Biotehnologia aplicata speciei Commiphora wightii : o potentiala sursa de compusi naturaliAbstract: Commiphora wightii a devenit o specie pe cale de disparitie din pricina supraexploatarii sale pentru guma de rasina. Planta endemica in India, cu contributii majore in biologie, chimie, farmacologie si biotehnologie pentru culturi de celule si micropropagare.

1. IntroducereCommiphora wightii cunoscut sub numele de Indian bdellium sau guggul, este o planta cu importanta medicinala a patrimonului indian. De secole, a fost folosita la scara larga ca Ayuvedic de catre medici pentru a trata diverse afectiuni, precum: artrita, inflamatii, fracturi osoase, obezitate, si tulburari ale metabolismului lipidic. Aceste proprietati curative si medicamentoase sunt mentionate in textul clasic medical Ayurvedic- Sushruta Samhita de acum 3000 de ani. C.wightii a devenit pe cale de disparitie datorita supraexploatarii sale pentru guma de rasina, asocita cu moartea plantei datorita cresterii lente si deficitului de seminte. Guma de rasina da randament impotriva nivelului crescut de colesterol si lipide din sange.

2. RaspandireCommiphora este raspandita la scara larga in regiunile tropicale din Africa, Madagascar si Asia. Este raspandita, in general, in regiuni aride, foarte raspandit in desertul Thar. Specii de Commiphora se gasesc in Pakistan, Baluchistan si India, iar din totalul de 185 de specii de Commiphora doar trei specii au fost gasite in India (C. wightii, C. sticksii, C. berryi). Commiphora wightii este intalnita in Rajasthan, Gujarat si Maharashtra.

3. BiologieCommiphora wightii face parte din familia Burseraceae. O trasatura specifica al familei Burseraceae este prezenta ductelor de rasina in scoarta parenchimatoasa. Este un arbust ce atinge 3 metri inaltime, cu noduri transformate in spini. Florile sunt solitare sau grupate cate 2-3. Fructul este o drupa ce devine rosie la coacere si atinge 6-8 mm in diametru. Randamentul de fructe si de seminte este scazut ( aproximativ 16% conform intervalelor Aravalli). Numarul de cromosomi este 2n=26. Recent, Gupta raporteaza dezvoltarea semintelor apomictice cu poliembrionia. Experimentele realizate manual si studiile embriologice au confirmat aparitia apomixiei non-pseudogamica, nucellar polyembryony si formarea de endosperm autonomic(liber). Acesta fost dedus ca apomixia ar putea avea un rol important in speciatia arborilor tropicali. Apomixia poate fi favorizata de selectia naturala in cazul in care densitatea populatiei este mica si distanta dintre arbori este mai mare decat cea permisa de polenizarea incrucisata. Intr-un alt studiu, Gupta precizeaza ca cauza nivelului scazut de seminte la C. wightii se bazeaza pe interactiunea polen-stigmat la plantele apomictice non-pseudogamice. Au observant ca , desi polenul a germinat pe stigmat, pistilul nu a sustinut cresterea tubului de polen, probabil datorita schimbarii de orientare a celulelor si de absenta proteinelor in matricea intercelulara. Acest fapt a dus la un set redus de seminte.

Acesta este considerat un lemn excelent pentru combustibil. Datorinta unor probleme biologice si sociale planta a devenit astfel o specie pe cale de disparitie. Constituientii uleiului esential de rasina s-au dovedit a consolida maturitatea sexuala a adultilor imaturi de lacuste de desert.

4. Compozitia chimica a gumei de rasina

Prezenta gugulsteronilor diferentiaza C. wightii de cele 184 de specii de Commiphora. Guma de rasina obtinuta din Boswellia serrata, un alt arbore din familia Burseraceae si comun in aceleasi regiuni, este cunoscut pe plan local ca si guggul alb, doar ca B. serrata nu contine gugulsteroni. Acesta este utilizat ca medicament antiinflamator.

