Capitolul 4

Diagnosticul de laborator al TBC 43

Capitolul 4

Diagnosticul de laborator al tuberculozei

4.1. Recoltarea produselor patologice4.1.1. Principii generale

Recoltarea se va face înaintea administrării oricărui antituberculos sau după o întrerupere de minimum 3 zile.

Recoltarea se va face sub supravegherea unui cadru mediu instruit, în camere special amenajate.

Produsele vor fi recoltate în recipiente speciale, de preferat de unică utilizare, transportate şi închise ermetic.

Produsele vor fi trimise cât mai rapid la laborator. Dacă transportul este temporizat, produsele vor fi păstrate în frigerator.

4.1.2. Produsele patologice utilizate pentru examenul bacteriologic Tuberculoza poate avea multiple localizări, de aceea şi produsele patologice

folosite pentru diagnostic sunt multiple.4.1.2.1. Tuberculoza pulmonară

Sputa expectorată spontan - bolnavul trebuie instruit astfel încât ceea ce se recoltează să fie realul produs patologic şi nu salivă sau secreţii rinofaringiene. Pentru creşterea ratei de izolare de la fiecare bolnav se vor recolta trei probe de spută în două zile consecutive după cum urmează: o primă probă la prima prezentare a pacientului la medic, proba care se recoltează sub supraveghere; a doua probă va fi recoltată a doua zi dimineaţa, de pacientul deja instruit, iar a treia probă va fi recoltată tot a doua zi când pacientul revine la pneumolog;

Spălătura bronşică – uneori bolnavul nu expectorează spontan, în această situaţie, expectoraţia este provocată prin introducerea a aproximativ 10 ml soluţie salină sterilă în orificiul glotic, ceea ce provoacă tusea şi expectoraţia;

Aerosolizarea cu soluţie salină hipertonă este de asemenea o metodă de provocare a tusei;

Aspiratul traheobronşic recoltat prin bronhoscop sau fibroscop; Spălătura gastrică se practică la pacienţii care obişnuiesc să înghită sputa (sugari şi

copii mici); Lichidul pleural; Piese biopsice; Piese operatorii.

4.1.2.2. Tuberculoza extrapulmonară Produsele patologice se aleg în funcţie de localizarea bolii. Pot fi lichide

(urina, LCR, lichid de ascită, sânge menstrual, etc) sau fragmente de ţesut.

4.2.Transportul


Acesta trebuie să fie prompt şi asigurat în condiţii de securitate microbiologică.

4.3. Prelucrarea4.3.1. Examenul microscopic. Presupune efectuarea de frotiuri, care vor fi

colorate cu coloraţii diferenţiale ce evidenţiază bacilii acido-alcoolo rezistenţi (BAAR). Detaliem în continuare etapele efectuării unui frotiu din spută:

examen macroscopic al produsului. Se reperează un flocon mucopurulent, care se prelevă cu ansa şi se depune pe o lamă de microscop curată, neutilizată şi bine degresată;

etalarea. Cu ansa se etalează produsul patologic în strat subţire şi cât mai uniform. Frotiul obţinut trebuie să aibă o lungime de 2 cm şi o lăţime de 1 cm şi trebuie să fie amplasat în mijlocul lamei, astfel încât riscul de contaminare a persoanei care îl manipulează să fie minimalizat pe cât posibil;

uscarea. Se poate face la temperatura camerei sau mai bine, pe o platină încălzitoare.

Apoi frotiul este colorat. Coloraţiile care pun în evidenţă micobacteriile sunt coloraţii diferenţiale, care se bazează pe acido-alcoolo rezistenţa acestor microorganis-me. Acido-alcoolo rezistenţa este o caracteristică tinctorială şi înseamnă nedecolorarea micobacteriilor când sunt tratate cu mixturi de acizi minerali şi alcooli. Această caracteristică nu are legatură cu viabilitatea micobacteriilor în mediul acid.

