. Commun. 315, 264–271

Nedergaard J, Bengtsson T, Cannon B: Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007, 293:E444-E452.

Nishimura S, Manabe I, Nagasaki M, Hosoya Y, Yamashita H, Fujita H, Ohsugi M, Tobe K, Kadowaki T, Nagai R, Sugiura S. Adipogenesis in obesity requires close interplay between differentiating adipocytes, stromal cells, and blood vessels. Diabetes 56(6):1517-1526, 2007.

Nishimura S, Manabe I, Nagasaki M, Seo K, Yamashita H, Hosoya Y, Ohsugi M, Tobe K, Kadowaki T, Nagai R, Sugiura S. In vivo imaging revealed local cell dynamics in obese adipose tissue inflammation. J Clin Invest 118(2):710-721, 2008.

Ozata M, Ozdemir IC, Licinio J. Human leptin deficiency caused by a missense mutation: multiple endocrine defects, decreased sympathetic tone, and immune system dysfunction indicate new targets for leptin action, greater central than peripheral resistance to the effects of leptin, and spontaneous correction of leptin-mediated defects. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:3686–3695.

50

Pagano C, Pilon C, Olivieri M, Mason P, Fabris R, Serra R, Milan G, Rossato M, Federspil G, Vettor R: Reduced plasma visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in obesity is not related to insulin resistance in humans. J Clin Endocrinol Metab 2006, 91:3165-3170.

Petrescu BC, Gurzu B, Iancu RI, Indrei A, Dumitriu I, Chelaru L, Slătineanu SM, Petrescu G, Costuleanu M. Apelin effects on lipopolysaccharide-increased pulmonary permeability in rats. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2010;114(1):163-169.

Rabe K, Lehrke M, Parhofer KG, Broedl UC: Adipokines and insulin resistance. Mol Med 2008, 14:741-751.

Raffetto JD, Qiao X, Beauregard KG, Khalil RA. Estrogen receptor-mediated enhancement of venous relaxation in female rat: implications in sex-related differences in varicose veins. J Vasc Surg. 2010 Apr;51(4):972-981.

Rahmouni K, Morgan DA, Morgan GM, Mark AL, Haynes WG. Role of selective leptin resistance in diet-induced obesity hypertension. Diabetes 2005;54: 2012–2018.

Ran J, Hirano T, Fukui T, Saito K, Kageyama H, Okada K, Adachi M. Angiotensin II infusion decreases plasma adiponectin level via its type 1 receptor in rats: an implication for hypertension-related insulin resistance. Metabolism 2006;55:478–488.

Ran J, Hirano T, Fukui T, Saito K, Kageyama H, Okada K, Adachi M: Angiotensin II infusion decreases plasma adiponectin level via its type 1 receptor in rats: an implication for hypertension-related insulin resistance. Metabolism 2006, 55:478-488.

Rasmussen MS, Lihn AS, Pedersen SB, Bruun JM, Rasmussen M, Richelsen B. Adiponectin receptors in human adipose tissue: effects of obesity, weight loss, and fat depots. Obesity 2006;14:28–35.

Rausch ME, Weisberg S, Vardhana P, Tortoriello DV: Obesity in C57BL/6J mice is characterized by adipose tissue hypoxia and cytotoxic T-cell infiltration. Int J Obes (Lond) 2008, 32:451-463.

Reilly MP, Lehrke M, Wolfe ML, Rohatgi A, Lazar MA, Rader DJ: Resistin is an inflammatory marker of atherosclerosis in humans. Circulation 2005, 111:932-939.

Rutkowski JM, Davis KE, Scherer PE: Mechanisms of obesity and related pathologies: the macro- and microcirculation of adipose tissue. FEBS J 2009, 276:5738-5746.

Saddi-Rosa P, Oliveira CS, Giuffrida FM, Reis AF: Visfatin, glucose metabolism and vascular disease: a review of evidence. Diabetol Metab Syndr 2010, 2:21.

