18

Cursul 2 3. Clasificarea enzimelor. Nomenclatura

Clasificarea enzimelor în funcŃie de reacŃia pe care o catalizeazã

este prezentatã în Tabelul 3.1.

Tabelul 3.1: Clasificarea enzimelor în funcŃie de tipul reacŃiei pe care o catalizeazã

Numele enzimei ReacŃia catalizatã

Dehidrogenaze Dehidrogenarea unui substrat cu

transferul hidrogenului la o moleculã diferitã de oxigen

Hidroxilaze Hidroxilarea unui substrat la care participã oxigen molecular ca donor

Kinaze Transferul unei grupe fosfat de la o trifosfatnucleotidã (ATP) la un substrat

Mutaze Migrarea unei grupe fosfat de la o poziŃie la alta în aceeaşi moleculã

Oxidaze Oxidarea unui substrat cu oxigen molecular ca donor

Oxigenaze Incorporarea unei molecule de oxigen cu ruperea oxidativã a unei legãturi C - C

Fosfataze Hidroliza unui ester fosforic Sintetaze Condensarea a douã molecule simultan

cu hidroliza unei trifosfonucleotide (ATP) Transferaze Transferul unei grupe funcŃionale de la un

substrat la altul Nomenclatura enzimelor se face în mai multe moduri:

a) Denumire comunã

Se pãstreazã denumirile comune deşi acestea nu precizeazã

acŃiunea enzimei într-un anumit tip de reacŃie.

Exemplu: pepsina, tripsina, ureaza, etc.

b) O altã denumire puŃin mai precisã constã în folosirea numelui

substratului + numele reacŃiei catalizate + sufixul “azã”:

Exemplu: malatdehidrogenaza

19

c) In 1961 Comisia de Enzime a Uniunii InternaŃionale de

Biochimie şi Biologie Molecularã a stabilit o clasificare şi o nomenclaturã

sistematicã a enzimelor, mult mai riguroasã, care cuprinde şase clase,

divizate în subclase, care la rândul lor sunt împãrŃite în sub-subclase.

Fiecare enzimã are un numãr de cod format din patru cifre:

EC a b c d, unde: a = clasa; b = subclasa; c = sub-subclasa; d =

numãrul de ordine al enzimei respective în sub-subclasã (nr. propriu

pentru fiecare enzimă).

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme - clasificarea enzimelor Web Version of Enzyme Nomenclature – 1992 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology

1. Oxido- reductaze (catalizeazã procese de oxido-reducere)

1.1 AcŃioneazã asupra R2CH -OH

1.1.1 cu NAD+ sau NADP+ ca acceptor de hidrogen

Exemplu:

- EC 1.1.1.1 (alcool dehidrogenaza) este enzima care

catalizeazã oxidarea etanolului, acceptorul de hidrogen fiind NAD+:

+NADH, H+CH3CHO+NAD+CH3CH2OH

Aceastã enzimã nu este specificã pentru etanol, ea putând oxida şi alŃi alcooli.

- EC 1.1.1.27 (L-lactat-NAD-oxidoreductaza sau L-lactat dehidrogenaza) este enzima care catalizeazã transformarea L- lactatului în piruvat:

_ _ +++++CH3CHCOO NAD CH3COCOO NADH H

OH 1.2 AcŃioneazã asupra grupei carbonil ( C =O)

1.3 AcŃioneazã asupra grupei CH – CH

20

1.4 AcŃioneazã asupra grupei CH – NH2

1.5 AcŃioneazã asupra grupei CH – NH, etc.

EC 1.98 Enzymes using H2 as reductant

EC 1.98.1.1 now EC 1.18.99.1

EC 1.99 Other enzymes using O2 as oxidant

2. Transferaze (catalizeazã transferul unor grupe funcŃionale)

2.1 Tranferã grupe monocarbonate

2.1.1 Metiltransferaze

2.1.2 Hidroximetiltransferaze

2.2 Transferã grupe aldehidice sau cetonice

2.3 Aciltransferaze

2.4 Glicoziltransferaze

2.5 Alchiltransferaze

2.6 Transferã grupe azotate

Exemplu:

- EC 2.6.1.2 (alanin aminotransferaza) este enzima care

transferã grupa amino de la alaninã la α-cetoglutarat:

+

_

__

_

__

+COO

+C

CH3

HH3N

COO

CO

(CH2)2

COO

C

CH3

COO

O +

COO

(CH2)2

C

COO

HH3N

2.7 Fosforiltransferaze

3. Hidrolaze (catalizeazã reacŃii de rupere a unor legãturi cu

ajutorul apei)

3.1 Scindeazã legãturi esterice

3.1.1 Scindeazã esteri ai acizilor carboxilici

21

Exemplu:

- EC 3.1.1.3 (glicerol-esterhidrolaza) sau lipaza;

3.2 Scindeazã legãturi glicozidice

Exemplu:

- EC 3.2.1.1 (αααα-1,4-glucan glucanohidrolaza) sau αααα-amilaza

3.3 Actioneaza asupra legaturilor eterice 3.4 Scindeazã legãturi peptidice

Exemplu:

- EC 3.4.21.4 sau tripsina

- EC 3.4.23 cuprinde poteinaze acide care acŃioneazã la pH <5:

- pepsina ( EC 3.4.23.1) care acŃioneazã la pH = 1.5 – 2

-renina (EC 3.4.23.4) din stomacul ierbivorelor – este impli-

catã în coagularea laptelui.

3.5 Scindeazã alte legãturi: C = N

Exemplu:

- EC 3.5.1.5 (ureo-amidohidrolaza) sau ureaza.

4. Liaze sau sintaze(catalizeazã reacŃii de adiŃie sau de eliminare)

4.1 Liaze pentru legaturi C - C

4.2 Liaze pentru legaturi C - O

Exemplu:

- EC 4.2.1.1 (anhidraza carbonicã): este enzima care catalizeazã

transformarea acidului carbonic in CO2 si apa, precum si hidratarea

dioxidului de carbon în celula vie

H2CO3 = CO2 + H2O sau

H2CO3H2O+CO2

4.3 Liaze pentru legãturi C – N, etc.

22

5. Izomeraze (catalizeazã reacŃii de izomerizare)

5.1 Racemaze si epimeraze (enzime care catalizeazã procese de

racemizare sau epimerizare):

Exemplu: - EC 5.1.1.1 (alanin racemaza) catalizeaza transformarea L- alaninei in D-alanina

- EC 5.1.2.1 (lactatracemaza) care catalizeazã reacŃia de

transformare a L-lactatului în D-lactat si invers:

_ _

HC

CH3

COO

H C

CH3

COO

OHHO

5.2 Izomeraze cis – trans

Exemplu: EC 5.2.1.1 maleat cis-trans izomeraza:

_

_

_

_

CH

C

COO

H COO HC

CH

COO

OOC

5.3 Cetoizomeraze intramoleculare Exemplu: EC 5.3.1.1 triose-phosphate isomerase

CO

CH2OPO3

CH2OH

CH2OPO3

H OH

CH=O

C2_ _2

gliceraldehid-3-fosfat dihidroxiacetonfosfat 6. Ligaze sau sintetaze (catalizeazã reacŃii de sintezã prin

condensarea a douã molecule simultan cu hidroliza unei legãturi

23

fosforice din ATP sau din alt compus macroergic din care rezultã energia

necesarã desfãşurãrii acestei reacŃii)

6.1 Formare de legãturi C – O

6.2 Formare de legãturi C – S

Exemplu: EC 6.2.1.1 (acetat-CoA-ligaza) sau acetil-CoA sintetaza :

ATP + acetate + CoA = AMP + diphosphate + acetyl-CoA

6.3 Formare de legãturi C – N

6.4 Formare de legãturi C – C

Exemplu: EC 6.4.1.1 (piruvat-CO2-ligaza) sau piruvat carboxilaza.