Pentru evidenţierea micobacteriilor se folosesc în principal două coloraţii: Ziehl Neelsen şi coloraţia cu fluorocromi auramină-rodamină. Expunem în continuare timpii coloraţiei Ziehl Neelsen ca fiind tehnica standard:

se acoperă complet lama cu fucsina Ziehl turnată prin pâlnie cu hârtie de filtru (pentru cca 10 min);

se încălzeşte lama trecând pe sub frotiu flacăra unui bec Bunsen sau a unei lampi cu spirt până la emitere de vapori; colorantul nu trebuie să fiarbă şi nici să se usuce; operaţiunea se repetă de doua ori;

se varsă fucsina şi se spală frotiul sub jet slab de apă; decolorarea: se acoperă lama cu amestec alcool-acid timp de 3 min după

care se spală şi se scurge excesul de lichid; recolorarea: se acoperă lama cu soluţie de albastru de metilen timp de 1

min; se spală bine lama sub jet de apă şi apoi se usucă. Frotiurile colorate Ziehl Neelsen vor fi examinate la microscopul optic, iar

cele colorate cu auramină- rodamină la microscopul cu lumina ultravioletă.Examinarea presupune parcurgerea a 100 câmpuri microscopice cu imersia la

coloraţie Ziehl Neelsen şi a 30 câmpuri cu obiectiv uscat (40x) pentru coloraţia fluorescentă. Lamele pozitive în fluorescenţă se recolorează Ziehl Neelsen pentru confirmare, dat fiind specificitatea mai scazută a examenului în U.V.

Examenul microscopic este semicantitativ. Există mai multe scale de apreciere a concentraţiei bacteriene. Cea utilizată în serviciul nostru este cea elaborată de Organizatia Mondiala a Sănătăţii şi care este descrisă în continuare:


Tabel 4.1.Număr BAAR/ câmp microscopic Rezultat0 BAAR/100 câmpuri Negativ1- 3 BAAR/100 câmpuri Negativ - se repetă4- 9 BAAR/100 câmpuri Se comunică numărul exact de BAAR10- 99 BAAR/100 câmpuri 1+1- 9 BAAR/câmp 2+> 10 BAAR/câmp 3+

Examenul microscopic are următoarele avantaje: este cel mai rapid mijloc de diagnostic al tuberculozei; diferenţiază bolnavii intens contagioşi de cei mai puţin contagioşi; reprezintă un mijloc eficient de verificare a succesului antibioterapiei.Examenul microscopic are şi dezavantaje: sensibilitate mediocră (doar aprox. 50% dintre bolnavii cu tuberculoză

sunt microscopic pozitivi); nu oferă indicaţii despre specia de micobacterii vizualizate; nu oferă indicaţii despre sensibilitatea la antituberculoase.De aceea diagnosticul tuberculozei este continuat prin cultivare.4.3.2. CultivareaPrin prisma cultivării, produsele patologice se împart în două categorii, în

funcţie de condiţia lor microbiologică. O primă categorie este aceea a produselor care vin din zone normal sterile. Acestea nu necesită decontaminare înaintea însămânţării. A doua categorie este constituită din probe care provin din zone normal colonizate sau care se contaminează pe traiectul de eliminare (ex: sputa spontană sau provocată, aspiratul traheo-bronşic, spălătura gastrică, etc). Aceste produse trebuie decontaminate înaintea cultivării pentru eliminarea aşa numitei florei de asociaţie, constituită din bacterii cu creştere rapidă. Decontaminarea este chimică şi se bazează pe relativa rezistenţă a micobacteriilor la alcali. Metoda de decontaminare cea mai utilizată constă în tratarea probei timp de 15 - 20 min cu NaOH 4%. După acest interval amestecul obţinut este adus la neutralitate cu HCl 8% în prezenţa albastrului de bromtimol ca indicator de pH. După neutralizare, amestecul este centrifugat pentru concentrare şi din sediment se face însămânţarea pe medii de cultură. Fiecare produs patologic trebuie cultivat pe cel puţin un mediu solid şi un mediu lichid. Mediul solid cel mai frecvent utilizat este mediul Löwenstein Jensen. Mediile lichide, la ora actuală, sunt utilizate în sisteme automate de cultivare a micobacteriilor (ex.: BACTEC, MB/BacT, MGIT, etc.). Mediile lichide au o rată mai mare de pozitivitate şi un timp mai scurt de pozitivare, în schimb mediile solide se suprainfectează mai rar.