Salcedo A, Garijo J, Monge L, Fernández N, García-Villalón AL, Sánchez Turrión V, Cuervas-Mons V, Diéguez G: Apelin effects in human splanchnic arteries: role of nitric oxide and prostanoids. Regul Pept 2007, 144:50-55.

Sattar N, Wannamethee G, Sarwar N, Tchernova J, Cherry L, Wallace AM,Danesh J, Whincup PH. Adiponectin and coronary heart disease: a prospective study and meta-analysis. Circulation 2006;114:623–629.

51

Schleifenbaum J, Köhn C, Voblova N, Dubrovska G, Zavarirskaya O, Gloe T, Crean CS, Luft FC, Huang Y, Schubert R, Gollasch M: Systemic peripheral artery relaxation by KCNQ channel openers and hydrogen sulfide. J Hypertens 2010, 28:1875-1882.

Schrader LI, Kinzenbaw DA, Johnson AW, Faraci FM, Didion SP: IL-6 deficiency protects against angiotensin II-induced endothelial dysfunction and hypertrophy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007, 27:2576-2581.

Shatat IF, Freeman KD, Vuguin PM, Dimartino-Nardi JR, Flynn JT: Relationship between adiponectin and ambulatory blood pressure in obese adolescents. Pediatr Res 2009, 65:691-695.

Shetty, G. K., Economides, P. A., Horton, E. S., Mantzoros, C. S. and Veves, A. (2004) Circulating adiponectin and resistin levels in relation to metabolic factors, inflammatory markers, and vascular reactivity in diabetic patients and subjects at risk for diabetes. Diabetes Care 27, 2450–2457

Skurk T, Hauner H. Obesity and impaired fibrinolysis: role of adipose production of plasminogen activator inhibitor-1. Int J Obes Relat Metab Disord 2004;28: 1357–1364.

Skurk T, van Harmelen V, Blum WF, Hauner H: Angiotensin II promotes leptin production in cultured human fat cells by an ERK1/2 dependent pathway. Obes Res 2005, 13:969-973.

Sobel BE, Taatjes DJ, Schneider DJ. Intramural plasminogen activator inhibitor type-1 and coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23:1979–1989.

Thatcher S, Yiannikouris F, Gupte M, Cassis L: The adipose renin-angiotensin system: role in cardiovascular disease. Mol Cell Endocrinol 2009, 302:111-117.

Thengchaisri N, Kuo L: Hydrogen peroxide induces endothelium-dependent and -independent coronary arteriolar dilation: role of cyclooxygenase and potassium channels. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003, 285:H2255-H2263.

Tooke, J. E. (1995) Microvascular function in human diabetes: a physiologic perspective. Diabetes 44: 721–726.

Trayhurn P, Beattie JH: Physiological role of adipose tissue: white adipose tissue as an endocrine and secretory organ. Proc Nutr Soc 2001, 60:329-339.

Trayhurn P, Wood IS: Adipokines: inflammation and the pleiotropic role of white adipose tissue. Br J Nutr 2004, 92:347-355.

Tsuchida A, Yamauchi T, Ito Y, Hada Y, Maki T, Takekawa S, Kamon J, Kobayashi M, Suzuki R, Hara K, Kubota N, Terauchi Y, Froguel P, Nakae J,

Usurelu CP, Marina A, Simona A, Bruckner I1, Minerva M. Evaluarea adipocitokinelor la pacienții cu boală coronariană și insuficiență cardiacă. Med. Int. 2009; 6:1-8.

Vachharajani V, Granger DN. Adipose tissue: a motor for the inflammation associated with obesity. IUBMB Life 61(4):424-430, 2009.

Vecchione C, Maffei A, Colella S, Aretini A, Poulet R, Frati G, Gentile MT, Fratta L, Trimarco V, Trimarco B, Lembo G: Leptin effect on endothelial nitric oxide

52

is mediated through Akt-endothelial nitric oxide synthase phosphorylation pathway. Diabetes 2002, 51:168-173.