Guggl (C. wightii) este format dintr-un amestesc de rasini: 38.5% rasina, 32.5% guma, 1.45% ulei volatil, 19.5% minerale, 3.2% materie organica si 3.6% alte impuritati. In timpul separarii diferitilor compusi din complex, a fost raportat ca fractia neutra contine compusi cetonici (5.13%). Este o fractie cetonica ce contine importante principii biologice active ale steroizilor C12 sau C27 si anume: Z-guggulsterol-III (0.01%), guggulsterol-VI (0.02%), Z-guggulteron-IV (1.6%), E-guggulsteron (0.4%), guggulsterol-III (0.03%), guggulsterol-I (0.8%), guggulterol-IV, guggulterol-V si unele cetone secretoare de aparare. Oleoguma de rasina(guggul) este un amestec complex ce are nevoie de separare graduata(treptata). Purificarea implica separarea componentelor solubile(45%) si insolubile(55%) cu ajutorul acetatului de etil, alcolului sau eterului de petrol. Partea insolubila este asociata cu efecte toxice in timp ce cea solubila contine guggulsteroni si alti constituienti cu efecte hipolipemiante si antiinflamatorii. A fost propusa o metoda de separare ( de inalta performanta) cromatografica de lichide (HPLC). Recent a fost dezvolat un ser si supliment de dieta, printr-o metoda HPLC pentru determinarea cantitativa a E- si Z-guggulsteron din rasina de C. mikul.

Pe langa acesti steroizi, guma de rasina a C. wightii contine diterpenoide (combrene-A si mukulol), steroizi derivati din pregnan si colestan si diversi derivati de carbohirati. Prin distilarea cu vapori/aburi, guma de rasina furnizeaza ulei esential aromatic. Uleiul contine monoterpene-myrcene, camforene, polimircene si cariofiline. Partile aerine a C. wightii contine -sitosterol, alcool de miricil si aminiacizi. Florile sunt bogate in flavonoide, dar mai ales in quercetin.

Din rasina de C. tenuis, ce creste in Etiopia, au fost depistate si identificate prin GLC si GLC-MS, 37 de monoterpene. Principalele component ale fractiei monoterpenoide a fost: - pinen (60.8%), -pinen (8.8%), sabinen (6.3%), -tujen (8.9%), limonene (5.5%), 3-caren (3.7%), -mircen (1.8%), si -elemen (1.1%) constituind 97% din ulei. Componentele sesqiuternenoide identificate constituie aproximativ 1.6 % din ulei.

5. Proprietati medicinale si farmacologie

Multe plante medicinale indiene au ajuns sub control stiintific de la mijlocul secolului al XIX-lea. Commiphora wightii este o astfel de planta din care a fost elaborata un medicament modern, pe baza informatiilor vechi pentru hiperlipidemie (hipertensiune). In antichitate, guggul a fost utilizat in principal ca medicament antiinflamator. Dezvoltarea gumei de guggul ca agent hipolipemiant a fost raportat de Satyavarti lucrand la Universitatea Banaras Hindu, ceea ce a dus la descoperirea de noi medicamente anticolesterol din sursa vegetala. Acest lucru a fost initiata pe baza informatiilor culese din conceptul vechi de patogeneza a aterosclerozei si a obezitatii descrisa in Sushruta Samhita.

Guggulul este foarte apreciat pentru tratarea mai multor boli, inclusiv artrita reumatoida, tulburari lipidice si obezitatea. Multe rapoarte farmacologice moderne stabilite stiintific testeaza proprietatile hipolipidemice si hipocolesterolemice a extractului de C. wightii. Guggulul conine o rin bogat n gugulsteroni.Guggul a fost foarte promitator in sistemul experimental animal. Imediat dupa studiile realizate despre guggul a fost stabilit un agent hipolipidemic eficient la pacientii cu boala cardiaca ischemica, hipercolesterolemie, obezitate si hiperlipidemie. In diferite studii cu pacienti, a fost inregistrata o scadere a colesterolului seric (24-59%) si a trigliceridelor (22-30%). Guggulipid un medicament preparat din guggul a demonstat ca la pacintii cu hipercolesterolemie are efect antioxidant si hipolipidemic. S-a demonstrat c datorit gugulipidelor, care sunt coninute n gugulsteroni, reduc nivelul de trigliceride cu 23%, de colesterol total cu 24%, de lipoproteine cu densitate mic (LDL) cu 30% i se sporete nivelul de lipoproteine cu densitate mare (HDL) cu 16%. Aceti indici practic nu sunt diferii fa de cei rezultai n urma aciunii preparatelor pentru scderea colesterolului, ns spre deosebire de acestea gugulipidele nu sunt toxice. Guggulipid este utilizat in prezent in India si Europa pentru hiperlipidemie si hipercolesterolemie. n plus, guggulul manifest aciune antiinflamatoare, antiseptic, analgezic, spasmolitic, anticonvulsiv, fiind totodat antiedematos i astringent. El reduce agregarea trombocitelor, prevenind formarea trombozelor, mpiedic absorbia grsimilor la nivel intestinal. Gugulsteronii influeneaz asupra mai multor procese biologice, inclusiv a metabolismului tiroidian, regleaz nivelului de colesterol. Folosirea lor n dietele cetogene favorizeaz producerea hormonului de cretere. Guggulul este foarte eficient n lupta cu inflamaiile acneice ale pielii. Este utilizat i n cazul dereglrilor metabolismului lipidic, aterosclerozei, bolii ischemice a cordului, hipertoniei, sindromului metabolic, obezitii, diabetului zaharat, sindromului intestinului iritat, artritelor. Aceasta planta s-a dovedit eficienta si in cazuri de obezitate cauzate de afectiuni ale tiroidei, cand activitatea acesteaia este scazuta, ducand la o incetinire a metabolismului. Extractul de guggul actioneaza ca un stimulent pentru glanda tiroida, permitand cresterea productiei de hormoni si accelerarea metabolismului. Astfel, cu cat este consumata mai multa energie, cu atat mai multe calorii sunt arse, iar greutatea scade.Necroza miocardica este asociata cu niveluri crescute de peroxizi lipidici, cu activitatea xantin oxidaza si cu o scadere de superoxide dismutaza, ce pot duce la formare de radicali liberi cu deteriorarea celulelor cardiace. Extractul de C. wightii impreuna cu Allium sativum si Allium cepa a indus protectie impotriva nivelului crescut de colesterol si trigliceride din sange, astfel conferind protectie impotriva ateroslerozei si infarctului miocardic.