Incubarea se face la 37oC timp de 60 zile pentru mediile solide şi 42 zile pentru mediile lichide. Mediile solide sunt verificate săptămânal pentru detectarea creşterii bacteriene. În sistemele automate culturile pozitive sunt anunţate de sistem.

Următoarele etape în diagnosticul tuberculozei sunt identificarea şi testarea sensibilităţii la antibiotice.


4.3.3. IdentificareaIdentificarea micobacteriilor se bazează pe caractere microscopice (dispoziţie

în corzi), de cultura (temperatura şi viteza optimă de creştere, aspectul colonilor, pigmen-togeneza), biochimice (producerea de catalază şi termorezistenţa acesteia, producerea de niacină sau rezistenţa la hidrazida acidului tiofen -2- carboxilic).

Pe mediul Löwenstein Jensen Mycobacterium tuberculosis creşte lent şi eugonic, coloniile sunt de tip “R” (rugoase, uscate, conopidiforme), greu emulsionabile şi nepigmentate. M. africanum are o creştere disgonică, iar coloniile sunt plate, rugoase. M. bovis creste disgonic, coloniile sunt “S”, mici, rotunde, emulsionabile.

4.3.4. Testarea sensibilităţii la antituberculoaseExistă trei metode diferite de testare a sensibilităţii la antituberculoase: metoda

proporţiilor (cea mai exactă, dar laborioasă şi costisitoare), metoda concentraţiilor absolute şi metoda rapoartelor de rezistenţă. Metoda utilizată în România este metoda concentraţiei absolute. Principiul acesteia este următorul: un inoculum standardizat este cultivat simultan pe mediu fără antituberculoase (tuburi martor) şi pe tuburi cu mediu în care sunt incluse antituberculoase în anumite concentraţii (tuburi test). Citirea constă în compararea intensităţii creşterii bacteriene pe tuburile martor cu cele test. Dacă pe tuburile test creşterea este absentă tulpina este considerată sensibilă, dacă pe tuburile test există creştere, dar de intensitate mai mică decât pe tubul martor, tulpina este parţial rezistentă; dacă pe cele două categorii de tuburi creşterea are aceeaşi intensitate, tulpina este rezistentă.

4.3.5. Metode noi de diagnostic de laborator în tuberculozăDiagnosticul de laborator în tuberculoză este grevat de necesitatea cultivării

agenţilor etiologici care au un timp de generaţie lung. De aceea, pentru laboratoarele care folosesc doar medii solide, culturile pozitive se obţin, în medie, în 34 zile la care se mai adaugă trei săptămâni pentru antibiogramă.

Metodele noi, noncultivative, de diagnostic pentru infecţiile micobacteriene sunt desemnate să detecteze şi să identifice micobacteriile direct în proba clinică, evitând astfel pierderea de timp.

În general aceste teste folosesc fie o metodă foarte sensibilă pentru a detecta anumite componente micobacteriene, fie o metodă prin care o componentă bacteriană este amplificată până la un nivel detectabil.

4.3.5.1. Detectarea componentelor micobacterieneAcidul tuberculostearic (acid gras saturat) este un component al peretelui

celular al unor bacterii clasificate în ordinul Actinomycetales, printre care şi cele din genul Mycobacterium. Acidul tuberculostearic poate fi detectat prin cromatografie gaz-lichidă. Metoda este folosită pentru diagnosticul rapid al meningitei tuberculoase, pentru că dintre agenţii etiologici posibili doar M. tuberculosis conţine acid tuberculostearic.

