Capitolul 1

A C I Z I I N U C L E I C I - S U P O R T U L M A T E R I A L AL I N F O R M A Ţ I E I E R E D I T A R E

1. 1. Din istoricul descoperirii acizilor nucleici

Dată fiind importanţa lor de excepţie

pentru fenomenul viaţă, macromoleculele de

acizi nucleici au polarizat atenţia biologilor,

chimiştilor şi chiar a fizicienilor, investiga­

ţiile dedicate cunoaşterii compoziţiei,

structurii şi funcţiilor lor fiind extrem de

numeroase, caracterizate prin tehnici de

înaltă fineţe şi deosebită putere de rezoluţie.

Pe la sfârşitul celui de al doilea deceniu

al secolului nostru s-au semnalat primele

speculaţii referitoare la "tipul" moleculelor

responsabile de transmiterea informaţiei

ereditare. Dar, până în 1940 nu au fost

disponibile date elocvente relative la esenţa

chimică a genelor (unităţile ereditare fun­

damentale). Incepînd cu anul 1941, cerce­

tările efectuate pe specii ale genului Neu-

rospora au furnizat dovezi concludente

pentru concepţia în conformitate cu care

genele au capacitatea de a controla asambla­

rea enzimelor. Se puneau, în fapt, bazele

conceptului o genă = o enzimă.

Acumularea continuă de date a impus

necesitatea acceptării existenţei unui suport,

a unei matriţe pe care să se ordoneze

aminoacizii ce intră în componenţa unei

molecule proteice. Pe de altă parte se

impunea ca respectivul suport, să aibă şi

calitatea de a se autoreplica. Presupunerile

în conformitate cu care ar fi posibil ca un

anumit aminoacid să se autospecifice (să se

specifice pe sine) sau că un aminoacid poate

specifica pe altul (şi în consecinţă 10

aminoacizi din cei 20 existenţi i-ar specifica

pe ceilalţi 10), sau că ar exista 20 de

proteine diferite (câte una specifică pentru

fiecare aminoacid) nu au putut fi demon­

strate şi argumentate. Dimpotrivă, s-au

acumulat nenumărate argumente care

infirmau presupunerile menţionate.

Interesant şi important totodată este

faptul că nu există diferenţe structurale

suficient de marcante între aminoacizi. Spre

exemplu, valina şi izoleucina (aşa cum se

preciza în volumul 1) diferă între ele doar

prin prezenţa unui grup metil, adiţiona! la

izoleucina. Glicina şi alanina, pe de altă

parte, diferă doar printr-o grupare metil.

4 Ion I. Bara, Ovidiu C. Z ^ ^ m a r a n d a C. Vântu

constatat că o asemenea afirmaţie este

inexactă. Dealtfel, chiar denumirea de acizi

nucleici este întrucâtva nejustificată deoa­

rece, contrar primelor păreri în conformitate

cu care acizii nucleici s-ar găsi doar în

nucleul celular (de unde le provine, dealtfel,

numele) s-a constatat că sunt prezenţi în

întreaga celulă, în cantităţi variabile şi

dependente ce starea fiziologică concretă a

celulei.

Frederick Griffith, în 1928, a efectuat

celebrul experiment prin care a sesizat

transformarea pneumococilor de tipul R,

nevirulenţi, în pneumococi virulenţi de tipul

S. Evident, la acea dată nu a fost posibilă

explicarea fenomenului. Nu se ştiau prea

multe despre acizii nucleici. Ulterior însă, în

1944 (în plin război), Oswald T. Avery,

Colin M. McLeold şi Maclyn McCarty au

demonstrat, că factorul activ responsabil de

acest fenomen este ADN-ul. Cei trei au

constatat că dezoxiribonucleaza pancreatică

distruge "factorul activ" ("fracţiunile

active") dar nu are efecte asupra moleculelor

mari sau asupra ARN-ului. Pe de altă parte

s-a constatat că proprietăţile "transformările"

ale ADN-ului nu sunt afectate de adaosul de

enzime proteolitice sau de ribonucleaza

pancreatică (ribonucleaza ce distruge

Prin urmare, orice proces de copiere trebuie

să se caracterizeze printr-o mare acurateţe,

pentru a putea deosebi două molecule atât de

asemănătoare. Mai exact, fiecare moleculă

de aminoacid ar trebui să fie specificată cu

o acurateţe extraordinară, erorile neputând

depăşi 1/103. Dar, conform datelor de

biochimie, nu se cunosc reacţii chimice în

care să se poată decela diferenţa de o

singură grupă metil între două molecule

(altfel identice), cu o acurateţe ale cărei

şanse de eroare să fie mai mici de 1/106'. De

pildă, în experimente efectuate cu aminoa­

cizi s-a constatat că leucina este inserată în

lanţurile polipeptidice cu o siguranţă de

99,9%, ceea ce reprezintă o eroare la 1000

repetiţii experimentale. Prin urmare protei­

nele nu pot avea calitatea de molecule

ereditare.

