Curs 1

EXTRACŢIA ENZIMELOR

Este evident că pentru a putea înţelege în detaliu comportarea unei enzime într-un sistem complex în

care există ea în mod obişnuit - aşa cum sunt organitele celulare (mitocondrii, lizozomi, ribozomi etc.),

celula, tesuturi, organe parti sau întregul organism – este necesar să încercăm în primul rând să-i

înţelegem proprietăţile în cel mai simplu sistem posibil. În cele mai multe cazuri, când enzima este

exocelulară, sistemul simplu este constituit dintr-o soluţie enzimatică care conţine şi mici cantităţi de

ioni, molecule tampon, cofactori, etc. În alte cazuri, însă, cum sunt cele în care enzimele sunt

componente a unor organite celulare sau sunt legate de membranele celulare izolarea enzimei este un

proces mai complicat deoarece enzima poate fi inactivată dacă în mediu nu există unii componenţi

adiţionali specifici.

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice ale unei enzime trebuie aleasa sursa care

raspunde cel mai bine cerintelor de izolare cu o activitate catalitică maximă adică enzima prezentă sa

nu fie degradată sau inactivată şi să fie de puritate maximă posibilă adică nu trebuie să conţină alte

enzime sau molecule mari. Daca se urmareste si purificarea enzimei, scopul purificarii trebuie sa fie

obtinerea unui preparat cu un randament maxim posibil rezultat din procentul de activitate recuperată

comparativ cu activitatea extractului original.

Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in diferite

scopuri sau pentru studiul ei este necesar să se ţină cont de o serie de factori cum sunt:

abundenţa enzime;

disponibilitatea şi preţul de cost;

localizarea intracelulara;

caracterizarea sursei;

studii comparative.

In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere si stabilitatea enzimei si posibilele

dificultăţi în manipularea sursei.

Abundenţa enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare, este necesar să se obţină extracte

proteice totale cu concentraţii ridicate ale enzimei de interes trebuie alese surse biologice bogate în

enzima dorită.

Astfel rădăcinile de hrean sunt surse extrem de bogate de peroxidaze, muşchiul inimiii este bogat în

lactatdehidrogenaze, glandele mamare în periada lactaţiei sunt o sursă bună de acetil CoA carboxilază

şi rinichii sunt bogaţi în hidrolaze.

Microorganismele sunt surse de obţinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate în diverse

domenii cum sunt agricultura, industria alimentară, industria farmaceutică, pielărie etc. De exemplu un

microorganism cunoscut de toată lumea, drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae), care este utilizată

în special în panificaţie şi industria berii, se obţine uşor în cantităţi mari şi este foarte bogată în enzime

glicolitice. Avantajul utilizării microorganismelor ca surse de enzime constă în faptul că prin modificări

ale mediului de cultură sau modificări genetice se poate creşte nivelul de producţie a enzimei de

interes.

Astfel sinteza -D-galactozidazei poate fi indusă la E. coli prin creşterea bacteriei într-un mediu care

conţine lactoză (substratul enzimei) ca unică sursă de carbon. Dezvoltarea tehnicilor de clonare

moleculară, a ADN-ului recombinant, a determinat apariţia unor noi metode de realizare a unor tulpini

de microorganisme înalt producătoare de enzime. În această tehnică, gena care codifică o enzimă este

izolată de la organismul parental şi expresată la un nivel ridicat într-un organism de creştere convenabil

cum sunt E. coli şi drojdiile. Prin această tehnică o tulpină de E. coli a produs de 100 până la 200 de ori

mai multă glutation reductază decât tulpina sălbatică.

Trebuie să subliniem că deşi aceste tehnici reprezintă posibilităţi reale de creştere a capacităţii de

biosinteză a unei enzime pot apărea probleme considerabile la exprimarea unor gene eucariote în celule

procariote, astfel încât, în unele cazuri proteinele supra exprimate pot forma agregate insolubile şi

recuperarea activităţii enzimatice din acestea nu a fost totdeauna posibilă.

Disponibilitatea sursei. Sursa biologică trebuie să fie accesibilă din punct de vedere economic şi

geografic. În acest sens nu se recomandă utilizarea unor surse scumpe, ca de exmplu muşchiul de

homar, sau a unora care se găsesc în regiuni îndepărtate, „exotice”, ale globului (specii

bioluminiscente). Ţesuturile umane sunt surse greu de procurat în multe ţări.