Hidroliza anumitor esteri micolaţi ai micobacteriilor produce 2- eicosanol (un alcool cu lanţ lung) care poate fi detectat prin gaz- cromatografie- spectrometrie de masă.

4.3.5.2. Metode de amplificare


Utilizarea acestora în laboratorul de microbiologie are câteva scopuri: 1.creşterea sensibilităţii metodei; 2. automatizarea metodelor de microbiologie moleculară şi 3. Excluderea moleculelor radioactive din sistemele de detecţie.

Există trei sisteme de amplificare: amplificarea ţintei (materialul genetic care trebuie detectat), amplificarea sondei (catenă de acid nucleic complementară ţintei) şi amplificarea semnalului (modalitatea prin care este relevată reacţia pozitivă).

Metodele de amplificare ale ţinei utilizate în diagnosticul tuberculozei sunt: polymerase chain reaction (PCR), self sustaining sequence replication (3SR) şi stand displacement amplification (SDA).

In PCR principiul este următorul: 2 fragmente mici, monocatenare de DNA, numite primeri se vor alinia segmentului care trebuie amplificat (ţinta). Primerii, care sunt molecule sintetizate, sunt complementari secvenţelor care flanchează ţinta. Primerii iniţiază amplificarea care decurge în cicluri alternative de amplificare şi denaturare a DNA- ului nou format, fiecare ciclu dublând numărul de segmente. Un ciclu începe când temperatura crescută desface catena dublă de DNA. Primerii pot acum hibridiza cu secvenţele lor complementare pe fiecare catenă a materialului nucleic iniţial. O DNA- polimerază termostabilă (Taq polimeraza) reface helixul dublu catenar, alipind baze nucleotidice la primer. Când polimeraza ajunge la capătul catenei originale, secvenţa ţintă este refăcută. Altă aplicare a căldurii începe un nou ciclu prin denaurarea DNA- ului nou format.

3SR utilizează activităţile selective a trei enzime: o reverstranscriptază, o RNA- ză şi o RNA- polimerază DNA- dependentă) pentru a amplifica o ţintă. De fapt, este o reacţie repetată în doi cicli în care se obţine un cDNA pornind de la o ţintă in intermediul reverstranscriptazei, urmând transcripţia acestuia în multiple copii RNA prin intermediul polimerazei. Între cele două etape, există o fază intermediară care are ca rezultat formarea unui hibrid RNA- DNA. RNA- ul din acest hibrid este distrus de RNA-ză.

SDA este o procedură izotermală de amplificare a DNA-ului care utilizează primeri specifici, o DNA polimerază şi o endonuclează de restricţie.

Amplificarea sondei survine în cazul reacţiilor Qβ replicase şi ligase chain reaction (LCR). Qβ replicase se bazează pe incorporarea unei sonde monocatenare, oligonucleoidică într-o moleculă de RNA care după hibridarea cu ţinta poate fi amplificată exponenţial datorită enzimei Qβ replicase.

LCR se bazează pe capacitatea ţintei de a direcţiona legarea covalentă a două oligonucleotide de către DNA ligază. Odată legate, prima pereche de nucleotide poate servi ca matriţă pentru a amorsa legarea a noi nucleotide complementare. Specificitatea metodei constă în specificitatea hibridizării oligonucleotidelor la DNA- ul ţintă.

Principiul metodei branched DNA (bDNA) este amplificarea semnalului. Acest sistem utilizează o etapă specifică de capturare a ţintei care conduce la izolarea secvenţei de acid nucleic, urmată de hibridizarea cu o sondă nemarcată. O regiune a acestei sonde este complementară secvenţei ţintă şi alta este capabilă să hibridizeze cu multimerul bDNA. Multimerul, cheia amplificării este o macromoleculă sintetizată


chimic, cu o structură asemănătoare unui pieptene. Această moleculă are capacitatea de a hibrida cu o mulţime de sonde marcate, ceea ce conduce la un semnal foarte puternic.

Capitolul 4

Documents

Transcript of Capitolul 4