CAPITOLUL I OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE

Biologia este stiinta care se ocupa cu studiul legilor ce stau la baza originii, organizarii si evolutiei organismelor vii. Desi cunoscuta din antichitate, Biologia s-a dezvoltat si se dezvolta permanent, reprezentand fundamentul teoretic pentru discipline ca : genetica, anatomia, fiziologia, embriologia, antropologia, patologia genetica, imunobiologia, biologia celulara, etc. Dezvoltarea biologiei a fost si este conditionata de dezvoltarea tehnicii si perfectionarii metodelor de studiu si cercetare, cautandu-se o permanenta preocupare de a elucida relatia omului cu universul, cu mediul inconjurator care este in permanenta schimbare. Este stiinta cu caracter nerestrictiv. Dar lumea vie se compune dintr-un mare numar de individualitati, care, prin similitudini de forma, structura, functii, se grupeaza in populatii, in specii. Similitudinile se mentin in succesiunea generatiilor in populatie datorita capacitatii de a transmite, in forma codificata, ansamblul de caractere specifice populatiei sau speciei, dar si cu particularizari fenotipice ale fiecarui individ in populatie. Diversitatea fenotipica a indivizilor in populatie este consecinta recombinarii aparatului genetic in meioza si fecundatie, a proceselor cronogenetice si cronobiologice in activitatea genomului. Este influenta unor secvente tranzitionale din genom, sau efectul distructiv indus de factori fizicochimici si biologiei agresivi, capabili sa modifice aparatul genetic al celulelor din organism. Complexitatea acestor procese particulare organismelor vii a impus aparitia unei stiinte biologice bine delimitata : GENETICA. GENETICA este stiinta ereditatii, variabilitatii si reproducerii organismelor vii. Este stiinta fundamentala. Relativ tanara, genetica a avut o evolutie rapida, diversificandu-se in mai multe directii de cercetare si anume: - genetica umana fundamentala - genetica moleculara - genetica medicala - genetica populatiei sau antropologica - cronogenetica 9

- si cronobiologia dezvoltarii organismelor. Genetica, sinteza dinamica a datelor si descoperirilor din biofizica, biochimie, biomatematica, cibernetica, semantica, citologie, etc., ne ofera cheia" dezlegarii necunoscutelor fiintelor vii. Genetica permite sa cunoastem structura materialului ereditar, mecanismelor de conservare sau de diferentiere a caracterelor pe fond genetic, sa cunoastem factorii cu potential de modificare a structurii si functiei aparatului genetic (mutatiile). Tot genetica descifreaza macanismele si procesele de diferentiere, de dezvoltare ontogenetica (normala si/sau patologica). Ea permite elaborarea de metode pentru clonarea terapeutica, de fertilizare in vitro, etc. Prin extrapolarea principiilor Biologiei si Geneticii in patologia umana, s-a conturat o disciplina medicala fundamental : Genetica Medicala". Genetica umana, Genetica medicala studiaza principiile, procesele, mecanismele si legile care guvemeaza diferentierea, cresterea, reproducerea si dezvoltarea indivizilor din populatiile umane. Analizeaza relatiile dintre individ si populatiile conspecifice, ca produs al evolutiei normale sau patologice a omului, in raport cu mediul sau de viata. Genetica medicala contribuie la elaborarea mijloacelor terapeutice eficiente in combaterea, corectarea si preintampinarea aparitiei bolilor genetice in familie, in populatie. Deasemenea asigura starea de sanatate fizica si psihica a omului. Recentele achizitii stiintifice in genetica confirma valoarea extrapolarii principiilor acestei stiinte in medicina, cu posibilitatea cunoasterii complexe a omului normal sau bolnav. Datorita progreselor in biologie si biogenetica, J. Bernard afirma ca Genetica este strans legata de interesele omului, de societate. De aceea spunea Bernard: ....genetica cere cu necesitate clarificarea stiintifica a proceselor biologice, abordarea stiintifica a evolutiei genomului uman, cunoasterea, la toate nivelele de organizare, a organismului si viitorul genetic al omului..." Linus Carl Pauling (1949) afirma urmatoarele: ...dintre toate sistemele naturale, materia vie este aceea care, prin imensele sale transformari, pastreaza cea mai mare parte a propriei sale treceri istorice inscrise in organizarea sa. Ca nu exista alt sistem ca eel biologic, care sa fie constant suprimat si simultan mentinut, si ca este suficient a ne interoga pe noi insine pentru a sti in care dintre sistemele vii actuale s-a realizat cea mai mare parte a trecerii istorice...".

10

Genetica cauta sa descifreze interrelatiile dintre componenta genetica a organismului si factorii de mediu, de a descifra interferentele de influenta si/sau efectele distinctive, intre genotip si mediul ambiant. Genetica, stiinta cu caracter nerestrictiv, studiaza complexitatea structural-functional-comportamentala a omului, in care rolul primordial il are genomul, constituit in momentul formarii zigotului prin procesul de fecundatie. Pentru o corecta apreciere a aparatului genetic care controleaza caracterele exprimate fenotipic, este necesara cunoasterea unor marimi pe care Dubinin (1969) le mentiona pentru om : - celula gametica la om contine aproximativ un sfert de microni cubi 3 (miu ) de acizi nucleici, in greutate de 4x10 12 g (grame) ; - populatia terei este estimata la sase miliarde de locuitori : 6x109; - nasterea acestui numar de oameni necesita 12xl09 gameti haploizi (6x109 ovule si 6x109 spermatozoizi); - volumul total al acizilor nucleici existent in cele 12 miliarde de gameti haploizi se estimeaza la 4,8 mm3 si o greutate de 48 mg ADN; - intr-un vol urn egal cu o picatura de ploaie este inmagazinata componenta moleculara, ADN-ul, pentru cele 6 miliarde de indivizi umani; - dar corpul uman are aproximativ 6xl013 celule, din care se distrug in 24 de ore cca 5x10" celule. Dar tot atatea se produc, asigurand regenerarea fiziologica si mentinerea integritatii morfo-functionale a organismului. Datele prezentate de Dubinin evidentiaza complexitatea constitutionala a speciei Homo sapiens.

11

CAPITOLUL II EREDITATEA LA OMEreditatea este functia biologica a organismelor vii de a conserva si transmite caracterele morfo-structurale, moleculare, fiziologice si comportamentale de la o generatie la cele care-i succed. Este latura sincronica, de conservare si transmitere a informatiei genetice, prin care este mentinut axul structural-functional al speciei in spatiu si timp. Ereditatea conserva caracterele, le stabilizeaza. Pentru studiul ereditatii, in fata geneticienilor au fost formulate o serie de intrebari ca: - Ce se transmite? Care este natura fizico-chimica a materialului genetic mostenit de la parinti? - Cum este transmis materialul genetic? Care sunt mecanismele ce asigura continuitatea intre generatii? - Cum actioneaza materialul genetic? - Daca raspunde destructiv la interferentele cu factorii agresivi din mediu si care sunt efectele fenotipice asupra indivizilor? Sunt intrebari fundamentale la care genetica raspunde, explica, demonstreaza, convinge. Viata precede intricatiei fenomenelor dinamice, legate de structurile specifice ale celulei, ale organismului. Dinamismul", propriu vietii, este exprimat sub diversele activitati metabolice care asigura cresterea si functiile organismului. Suportul acestui dinamism este asigurat de moleculele proteice, cu rol structural sau enzimatic, ce se caracterizeaza prin specificitate de structura si functie. Identitatea si specificitatea proteinelor de la o generatie la alta in cadrul speciei sunt garantate si realizate prin mecanisme informational codificate, de biomoleculele genomului uman. Biomoleculele care detin, in forma codificata, informatiile genetice se caracterizeaza prin aranjari particulare ale componentelor structurale, realizand ceea ce numim masinaria genetica", "banca genetica" de informatii din genomul organismului. Dar spre deosebire de variabilitate, ereditatea, ca functie sincronica, stabilizeaza caracterele datorita macromoleculelor codante. 12

Macromoleculele codante implicate in functiile de ereditate si variabilitate trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii : - sa detina informatia necesara structurii, functiei si stabilitatii" de reproducere in celulele organismului. Aceasta informatie o gasim codificata in ordonarea aperiodica a monomerilor, ca unitati de structura ce alcatuiesc aparatul genetic molecular al celulei, in ADN; - sa fie capabile de autoreplicare (autocatalitica), mecanism care asigura trecerea nemodificata" a informatiei genetice din celula mama spre celulele fiice ce rezulta prin diviziune; - sa exercite functia heterocatalitica, cand, prin decodificarea informatiilor genetice inscrise in structura lor, sa asigure sinteza de ARN mesager care, in citoplasma, realizeaza sinteza proteinelor cu structura specifica, in conformitate cu mesajul genetic copiat. - sa prezinte o oarecare labilitate" ca raspuns la interferanta cu factorii de mediu potentiali agresivi si cu efecteie distructive asupra moleculelor codante. Aceste conditii sunt indeplinite de acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul), care, virtual, isi exercita functiile la toate organismele: procariote si eucariote. Datorita procesului convergent intre informatia codanta si proteine, apar similitudini de forma structura si functii intre indivizii conspecifici, dar si o divergenta fenotipica interindivizi, definind individualitatile in populatie. De exemplu, fenotipul unui individ este o sinteza" complexa de elemente mostenite de la generatiile ascendente, realizata prin procesul informativ, codificata , transmisa si mostenita. Trasaturile fenotipice le grupam in categorii de caractere dupa cum urmeaza: - caractere specifice care particularizeaza specia; - caractere intraspecifice sau individuale particulare si de diferentiere a indivizilor conspecifici; - caractere dobandite de novo"posibile a fi inscrise in zestrea genetica a individului. Ele au efecte severe distructive - morbide sau letale - si care pot deveni transmisibile.