Verdecchia P, Angeli F, Mazzotta G, Gentile G, Reboldi G: The renin angiotensin system in the development of cardiovascular disease: role of aliskiren in risk reduction. Vasc Health Risk Manag 2008, 4:971-981.

Verlohren S, Dubrovska G, Tsang SY, Essin K, Luft FC, Huang Y, Gollasch M: Visceral periadventitial adipose tissue regulates arterial tone of mesenteric arteries. Hypertension 2004, 44:271-276.

Verma S, Li SH, Wang CH, Fedak PW, Li RK, Weisel RD, Mickle DA: Resistin promotes endothelial cell activation: further evidence of adipokine-endothelial interaction. Circulation 2003, 108:736-740.

Viengchareun S, Zennaro MC, Pascual-Le Tallec L, Lombes M: Brown adipocytes are novel sites of expression and regulation of adiponectin and resistin. FEBS Lett 2002, 532:345-350.

Villela NR, Aguiar LGK, Bahia L, Bottino D, Bouskela E. Does endothelial dysfunction correlate better with waist-to-hip ratio than with body mass index or waist circumference among obese patients? Clinics. 2006;61:53-57.

Vita, J. A. and Keaney, Jr, J. F. (2002) Endothelial function: a barometer for cardiovascular risk? Circulation 106, 640–642

Vona-Davis L, Rose DP: Angiogenesis, adipokines and breast cancer. Cytokine Growth Factor Rev 2009, 20:193-201.

Wagner EM: TNF-α induced bronchial vasoconstriction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000, 279:H946-H951.

Wang B, Wood IS, Trayhurn P: Dysregulation of the expression and secretion of inflammation-related adipokines by hypoxia in human adipocytes. Pflugers Arch 2007, 455:479-492.

Wang P, Xu TY, Guan YF, Su DF, Fan GR, Miao CY: Perivascular adipose tissue-derived visfatin is a vascular smooth muscle cell growth factor: role of nicotinamide mononucleotide. Cardiovasc Res 2009, 81:370-380.

Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW Jr: Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest 2003, 112:1796-1808.

Wozniak SE, Gee LL, Wachtel MS, Frezza EE: Adipose tissue: the new endocrine organ? A review article. Dig Dis Sci 2009, 54:1847-1856.

Xi W, Satoh H, Kase H, Suzuki K, Hattori Y: Stimulated HSP90 binding to eNOS and activation of the PI3-Akt pathway contribute to globular adiponectin-induced NO production: vasorelaxation in response to globular adiponectin. Biochem Biophys Res Commun 2005, 332:200-205.

Yamauchi T, Kamon J, Ito Y, Tsuchida A, Yokomizo T, Kita S, Sugiyama T, Miyagishi M, Hara K, Tsunoda M, Murakami K, Ohteki T, Uchida S,

Zeidan A, Purdham DM, Rajapurohitam V, Javadov S, Chakrabarti S, Karmazyn M: Leptin induces vascular smooth muscle cell hypertrophy through angiotensin II- and endothelin-1-dependent mechanisms and mediates stretch-induced hypertrophy. J Pharmacol Exp Ther 2005, 315:1075-1084.

53

Zhang HR, Park YJ, Wu JX, Chen XP, Lee S, Yang J, Dellsperger KC, Zhang CH: Role of TNF-α in vascular dysfunction. Clin Sci 2009, 116:219-230.

Zhang L, Curhan GC, Forman JP: Plasma resistin levels associate with risk for hypertension among nondiabetic women. J Am Soc Nephrol 2010, 21:1185-1191