Guggulsteronii E si Z sunt responsabili de reducerea lipidelor in sangele uman si pentru a explica activitatea lor, au fost propuse cel putin patru mecanisme. Primul mecanism consta in faptul ca guggulteronii pot interfera cu formarea lipoproteinelor prin inhibarea biosintezei colesterolului in ficat. Al doilea mecanism: guggulsteronii au dovedit ca sporesc absorbtia de LDL in ficat prin stimularea activitatii de legare a receptorului LDL in membrane celulelor hepatice. Al treilea: guggulsteronii cresc excretia fecala a acizilor biliari si a colesterolului rezultand o rata scazuta de absorbtie de grasimi si colestrol in intestin. Si in cele din urma, guggulsteronii stimuleaza glanda tiroida in mod direct. Guggul induce productia de triiotironina cu posibila implicare a peroxidarii lipidelor; a demonstrat efectul stimulator al administrarii de guggul asupra tiroidei, facandud-se teste pe soareci experimentali. Deoarece lipidele serice, inclusiv colesterolul, sunt reduse ca raspuns la nivelul crescut de hormoni tiroidieni circulanti, efectul guggulsteronilor asupra glandei tiroide ar putea explica activitatea hipolipidemica si proprietatea de a pierde in greutate.

Efectul antiinflamator este comun si in alte plante din familia Burseraceae: Borswellia dalzielli, B. carteri, B. serrata si C. incisa.

Extracul de C. molmol, o alta specie din Orientul Mijlociu, are efect anti-cancerigen, efect antiinflamator si citotoxic, are proprietate cito-protectoate si anti-ulcer. Pe baza potentialului citotoxic, antioxidant si non-mutagen a extractului de C. molmol, acesta se recomanda utilizarea sa in tratamentul cancerului. In mod similar au fost izolate din C. myrrha sesquiterpene responsabile pentru activitatea hipoglicemica.

6. Producerea gumei de rasina

Balsamul de C. wightii (oleogum-resin sau guma de rasina fluida) este prezent in canalele balsam, in floemul nervurilor frunzei. Lumenul canalului este inconjurat de un start epitelial de parenchim ce contine citoplasma densa si picaturi de guma si rasini. Materialul rasinos este sintetizat in celulele epiteliale si este probabil transportat in lumenul canal. Dintre diferiti reglatori de crestere a plantelor, aplicate pe tulpina cu pasta de lanolina, doar kinetina a crescut dimensiunea lumenului, in timp ce auxina si morfactina a avut un efect negativ cauzand cresterea numarului de celule epiteliale.

Guma este exploatata in sezonul de iarna. Sunt potrivite plantele de peste 5 ani, cu diametrul bazal mai mult de 7.5 cm. Sunt realizate incizii circulare de 1.5 cm adancime pe ramurile principale si pe tulpina la o distanta de 30 cm si un unghi de 60 grade fata de acesta(tulpina). Latexul de culoare galbena se colecteaza manual, acesta se solidifica in contact cu aerul. Colectarea gumei de rasina se face la un interval de 10-15 zile. De obicei de la o planta este obtinut aproximativ 200-300 g de guggul uscat. Aplicarea etefonului pe sectiune, imbunatateste productia de guggul de 22 de ori peste cel obtinut in control. Aceasta tehnica dezvoltata de Bhatt este ieftina si sigura. S-a constatat ca productia de guggul este crescuta cu debutul verii, fiind sustinuta prin observatii de microscopie fluorescenta si camp luminos. Productia excesiva pe termen lung, prin aplicarea etefonului epuizeaza planta si astfel duce la moartea acesteia.