13

1. Suportul molecular al ereditatiiDupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structura in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici. In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituenti principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone. Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in forme virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiphcarea bacteriofagilor. Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiphcarea prin sinteza de ARN. In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotidelor din moleculele ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale. In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structura ADN-ului. Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice. S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala. S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5 nucleotidele in molecula, determinant o structura liniara si ordonata care este ADN-ul. 14

1. Suportul molecular al ereditatiiDupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick (1953) au elucidat structure in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici. In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituent! principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite histone. Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in fonne virulente, cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul infectiei" bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda), unde, prin autosinteza, se asigura multiplicarea bacteriofagilor. Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiplicarea prin sinteza de ARN. In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG = Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea nucleotideior din moleculeie ADN ce apartineau diverselor specii de plante si animale. In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi nucleotidice din structure ADN-ului. Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei genetice. S-a demonstrat ca molecula tipar" genereaza noi molecule complementare cu molecula initiala. S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5'-3' cupleaza nucleotidele in molecula, determinand o structure liniara si ordonata care este ADN-ul. 14

Totusi momentul revolutionar" in studiul structurii si dispozitiei spatiale a ADN-ului este anul 1953, cand Watson si Crick (laureati ai premiului Nobel) folosind ca metoda de studiu spectreie de difractie a razelor X, au demonstrat ca molecula ADN are o structura spatiala (o arhitectura) ordonata sub forma de dublu helix. Argumentele de ordin general rezultate din cercetarile biochimistilor si geneticienilor, prin care este atestat rolul ADN-ului ca suport molecular al ereditatii si variabilitatii sunt urmatoarele: - ADN-ul este o molecula cu structura speciala determinata de ordonarea aperiodica a nucleotidelor in catenele cuplate complementar; - ADN-ul este molecula capacitata cu functia de autoreproducere, functia autocatalitica, care se realizeaza prin replicare semiconservativa. Este functia care asigura conservarea informatiei genetice in generatiile ce succed; - ADN-ul serveste ca tipar pentru a i se decodifica mesajul genetic inscris in structura sa. Prin decodificare si respectarea principiului complementaritatii bazelor, rezulta molecula de ARN mesager, care, in citoplasma celulei, asigura sinteza de proteine cu structuri si functii specifice; - avand structura neramificata, informatia genetica din ADN este stocata si dispusa liniar. Este principiul care asigura decodificarea corecta"; - cantitatea de ADN este aceeasi in toate celulele somatice (cu aproximatie), fiind celule diploide; - in celulele gametice, care sunt haploide (cu numarul injumatatit de cromozomi fata de celulele somatice - la organismele cu reproducere sexuata) cantitatea de ADN este redusa la jumatate in raport cu celula somatica diploida; - cantitatea de ADN variaza in raport cu fazele ciclului celular si numarul cromozomilor : - in ciclul mitotic (fig. 1) : -in stadiul interfazic Gi gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul interfazic S are loc sinteza ADN-ului prin replicare semiconservativa. La sfarsitul acestui stadiu cantitatea de ADN va fi de 4n; - in stadiul G2 interfazic gasim: - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; 15

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul ciclului mitotic gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

cantitate ADN

4o ADN

2n ADN

INfTERFAZA

10 12 14

16

18

imi20 Z.

Fazeieji durata

(h)

|P:'M! ATIMTTOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice - in meioza, cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2) - In diviziunea primara a meiozei: - in stadiul d gasim : - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul G2 gasim : - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul diviziunii primare celulele au : - in numar cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - In diviziunea secundara a meiozei : - in interfaza, profaza si metafaza gasim : - in numar cromozomi; 16

- 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul ciclului mitotic gasim: - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

ADN

4n ADN

2n ADN 0,5 C2 C,

0,

2

4

6

8

10

12

14

16

18

iiili 20 22fc.11111

Riwfejidurata

irsTTERFAZA

^T^-s |P!M ATI*

Wfc

MITOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor somatice - in meioza. cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2) - In diviziunea primara a meiozei: - in stadiul d gasim : - 2n cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom; - in stadiul G2 gasim : - 2n cromozomi; - 4n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - la sfarsitul diviziunii primare celulele au : - in numar cromozomi; - 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom; - In diviziunea secundara a meiozei : - in interfaza, profaza si metafaza gasim : - in numar cromozomi; 16

- 2n cantitate ADN; - 2 cromatide pentru fiecare cromozom;-la sfarsitul diviziunii secundare celulele vor avea : - in numar cromozomi; - in cantitate ADN; - 1 cromatida pentru fiecare cromozom. Observam ca in celula gametica numarul cromozomilor si cantitatea de ADN sunt reduse la jumatate in raport cu celula somatica; - cand structura ADN este modificata, efect al actiunii agresive a factorilor potentiali mutageni, sau printr-un mecanism de crossing-over inegal, apar caractere noi (normale - adaptative sau patologice).

Fig. 2 Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celular in gametogeneza.

2. Structura moleculei de acid dezoxiribonucleic (ADN)Molecula de ADN din genomul procariotelor si eucariotelor are o structura polidezoxiribonucleotidica dublu catenara, catenele fimd cuplate intre ele pe principiul complementaritatii bazelor azotate componente. Cele doua catene cuplate realizeaza o dispozitie spatiala, o arhitectura in dublu helix. 17

legaturi fosfodiester 5 -3 formand scheletul glucido-fosforic. ADN-ul este molecula inalt polimerizata. 2.1. Unitatea de structura a molecuiei de ADN Unitatea de structura a ADN-ului este nucleotidul. Este un monomer in componenta caruia exista trei tipuri de molecule, inseparabile intre ele : o baza azotata, o pentoza si un radical fosfat. Bazele azotate pot fi purinice si pirimidinice. Bazele purinice prezinta doua heterocicluri : un hexaheterociclu (pirimidinic) si un pentaheterociclu (imidazolic). Bazele purinice in structura ADN-ului sunt : adenina (A) si guanina (G) (fig. 3).NM, 0

I

!

CM

W INM, N it C OX

O HN i C OX

CH XH MM

C * .CM NM

"

mFig.3 Structura bazelor purinice (A; G) si pirimidinice (T; C).

18

Bazele pirimidinice se prezinta sub forma unui hexaheterociclu pirimidinic. In structura ADN-ului bazele pirimidinice sunt reprezentate de timina (T) si citozina (C) (fig.3). A doua componenta din structura nucleotidului este pentoza, un glucid care se prezinta ca heterociclu de tip beta ((3)- furanozic. Cele doua componente, baza azotata si pentoza, esterifica cu formarea nucleozidului. Esterificarea se face printr-o legatura N-glucidica, legatura covalenta. Esterificarea se face intre hidroxidul din pozitia Ci al pentozei si azotul din pozitia N3 la pirimidine si pozitia N9 pentru purine. A treia componenta a nucleotidului este radicalul fosfat, care se cupleaza, prin esterificare, de nucleozid, cuplarea stabilindu-se cu hidroxidul de la C3 sau C5 al pentozei. Cuplarea celor trei componente fmalizeaza structura nucleotidului (fig.4sifig.5). Fig. 4 Structura nucleotidului cu baza pirimidinica ( Timina ) ; esterificare C5-

Structura nucleotidului cu baza purinica (Adenina) ; esterificare C5.

19

H-'

H HO' P">-CM>/li 0

H\H

1 OK

H/M

OK

(Acidul fosforic poate esterifica si la OH de la carbonul 3, ramane liber de la carbonul 5). Fig. 5 Structura nucleotitului cu citozina

N

H

01

O-P-

0-

0 \

/

/

*\

\

/

A{***)

Tl*irtft)

GfoMBMI

H

Cjcftorirt}

Fig. 7 Cuplarea bazelor azotate prin legaturi de hidrogen. T se leaga cu A prin doua legaturi de hidrogen ; C se leaga cu G prin trei legaturi de hidrogen. - analiza cantitativa a moleculelor de ADN extrase de la diverse specii animale sau vegetale au evidentiat urmatorul aspect : cantitatea de A + T nu este egala cu cantitatea G + C : 26

A+T ---------^ 1 G+C Datorita raportului valoric neunitar este confirmata aperiodicitatea ordonarii nucleotidelor in catenele copolimerice (deci intre purinele si pirimidinele din componenta celor doua catene este respectata complementaritatea de cuplare). Valoarea neunitara a raportului Chargaff confirma aperiodicitatea celor doua catene (aperiodice) copolimerice , desi intre bazele purinice si cele pirimidinice este respectata complementaritatea. A+T - raportul ---------, valoric , variaza in limite foarte largi. G + C De exemplu: - la Saccharomyces cerevisie cuplul A + T este in proportie de 64% fatadeG + C-36%; " - la Bos taurus A + T este in proportie de 58% iar G + C in proportie de 42%; - la Homo sapiens (om) proportia este de 62% A + T iar G + C de 38% etc. Observam ca intre specii apar diferente valorice intre A + T si G + C; - desi valoarea raportului Chargaff variaza valoric intre specii, la indivizii conspecifici se mentine aproape constant si apropiat valoric. In 1978 Lints confirma aperiodicitatea cuplurilor complementare. Ca importanta, complementaritatea structurii secundare confera moleculei de ADN functii bio-genetice esentiale: - respectand principiul complementaritatii se asigura replicarea semiconservativa a ADN-ului (autocatalitica) si continuitatea informatiei genetice (functia sincronica si conservarea ei); - pe principiul complementaritatii bazelor azotate, se realizeaza decodificarea mesajelor genetice inscrise in structura ADN-ului de catre moleculele de ARNm. Moleculele de ARNm sunt complementare fata de secventele decodificate din ADN; - metode de analiza a structurii ADN-ului prin denaturare si renaturarea moleculei se bazeaza tot pe principiul complementaritatii bazelor purine si pirimidine;

27

- pe principiul complementaritatii bazelor azotate se construiesc" si se folosesc sondele si amprentele genetice pentru identificarea si localizarea genelor, pentru secventierea moleculelor de ADN.

2.4. Structura tertiara a ADNPrin tehnica difractiei razelor X s-a stabilit ca ADN-ul are o arhitectura spatiala ordonata. Wilkins (1950) este primul cercetator care a folosit tehnica difractiei razelor X in studiul moleculei ADN , urmat de Franklin in 1951. Rezultatele obtinute de Wilkins si Franklin au confirmat ca: - cele doua catene copolimerice, cuplate complementar, au dispozitia spatiala in dublu helix. Aceasta observatie confirma ca molecula ADN are structura tridimensionala sau dispozitie spatiala; - structura tridimensionala a ADN-ului este asemanatoare pentru procariote si eucariote, indiferent de gradul de evolutie a speciilor. In 1953, Crick si Watson care, fara sa cunoasca lucrarile si observatiile lui Wilkins si Franklin, folosind tehnica difractiei razelor X, elaboreaza ipoteza asupra structurii tridimensionale a moleculei ADN din genomul celular. Modelul elaborat de Watson si Crick a fost publicat in 1953 in revista Nature", rezultate pentru care li s-a acordat Premiul Nobel pentru Medicina. La elaborarea modelului tridimensional, Watson si Crick au folosit raportul de complementaritate intre cele doua catene copolimerice din molecula ADN. Pe baza datelor obtinute prin difractia razelor X cei doi cercetatori au elaborat postulatul: ADN-ul este molecula dublu catenara. Cele doua catene sunt cuplate prin punti de hidrogen, conform principiului complementaritatii intre purine si pirimidine (A = T si G = C). Catenele cuplate se spiraleaza formand un a helix iar catenele copolimerice fiind antiparalele. Planele pentozelor cuplate cu acidul fosforic sunt dispuse la exteriorul duplexului, formand scheletul glucidofosforic paralel pe axa virtuala a dublului helix. Bazele azotate, cuplate complementar si dispuse in interiorul moleculei au planele perpendiculare pe axa virtuala a moleculei de ADN". Planele cuplurilor complementare sunt la distanta de 3,4 A (0,34nm) intre ele. Fiecare cuplu complementar de baze are un unghi de rotatie de 36 in raport cu cuplul urmator. Cuplurile complementare sunt Valori folosite in studiul moleculei ADN: lm = 102cm = 103mm = 106um = 109nm = 1010A metru centimetri milimetri micrometri nanometri Angstromi 28

etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus de stabilitate moleculei de ADN. Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui ax central virtual", se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360 are un pas de 34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri complementare de baze azotate. Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin interrelatii termodinamice: forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen. La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine bazice care neutralizeaza sarcinile negative. Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen. In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are o structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G = C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista toate permutarile posibile de inserare secventiala. Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea, denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca proprietati fizico-chimice mentionam: - prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei molecule ADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiului corespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesaje genetice in ADN-ul genomului uman; - ADN-ul este molecula neramificata, putin rigida. Este o molecula polimerica flexibila si fragila" ; - masa moleculara a moleculei de ADN poate fi estimata la 12-16 x 6 10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46 cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7>ADN in timplul replicarii si sintezei moleculei de ADN. Ei au Herimentat pe ribovirusul Rauscher pentru leucemia murina si pe )ribovfrusul sarcomului Raus. Incuband acesti virusi in prezenta HP(d-nucleozid trifosfat) a ionilor de Mg2+ sau de Mn2' au obtinut un iimer ADN sensibil la hidroliza cu dezoxiribonucleaza. Autorii au Hat ca prin tratarea amestecului obtinut din respectiva hidroliza cu nbonucleaza, sinteza ADN-ului nu avea loc. Bazandu-se pe aceste rezultate pnin si Baltimore au emis ipoteza ca ARN-ul viral este esential pentru Dlimerizarea si sinteza ADN-ului. I Acest experiment elaborat de Temin si Baltimore a evidentiat ca ..ADX-polimeraza dirijata de ARN" sau transcriptaza inversa" este enzima H foloseste ARN-ul, hibrizii ARN-ADN si ADN-ul ca matrita pentru carea ADN-ului din genomul celulelor. [ Enzima transcriptaza inversa" a fost izolata din oncovirusuri din Alele umane si murine (precum soareci, sobolani). La om si murine area transcriptazei inverse s-a realizat atat din celule normale cat si din | cclulc canceroase. [ Mecanismul de actiune a transcriptiei inverse este prezentat ftnatic in fig. 22. 23. schema elaborata de Watson. loose si Kurtz in 83 (..Recombinant DNA").

79

ADN giraza de reducere a spiralizarii ADN(despiralizarea) Helicaza de despiralizare a ADN Proteina SSB de conversie a singurei catene ADN Primozomul forma primara Holopolimeraza III

Topoizomeraza de relaxare a tensiunil SSB Proteina deplasata de catena in crestere

Catena intarziata ndepartarea primerulw si completarea spatiulii Polimeraza Catena Leading rapida (conducatoare)

Ligaza Fig. 22 Factorii implicati in replicarea ADN-ului (proteinele implicate) dupa Adams si col. 1992, si reprodusa dupa Clark si Wall, 1992.

80

ARN 5' 3"

Termina te poliA (poliade ninicS) AAAA AAAA TTTT

flevers transcriptase Primer oligotimidinic virala"

i

ADNc

cNaOH

AAAAAA AA TTTT

B u c I S "ac de par*

eADNc '

TTTT

iADN poiimeraza I

\

i

Nucleaza* SI

/;;'. JJMecanismul transcriptiei inverse. Analizand etapele transcriptiei inverse in sinteza ADNc dublu catenar, cu implicarea ARN- primer, se poate stabili urmatorul mecanism: terminatia poliadenilica din catena ARNm este hibridizata cu o catena scurta oligotimidinica. Secventa oligotimidinica serveste ca primer pentru actiunea revers-transcriptazei ce foloseste catena ARN ca matrita" pentru sinteza catenei ADNc (ADNc= ADN complementar); ADNc rezultat prezinta terminal o bucla in ac de par";

81

c) prin degradarea ADNm cu NaOH, bucla terminala a ADNc devine primer" pentru enzima ADN-polimeraza I; d) in prezenta nucleazei Si, bucla este clivata rezultand molecula de ADNc dublu catenara. Proprietatea revers transcriptazei (transcriptaza inversa) de a sintetiza ADN-ul cu ajutorul matritei de ARNm, este folosita la sintezele artificiale ale genelor, pornind de la un ARN-mesager corespunzator (complementar" structurii unei gene). Se mai foloseste la sinteza ADN-c ca sonda moleculara. Steele (1979) sugereaza ca ARNm din mutatiile somatice poate fi grins'' (acrosat) de un virus si transferat in gonade, iar cu ajutorul reverstranscriptazei sa produca ADN-c, care poate fi integrat in genomul celulelor gametice. Ipoteza lui Steele ar sustine rationamentul cu privire la mecanismul genetic de mostenire a caracterelor dobandite in cursul vietii individului. Desi ordinea etapelor nu este bine cunoscuta in totalitatea proceselor implicate, pot fi considerate urmatoarele etapizari: - sinteza ARN-primer; - extensia sa cu ADN-ul; - indepartarea ARN-primer si inlocuirea lui cu un fragment ADNcomplementarizat(ADNc) de ARN-ul primer; - legarea (covalenta) fragmentelor Okazaki adiacente. ARN-ul primer este sintetizat de un primozom, care este un complex proteic format din: - ARN potimeraza - ADN dependenta, enzima denumita primaza care este codificata de gena DNA-G - doua proteine codificate de genele DNA-B si DNA-C. Sunt proteine care se asociaza cu primaza; - proteinele i, n, n', n" si care recunosc loculde sinteza ARN-primer. Primozomul exercita rolul in sinteza ARN-primer implicat in procesele urmatoare: - pe masura ce helicazele actioneaza pentru ruperea puntilor de hidrogen si separearea monocatenelor complementare din structura ADNului in replicare, proteinele SSB, care mansoneaza catenele pentru a nu se recupla, nu mansoneaza ultimul segment al catenelor complementare, care va prezenta forma unui ac de par". Acest ultim segment va fi recunoscut de primozom. Este segmentul unde se initiaza sinteza ADN-ului. 82

Initierea sintezei ADN-ului in prezenta primozomului si a ARNprimer, catalizata de ADN-polimeraza III, incepe la extremitatea 3'-OH libera a moleculei de ARN-primer. Sensul esterificarii si de cuplare a nucleotidelor ce vor structura catena de novo'Va fi 5'-3\ Pe masura ce se sintetizeaza catena de novo" si cuplarea complementara cu catena matrita, proteinele SSB sunt indepartate. Acest proces se deruleaza pe catena leading. Pe catena logging, unde procesul este discontinuu, in esterificarea 5'3' si formarea catenei de novo", sunt implicate variante ale enzimei ADNpolimeraza III, deoarece aceasta enzima este compusa din subunitati functionale, care sunt codificate de gene diferite. Pe catena logging discontinua pe care, ca prima etapa, se sintetizeaza fragmentele Okazaki, sinteza ADN-ului este intarziata. Fragmentul Okazaki a carei dimensiune ajunge la 1000-2000 b, dupa sinteza sa realizeaza o rotatie de 180 in axul longitudinal al catenei matrita cu care se va cupla complementara. La rotatia de 180 a fragmentului Okazaki este implicata o enzima-invertaza. Rolul invertazei este urmatorul: catena logging are directia de esterificare 5'-3'. Initial fragmentul Okazaki sintetizat are directia de esterificare tot 5'-3'. Pentru a se cupla cu catena matrita logging se produce rotatia in ax longitudinal al fragmentului Okazaki. Dupa rotatie directia de esterificare a fragmentului Okazaki devine 3'-5'. In aceasta stare fragmentul Okazaki se va cupla complementar pe catena logging. In urma acestei cuplari catenele devin antiparalele cu formarea in final a moleculei ADN. Dupa sinteza si cuplarea fragmentului Okazaki cu catena matrita logging, ARN-primer este indepartat, iar golul" lasat este completat de ADN-polimeraza I care prin activitatea exonucleazica, va introduce un nou fragment Okazakic de ADN. Capatul 3'-OH al fragmentului ce se va asocia incontinuare este adiacent capatului fosfat 5'-OH al fragmentului anterior. Legarea fragmentelor Okazaki este realizata de o enzima ADN-ligaza. Zona cuprinsa intre punctul de initiere si fragmentele de ADN replicat este denumita replicon. La om, lungimea repliconului variaza in limite foarte largi, intre 100 si 300 kb, dimensiunea repliconului flind determinata de Huberman si Riggs, inca din 1968. In genomul mamiferelor (si la om) numarul unitatilor de replicare (a repliconilor) variaza intre 2000 si 3000. La mamifere situsurile de initiere a replicarii apar pe zone aleatorii, nu in puncte specifice. Aceste zone contin un niimar de secvente prezente in genom. Fiecare zona are importanta deoarece actioneaza ca initiator al replicarii (fig.24). 83

originea replicarii

_______i_______Furca Xj j j j j j \ Furca 5'------------------ 3' 5'------------------>3'3' 4--------------------5' 3'-

Crestere

Crestere

Fig. 24 Replicarea bidirectionala in sinteza ADN.

Spre deosebire de procariote, complexitatea zonelor de initiere a replicarii este consecinta naturala a genomului, care este complex si necesita mecanisme ample de activare si reglare a replicarii. Se presupune ca activarea unei zone de origine si initiere a replicarii ADNului ar depinde de pozitia in structura tridimensionala si cuaternara a cromozomilor si mai putin de compozitia specifica in nucleotide a repliconului. Huberman si Riggs (1968) au observat ca rata replicarii este diferita la eucariote fata de procariote. Folosind tehnica autoradiografica de analiza a replicarii ADN-ului a observat ca furca de replicare la mamifere ar inainta cu 3kb/min. Dupa initierea replicarii ADN-ului rata de alungire a catenelor de novo" pare a fi constanta, ca derulare, pentru fiecare tip de celula din organism. De exemplu la procariote, intregul ADN din unicul cromozom inelar se replica in 20 minute. La Escherichia coli cromozomul prezinta o singura zona de initiere a replicarii. Are un singur replicon cu doua furci de replicare care inainteaza in sensuri contrare pana cand se vor intalni. Fiecare furca de replicare are o rata de 1600 pb (perechi baze) pe secunda. La om rata replicarii in celulele somatice este mult redusa valoric. Se estimeaza ca ar fi de aproximativ 100-150 pb/sec pentru fiecare furca de replicare.