Prin urmare, dacă proteinele nu pot fi

molecule semantice, purtătoare de informaţii

ereditare, atunci "candidaţii" pentru acest rol

rămân acizii nucleici. Multă vreme, pe baza

rezultatelor obţinute prin diverse procedee

de extracţie, s-a crezut că acizii ribonucleici

reprezintă principalul constituent nuclear al

drojdiilor şi al celulelor vegetale, în timp ce

acizii dezoxiribonucleici ar fi constituentul

principal al celulelor animale. Ulterior s-a

Acizii nucleici 5

ARN-ul).

R. Signer, E. Hammarsten şi T.

Casperson au precizat că greutatea molecu­

lară a ADN este mai mare decât greutatea

moleculară a multor proteine (mai mare de

50. 000 d). Apoi, prin 1950, cu ajutorul

microscopiei electronice a fost posibil să se

constate ca molecula ADN-ului este extrem

de lungă şi subţire, având diametrul de

numai 20 Â (lungimea depăşeşte mai multe

mii de angstromi).

Cercetările au continuat şi s-au găsit

conexiuni clare între prezenţa ADN-ului şi

prezenţa cromosomilor. A. E. Mirsky şi H.

Ris (de la Institutul Rockfeller din USA şi,

respectiv, Vendrelys, din Franţa), au

constatat că ADN-ul este destul de constant

în cadrul unei specii şi că este în cantitate

dublă în celulele somatice, comparativ cu

cele sexuale. Apoi s-a demonstrat că ADN-

ul este metabolic stabil, în sensul că nici nu

poate fi sintetizat de novo nici nu poate fi

degradat cu rapiditate, aşa cum se întâmplă

cu alţi constituenţi celulari.

Unele dintre cele mai evidente dovezi

ale rolului genetic al ADN-ului au fost

furnizate de genele virale. în 1950 a fost

posibilă obţinerea de viruşi puri şi determi­

narea principalelor lor componente. S-a

stabilit, cu exactitate, că toţi viruşii conţin

acizi nucleici şi, în consecinţă, a apărut

întrebarea: aceştia reprezintă materialul

lor genetic ?

în 1952 au fost iniţiate studii detaliate pe

virusul (bacteriofagul) T 2, de către A. D.

Hershey şi M. Chase (de la Cold Spring

Harbour). învelişul proteic (capsida) a fost

marcat cu 35S şi ADN-ul c u 3 2 P . S-a constatat

că "infectarea" bacteriei se datorează doar

ADN-ului, care pătrunde în celulă şi se

autoreplică (în timp ce capsida, supranumită

şi fantomă fagică, rămâne în afară). în 1949

se stabilise deja, de către Erwin Charg/aff

de la Universitatea Columbia din New York,

că cele patru nucleotide (din componenţa

acizilor nucleici) nu sunt prezente în cantităţi

egale şi că rata lor variază, de la specie la

specie. Prin urmare, se poate conchide că

această ordine -ce conferă specificitate

genetică - este o ordine semantică. Deci,

rata celor patru baze nu este randomică. Mai

mult decât atât, cantitatea de A este egală cu

cea de T (în sensul egalităţii numărului de

reziduuri) şi cea de G este egală cu cea de

C. Acest fenomen este cunoscut, în genetica

moleculară, sub numele de regula lui Char­

g/aff.

Prima difracţie a ADN-ului a fost

6 Ion I. Băra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu

efectuată în 1938. Apoi, M. H. F. Wilkins

şi Rosalind Franklin (în cadrul Colegiului

King's din Londra) au obţinut fotografii de

o foarte bună calitate. Pe baza acestor date,

s-a sugerat că structura ADN elicoidală

şi că elicea (helixul) este formată din două

sau trei catene (oricum mai mult decât o

singură catenă). în 1952, un grup de

chimişti din laboratorul condus de către A.

