IZOLAREA ŞI CONFIRMAREA SPECIEI ESCHERICHIA COLI DIN

PRODUSELE ALIMENTARE DE ORIGINE ANIMALĂ

Izolarea şi confirmarea Escherichia coli din produsele alimentare se efectuează - conform SR ISO/TS 16 649 – 1,2,3/2009 sau – conform SR ISO 7251/2009

 E. coli reprezintă cel mai bun indicator al CONTAMINĂRII FECALE a produselor alimentare. E. coli reprezintă un bun indicator al CONTAMINĂRII RECENTE a produselor alimentare.

Trebuie sublinat aspectul de adaptabilitate al bacteriilor în general şi al speciei E. coli în special, la modificări de temperatură: frig, congelare, modificări de umiditate (uscăciune), modificări de pH, rezistenţă la antibiotice, etc.

Escherichia coli sau colibacilii sunt bacterii aerobe din grupul coliformelor, se prezintă sub formă de bastonaş, sunt mobile, nesporogene, fermentează lactoza la 440C, cu producere de gaze şi formare de indol din triptofan .

Ross T., Ratkowsky D.A., Mellefont L.A., McMeekin, (2003), consideră că dezvoltarea speciei

E. coli este influenţată de mai mulţi factori: temperatură - este favorizată de o temperatură cuprinsă între 7,63 şi 47,43ºC, existenţa unor soluţii, la o activitatea a apei cuprinsă între 0,951 şi 0,999, ajutată de soluţii de clorură de sodiu şi la un pH situat între 4,0 şi 8,2.

Mecanismele adaptărilor sunt de natură genetică, traduse prin modificări în genom şi al transcripţiei expresiei acestor modificări la nivelul genelor. COLIBACILII sunt bacterii care au formă de bastonaşe mici, drepte - bacili sau cocobacili (2,0-6,0/1,1-1,5 micrometri, vii şi 1,0-3,0/0,4-0,7 micrometri, moarte şi colorate), Gram negative, aşezate izolat sau în perechi, adesea mobile dar şi imobile, unele tulpini capsulează, formând microcapsule, asporogene.

Temperatura optimă de dezvoltare este de 37 0C, dar se dezvoltă foarte bine şi la 44-450 C. Această ultimă temperatură fiind un criteriu de difernţiere, denumit testul Eyjkman-Mackensie. În laboratoare de bacteriologie alimentară, aceast test se utilizează pentru diferenţierea lui E. coli de speciile înrudite, de tip Enterobacter, Klebsiella sau alte enterobacterii.

•E. coli se dezvoltă foarte bine în prezenţa sărurilor biliare şi a bilei, a sărurilor de seleniu, a colorantului verde briliant, a tetrationatului, etc. •Se dezvoltă bine la pH neutru; nu se dezvoltă la pH mai mic de 5,9 şi mor la pH acid.•Pe medii nutritive simple se dezvoltă bine, producând turbiditate intensă, uneori cu inel la suprafaţă pe bulionul simplu, cu adunarea unui depozit în cazul culturilor vechi, iar pe suprafaţa agarului nutritiv cresc colonii netede, de 2-6 mm, uşor convexe, opace, nepigmentate, de tip S. Culturile degajă miros fecaloid, amoniacal.

Bârzoi D. şi colab., (1999), descriu că aproximativ 95% din tulpinile de E. coli sunt indol pozitive, roşu-metil pozitive, Voges-Proskauer negative, citrat negative, beta-galactozidază şi beta-glucuronidază pozitive şi sunt cuprinse în E. coli biotipul 1. Celelalte tulpini răspund diferit, fiind indol negative, nu elaborează enzime de tipul beta-galactozidază şi beta-glucuronidază şi sunt catalogate ca aparţinând E. coli biotipului 2.

Speciile din genul Escherichia fermentează glucoza, lactoza, manita, trehaloza, produc lizin-decarboxilază. Există şi unele excepţii, de exemplu, tulpinile enteroinvazive, care sunt lactoză şi lizindecarbixilază negative.Diferenţierea tulpinilor aparţinând biotipului 1 faţă de biotipul 2 se efectuează pe baza testului IMVIC.

Testele biochimice cele mai importante şi care sunt utilizate pentru identificarea speciei E. coli au fost următoarele:

•creştere aerobă la 44-450C;•producere de gaze captate în tubuleţe Durham

în medii specifice BBLV, LST, etc.;•producerea indolului;•fermentarea glucozei şi/sau lactozei;•formarea de colonii roşii-violacee, cu centrul

mai închis la culoare, cu reflexe metalizate auriu-verzui, caracteristice pe suprafaţa mediului GEAM sau Levine

•utilizarea glucozei cu formarea de produşi acizi stabili, ceea ce determină reacţia roşului de metil pozitivă;•metabolizarea glucozei cu producere de acetoin, reacţia Voges-Proskauer negativă;•neutilizarea citratului ca unică sursă de carbon;•fermentarea sorbitolul şi producerea beta-galactozidazei, exceptând tulpinile de E. coli O157 H7 - enterohemoragică.