cS4

Daca luam in consideratie numanil cromozomilor, tipul si cantitatea de ADN (repetitiv si nonrepetitiv), arhitectura moleculelor ADN, prezenta histonelor si arhitectura cuaternara a cromozomilor (nucleozomi, solenoizi, bucle, etc.) la eucariote, sunt consemnate deosebiri esentiale intre procariote si eucariote. Procariotele au un singur replicon, un singur situs de initiere in replicarea ADN-ului, genomul este lipsit de histone si tipuri diferite de ADN (Cairn, 1962). Spre deosebire de procariote, eucariotele au in genomul celular o cantitate foarte mare de molecule ADN, care insumeaza in total un numar de aproximativ 3.5 x 109 pb. Ca urmare prin structure si componenta repetitiva si nerepetitiva este putin probabil existenta unui singur situs de initiere in replicarea ADN (Cairn). La eucariote, replicarea intregului ADN genomic se face intr-un timp limitat, in stadiul interfazic S'. La eucariote apar doua probleme fundamentale in replicarea ADN-ului genomic: - probleme de ordin topografic determinate de structura cromatinei cromozomiale: nucleozomii, solenoizii, buclele. Sunt elemente legate de arhitectura cromozomilor care pot introduce" superspire negative" in morfologia cromozomilor; - o alta problema este ca moleculele ADN-ului in dublu helix, cuplate cu histonele si prezentand si secvente repetitive, trebuie sa se replice integral, intr-un interval foarte scurt de timp. Daca am raporta procesul la eucariote fata de procariote, prin cantitatea si heterogenitatea ADN-ului, ar trebui ca la eucariote timpul necesar pentru replicarea integrala a ADN-ului sa fie de peste 100 ori mai mare la om fata de procariote.(Eschericia coli). Asa cum s-a mentionat, Huberman si Riggs au identificat formarea mai multor puncte de initiere in replicarea ADN-ului cromozomial, puncte ce se gasesc la distante intre ele de 100-300 kb. In raport cu numarul punctelor de initiere putem aprecia numarul repliconilor / cromozom. In genomul uman punctele de initiere s-ar gasi la 150-200 kb distanta intre ele. Luand in consideratie numarul perechilor de nucleotide si distanta intre punctele de initiere, se aproximeaza un numar de aproxiativ 3000 situsuri de initiere. La om repliconii nu se replica sincron. Se observa o replicare asincrona. Asincroniile sunt legate de momentul activarii situsului de initiere si de elongatia repliconului. Asincronia replicarii ADN-ului se observa in stadiul interfazic S". 85

Asincronia in activitatea repliconilor este determinata si de forma de condensare a fibrilei de ADN, de abundenta cuplurilor complementare G = C in structura repliconilor, de cantitatea de ADN repetitiv per molecula si cromozom.

7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in genomul uman

ADN-ul din componenta genomului celular, prezent la procariote si/sau eucariote, datorita interrelatiei cu factorii ambientali ai organismelor vii, poate fi influentat, distructiv , de interferenta agresiva" a unor factori exogeni sau endogeni (vezi cap. mutatii). Aceste distructii mutationale in structura ADN-ului genomic au ca efecte directe modificarea mesajelor genetice inscrise, iar ca efecte secundare aparitia unor caractere noi, care la om se manifesta ca sindroame severe pe fond genetic. Daca s-ar mentine erorile induse in structura si functiile ADN-ului, frecventa, incidenta bolilor pe fond genetic, ar fi alarmant de ridicata. Mai mult, cu fiecare generatie care succede frecventa ar fi in permanenta crestere valorica. Se apreciaza ca frecventa erorilor punctiforme in structura ADN-ului, manifestate ca boli genetice, ar fi de 10~6 la nivelul intregii populatii umane. Dar ADN-ul genomic dispune de mecanisme si procese prin care sa-si corecteze erorile din structura proprie. In cazul cand ADN-ul n-ar avea capacitatea de autoreparare structurala, atunci valoarea mutatiilor punctiforme ar creste de la 10"6, cat se considera mutatiile spontane in populatiile umane, la peste 1000 de ori. Dar ADN-ul genomic uman isi corecteaza propriile erori mutationale, ceea ce explica incidenta scazuta a mutatiilor genice la nivel populational. Factorii populationali ce indue erori in structura ADN-ului genomic pot fi endogeni si/sau exogeni. a) Factorii endogeni - intracelulari. La nivel intracelular pot avea loc o serie de procese care favorizeaza producerea leziunilor in structura ADN-ului genomic. Acestea sunt: pierderea unei baze purinice sau pirimidinice, urmarea hidrolizei legaturilor glicozidice; 86

trans form area adeninei in hipoxantina, care modiflca raportul de complementaritate. In urma dezaminarii adeninei, hipozantina ce rezulta va complementariza cu guanina; radicalii de oxigen rezultati in concentratii crescute pot interfera distructiv (mutagen) ADN-ul; prin procese de metilare a bazelor azotate cu modificarea complementaritatii. b) Factorii exogeni ce produc leziuni in ADN. Factorii exogeni, potentiali mutageni, cu actiune distructiva a structurii si functiei ADN-ului sunt: factori fizici (radiatii ionizante, ultraviolete); factori chimici; factori medicamentosa factori biologici. Catalogul acestor factori mutageni este impresionant valoric si mult diversificat (vezi cap. mutatii).

7.6.1.Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADNIn prezent s-a demonstrat ca in genomul celular au loc procese reparatorii, care asigura integritatea structurala si functia ADN-ului. In procesele de reparare si realizarea integritatii ADN-ului celular sunt implicate complexe enzimatice in mecanismele desfasurate in genomul eucariotelor. a) Complexe enzimatice ce intervin in repararea erorilor ADN.

Endonucleazele Actioneaza asupra situsurilor apurinice/apirimidinice dupa excizia bazelor, excizie indusa de ADNglicozidaze , sau prin incorporarea eronata a bazelor in structura ADN-ului genomic. Unele endonucleaze isi intensifica activitatea de reparare dupa iradierea genomului cu UV (ultraviolete). Prin iradierea cu UV unele endonucleaze excizeaza dimerii pirimidinici care se formeaza pe cateneie ADN-ului. Acest grup de endonucleaze este denumit UV-endonucleaze. ADN-polimerazele - Sunt implicate catalitic in repararea exciziilor din cateneie ADN-ului care prezinta terminatii 3'-OH.

87

ADN-ligazele - Sunt enzime care cupleaza doua catene din structura moleculei ADN prin formarea de legaturi difosforice intre hidroxilii3'-OHsi5'-OH. Topoizomerazele I si II - care pot sectiona una sau ambele catene ale ADN-ului unde s-au produs erori in molecula. b) Mecanismele de reparare a erorilor din ADN la eucariote

Spre deosebire de procariote, la care mecanismele de corectare a erorilor din ADN-ul genomic sunt bine studiate, la eucariote, datorita complexitatii genomului (numar mare de cromozomi, numar mare molecule ADN, etc.) mecanismele nu sunt complet elucidate si cunoscute. Erorile pot rezulta prin cuplarea incorecta intre purine/pirimidine. In timpul replicarii semiconservative cuplarea complementara intre nucleotide nu este respectata" datorita interferentei distructive a unor factori ambientali agresivi". Erorile se produc in urmatoarele situatii: cand incepe despiralizarea si separarea catenelor, este posibila fisura pe una sau ambele monocatene; nerespectarea principiului complementaritatii intre purine si I pirimidine (normal A-T si G-C) a nucleotidelor care se esterifica pe catena I de novo" in raport cu catena matrita". Se pot forma dimerii", cupluri I nucleotidice false (necomplementare); cand asupra nucleului, ADN in replicare, actioneaza factori potential mutageni, inducand suprimare de nucleotide, substitutie sau insertie de baze in catena matrita sau in cea de novo"; formele tautomere ale bazelor azotate, sau ionizarea lor, modifica I raportul de complementaritate cu formarea de dimeri si erori in structura I ADN. Sunt cercetatori care mentioneaza ca sunt posibile erori, dar in I procente foarte mici, datorita cuplarii gresite (eronate) intre purine si I pirimidine. Dupa Covic si Stefanescu (2004), conform reactiilor | stoichiometrice , greselile de necomplementaritate intre nucleotidele de pe catena matrita" si cele esterificate pe catena de novo" se pot produce in raport de 1/10000.5

Stoichiometria (gr. Stoikheion = element + metron = masura). Chimia fizica ce studiaza raporturile cantitative intre elemente in combinatii sau in reactii chimice.88

In genomul celulelor eucariote (sau procariote) sunt sisteme care I identifica eroarea lezionala sau insertionala din ADN, iar pe cale enzimatica pot fi corectate (fig.25 si fig.26). Repararea poate fi realizata prin mecanisme enzimatice implicate in I urmatoarele procese: fotoreactivarea enzimatica, repararea prin excizie, I repararea postreplicare, sau repararea prin alchilare sub actiunea metil transferazei (Anca-Michaela Israil, 2000). Ca mecanisme la eucariote mai consemnam: Mecanismul BER (Base Excision Repair) - Cand ADN -polimerazele nu catalizeaza incorporarea gresita intre bazele azotate pe | catena nou sintetizata, producand distorsiuni in dublul helix al ADN. Capacitatea de autocorectie a ADN-polimerazelor care asigura I complementaritatea corecta intre cuplurile nucleotidice in timpul sintezei fc)N-

ului.4

Rata de corectare a erorilor in timpul replicarii ADN-ului este de 110' -lO"6 prin mecanismul BER si de peste 1000 de ori prin capacitatea ADN-polimerazelor de autocorectare a erorilor din ADN (Covic si Stefanescu, 2004). La om sunt identifiacate complexe genice care codifica sinteza proteinelor MSH2, MSH3 si GTBP. Aceste proteine pot recunoaste erorile de imperechere, iar cuplul MSH2 / MSH3 are capacitatea de a identifica insertiile si deletiile punctiforme ce survin in structura ADN. Restitutia moleculei ADN lezata poate fi: completa, fiind identica cu structura initiala a moleculei ADN; restitutie partiala a moleculei; reparatie nerezolvata, molecula ADN necorectata va fi prezenta in genom ca molecula mutanta. Prin lipsa capacitatii de reparare a leziunilor" apar disfunctii" severe in organism. De exemplu, indivizii care prin mutatie isi pierd capacitatea de reparare a ADN-ului la actiunea UV, prezinta maladia cunoscuta sub denumirea Xerodermie pigmentara".

89

u.v. i i i i i i i i i i i ii i i i i i

i i i ] i i ii i i i i i i

iiII

i i i i i i i ii i i i

**>i i i i i i i i i i i i i ii i i i i i i

/s yi i i i i i i i i i i i i ii i i i i i i

i i i i i ii i i i i i iii i i i i ii

Fig.25 Schema generala de reparare a ADN: 1 leziunea produsa de UV; 2formarea dimer-timinei; 3ruperea catenei de catre ADN - endonucleaze si ADN-glicozidaze; 4incepe corectarea leziunii catenei de novo", de ADN-polimeraze si I ADN-ligaze; 5excizia completa a regiunii lezate de UV de catre topoizomerazele I I sill; 6cuplarea si completarea sectiunii lezate si refacerea ADN-ului.

90

-**"!"'