54

LISTĂ DE LUCRĂRI Lucrări ştiinţifice in extenso publicate (ca autor sau coautor) în reviste de specialitate clasificate CNCSIS/ reviste naţionale, cu referenţi şi colective editoriale sau volumele unor Conferinte Nationale în edituri recunoscute CNCSIS. 1. Dincă M, Dumitriu IL, Gurzu MB, Slătineanu SM, Foia L, Vâţă L, Cojocaru E, Petrescu G. Ghrelin and Ang 1-7 have cumulative vasodilatory effects on pulmonary vessels. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2010;114(3):803-807. 2. Dincă M, Dumitriu IL, Slătineanu SM, Vâtă LG, Gurzu MB, Petrescu G. Contribution of intrapulmonary renin angiotensin system on modulation of rat pulmonary arteries reactivity. Fiziologia-Physiology 2010; 20(3): 12-17. 3. Cojocaru E, Dumitriu IL, Gurzu B, Ciureanu IS, Dinca M, Costuleanu M, Slătineanu SM, Scutaru B, Petrescu G. Adenosine involvement on bronchial reactivity modulation by diesel exhaust. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009;113(1):180-184. 4. Mihai AC, Dinca M, Dumitriu IL, Gurzu MB, Slătineanu SM, Foia LG, Vata LG, Cojocaru E, Petrescu G. Apelin involvement on angiotensin II – induced venoconstriction in obese rats. Fiziologia-Physiology 2010; 20(3): 8-12. 5. Dinca M, Dumitriu IL, Vata LG, Zugun FE, Ciureanu IS, Slatineanu SM, Costuleanu M, Gurzu B, Petrescu Gh. In: Lupusoru CE and Tartau L (ed.), EFFECTS OF Angiotensin II receptor antagonist and angiotensin-converting enzyme inhibitor treatments on contractile responses to urotensin-ii in asthmatic rat pulmonary arteries. Adverse effects of pharmacologic active substances: from bench to bedside, pp 271-278, Junimea Publishing House, ISBN 978-973-37-1351-7

55

6. Mandric CG, Dumitriu IL, Vata LG, Dinca M, Petrescu BC, Slătineanu SM, Mihai CA, Laurentiu Sorodoc4, Gurzu B, Petrescu Gh. In: Lupusoru CE and Tartau L (ed.). Epirubicin effects on coronary arteries reactivity. Adverse effects of pharmacologic active substances: from bench to bedside, pp 285-293, Junimea Publishing House, ISBN 978-973-37-1351-7 7. Mihai CA, Dumitriu IL, Dinca M, Slatineanu SM, Costuleanu M, Gurzu B, Petrescu Gh. Protective effects of apelin on pulmonary vessels. In: Lupusoru CE and Tartau L (ed.), Adverse effects of pharmacologic active substances: from bench to bedside, pp 278-285, Junimea Publishing House, ISBN 978-973-37-1351-7 Lucrări comunicate sau publicate în rezumat, (ca autor sau coautor) în volumele unor manifestări ştiinţifice naţionale şi/ sau internaţionale. 1. Activation of vascular renin angiotensin system on pulmonary vessels by antigen sensitization and challenge. Dumitriu Irina Luciana, Vata Luminita Gina, Dinca Maria, Gurzu Mihaela Beatrice, Petrescu Bogdan Cristian, Mihai Ana Camelia, Slatineanu Simona Mihaela, Gurzu Bogdan, Costuleanu Marcel, Petrescu Gheorghe. Hypertension 2008; 52(4):772-772. 2. Diesel exhaust enhances the specific hyperresponsiveness of ovalbumin sensitised rats airways. Dumitriu Irina Luciana, B. Gurzu, Maria Dinca, Beatrice Mihaela Gurzu, G. Petrescu. Journal of Preventive Medicine 2007; 15: 178 ISSN: 1582-5388 3. Apelin effects on rat portal vein tone M. Dinca, AC. Mihai, L. Vata, IL. Dumitriu, B. Gurzu, M. Costuleanu, Gh. Petrescu. Physiology 2008.18.2(58): 22 4. NO – dependent but endothelium – independent apelin relaxant effects on vascular teritory. Bogdan Gurzu, Irina Luciana Dumitriu, Maria Dinca, Simona Mihaela Slatineanu. XXIInd NATIONAL CONFERENCE OF ROMANIAN SOCIETY OF

56

PHYSIOLOGICAL SCIENCES BUCHAREST 1 – 2 JUNE 2007. (Abstract book p 87)