În multe situaţii sursele clasice pentru anumite enzime au fost înlocuite de surse alternative:

De exemplu creierul porcului de guinea, sursa clasică pentru extracţia şi purificarea histamin-

metiltransferazei, poate fi înlocuit cu rinichiul de porc, sursă mai ieftină şi mai accesibilă;

În studiul structurii subunitare a ceruloplasminei umane, o problemă a fost sensibilitatea mare a

acestei proteine la atacul enzimelor proteolitice. Când s-a descoperit că ceruloplasmina umană

este aproape similară cu cea porcină, studiile au fost orientate spre această sursă în care

proteina se găseşte în cantităţi mult mai mari şi este mai stabilă la atacul enzimelor proteolitice;

Enzimele pectolitice necesare obtinerii sucurilor limpezi din fructe sau legume se obtin cu

ajutorul microorganismelor. Obtinerea lor din fructe le-ar ridica pretul foarte mult ceea ce ar

duce la indisponibilitatea lor pentru industria de sucuri.

Sursele animale sau microbiene tradiţionale pentru anumite enzime pot fi înlocuite la ora actuală de

microorganisme obţinute prin inginerie genetică sau de culturi de celule eucariote. Proteinele de origine

eucariotă, produse prin clonare şi expresare în bacterii de tipul E. coli, pot fi localizate în citoplasmă

sau pot fi secretate prin membrana celulară. În al doilea caz, ele se pot acumula în interiorul spaţiului

periplasmatic, sau pot fi secretate în mediul de cultură. O enzimă care se acumulează în interiorul

spaţiului periplasmatic poate fi şi ea secretată în mediul de cultură prin schimbarea condiţiilor de

creştere. Această metodă conduce la obţinerea unui grad avansat de purificare pentru enzimele

secretate, pentru că, majoritatea proteinelor biosintetizate rămân în interiorul celulelor.

În alegrea sursei de izolare şi purificare a unei enzime trebuie să se facă un compromis între abundenţa

şi accesibilitatea acesteia.

Localizarea intracelulară a unei enzime este esenţial de cunoscut pentru a se putea stabili cea mai

convenabilă metodă de extracţie. Astfel dacă o enzimă are o singură localizare în celulă (cum sunt de

exemplu succinat dehidrogenaza şi alte enzime din ciclul acizilor tricarboxilici care se găsesc exclusiv

în mitocondrii) se poate utiliza pentru purificare şi studiu un omogenat obţinut din întregul ţesut. În

cazul unor enzime similare ca funcionalitate si structura localizate în mai multe formaţiuni

intracelulare, este necesară o fracţionare subcelulară înainte de a începe purificarea enzimei de interes.

Astfel, în cazul purificării adenozintrifosfatazei mitocondriale, enzimă implicată în transportul H+, este

necesară obţinerea unui preparat mitocondrial cu puritate rezonabilă, pentru a se evita contaminarea cu

alte adenozintrifosfataze implicate de exemplu în transportul Na+ şi K+ prin membrana celulară.

Fracţionarea subcelulară se realizează prin centrifugare diferenţială, organitele celulare sedimentează

la diferite valori ale forţelor centrifugale

Caracterizarea sursei. Sursa aleasă trebuie să fie perfect caracterizată. Când sursa aleasă este vegetală,

este necesară cunoaşterea genului, speciei şi varietăţii acesteia. În cazul microorganismelor este

necesară unei tulpini bine caracterizate, crescută pe medii de cultură cu compoziţie bine determinată.

Pentru surse animale, este necesară prelevarea de ţesuturi sau organe de la animale normale, având

acelaşi sex, aceiaşi greutate şi vârstă, care au fost supuse unui regim alimentar identic. În cazul surselor

animale este necesară cunoaşterea aproximativă a compoziţiei sursei pentru a înlătura unele interferenţe

care pot apărea pe parcursul extracţiei şi purificării. De exemplu, ficatul conţine o cantitate mare de

glicogen care interferă în multe dozări. Pentru a limita aceste interferenţe, animalele de laborator

trebuie supuse unui regim de inaniţie înainte de sacrificare. Partea endocrină a pancreasului este bogată

în lipide care interferă în extracţia enzimelor. Pentru a limita acest neajuns se recomandă îndpărtara

mcanică a acsti părţi a pancreasului înainte de extracţia enzimelor.

Studii comparative.