I T G ' A C

1T C 1| T G 1C 1 1A 11 |1

|G C

| |C GA

11

A

G

11"f A G C T A

I

A

A

c

c

G

G

T

C G

1

1iradiere UV 1 1A T A T dimer timinic G C C G A C G G C

C G

fotoliaza' (pozitionare)

absorb tie onerqie UV

' IId)

T # T

I*

T

C A G T

J___I_ _I___I_ _L _ _eliberarea enzimei

G C

T A

C A T G T A

1 G A C

C G

C G

C G

A T

26 Etape in repararea erorilor moleculei de ADN

91

CAPITOLUL III

ANATOMIA GENOMULUI UMAN CROMOZOMII

La organismele eucariote si om, cea mai mare cantitate de ADN este localizata in nucleu in formatiuni pe care Weldever (1883) le-a denumit cromozomi. Prin definitie, cromozomii sunt elemente cu aspect filamentos de natura nucleo-proteica, prezenti permanent in nucleul celulei. Individualizarea si analiza cromozomilor este posibila in fazele ciclului mitotic sau meiotic, in special in metafaza mitotitca, precum si studiul lor la microscopul electronic. In interfaza ciclului celular la eucariote, cromozomii sunt condensati formand asa numita cromatina nucleara, ca in mitoza sa prezinte aspectul filamentos hipercondensati. Cromozomii sunt elemente dinamice si constante, a caror functie si activitate genetica sunt esentiale pentru viata celulei, pentru viata organismului. Cromozomii se gasesc la toate organismele eucariote, si unele procariote, la care numarul, forma, talia sunt trasaturi caracteristice fiecarei specii.

92

1. Etape in analiza genomului umanGeneticianul francez Dutrillaux (1976) considera parcurgerea a trei etape principale in analiza si studiul genomului uman si anume: - etapa socului hipotonic - etapa trizomiilor - etapa bandarii cromozomilor Totusi o etapa istorica in studiul aparatului genetic la om este Proiectul Genomului Uman" care, primele rezultate obtinute de geneticieni, au fost publicate in anul 2000. Pana in 1956, genetica era abordata conceptual, fiind consemnate si unele cercetari experimentale de certa valoare stiintifica cum sunt experientele lui Gr. Mendel (1865) facute pe Pissum sativum (mazare), iar Th. Morgan (1903-1911) pe Drosophila melanogaster (musculita de otet). Rezultatele lor sunt deosebit de valoroase pentru fundamentarea stiintifica a geneticii. De exemplu Mendel a formulat legile segregarii si transmiterii caracterlor ereditare, legi care au caracter universal in lumea vie a organismelor cu reproducere sexuata, iar Morgan a elaborat teoria cromozomiala a ereditatii. Dar, datorita dezvoltarii tehnicilor si metodelor cu aplicabilitate de studiu in genetica umana (in mod deosebit) a inceput cercetarea diversificata si aprofundata asupra genomului uman. De exemplu, cercetatorul Hsu (1956), introducand socul hipotonic asupra celulelor mitotice, a reusit pentru prima data, sa stabileasca numarul corect de cromozomi in celulele somatice la om. Aceasta descoperite a fost considerata atat de importanta incat atomistul Hanschka (1961) a declarat Homo sapiens a cunoscut nucleul atomic inainte de a cunoaste numarul cromozomilor din celulele propriului corp". Cu ajutorul acestei metode s-a efectuat studiul analitic al cromozomilor umani la subiectii normali sau cu diverse sindroame genetice. De exemplu intre 1956 - 1970 s-a studiat morfologia cromozomilor, originea cromozomilor - materni si paterni (Ford si Hamerton 1956), iar in 1959 Legeune, Gauthie si Turpin au stabilit ca etiologie a sindromului Down, prezenta unui cromozom acrocentric 21, in plus (cariotipul: 47,XX + 21 sau 47,XY + 21).

93

A urmat apoi identificarea modificarii numarului de cromozomi, ca etiologie genetica in sindroamele: Turner, Patau, Eduards, Klinefelter, superfemele, etc. Etapa trizomiilor. O data memorabila este anul 1970 cand incepe o noua etapa in analiza si studiul genomului uman. Este etapa bandarii cromozomilor,, Prin bandarea cromozomilor se identifica omologia corecta a cromozomilor, precum si eventualele modificari, in structura cromatidelor cromozomale, care, cu microscopul optic si metoda Hsu nu puteau fi identificate. Incepand din anul 1980 pana in prezent analiza cromozomilor umani se extinde asupra infrastructurii si secventializarii nucelotidelor din genomul uman. Aceste studii deschid noi orizonturi de analiza teoretice dar mai ales cu aplicabilitate in patologia umana. Este etapa Proiectul Genomului Uman".

2. Numarul cromozomilor la omPrimele enuntari legate de genomul uman apartin lui Fleming (1882) care introduce notiunea de ,,crornatina'', considerand cromozomii segmente colorabile ale nucleului. Dupa ce Waldeyer introduce notiunea cromozom" a urmat incercari nereusite de a stabili numarul cromozomilor la om. De exemplu, Hansemann (1897), considera ca celula somatica la om ar avea intre 16 si 36 cromozomi, iar Winiwater (1912) lanseaza ipoteza ca barbatii ar avea 47 cromozomi (47, X) in celula somatica iar femeia 48 cromozomi (48, XX). In 1920, H.Winkler introduce notiunea de genom". Dupa el, genomul este setul haploid de cromozomi din celula gametica. In prezent, prin genom se considera setul complet de gene particulare fiecarei specii. Anul 1956 este important deoarece s-a stabilit numarul corect al cromozomilor in celula somatica: 2n = 46 cromozomi. Studiile citogenetice comparate la diverse specii eucariote au evidentiat variatii numerice in limite foarte largi (Tabel III).

94

Tabel III. Numarul cromozomilor la unele specii de eucariote Specia Homo sapiens (om) Macaca mulata (maimuta Rhesus) Pan troglodytes (cimpanzeu) Bos taurus (bovine) Canis familiaris (cainele) Felis domestica (pisica) Eqvus cabalus (cal) Mus musculus (soarece) Raltus norvegiens (sobolan) Cyprinus carpio (crap) Drosophila melanogaster Musca domestica Ascaris megalocaphala univaleus Numar diploid de 46 V , 42 ^ 48 60 78 V 38 ^ 64 V 40 V 42 V 104 \/8 v

12 2 V

Din exemplele din tabel observam ca numarul cromozomilor in celulele somatice nu respecta gradul evolutiei bio-genetice si complexitatea structurala si functionala a speciilor. In consecinta numarul cromozomilor nu este criteriu taxonomic sa stabilim evolutia si pozitia filogenetica a speciilor. De exemplu la vertebtrate sunt specii inferioare filogenetic" cum este Cyprinus carpio cu 104 cromozomi, in timp ce omul are 46. Speciile cu reproducere sexuata poseda doua tipuri de celule, diferite prin numarul de cromozomi: celulele sexuale (gametii) au un set simplu de cromozomi - denumit set haploid sau garnitura gametica, notat cu n"; celulele somatice cu numar dublu de cromozomi, garnitura diploida, notata cu 2n". In nucleul celulei somatice diploide, fiecare cromozom este dublu reprezentat, unul de origine materna, adus de ovul, al doilea patern, adus de spermatozoid. Ei alcatuiesc perechea de cromozomi omologi, deoarece au aceeasi dimensiune, aceeasi morfologie si aceeasi valoare genetica. Cum numarul diploid se realizeaza in procesul de fecundatie, rezultand zigotul, el poate fi numit si garnitura zigotica. Omul este specie somatica diploida, cu gameti haploizi6. Numarul cromozomilor din setul haploid gametic este de 23 (n - 23). Celula Scurtarea fazei haploide in favoarea celei diploide este caracteristica organismelor eucariote superioare95

somatica diploida contine 46 cromozomi (2n = 46), respectiv 23 perechi de cromozomi, respectiv suma a doua seturi haploide. Dupa functia genetica in celule exista doua grupe de cromozomi: autozomi (somatici) si heterocromozomi sau gonozomi. Heterocromozomii sunt numiti si cromozomi sexuali deoarece determina sexul genetic al individului. De exemplu, in celula somatica diploida sunt 44 autozomi, dispusi in 22 perechi de cromozomi omologi, doi cate doi. Dar in celula somatica exista si doi cromozomi sexuali, care, raportati la cele doua sexe nu prezinta omologie morfo-structurala si functionala, si anume: la femeie avem doi cromozomi X (XX), la barbat un X si un Y (XY). La om, specie cu reproducere sexuata, dupa pubertatea ontogenetica, gasim un tip de celule care difera de celulele somatice, prin numarul cromozomilor. Sunt celulele sexuale (gametii) la care numarul cromozomilor este redus la jumatate, fata de celulele somatice. La om celulele sexuale au 23 de cromozomi: 22 autozomi si un cromozom sexual, care, in functie de sex poate fi X sau Y. Cum la femeie intre ovulele ce pot fi elaborate prin ovogeneza nu exista diferente genetice, prezentand aceeasi formula cromozomiala - 23 X, inseamna ca ea va elabora acelasi tip de ovula. Deci femeia este homogametica. La barbat, dataorita neomologiei cromozomilor sexuali (XY), in spermatogeneza se vor repartiza cromozomul X intr-un garnet, iar Y in altul. Ca urmare, barbatul elaboreaza doua tipuri de gameti care se deosebesc prin tipul de cromozom sexual prezent, X sau Y. Deaceea barbatul este considerat heterogametic. Prin fuzionarea a doua celule haploide gametice se obtine zigotul, celula diploida din care se va dezvolta viitorul organism uman. La om, ca la toate speciile cu reproducere sexuala, ontogenetic este parcursa alternanta intre celulele somatice diploide ca numar de cromozomi (diplofaza) si celulele gametice haploide (haplofaza) (fig. 27).

96

"

6,XY^-^ 46.XX Ovul fecundat (zigot) (2N) Spermatozoid (N) Ovul (N) -

Diplofaz a

I

^ Ovogonie Spermatogonie "" ^ f(2N) (2N Haplofaza

Fig. 27 Alternanta genomului la om: diplofaza - haplofaza

Sunt cazuri cand starea fiziologica a organismului sau influenta unor factori agresivi externi, pot influenta ciclul celular (meioza sau mitoza), modificand numarul cromozomilor. Prin aceste modificari apar celule aneuploide (vezi mutatiile). Sunt deviatii de la numarul cromozomilor in celula somatica sau gametica. In cazul cand in organism exista o populatie celulara aneuploida, numeric crescuta, se indue dereglari in morfologia, anatomia si functia orgnanismului, a caror etiologie clinica se incadreaza in grupul sindroamelor genetice". Aneuploidia apare foarte rar la subiectii normali fiziologic. De exemplu C. Brown (1966) a constatat la unele persoane normale, dar inaintate in varsta, existenta unor celule la care lipseste un cromozom. El a gasit un procent de aproximativ 7% limfocite, cu 45 cromozomi (monozomie) la unele femei care au depasit varsta de 60 ani. Cromozomul 97

absent probabil, fund cromozomul X. La barbatii peste 60 de ani, unii aveau in sangele periferic 1-2% limfocite cu 45 cromozomi, absent fiind probabil cromozomul Y. Deci aneuploidie prin pierderea unui cromozom.