7. Propragarea vegetativa/ inmultirea vegetativa

Randamentul fructelor este foarte scazut in stare naturala. Raspandirea plantelor este un esec datorita viabilitatii semintelor si a conditiilor aride si a setului scazut de seminte; planta da roade in aprilie-mai si in august-octombrie. Aproximativ 27% din fructe contine un singur embrion, 7% din fructe contin 2 embrioni si 66% din fructe sunt fara embrion. Astfel, s-au facut incercari de propragare prin metode conventionale, prin butasi de tulpina si se incerca propagarea plantelor prin metode biotehnologice nonconventionale.

7.1. Metode conventionale

Inradacinarea este afectata in mod negativ de catre caldura, deshiratare si de atacul termitelor. Acesta a fost imbunatatita prin aplicarea de regulatori de crestere, prin tratarea cu saruri de potasiu si taierea adecvata in lungime si in diametru (a tulpinii). Cu toate acestea, aceste metode nu sunt potrivite pentru multiplicarea la scala larga cu suficienta biomasa deoarece este variabila si afectata de anotimpuri.

7.2. Metode biotehnologice

Cercetarea biotehnologica pe C. wightii a fost sustinuta de angentiile centrale de finantare din 1979, dar nimic concret nu a iesit din aceste programe, ceea ce astesta natura dificila a materialului. In vivo, planta este un arbust cu crestere lenta. Explantele obtinute din plante mature ( tulpina, frunza sau petiol) produc un calus amorf, de culoare alba si cu crestere rapida pe mediul de cultura MS, ce contine kinetina si 2,4 D. Exudatul de rasina din explante face procesul de sterilizare dificil. Este la fel de dificil de a gasi explante de tulpina pentru crestere in vitro. Si din aceste motive investigatiile sunt afectate deorece sunt folosite ca material de surs explantul.

7.2.1. Propagarea clonala

Propagarea clonala, ca abordare biotehnologica este aplicata pentru inmultire vegetativa a materialelor selectate. Brave si Metha au descris o metoda de propagare clonala de explante de tulpina C. wightii crescute pe mediu de cultura Murashinge si Skoog continand benziladenina (BA, 4.0 mgl ), kinetina (4.0 mgl), glutamina ( 100 mgl), HCl tiamina (10 mgl) si 0.3% carbune activ. Mugurii obtinuti din explante au fost incubate pe mediu continand concentratie scazuta de BA(0.40 mgl) si kinetina. (0.4 mgl). Acesti muguri s-au inradacinat prin tratarea lor cu IAA si IBA la intuneric timp de 24 de ore si au fost transferate pe un mediu scazut de sare cu carbune activ. Micropropagarea C. wightii odata stabilita in sol a aratat o crestere puternica si uniforma, fara anomalii morfologice. Numarul limitat de plante produse prin aceasta metoda reprezinta un factor de limitare pentru utilizarea acestei tehnici pe o scala larga de multiplicare. Pentru propagarea lor clonal este necesar un numr foarte mare de plante, iar micropropagarea convenional are nevoie de un timp ndelungat.

7.2.2. Embriogeneza somatica

In culturile de calus de C. wightii embriogeneza somatica a fost atinsa. Formarea embrionului somatic a fost observat pentru prima data in explantele de zigoti imaturi sau in ovule intacte trasferate pe mediu B5. Desi frecventa explantelor producatoare de cultura embrionara a fost scazuta, embrionii zigotici imaturi au fost singurele explante potrivite pentru producerea de calus embrionar dupa transferul reciproc de mediu B5 continand 0.1 mgl acid acetic 2,4,5-triclorofenoxi si 0.1 mgl kinetina. In calus embriogeneza somatica obtinuta din embrioni zigotici imaturi a fost posibila datorita selectiei celulelor embrionare. Celulele embrionare au fost mici, cu citoplasma densa comparativ cu celulele non-embrionare care au fost mari, alungite, vacuolate. O crestere maxima a calusului embrionar a fost inregistrat la mediu MS-2 suplimentat cu 0.25 mgl BA si 0.1 mgl IBA. S-a observant o crestere mai mare de calus pe mediu MS-2 comaparativ cu tesuturile cultivate pe mediul B5 continand aceleasi concentratii de regulatori de crestere.