ATP + pyruvate + HCO3- = ADP + phosphate + oxaloacetate

Aceasta clasificare functioneaza partial in practica deoarece

toleranta fata de substrate nenaturale este comuna mai multor clase de

enzime (fapt important pentru aplicatiile practice in sinteze organice).

Utilitatea enzimelor din punct de vedere practic este prezentata in

Tabelul 3.2.

3.1 Analiza cantitativă a activităŃii enzimatice

In Sistemul International, activitatea catalitica se masoara in

katal = cantitatea de enzima care transforma un mol de substrat intr-o

secunda: 1 kat = 1 mol s-1

Pentru ca marimea acestei unitati este prea mare, se foloseste

unitatea internationala care reprezinta cantitatea de enzima care

transforma un µmol de substrat intr-un minut.

1 U = 1 µmol minut-1.

In practica se folosesc si subunităŃi ale katalului:

µkat - microkatal (10-6 kat); nkat - nanokatal (10-9 kat); pkat - picokatal

(10-12 kat), precum si nmol/min sau nmol/h.

24

Tabelul 3.2: Utilitatea tipurilor de enzime in biotransformari organice

Numarul enzimelor Clasa de enzime Clasificate Disponibile

Tipul de reactie/Utilitatea in sinteze*

1. Oxido-

reductaze

650

90

Oxidarea legaturilor C-H, C-C, C=C

+++; 25%

2. Transferaze

720

90

Transfer de grupe: aldehidice, cetonice, acil, glicozil, fosforil sau metil

+; 5%

3. Hidrolaze

636

150

Hidroliza/formarea esterilor, amidelor, lasctonelor,

lactamelor, epoxizilor,nitrililor,anhidridelor,

glicozidelor; +++ 60%

4.

Liaze

255

35

Aditie/eliminarea unor molecule mici la legaturi duble

C=C, C=N, C=O ++; ~7%

5.

Izomeraze

120

6

Izomerizari: racemizari, epimerizari, rearanjari de

schelet +; ~2%

6. Ligaze

80

5

Formare/rupere a unor legaturi simple: C-O, C-S,

C-N, C-C cu aport de energie chimica stocata in

adenozintrifosfat (ATP) +; ~1%

• Utilitatea estimata pentru folosirea enzimelor pentru transformarile substantelor nenaturale : +++ (foarte utile), ++ (utile), + (putin utile), valorile procentuale fiind observate in perioada 1987 – 2003.

O unitate de activitate enzimatică este egală cu 16,67 nkat,

valoare care se deduce astfel:

106 µmol

1 kat = 1 mol/s = -------------- = 60 x 106 U

min/60

Deci, U = 1 kat/ (60 x 106) = 106 µkat/ (60 x106) = 1/ 60 µkat

U = 1000/ 60 nkat = 16.67 nkat.

25

Este de remarcat faptul ca activitatile care se observa cand sunt

transformati compusi organici nenaturali sunt adesea mult mai mici

decat valorile observate pentru substrate naturale.

Pentru a face o comparatie intre activitatile unei enzime trebuie

folosita aceeasi cale de reactie atat pentru substratul natural, cat si

pentru cele nenaturale.

Puterea catalitica a (bio)catalizatorului poate fi descrisa foarte bine

de frecventa turnover (TOF), care reprezinta numarul de molecule de

substrat care este transformat de un singur situs catalitic intr-o secunda

(pentru reactii biochimice) sau intr-un minut pentru catalizatorii chimici.

Pentru reactiile biocatalizate TOFs = 10 – 1000s-1.

Productivitatea (bio)catalizatorilor este caracterizata prin numarul

turnover (TON), care reprezinta numarul de molecule de substrat

transformate de un singur situs activ in timpul vietii sale.

Numarul turnover este o masura a durabilitatii sistemului

catalitic.