3. Dimensiunea genomului umanDesi structura fizica a nuceleelor celulelor la eucariote este similara pentru toate speciile, sunt consemnate diferente de lungime, de dimensiune a genomului. De exemplu, la eucariotele inferioare genomul poate avea o lungime de aproximativ 10 Mb, in timp ce la eucariotele superioare lungimea genomului depaseste 100 000 Mb . Deasemenea apar diferente de dimensiune si lungime a genomului intre procariote si eucariote. Unii geneticieni considera ca lungimea genomului este concordanta cu complexitatea structurala a speciilor analizate (tabel IV) . Tabel IV Exemple de dimensiune a genomului la diverse specii de organisme (publicate si analizate in cadrul proiectului de secventializare)Specia Lungimea genomului in Mb 3200 3300 180 97 12,1 4,64 4,41 2,16 16000 120000 Autorii

Homo sapiens Mus musculus (soarece) Drosophila melanogaster Nematode Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli K12 Mycobacterium tuberculosis Streptococcus pneumoniae Triticum aestivum Fritillaria assyriaca

Venter si col. (2001); HGSC (2001) -//Adams si col. (2000) CESC(1998) Goffean si col. (1996) Blattnersicol. (1997) Cole si col. (1998) Tettelin si col. (2001) -//-//-

Lungimea genomului este in concordanta cu complexitatea structurala o organismelor (vezi tabelul). Astfel la ciuperci dimensiunea98

genomului este foarte redusa (12,1 Mb) in timp ce la vertebratele superioare poate ajunge pana la 3200 Mb (la om) si 3300 Mb (la soarece). Iar la unele I specii de plante dimensiunea genomului este impresionanta de 16 000 si chiar 120 000 (la exemplele din tabel). Dimensiunile foarte crescute la vertebratele superioare sunt legate de numarul genelor din genom, care la om este de aproximativ 30 000 - 40 000 gene informational active. Marea variatie a dimensiunii genomului la eucariotele superioare, este legata si de numarul secventelor repetitive care variaza de la 106 pentru ADN inalt repetitiv pana la 103-10 pentru ADN-ul moderat repetitiv, fata de cateva zeci de mii de copii pentru ADN cu secvente unice". Legat de paradoxul valorii C, s-a crezut mult timp ca exista o corelatie intre complexitatea structural-morfologica si functionala a organismelor si dimensiunea genomului nuclear la eucariote. Daca la eucariotele inferioare este o cantitate foarte mica de ADN in I genomul nuclear, in raport cu existentul in genomul eucariotelor superioare I (vertebrate) explicatia ar fi urmatoarea : la eucariotele inferioare genele I functionale sunt mai grupate si au mai putin ADN repetitiv in timp ce la vertebratele superioare este o accentuata dispersare a genelor functionale in genom, distantate de secventele repetitive din genom. Dar moleculele ADN sunt in strctura si functia cromozomilor. In Iconsecinta lungimea totala a genomului nuclear, o gasim repartizata pe segmente" moleculare in cromozomi. Ca urmare in functie de cantitatea ADN prezenta in fiecare cromozom din totalul genomului nuclear, cromozomii pot avea dimensiuni variabile. Deasemenea dimensiunea cromozomilor este conditionata si de prezenta (variabila cantitativ) moleculelor de ADN, repetitiv si nerepetitiv, precum si in raport de functia exercitata de celula in organism. In aceste conditii putem admite ca la eucariote putem face o clasificare a cromozomilor dupa dimensiune (talie, grosime) in raport cu genomul diferitelor specii eucariote. De exemplu la eucariote putem observa urmatoarele dimensiune ale cromozomilor: - cromozomi mici, intalniti la unele nevertebrati inferioare, la reptile, la pasari; - cromozomi mari, intalniti la vertebratele superioare si om; - cromozomi uriasi sau politeni, prezenti in glandele salivare la diptere (insecte). In raport cu factorii implicati, lungimea si grosimea cromozomilor variaza in limite foarte largi. 99

De exemplu, la om lungimea (talia) cromozomilor variaza intre 1,5 10 /I, iar diametrul (grosimea) intre 0,2 - 2 /x . Dar lungimea si grosimea cromozomilor variaza si in raport cu fazele ciclului celular. Daca in interfaza ciclului celular, cromozomii dispusi in tandem (sinapsis) sunt sub forma de filamente foarte fine si lungi (grosimea putand varia intre 35-100 A) formand cromatina nucleara, in ciclul mitotic ei se individualizeaza si sunt usor de analizat. In ciclul mitotic incepe spiralizarea si hipercontractia (hipercondensarea) fibrilei de ADN din cromozomi (hiper - hiper -spiralizarea - polisolenoidica, a polibuclei, forma si condensarea fibrilei de nuceloproteina). Prin procesele de hiper-spiralizare si condensare (contractia cromatidelor) cromozomii se vor scurta considerabil ca talie. De exemplu, Onuki (1968) si Ruzicka (1973) analizand cromozomii la microscopul electronic au observat ca intr-o faza amitotica, progresiv, filamentul de ADN se hiperspiralizeaza si condenseaza (contractia fibrilei). Aceste procese observate sunt maxime in metafaza mitotica. Prin aceste procese, grosimea creste, urmata de reducerea taliei cromozomilor. Talia sau lungimea cromozomilor poate fi apreciata cu ajutorul urmatoarei relatii: L=P + q

Y.22A + XL = lungimea relativa a cromozomului. p+q = lungimea totala a cromozomului ( p este bratul scurt, q este bratul lung al cromozomului); E = este suma lungimii a 22 autozomi + cromozomi sexual X (lungimea cromozomilor dintr-un set haploid). Se apreciaza ca prin hiperspiralizare si condensarea fibrilei de ADN, talia cromozomilor s-ar reduce (aproximativ) de 20 ori, in raport cu extensia posibila a fibrilei. Dar lungimea si grosimea cromozomilor, pot fi modificate ireversibil atunci cand asupra celulei actioneaza unele medicamente (ex. citostatice ), unele noxe chimice sau agenti fizici. De exemplu, daca ciclul mitotic se deruleaza la temperatura ridicata sau in prezenta colchicinei, cromozomii se scurteaza si se ingroasa 100

considerabil. In schimb prezenta unor compusi alchilanti indue o ireversibila despiralizare si decontractare a cromozomilor.

4. Morfologia cromozomilorPrin analiza cromozomilor in metafaza ciclului mitotic la microscopul optic, se pot observa unele particularitati legate de morfologia cromozomilor, datorita procesului de hiperspiralizare si condensare in aceasta faza. Elementele legate de morfologia cromozomilor sunt urmatoarele (fig.28) 101

c.s. cm

c.s.

q

Fig.28 Morfologia generala a cromozomilor a)- Cromatidele (fig.28)

Intr-un ciclu celular cromozomii parcurg doua etape distincte morfologic: etapa de cromozom monocromatidic si cea de cromozom dicromatidic. Etapa de cromozom monocromatidic o parcurge anafaza si telofaza ciclului mitotic precum si in stadiul Gi interfazic.

102

Etapa de cromozomi dicromatidici - Stadiul de cromozom dicromatidic il gasim in stadiul G2, interfazic, precum si in profaza si metafaza mitotica. O referire speciala este pentru stadiul S-interfazic. In stadiul S are loc replicarea semiconservativa a fibrilei de ADN din cromozomul monocromatidic. Prin replicare se dubleaza cantitatea de ADN. Progresiv, pe masura ce fibrila de ADN se replica semiconservativ, fibrilele rezultate se vor separa, rezultand doua cromatide identice sau surori. Cele doua cromatide se mentin cuplate pana la sfarsitul metafazei, in punctul numit centromer. La sfarsitul metafazei are loc clivajul ecuational la nivelul centromerului avand ca rezultat separarea celor doua cromatide. Din momentul separarii fiecare cromatida devine cromozom monocromatidic (fig.29) pentru urmatorul ciclu celular.

,Gj_______SjJ_______, PROFAZA METAFAZA ANAFAZA_______TELOFAZ.A INTERFAZA MITOZA INTERFAZA

Fig.29 Alternanta mono - si dicromatidica a cromozomilor intr-un ciclu celular. In anafaza, fiecare cromatida separata prin clivajul centromerului (cromatidele dupa separare devin cromozomi monocromatidici) se va deplasa spre unul din polii celulei in mitoza, sau in anafaza meiozei secundare. Prin aceasta repartitie a cromatidelor surori la cei doi poli ai celulei in diviziune (a cromozomilor monocromatidici) se asigura repartitia identica" a materialului genetic in celulele fiice rezultate.

103

b)- Centromerul - ultrastrucutra Centromerul, numit si constrictie primara este zona unde cele doua cromatide surori, rezultate prin replicare semiconservativa, raman unite pana la sfarsitul metafazei mitotice si in metafaza secundara meiotica. Centromerul este o particularitate morfologica constant prezenta la nivelul fiecarui cromozom, mentinandu-si pozitia la nivelul cromatidelor. La cromozomii umani, centromerul apare ca o conexiune punctiforma, deoarece cromatidele in acea zona de cuplare au o grosime foarte mica. Datorita acestui aspect, i s-a atribuit si denumirea de constrictie primara. Imaginea electronomicroscopica arata ca centromerul, la cromozomii umani ca la toate eucariotele superioare, este alcatuit din trei domenii: domeniul central, domeniul de imperechere si kinetocorul, domenii care au fost descrise de Politi si colaboratorii (2002). Bogat in heterocromatina, centromerul este un complex de proteine si ADN repetitiv, neinformational si netranscriptibil. Miezul centromerului format din ADN alfa satelit, datorita variatiei numarului de cupluri nucleotidice in secventele repetitive (variaza intre 5 pana la 171 pb), prezinta un accentuat polimorfism. Polimorfismul centromerului poate fi observat prin variatiile cantitative ale heterocromatinei centromerice constitutive. ADN-ul alfa satelit, asociinduse cu proteinele centromerice (ex: CENP-A, CENP-C, CENP-I) este implicat in organizarea centromerului (proteinele centromerice identificate sunt: CENP-A, B, C, D, E, F, G, H si I). ADN centromeric, asociat cu proteina CENP-A(proteina omoloaga histonei H3) se replica la mijlocul stadiului S interfazic. Aceasta asociere este prima etapa in determinarea morfologica a centromerului. Ross (1977) si Clophan (1978) au stabilit ca centromerul cromozomilor are o structura complexa. Initial ei au confirmat ca la nivelul centromerului apar doua formatiuni cu aspect granular pe care le-au denumit cu kinetocor, formatiuni care se dispun simetric axului longitudinal al cromozomilor, cu ajutorul carora se cupleaza de fusul mitotic. Kinetocorii sunt domenii distincte si tranzitorii din structura centromerului. Formandu-se la sfarsitul profazei sunt activi in metafaza si anafaza, ca in telofaza sa aiba parte o dezansamblare. In 1999 Van Hooser si col., examinand kinetocorii la microscopul electronic, observa ca au structura trilaminata si anume: stratul extern dens a carei coroana este vizibila numai cand kinetocorul nu este atasat de microtubuli; 104