Calusul embrionar trasferat pe mediul MS-2 continand diverse combinatii de IAA si BA produc etapa globulara, torpedo si etapa timpurie cotiledonara a embrionului. Numarul maxim de embrioni somatici a fost obtinut pe mediul ce contine 0.1 mgl IAA si 0.25 mgl BA. Etapa torpedo si cotiledonara a embrionilor obtinuti din experimente de dezvoltare a embrionilor somatici , au fost utilizate in experimentele anterioare. Pentru a genera stres si sporirea maturatei in embrionii somatici, in mediu MS-2 au fost incluse carbon activ, ABA, agar. Numarul maxim de embrioni in stadiul cotiledonar a fost produs pe mediu continand carbon activ si zaharoza. In acest experiment embrioni au fost plasati pe hartie de filtru folosind mediu lichid. Stadiul cotiledonar al embrionilor somatici pastrate pe diferite medii de maturare apoi transferate pe mediu MS-2HF. Embrionii somatiti cultivati pe medii de cultura continand regulatori de crestere, a podus calus indiferent de concentartie si de asociere. Un procent ridicat de embrioni a ramas negerminat , in timp ce 10-15% a podus embrioni somatici secundari. Pentru obtinerea unui procent ridicat de germinare a fost necesara o selectie corecta a embrionilor maturi.. A fost observata ingrosarea hipocotilului fara alungire de internoduri. Mediul MS-2 continand acid giberelic a fost cel mai eficient pentru enlogatie/alungire a plantulelor. Aproximatix 200 de plantule a fost plasate cu succes in pamant pentru a verifica rata de regenerare/supravietuire si astfel rata de supravietuire a plantulelor a fost de 95%. Acesta realizare a deschis noi cai de cercetare pe C. wightii cum ar fi: embriogeneza si culturi de celule in bioreactor, formarea in vitro de canale de rasina si producerea de guggulsteroni din aceste culturi organizate.

7.3. Producerea de guggulsteroni

Datorita distrugerii plantelor din mai multe localitati, s-a initiat cautarea de metode alternative de producere a guggulsteronilor. O alternativa excelenta de a produce metaboliti secundari sunt culturile de celule. Culturile de suspensii celulare a C. wightii au fost derivate din calus-frunza pe mediu MS continand fiecare 0.15 mgl (2,4 D si kinetina). Celulele au fost imobilizate in alginat de calciu. Celulele imobilizate in culturile de suspensie in faza de stationare au fost utilizate mai putin, dar ele au fost active in sinteza guggulsterolilor. Productia de gugulsterol a fost de 1.9% in expant de tulpina, 0.22% in cultura de calus (2 luni) si 0.32% in cultura de suspensie celulara (25 zile). Guggulteronul este produs in canale de rasina si , pri urmare, culturile neorganizate s-au dovedit a fi neproductive in acest scop. Cu toate acestea, utilizarea culturilor organizate sunt in curs de evaluare deoarece embrionii produsi pot dovedi si surse mai bune.

8. Cercetari necesare si perspectivaC. wightii a devenit o specie pe cale de disparitie din cauza cererii inalte a gumei de rasina. Aceasta planta eficace este utilizata in sistemul de medicina indiana. Si astfel, mai multe plante au fost reinvestigate pentru proprietatile lor mentionate in sistemul vechi de medicina. Folosirea metodelor biotehnologice pe baza surselor naturale a garantat productia lor. Dezvolatarea de culturi de celule somatice in mediu solid sau lichid a deschis noi cai de cercetare pe acest material. Este cunoscut faptul ca, materialul organizat spre deosebire de culturile neorganizate, produce o cantitate mai mare de principiu activ. Acest lucru poate fi utilizat in mod eficient pentru imobilizarea de embrioni, rasaduri germinate, parti de material saditor si asa mai departe. Toate acestea sunt disponibile in conditii aseptice si datorita prezentei de rasina este dificil de sterilizat in cantitati mari de unde si natura adeziva a explantelor. Bioreactorul pentru culturi necesita o cantitate mare de material aseptic, iar o defectiune a sistemului, din pricina contaminarii,ar adauga un factor de cost pentru funtionarea sistemului. Astfel avantajele propagarii in masa si a dezvolatarii semintelor artificiale sunt evidente si nu trebuie subliniate din nou. O noua abordare este dezvolatarea de culturi hairy root folosind Agrobacterium rhizogenes pentru producerea principiului activ, descrise mai sus pentru culturile organizate.