Todd a reuşit să demonstreze că nucleotidele

din care este format ADN-ul sunt legate,

împreună, în succesiunea 3'-5' sau 5'-3'

(deci prin legarea unei nucleotide 5' la

poziţia 3' a celeilalte, sau a unei nucleotide

3' la poziţia 5' a celeilalte).

în 1953, Francis Crick şi James D.

Watson (după o tentativă nereuşită a lui W.

Cochran, Fr. Crick şi V. Vand) au elaborat

teoria dublului helix, cu cele două catene

complementare (în laboratorul lui Perutz şi

Kendrew). Cele două catene sunt legate

(împreună, în dublet) prin câte două punţi de

hidrogen între A şi T şi câte trei punţi de

hidrogen între G şi C.

Pe baza tuturor acestor date a devenit

evident că gena este o moleculă reală,

asupra căreia pot "gândi", obiectiv, atât

chim işti i cât şi biologii. Deci, obiect

predilect de studiu pentru biologia molecu­

lară a devenit o moleculă. A apărut, astfel,

ideea excitantă că o catenă (din dublul helix

de ADN) se poate constitui în matriţă

specifică pentru formarea celeilalte catene.

Arthur Kornberg, în 1956, a demonstrat

că sinteza ADN-ului este posibilă în extracte

celulare de bacterii. El a precizat că o

enzimă polimerizatoare, specifică, este

necesară pentru a cataliza legarea "pietrelor

de construcţie" ale ADN-ului (dATP, dGTP,

dCTP şi dTTP). Enzima implicată este

ADN-polimeraza l(DNA-polimeraza 1), şi

reprezintă prima enzimă pentru care s-a

stabilit că este implicată în sinteza polide-

zoxinucleotidelor. Sinteza se derulează

astfel.! Enzima catalizează legarea precur­

sorilor nucleotidici prin punţi fosfodiesterice

în poziţiile 3' şi 5'. Enzima este activă

numai în prezenţa macromoleculei ADN-ului

care serveşte ca "ordonator" al celor patru

nucleotide menţionate anterior.

ADN-polimeraza 1 recunoaşte doar

porţiunile pentoză-fosfat regulate. Deci ea

nu poate determina specificitatea secvenţei

pe care o asamblează. întrucât ADN-ul care

serveşte ca matriţă are anumite raporturi

A/T şi G/C, produsul sintetizat va avea, de

fiecare dată, cele 4 baze în aceleaşi raporturi

ca şi matriţa. Dar, aşa cum vom vedea

Acizii nucleici 7

ulterior, sinteza ADN-ului este un proces

deosebit de complex în care sunt "antrenate"

multe enzime.

în 1958, M. Meselson şi F. W. Stahl au

separat moleculele ADN rezultate prin

autoreplicarea unei molecule ce a servit ca

"MATRIŢĂ", demonstrând că, în timpul

autoreplicării, cele două catene ale "MA­

TRIŢEI" se separă. Cei doi au utilizat 1 5N şi 1 3C. Investigaţiile s-au efectuat pe populaţii

bacteriene cultivate în medii cu 1 5 N. Trebuie

menţionat faptul că bacteriile crescute pe

medii cu 1 5N au ADN-ul mai greu decât cele

crescute pe mediu cu 1 4 N. In consecinţă, a

fost nevoie să se pună la punct metode de

separare a ADN-ului cu 1 3N de ADN-ul cu 1 4N - adică să se pună la punct metode de

separare a ADN-ului greu de ADN-ul uşor.

Metoda se bazează pe gradientul de densitate

în sarea de CsCl2. Aplicând forţe centrifuge

se constată că soluţia în care au fost imer-

sate bacteriile devine mai densă decât

citoplasmă celulară. Dacă se reuşeşte să se

aleagă o densitate corectă a soluţiei iniţiale,

moleculele de ADN se vor deplasa spre

regiunea centrală a celulelor centrifugate,

unde densitatea este egală cu aceea a soluţiei

saline. Dacă celulele bacteriene conţinând

ADN greu sunt transferate pe mediu normal

(uşor), cu I 4 N, nucleotidele disponibile

pentru sinteza unui ADN vor fi "uşoare".