stratul intermedial" luminos ingust si clar, care separa stratul extern de stratul intern; stratul intern dens, care se continua cu heterocromatina comisurala, prin care cromatidele sunt cuplate pana la clivajul ecuational al cromozomilor. In stratul extern sunt incluse proteinele motorii CENP-E precum si proteinele punctului de control al fusului mitotic de tipul Madl, 2, Bubl, 3 etc. Kinetocorii indeplinesc trei functii: se ataseaza de captetele microtubulilor fusului de diviziune; genereaza forte pentru deplarasarea cromozomilor deveniti prin clivaj monocromatidici; de a nu incepe anafaza pana cand toti cromozomii sunt toti atasati fusului de diviziune. Prin pozitia centromerului in cromozom, cromatidele sunt subdivizate in doua brate, care pot fi egale sau inegale ca lungime. Conventional, bratui scurt, numit si brat proximal se noteaza cu p" si bratui lung sau distal notat cu q". Pentru a stabili corect pozitia centromerului si diferenta de lungime intre bratele p" si q", se folosesc urmatorii indici de calcul si exprimare: indicele centromeric (i.e.) =----------= lugimea bratului scurt x 100 / p+q lungimea totala a cromozomului; diferenta de lungime intre brate (d) = q-p raportul intre brate (r) = . P Vezi tabelele V si VI. Prin pozitia centromerelor si diferentelor de lungime intre brate, in genomul uman se identifica trei tipuri morfologice de cromozomi: (fig.30). cromozomi metacentrici, care au centromerul in pozitie centrala, iar bratele p" si q" aproape egale (p ~ q ); cromozomi submetacentrici. Au centromerul pozitionat spre extremitatea cromatidelor, iar bratele sunt inegale ca lungime. De exemplu bratui p" reprezinta ca lungime aproximativ 1/3 din lungimea totala a cromozomului, iar bratui q" 2/3; cromozomi acrocentrici. Sunt cromozomii care au bratui p" foarte scurt (de aproximativ 2-3/10 din lungimea cromozomului), iar bratui q" lung (aproximativ 7-8/10 din lungimea cromozomului). La cromozomii

105

acrocentric! putem terminala.

considera ca centromerul este in pozitie aproape

METACENTRIC

SUBMETACENTRIC

ACROCENTRIC SATEUT PUNTE CROMATICA

CENTROMER

18 17

21

22

Fig. 30 Tipuri morfologice de cromozomi umani Tabel V. Clasificarea tipurilor de cromozomi dupa lungime si pozitia centromerelor. Lungimea cromozomil or Mari Mijlocii Mici Pozitia centromerului Metacentrici Submetacentri Acrocentric! A1;3 E B 2,4-5 -II16 F C6-12.X D 13-15 19-20 E 17-18 G21 -22,Y

Tabel VI. Valoarea indicelui centromeric ( i.e.) la tipul morfologic de cromozomi. Tipul de Metacentric Submetacentric Acrocentric Valoarea I.e. 46-49 26-45 17-30

b) - Constrictiile secundare Sunt cromozomi care au constrictii si in alte zone ale bratelor cromatidice. Deoarece este o pozitie aleatorie, nu toti cromozomii le prezinta si nu intotdeauna sunt observabile, au fost numite constrictii secundare. La unii cromozomi (1, 9 si 16) pozitia constrictiei secundare este constatnta in generatiile celulare care succed. Prin pozitia constanta

106

constrictia secundara este o particularitate morfologica de a indentifica un cromozom, precum si omologul sau. Ca zone de decondensare a fibrilei de nucleoproteina, constrictiile secundare pot fi identificate si cu ajutorul microscopului optic la cromozomii 1, 9 si 16, la care pozitia este pe bratele "q", in apropierea centromerului. Uneori apare constrictie secundara in zona mediana a bratului "q" a cromozomului sexual y, precum si pe bratele "p" la cromozomii acrocentrici. Daca pozitia constrictiei secundare poate fi constanta pentru unii cromozomi, in schimb zona de extindere pe cromatida este variabila: spatial redusa sau extinsa. 0 observatie interesanta a fost facuta de Sasaki si Makino (1963) care, cultivand celulele timp de sase ore pe un mediu de cultura lipsit de calciu, a constatat accentuarea constrictiei secundare la bratele "q" a cromozomilor 1, 9 si 16. Conform observatiei facute de ei, se pare ca ionul calciu, ar fi implicat in gradul de nespiralizare a fibrilei de nucleoproteina in zona constrictiilor (nespiralizare prin lipsa calciului). Mai tarziu Dutrillaux (1971) a consemnat ca gradul de extindere spatiala a constrictiei secundare pe bratul "q" al cromozomului 9 variaza in limite foarte largi: de la 1 la 5 unitati. El a stabilit ca aceste variatii dimensionale sunt caracteristici individuale. In 1972, Gagne si Laberge au emis ipoteza ca variatiile de extindere spatiala a constrictiei secundare ar fi determinate de prezenta unui situs fragil, unde este ADN repetitiv. Lubb si Ruddle (1971) au identificat o constrictie secundara pe bratul "p" la cromozomul 9 uman, constrictie, ca localizare, frecvent prezenta la populatia negroida din SUA. Datorita polimorfismului de dimensiune, constrictia secundara poate servi ca marker morfologic pentru identificarea indivizilor, cu valoare antropologica, dar si ca marker pentru cartografierea cromozomilor. De exemplu, constrictia secundara de pe bratul "q" al cromozomului 1 a servit ca marker pentru a stabili locusul genei pentru sistemul eritrocitar genetic Duffy, iar colectivul de geneticieni de la facultatea de Medicina din Craiova, condus de profesorul Chita a constatat la pacientii cu handicap psihoneurologic (deficienta mentala), o extensie spatiala a constrictiei secundare pe bratul "q" la la cromozomul 9. Deci locusul genei pentru dezvoltarea psiho-neurologica ar fi in zona limitrofa constrictiei secundare pe bratul "q" cromozom 9. Prin extensie respectiva sau respectivele gene au fost "represate". 107

Dutrillaux (1972) considera ca fragilitatea constrictiilor secundare ar fi responsabila de unele translocatii intercromozomiale cum ar fi translocatia reciproca intre cromoxomul X si banda 1 q 31. d) Satelitii cromozomiali sunt mase mici de cromatina localizate la extremitatea terminala a bratelor "p" (scurte), la cromozomii acrocentrici, separati de centromer prin prezenta unei constrictii secundare accentuate. Cu aspect corpuscular, sunt intens si uniform colorati cu colorantii specifici. La om, satelitii sunt observati la nivelul cromozomilor acrocentrici din grupa D (cromozomii 13 - 15) si grupa G (cromozomii 21 si 22). Toate cele cinci perechi de acrocentrici pot avea sateliti, dar numarul cromozomilor satelizati dintr-o anumita celula este variabil si nu depaseste, de regula cifra 9 (Fergusson Smith si Handmarker 1963). Mai rar, apare formatiune satelitica si pe cromozomul 17. Pe cromozomul y (acrocentric) nu apar sateliti. Dimensiunea variabila si aditia diferentiata a colorantilor bazici specifici asigura un polimorfism accentuat al cromozomilor, iar filamentele de cuplare la cromozom, prin grosime si lungime, prezinta o mare diversitate. Aceste elemente servesc drept criterii de comparatie intre indivizi, de a identifica un individ (in raport de tipul constitutional genetic) de a stabili (in anumite limite) filiatia genetica. Uneori se observa sateliti divizati in doua portiuni de cromatida datorita prezentei a doua constrictii secundare la distante mici, pe bratul "p" al acrocentricilor. Filamentele de cuplare ale satelitilor de cromozom sunt de natura hetero cromatina constitutiva. Frecvent in timpul mitozei sau meiozei, extremitatile satelitare se asociaza, fenomen denumit asociatie satelitara rezultand translocatiile echilibrate (t. robertsoniene). Luciani si col. (1968) au stabilit ca la nivelul filamentelor satelitice sunt localizate genele, complexul de gene, care codifica sinteza moleculelor de ARNr (ARNR: ARNr 5S si ARNr - 5,8 S) de aceea, acest nivel se asociaza cu denumirea de organizator nucleolar (fig.31). Formatiunile satelitice, desi sunt implicate direct in patologia genetica, pot servi ca marked morfologici pentru elucidarea unor mecanisme ce se produc in ciclul mitotic sau meiotic. Satelitii, datorita polimorfismului accentuat, pot fi folositi ca marked in urmatoarele cazuri: - care cromozom acrocentric supranumerar este corect identificat din grupele D sau G (in sindrom Patau, Down etc.); - care genitor este "responsabil" de non-disjunctie meiotica in trizomiile acrocentricilor; 108

- sa stabilim daca non-disjunctia s-a produs in meioza primara sau secundara. De exemplu daca celula, genetic, este diplosomica (adica avem uncromozom acrocentric in plus, numarul cromozomilor fiind de 24 in loc de 23) iar doi cromozomi acrocentrici au satelitii cu aceleasi particularitati [morfologice si intensitatea de aditie a colorantilor bazici speciflci, nondisjunctia a avut loc in meioza secundara. Daca intre cromozomii acrocentrici nu consemnam identitate, non-disjunctia s-a produs in meioza primara.

Satelit a r. Genomul uman contine 3 x 10 pb pentru fiecare cromozom. In fiecare cromozom se gaseste o molecula liniara de ADN care cuprinde ADN cu secvente unice, ADN moderat repetitiv si ADN inalt repetitiv (cu secvente foarte scurte necodificatoare care se repeta de un numar foarte mare de ori). (a se vedea tipurile de ADN celular, capitolul II). Cantitatea ADN-ului cromozomial nu exprima un raport direct proportional cu complexitatea structural functionala, cu evolutia j filogenetica a speciilor. De exemplu, amfibienii au cea ma mare cantitate de I ADN in genomul celular in raport cu existentul ADN in genomul celulei 119

umane. Un exemplu interesant il reprezinta lalelele (plante) care au in genom o cantitate de 10 ori mai mult ADN fata de genomul uman. Prin analizele fizico-chimice si stabilirea masei moleculare a ADN, in componentele nucleotidice (3,2 Gb - giga baze) s-ar gasi 3,2 x 10 pb. Dupa Kaplan (1989), fiecare cromozom contine o molecula de ADN. La unele eucanote lungimea moleculelor din componentaQ

cromozomilor variaza intre 6,7 x 10 pana la 1x10 pb. Casperson, folosind metoda microspectrofotometrica in UV a stabilit ca, in general, continutul ADN-ului intracromozomial este proportional cu lungimea fiecarui cromozom. De exemplu, cromozomul 1 cu lungimea cea mai mare din genomul uman, contine 279 Mb, iar cromozomul 22, eel mai mic, acrocentric, are 48 Mb. Continutul pb in cromozomi umani, de la 1 la 22 (autozomii), valoric descreste progresiv de la 279 Mb pana la 45 Mb pentru cromozomul 21, si 48 Mb pentru cromozomul 22. b) - ARN-ul cromozomial In extractele nucleare s-au identificat molecule hibride ADN -ARN. Asemenea complexe hibride variaza cantitativ cu fazele ciclului celular. De exemplu, in stadiul interfazic Gl, cantitatea de ARN in cromozomi este crescuta. Aceasta crestere a moleculelor de ARN in nucleu este motivata deoarece in acest stadiu are loc in celula o activitate intensa de sinteza a proteinelor, iar moleculele de ARN sunt necesare si implicate in aceste procese de sinteza. Cantitatea complexului hibrid ADN - ARN este crescuta in zonele eucromatice ale cromozomului. In stadiul interfazic S" cand are loc replicarea ADN-ului cromozomial, cantitatea de ARN este foarte redusa. In general in cromozomi cantitatea de ARN variaza intre 12 si 13 %.