METODA ORIZONTALĂ PENTRU DETECTAREA ŞI ENUMERAREA

ESCHERICHIEI COLI PREZUMTIVE.

METODA NUMĂRULUI CEL MAI PROBABIL.

SR ISO 7251/2009

Definiţii Escherichia coli prezumtivă: bacterii, care la 44°C, fermentează lactoza cu producere de gaze şi produc indol din triptofan, atunci când analiza este efectuată conform metodei specificate în SR ISO 7251/2009.Numărarea Escherichia coli prezumtivă – reprezintă numărul cel mai probabil de E. coli pe mililitru sau gram de probă din produs identificat prin metoda prevăzută de acest SR ISO.

• MOD DE LUCRU• Se efectuează diluţii seriate;• Se fac însămânţări (câte 1 ml) din produsele

lichide utilizate ca atare pt. prima inoculare şi/sau din diluţiile următoare în câte trei tuburi, din minim diluţii consecutive, pe mediul LST – bulion lauril sulfat, turnat câte 10 ml/tub;

• Se utilizează LST dublu concentrat pt. alimentele lichide, utilizate ca atare şi din diluţia iniţială pt. produsele solide;

• Se utilizează LST simplu concentrat pt. diluţiile următoare.

• INCUBAREA• Tuburile cu LST însămânţate se incubează de

37 0C, timp de 24 - 48 ore;• CITIREA • TEST POZITIV - Se constată prezenţa

opacităţii (creştere microbiană) şi producere de gaz.

• SUBCULTURILE• Din tuburile pozitive se fac însămânţări pe

mediul bulion EC;• CITIREA • TEST POZITIV - Se constată şi producere de

gaz.

• SUBCULTURILE• Din tuburile pozitive se fac însămânţări pe

mediul bulion EC;• Din tuburile pozitive se fac însămânţări pe apă

peptonată sterilă -APS;• CITIREA • TEST POZITIV - Se constată producere de gaz

pe bulion EC şi producere de indol pe APS.• Se numără tuburile pozitive şi se citeşte în

tabelul McGrady cifra corespunzătoare E.coli/g sau ml produs;

• Dacă nu exista tuburi cu reacţie pozitivă rezultatul este ABSENT/g sau ml produs examinat.

METODA ORIZONTALĂ PENTRU ENUMERAREA

ESCHERICHIEI COLI β-glucuronidază pozitivă.

Partea 1. METODA NUMĂRĂRII LA 44°C UTILIZÂND MEMBRANE 5-BROMO-4- CLORO-3-INDOLYL β-D-GLUCORONID.

SR ISO 16 649-1/2001

METODA NUMĂRĂRII LA 44°C UTILIZÂND MEMBRANE 5-bromo-4- cloro-3-indolyl β-d-glucoronid , cf. SR ISO 16 649-1/2001

•Este o tehnică de lucru care pune în evidenţă coloniile de E. coli resuscitate prin utilizarea membranelor specifice şi incubarea la 44°C, pe mediu solid cromogenic care conţine ingrediente pentru detectarea enzimei β-glucuronidază.

•Tulpinile care nu cresc la 44°C, sunt considerate β-glucuronidază negative, astfel că suşele de E. coli O157nu sunt detectate.

DEFINIŢII:

• E. coli β-glucuronidază pozitivă sunt bacterii care produc colonii de culoare albastră pe mediul triptonă-bilă-glucuronid TBX, în condiţiile specificate în SR ISO 16 649-1/2001.

• Determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii E. coli β-glucuronidază pozitivă stabilit pe gram sau ml de produs/probă şi stabilit prin calcul.

MOD DE LUCRU• Din cantităţile specificate de probe sau din

diluţiile iniţiale se fac inoculări pe membrane celulozice impregnate cu agar, minerale şi glutamat modificcat sau mediul MMGA, care se incuibează timp de 4 ore la 37°C;

• Pentru izolare, membranele celulozice după perioada de resuscitare pe MMGA se transferă pe mediul TBX, care se incubează la 44°C, timp de 18-24 ore .

• Se citesc plăcile care conţin între 15 şi 150colonii albastre tipice sau maxim 300 de colonii atipice.

CITIREA REZULTATELOR

• REACŢIA POZITIVĂ – numărarea coloniilor din cele două plăci ale fiecărei diluţii şi a cel puţin unei diluţii următoare, deci minim 2 diluţii consecutive şi introducerea în următoarea formulă de calcul:

• N - • REACŢIA NEGATIVĂ – medii sterile sau

absenţa coloniilor tipice, albastre.