Astfel, ADN-ul sintetizat după transfer va fi

diferit de cel sintetizat anterior. Dacă

autoreplicarea ADN-ului implică separarea

catenelor, se pot face previziuni asupra

densităţii moleculelor de ADN prelevate

după diferite perioade de timp de creştere pe

mediu uşor. După numai o generaţie, toate

moleculele ADN vor conţine o catenă uşoară

şi una grea - adică vor fi intermediare între

cele uşoare şi cele grele (vor fi hibride).

Aceste observaţii le-au efectuat Meselson şi

Stahl. Apoi, dacă bacteriile sunt menţinute

în aceleaşi condiţii, după două generaţii,

jumătate dintre molecule vor fi uşoare şi

jumătate hibride - conform calculelor,

estimative.

Prin urmare, pe baza unor experimente

de acest tip, s-a demonstrat că autoreplicarea

ADN este semiconservativă. Această

precizare este foarte importantă întrucât

înseamnă că nu putem vorbi despre existenţa

macromoleculei de ADN mamă şi a

macromoleculei de ADN fiică, de unde

(vom vedea ulterior) rezultă că nu putem

vorbi despre cromonemă mamă şi cromo-

nemă fiică, cromatidă mamă şi cromatidă

fiică, cromosomi parentali şi cromosomi fii

8 Ion I. Băra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu

etc. Este clar că ADN-ul reprezintă "macro-

molecula vieţii", firul vieţii care se menţine

ca atare în succesiunea de generaţii.

Descoperirea dublei elice (macro-

molecula ADN-ului dublu elicoidal) a pus

capăt controverselor privind identitatea

moleculei semantice, identitatea substanţei

ereditare -primare. Se mai punea doar

problema precizării modalităţii de funcţio­

nare a informaţiei deţinute de ADN, în

procesul complex al determinării (inducerii)

"informaţiei" din macromolecula proteică.

Specificitatea ADN rezidă în linearitatea

secvenţelor celor patru nucleotide ce

alcătuiesc o catenă. Macromoleculele ADN-

ului pot fi comparate cu propoziţii (sau cel

puţin cuvinte) foarte lungi, alcătuite prin

combinarea aleatorie a literelor A, G, C şi

T (în fond este vorba despre cele patru

nucleotide sau, altfel spus, cele patru baze

azotate din componenţa nucleotidelor). Dar

chiar şi numai cu aceste patru litere numărul

de secvenţe potenţial neidentice, de ADN,

va fi 4" (unde n reprezintă numărul de litere

din secvenţă) - destul de mare. Deci,

potenţial, există un număr infinit de mesaje

genetice diferite, redat prin relaţia 256256.

O genă bacteriană conţine aproximativ

1500 de baze. Numărul potenţial de gene

(pentru această mărime a unei gene) diferite

este de 41 5 0 0 - adică o valoare mult mai mare

decăt numărul genelor diferite care au putut

exista în toţi cromosomii ce au existat de la

apariţia vieţii pe TERRA.

Primele dovezi experimentale ale

dependenţei aminoaciziior de gene, au fost

furnizate de cazurile de anemie falciformă.

In stare homozigotă boala este gravă. în

stare heterozigotă este mai puţin gravă.

Tipul de celule roşii - hematii - este deci

corelat cu modelul genetic. în homozigoţie

(ss; s provine de la englezescul sickle =

seceră), hemoglobina este anormală, carac­

terizată prin solubilitate diferită faţă de cea

a hemoglobinei normale, în timp ce hetero-

zigoţii (s+) au 1/2 hemoglobina normală şi

1/2 hemoglobina afectată.

Tipul norma! de hemoglobina este

constituit din două tipuri de lanţuri polipep-

tidice - a şi Ş. Fiecare lanţ polipeptidic are

o greutate moleculară de aproximativ 16.

100 d. Două lanţuri a şi două lanţuri /3 sunt

prezente în fiecare moleculă, conferindu-i

hemoglobinei o greutate moleculară de cea

64. 650 d. Lanţurile a- şi j8 sunt controlate

de către gene distincte, aşa că o singură

mutaţie va afecta doar unul dintre lanţuri

(niciodată pe amândouă). în 1957, V. M.