7.1. Proteinele cromozomaleLa eucariote, ADN-ul din cromozomii nucleari este asociat cu proteinele, formand complexe de nucleoproteine sau fibra de cromatina. Proteinele din fibra de cromatina pot fi de doua tipuri: proteine de tip histone si proteine non histone. In ansamblu cantitatea de proteine histonice si nonhistonice din cromozomi este de 68-72 %.

120

7.1.1 Proteinele histoniceHistonele reprezinta o clasa de proteine bazice, cu masa moleculara mica si incarcatura pozitiva. Ele interactioneaza cu gruparile fosfat din ADN prin fortele electrostatice si ionice pentru a neutraliza incarcatura negativa a acestor grupari. Asocierea histonelor cu molecula ADN, cu fibrila ADN-ului cromozomial, se face in stadiul S interfazic al ciclului celular, in imediata vecinatate a bifurcatiei de replicare a ADN-ului. Cuplarea histonelor cu ADN-ul si prezenta lor in structura cromozomilor este numai la organismele eucariote. Genomul procariotelor este lipsit de histone. Structural, histonele lipsite de activitate enzimatica controleaza: structura tertiara in dublu helix a moleculei de ADN, sunt implicate in structura polinucleozomica a flbrilei de cromatina a cromozomilor nucleari. Deasemenea histonele asigura spiralizarea si condensarea cromatinei, maresc stabilitatea ADN-ului cromozomial. Functional, histonele actioneaza ca represori ai activitatii genice prin condensarea cromatinei si superspiralizarea ADN-ului, ADN care nu mai poate functiona ca matrita in replicare, si transcriere in stare superspiralizata. Prin metilare, acetilare si fosforilare, histonele indue modificari in procesele de transcriptie ADN * ARN. Histonele au in structura lor o proportie crescuta de aminoacizi cu sarcini pozitive (diamino-dicarboxilici), ceea ce permite cuplarea cu gruparea fosfat din structura moleculei de ADN. Histonele sunt alcatuite dintr-o catena polipeptidica cu un continut bogat in aminoacizi bazici (lizina si arginina). In raport cu continutul in aminoacizi bazici, histonele se grupeaza in: -histone bogate in lizina si sarace in arginina; -histone sarace in lizina dar bogate in arginina; -histone sarace in lizina si putini amioacizi arginina. Weintraub (1976), folosind metoda electroforetica si cromatografia cu schimbatori de ioni, a identificat existenta a cinci tipuri de histone in structura genomului la eucariote. Aceste histone au fost simbolizate cu notatiile Hi, H2A, H2B, H3 si H4 (tabel): -Hi este foarte bogata in lizina; -H2/\ contine raporturi cantitativ egale de lizina si arginina; -H213 contine un numar mai mare de lizina fata de arginina; -H3 si H4 contin un numar foarte mare de arginina. 121

Folosind electroforeza in gel, Weintraub a observat modificari posttranslationale, identificand si subtipuri de histone. Modificarile produse la nivelul histonelor altereaza" incarcatura electrica a moleculei, afectand interrelatia ADN - histona. De exemplu, Matsumoto si col. (1980) au observat ca fosforilarea histonei Hi se asociaza cu condensarea cromozomilor: fosfokinaza - histona Hi initiaza mitoza si regleaza condensarea cromozomilor. Au demnostrat ca acetilarea aminoacizilor din histona H4 determina deschiderea nucleului histonic, proces asociat cu transcrierea regiunilor cromatinelor nucleare si activarea ADN-ului ca matrita in transcrierea mesajului genetic. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 au secventa de aminoacizi conservata filogenetic, ele fiind in raport echimolecular cu ADN-ul. Raportul ADNhistona are valoarea ~ 1 pentru cele patru tipuri mentionate. Prin tratarea fibrilei polinucleozomice cu tripsina si eliminarea histonei Hi, fibrila polinucleozomica nu-si modifica structura, confirmanduse ca histona Hi nu participa la structura nucleozomului. Tabel VII Numarul de aminoacizi si masa molecuKi... a histonelor din timusul de vitel (dupa Elgin si Wintraub, 1976 ) Tipul de histonaHiH2A

H2B

H3 H4

Caracteristic a generala Foarte bogata in lizina Bogata in lizina si arginina in raporturi egale Contine mai multa lizina, mai putina arginina Bogata in arginina Bogata in arginina

Numar aminoaci zi 216 129 125 135 102

Masa molecular a 21.500 d 14.000 d 13.775 d 15.320 d 11.280 d

Histonele sunt prezente in genomul tuturor eucariotelor. Totusi, interesanta este identificarea unei proteine cu o structura apropiata de histonele eucariotelor la Escherichia coli. Aceasta proteina a fost notata H, desi procariotele nu au cromozomul cu structura nucleozomica. Histonele Hi, cu o masa moleculara de 21500 d, reprezinta un grup de proteine relativ heterogen. H] are 0 structura variabila la diferite specii. 122

Variabilitatea subtipurilor de histona Hi, apre ca modificari posttranslationale suferite. Pentru Hi se apreciaza o evolutie mai accelerata, confirmata de identificarea a 15 - 30 subtipuri Hi la diverse specii, si aproximativ 15 subfractii H] in diferitele tesuturi ale aceluiasi organism. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 se caracterizeaza printr-un conservatorism structural, fara a prezenta subtipuri histonice. Datorita conservatorismului celor patru tipuri de histone, consemnam 0 asemanare (nu identitate) a raportului de aminoacizi la histonele din genomul regnului vegetal si animal. De exemplu histona H4 de la Pissum sativum (mazare) are secventa in aminoacizi aproape identica cu cea de la Bos taurus (vitel). Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt proteine cu o masa moleculara cuprinsa intre 22000 d si 14000 d. Datorita numarului mare de aminoacizi bazici (diaminoacizi) valoarea pH ajunge la ~ 10. Ca urmare, prin gruparea NH2 din structura, aminoacizii interactioneaza cu electronii negativi din gruparea fosfat a ADN-ului cromozomial. Structura invariabila filogenetic a histonelor H2A, H213, H3 si H4 explica rolul universal si important in structura cromozomilor. Daca Hi are o variabilitate accentuata filogenetic, determinata de modificarile post-translationale, eventualele diferente ale histonelor H2A, H2B, H3 si H4 ar fi determinate de unele divergente evolutive. Cele mai conservatoare histone, prin structura, sunt histonele H2A, H3 si H4 . De exemplu, histona H4 are 0 rata a evolutiei de 0,06 mutatii pe 100 reziduuri de aminoacizi in 100 milioane de ani, in timp ce rata evolutiei fibrinei este de 80 mutatii, iar a hemoglobinei de 20 mutatii in 100 milioane de ani. Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt hidrofobe - acide la capatul Cterminal si hidrofobe -bazice la capatul N-terminal. Regiunea C-terminala ire aspect globular si e bogata in aminoacizi hidrofobi - leucina si izoleucina sau in aminoacizi destabilizatori ai duplexului ADN- glicina si 3rolina. Presiunea selectiva a conservat regiunea globulara din necesitatea nteractiunii histona-histona, sau histona-nonhistona. S-a constatat ca prin fosforilare, acetilare sau metilare a histonelor ipar modificari post - translationale. De exemplu, prin fosforilare se >roduce o crestere a sarcinilor pozitive (+), prin acetilare sau metilare are oc o scadere a sarcinilor pozitive (+) dar cresc sarcinile negative (-). Prin iceste modificari de sarcini (+) si/sau (-) se modifica fortele de interactie ntre familia histonelor H2A, H2B, H3 si H4 si ADN, interactional^ in irocesele de translatie si replicarea genelor, avand rol de modulare.

123

Histona Hi se asociza, ca monomer", cu ADN-ul, in timp ce H2A, H2B, H3 si H4 formeaza dimeri care se vor asocia intre ei, rezultand un octamer, in jurul caruia se infasoara duplexul ADN, formand nucleozomul. Legarea histonelor de ADN se face prin legaturi ionice intre gruparea fosfat a ADN-ului si gruparile amino ale histonelor. De exemplu Hi, H2A si H2B se leaga prin resturile lizina la perechile AT, iar H3 si H4 se leaga prin resturi de arginina la cuplul complementar G -C. Histonele se cupleaza cu ADN in depresiunea (adancitura) mare a moleculei ADN, atat in zonele eucromatice, cat si heterocromatice. Genele care codifica familia proteinelor histonice sunt localizate si dispuse in tandem pe aceeasi molecula ADN, ele fiind prezente in multe copii in genom. Genele care codifica histonele sunt reprezentate de secvente scurte. Unele gene de sinteza a histonelor sunt inserate printre secventele ADN-ului moderat repetitiv. Aceste gene sunt denumite si histogene". Se presupune ca histogenele sunt rezultate prin duplicatia secventelor nucleotidice din genom, sau prin crossing-over inegal intragenic. Histonele bogate in arginina inhiba sinteza ARN-ului, iar cele bogate in lizina au un proces de inhibitie a ARN mai moderat, mai redus. La eucariote, histonele sunt sintetizate sub controlul secventelor oligonucleotidice, incluse discontinuu si in ADN-ul moderat repetitiv. Genele care codifica sinteza histonelor sunt transmise numai in stadiul S interfazic al ciclului celular. Moleculele de ARNm pentru histone, cu numar mic de nucleotide, nu sunt poliadenilate, sunt lipsite de introni. Omul contine pe cromozomii 1, 6 si 12 aproximativ 20 de gene care codifica histonele. Genele care codifica histonele sunt grupate pe o secventa a moleculei ADN de 6-9 kb, iar transcrierea lor se face separat. Numarul mare al secventelor genice repetate pentru histone ar fi urmarea recombinarilor intragenice inegale selectionate in evolutia biogenetica.

7.1.2. Proteinele non-histonicePe langa proteinele histone,