Eficienta transformarilor microbiene (in care activitatea catalitica a

enzimelor implicate nu poate fi masurata) se exprima prin asa numitul

“numar de productivitate” (PN):

PN = gprod / muscat . t

unde: gprod reprezinta cantitatea de produs; muscat – cantitatea de celule

uscate; t – timpul transformarii.

Acest numar arata atat activitatea specifica pentru o enzima pura, dar

poate include si alti factori importanti: inhibitia, concentratia, fenomene

de transport.

Un PN mare pentru o biotransformare data indica un proces

eficient.

26

4. PROPRIETÃłILE ENZIMELOR

4.1 introducere

Enzimele prezintã situsuri caracterizate de activitate biologicã

(cataliticã).

Situsul catalitic este o parte a moleculei proteinei (loc geometric)

formată din câteva resturi de aminoacizi (de regulă neconsecutivi) care

sunt responsabili de trasformarea propriu-zisă a substratului.

Situsul alosteric este acea parte a proteinei care, în urma legării

specifice a unui modulator (efector alosteric) extern, modifică activitatea

caracteristică a proteinei (care este determinatã de situsul catalitic).

În cazul unei enzime, activitatea enzimatică este controlată în mod

direct de situsul catalitic şi indirect de situsul alosteric (de care se leagă

un efector care poate mări sau micşora activitatea catalitică).

O enzimã (E) acŃioneazã asupra unui substrat (S) cu care poate

forma un complex (ES) prin legarea specificã de situsul sãu catalitic:

+ EP ESS+E Acest complex se va transforma ulterior în produsul de reacŃie

(P) punând în libertate enzima netransformatã (E).

Substratul trebuie sã îndeplineascã urmãtoarele condiŃii:

- sã aibã o conformaŃie bine definitã care sã-i permitã accesul la situsul

catalitic;

- sã aibã particularitãŃi structurale care sã satisfacã necesitatea de

specificitate a enzimei;

- sã se asocieze cu enzima pe baza unei orientãri strict specifice.

Enzima trebuie sã aibã proprietãŃile unui catalizator:

- sã se regãseascã neschimbatã la sfârşitul reacŃiei;

27

- sã nu modifice natura (echilibrul sau bilanŃul termodinamic) reacŃiei pe

care o catalizeazã;

- sã permitã atingerea echilibrului într-un timp foarte scurt, mãrind

vitezele ambelor reacŃii care au loc simultan, dar în direcŃii opuse;

Enzimele au şi proprietãŃi care le deosebesc de catalizatorii

obişnuiŃi:

- acŃioneazã, în general, în condiŃii blânde, la temperaturi de ~ 37oC şi

pH neutru.

Existã însã şi enzime care acŃioneazã la temperaturi ridicate (în

bacteriile termofile) sau la pH-uri acide (pepsina) sau bazice (tripsina,

chimotripsina).

- scad mai mult energia de activare a unei reacŃii comparativ cu

catalizatorii obişnuiŃi.

Exemplu: Descompunerea apei oxigenate:

- energia de activare fãrã catalizator : 18 kcal/mol

- energia de activare în prezenŃa platinei coloidale: 11,7 kcal/mol

- energia de activare în prezenŃa catalazei (EC 1.11.1.6): 2 kcal/mol.

O moleculã de catalazã descompune 5x106 molecule de apã

oxigenatã într-un minut în condiŃii optime de temperaturã şi pH.

- sunt de naturã proteicã şi prezintã o specificitate foarte mare deoarece

situsul catalitic are o geometrie bine determinatã care-i permite fixarea

unui substrat cu structurã complementarã;

- activitatea lor poate fi reglatã şi autoreglatã;

- acŃioneazã în concentraŃie foarte micã (~10-6 moli);

- timp de reacŃie foarte scurt (cele mai rapide reacŃii fiind de ordinul

picosecundelor,10-12 s);

- randamentul reacŃiilor catalizate enzimatic este de 100%.

Enzimele pot acŃiona singure sau în prezenŃa unor cofactori, care

le determinã specificitatea.