Acizii nucleici 9

Ingram (de la Universitatea Cambridge) a

demonstrat că hemoglobina s diferă de cea

normală, prin schimbarea unui aminoacid în

lanţul (8 (în poziţia 6, acidul glutamic este

înlocuit prin valină). Cu excepţia acestei

schimbări, întreaga secvenţă aminoacidică

este identică în hemoglobina normală şi cea

mutantă. Deci mutaţia genei induce o

schimbare extrem de specifică în molecula

de hemoglobina. Studii ulterioare, având ca

obiectiv stabilirea secvenţei aminoacizilor în

hemoglobina izolată din alte forme de

anemie, susţin această afirmaţie. Analizele

demonstrează că fiecare tip de anemie se

caracterizează prin înlocuirea unui singur

aminoacid, la un singur locus, în lungul

lanţului polipeptidic.

ADN-ul nu poate fi matriţa pe care să se

ordoneze direct aminoacizii, în procesul

sintezei proteice. Argumente pentru acest

punct de vedere sunt furnizate de experi­

mente prin care se demonstrează că sinteza

proteică apare în zonele celulare în care

ADN-ul este absent. Citoplasmă este locul

sintezei (separată, prin membrana nucleară,

de ADN-ul cromosomial). De aceea este

normală existenţa unei a doua molecule cu

rol de matriţă, dar a cărei specificitate să fie

determinată de ADN. Suedezul Casperson şi

belgianul Brachet au constatat existenţa a

mari cantităţi de ADN în citoplasmă. A fost

simplu să se imagineze funcţionarea unei

catene ADN ca matriţă pentru sinteza ARN-

ului.

Chimic, ARN-ul este foarte asemănător

cu ADN-ul. El reprezintă o catenă lungă,

alcătuită din nucleotidele A, U, C şi G,

legate între ele prin prin punţi fosfodie-

sterice între C 5' de la pentoza unei nucleo-

tide şi C 3' de la pentoza nucleotidei

adiacente. ADN-ul se deosebeşte de ARN

prin două caracteristici ale grupelor chimice

din componenţa lor - riboza în locul dezo

xiribozei şi uracilul în locul timinei. In ciuda

acestor diferenţe, polinucleotidele au

capacitatea potenţială de a forma dubla elice.

Nici grupele hidroxil adiţionale, nici grupele

metil greşite din ti mină nu afectează capa­

citatea ADN-ului de a forma structuri dublu

helicoidale. In mod normal ARN-ul este

monocatenar, fapt pentru care nu are o rată

a bazelor complementare (tabel 1).

10 Ion I. Băra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu

Tabelul 1

Compoziţia în baze a ARN de diferite origini

Sursa de ARN Proporţia celor patru baze

Sursa de ARN Adenină Uracil Guanină Citozină

Escherichia coli 0. 24 0. 22 0. 32 0. 22

Proteus vulgaris 0. 26 0. 19 0. 31 0. 24

Euglena sp. 0. 22 0. 21 0. 30 0. 27

Virusul poliomelitei 0. 30 0. 25 0. 25 0. 20

Rinichi de şobolan 0. 19 0. 20 0. 30 0. 31

De aceea cantitatea de adenină nu este

egală cu cea de uracil şi nici cea de citozină

cu cea de guanină. Deci, spre deosebire de

ADN, ARN-ul are structură monocatenară.

De aici decurge şi lipsa structurii regulate,

structură caracteristică doar ADN-ului.

1.1.1 Dogma centrală a geneticii, stipu­

lează că informaţia ereditară circulă într-un

singur sens şi că, niciodată, ARN-ul nu

poate servi drept matriţă pentru ADN şi că

proteina nu poate servi ca matriţă pentru

acizii nucleici. Prima afirmaţie a suferit deja

unele corecţii. Dar este o evidenţă faptul că

enorma cantitate de informaţie ereditară

circulă în sensul A D N — > A R N .

1.1.2 Ipoteza adaptorului (elaborată de

Crick), admitea, la început, drept normal ca

pe macromolecula ARN-ului să existe

cavităţi în care "să se potrivească" cele 20

molecule de aminoacizi. Prin urmare,

cavităţile ar fi trebuit să aibă forme speci­

fice. Astfel, mol cc ula ARN-ului ar putea

"dicta" ordonarea aminoacizilor în cadrul

macromoleculei proteice. Dar, cu timpul,

ipoteza a început să nu mai fie agreată

deoarece au apărut o sumedenie de inadver­

tenţe, în primul rând, grupele specifice de

pe cele patru baze din ARN (U, C, A, şi G)

vor interacţiona cu grupele hidrosolubile.