Unele enzime au fost studiate in unele specii sau in diferite tesuturi ale unor specii. In asemenea cazuri

este de mare importanta sa se studieze enzimele respective si in diferite alte specii sau tesuturi in

vederea evaluarii evolutiei enzimei, proprietatile ei comparativ cu altele similare, structura primara,

tertiara, diferitele izoenzime etc.

Metode de extracţie

Există numeroase metode de extracţie a enzimelor atât din mediii în care acestea se află extracelular cât

şi în interiorul celulelor când sunt necesare metode speciale de spargere a celulelor. Alegerea metodei

de extracţie este dependentă de natura ţesutului, organismului sau mediului utilizat ca sursă enzimatică.

Astfel unele materiale biologice permit obţinerea de soluţii clare sau aproape clare de proteine, enzime,

prin simple procedee de filtrare sau centrifugare deoarece enzimele sunt, în aceste cazuri, libere în

solventul, apa, materialului biologic respectiv. În această categorie putem aminti ca exemple

următoarele: urina, laptele, serul sanguin, sucul unor fructe, veninul de şarpe, mediile extracelulare

rezultate după cultivarea microorganismelor sau a celulelor animale sau vegetale. Alegerea unei astfel

de surse prezintă avantajul că materialul de la care se porneşte procedeul de extracţie conţine un număr

relativ mic de componente, iar proteinele extracelulare sunt relativ stabile. Unele dintre aceste surse,

cum este urina sau supernatantele culturilor de celule, trebuie supuse unor operaţii de concentrare

înainte de începerea purificării efective.

În cazul unor surse este, însă, necesară extracţia proteinei cu o anumită activitate enzimatică dintr-un

ţesut sau dintr-un anumit tip de celulă. În aceste cazuri, alături de proteina de interes sunt eliberate un

număr mare de alte molecule contaminante, printre care şi enzime proteolitice, enzime care fac destul

de dificilă purificarea proteinei de interes. Astfel, extracţia şi purificarea unei proteine particulare dintr-

o sursă solidă implică cel mai adesea un compromis între gradul de recuperare (randament) şi puritatea

acesteia (factor de purificare).

Dezintegrarea celulelor sau ţesuturilor şi eliberarea conţinutului acestora în mediul de extracţie se poate

realiza printr-o serie de metode specifice. În anumite cazuri se preferă sau este necesara dezintegrarea

ţesuturilor şi prepararea unor populaţii omogene de celule intacte înainte de ruperea membranelor

celulare.

Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa si de tipul de ţesut sau organ utilizat ca sursă de

izolare a enzimei. În urma dezintegrării celulare se obţin omogenate celulare care conţin componentele

celulare suspendate în mediul de extracţie. Principalele metode utilizate pentru dezintegrarea celulelor

sunt :

Metoda Principiul de bază

Metode blânde

Liza celulară Ruperea osmotică a membranei celulare

Digestia enzimatică Ruperea pereţilor celulari; eliberarea conţinutului celular

în mediu.

Omogenizator Potter-

Elvehjem

Celulele sunt dezintegrate într-un spaţiu îngust existent

între pistil şi pereţii de sticlă; membranele celulare sunt

rupte datorită forţelor care apar;

Metode moderate

Omogenizator cu cuţite

(Warning blendor)

Membranele sunt tăiate cu ajutorul unor lame care se

rotesc

Mojarare în prezenţă de

nisip, alumină sau perle de

sticlă

Membranele sunt îndepărtate prin acţiunea abrazivă a

particulelor de nisip sau alumină

Metode severe

Presare (French press) Celulele sunt forţate să treacă prin orificii mici la

presiuni foarte mari; forţe de rupere afectează

integritatea ,membranelor

Decompresiune explozivă Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune

mare, ceea ce determină ruperea membranelor şi

eliberarea conţinutului celular

Măcinare cu bile (bead

mill)

Vibraţiile rapide realizate cu ajutorul perlelor de sticlă

conduc la îndepărtarea pereţilor celulari

Ultrasonicare Tratarea suspensiilor celulare cu frecvenţe sonice

determină ruperea membranelor

Îngheţ-dezgheţ repetat Ruperea legăturilor de hidrogen şi a celor hidrofobe

realizate între enzime şi alte componente precum si a

membranelor ca urmare a inghetarii apei.

Se recomandă pe cât posibil utilizarea unor metode de dezintegrare blânde, care să nu afecteze enzima

de interes şi să nu determine eliberarea enzimelor degradative din organite celulare de tipul vacuolelor

sau/si a lizozomilor.