Grupele specifice ale multor aminoacizi

(leucină, valină, fenilalanină) preferă

interacţiunea cu grupări hidrofobe (grupări

Acizii nucleici n insolubile în apă). în cel de al doilea rând,

chiar dacă ARN-ul ar fi putut să se cuteze,

încât să etaleze suprafeţele hidrofobe, nu ar

exista nici o cale pentru matriţa de ARN, de

a discerne cu acurateţe între moleculele

foarte asemănătoare de aminoacizi (cum ar

fi glicina şi alanina, vaiina şi leucina - care

diferă doar prin prezenţa unei singure grupe

metil). De aceea Crick a emis ipoteza în

conformitate cu care, anterior incorporării în

proteină, aminoacizii sunt ataşaţi la molecule

adaptoare care, în schimb, posedă suprafeţe

unice care se pot lega în mod specific la

bazele din macromolecula ARN-ului.

1.1.3 Sinteza proteinelor în tuburi-

test. Stabilirea proceselor prin care protei­

nele sunt sintetizate, impunea obţinerea unor

extracte celulare, capabile de a asigura toate

etapele sintezei. Acest lucru a fost posibil în

1953 când, la un spital din Boston, P. C. Z

amecnic şi colaboratorii săi, au folosit

aminoacizi marcaţi radioactiv, spre a marca

căile prin care se sintetizează proteinele. S-a

propus ca locul din celulă în care se sinte­

tizează proteinele să fie considerat acela în

care există o mare concentrare de ribosomi.

O altă precizare, extrem de importantă, a

fost aceea că ATP (adenozin trifosfatul) este

necesar ca sursă de energie - catalizând

formarea legăturilor dintre peptide. Câţiva

ani mai târziu, Zamecnic împreună cu M. B.

Hoagland au precizat că, anterior înglobării

în proteine, aminoacizii sunt legaţi la ARN t

cu ajutorul unei clase de enzime numite

aminoacil-sintetaze. ARN t reprezintă cea

10% din cantitatea de ARN celular.

Aceasta a fost o descoperire cu totul

neaşteptată - exceptând ipoteza adaptorului,

emisă de Crick, în conformitate cu care

lanţuri scurte de ARN aveau bazele cupla-

bile cu bazele complementare ale macro-

molecuielor de ARN ce serveau ca matriţă

pentru sinteza proteică.

1.1.4 Paradoxul ribosorailor nespecif­

ici. Peste 85% din ARN-ul celular se

găseşte în ribosomi. Cantitatea lui creşte în

celulele caracterizate prin activitate biosin-

tetică intensă (cum ar fi celulele pancreatice,

celulele hepatice, bacteriile în faza de

creştere intensă etc. ).

ARN r a fost considerat iniţial ca matriţă

pentru ordonarea aminoacizilor. Dar, toţi

ribosomii sunt compuşi din două subunităţi

inegale ca mărime, fiecare conţinând ARN,

care se adună sau se separă, în funcţie de

concentraţia ionică. In cel de al doilea rând,

Ion I. Băra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu 12

toate lanţurile ARN r din cadrul subunităţilor

mici, sunt similare ca lungime (au 1. 500

baze la Escherichia coli), în timp ce lanţu­

rile ARN-ului din subunităţile mari au în jur

de 3. 000 baze. în cel de al treilea rând,

compoziţia ambelor tipuri de lanţuri (atât a

celor mari, cât şi a celor mici) este aproxi­

mativ aceeaşi (bogată în G şi C) ia toate

bacteriile investigate, la plante şi animale -

în ciuda marii variabilităţi în raportul

AT/GC din ADNS. Deci, toate acestea sunt

imposibile dacă lanţurile de ARN ar fi o

colecţie de lanţuri cu rol de matriţă -

"copie" ale unor gene diferite. Adică ar

trebui să existe o strânsă corelaţie cu

genomul respectiv. Mai mult, noi ne-am

putea aştepta ca lungimea lanţurilor diferi­

telor matriţe de ARN să fie diferită şi

corelată cu lungimea produşilor polipepti-

dici.

1.1.5 Descoperirea ARNm. Celulele

infectate cu virusul T4 s-au dovedit a fi un

sistem ideal pentru depistarea matriţei

adevărate. Urmărind infecţia determinată de

acest virus, s-a constatat că activitatea

sintetică a celulelor de Escherichia coli,

afectate, este stopată, având loc doar

producerea de ARNm, pe matriţa oferită de

ADN-ul virai. Mai mult, nu numai ARN-ul

sintetizat astfel are o componenţă bazică

foarte asemănătoare ADN-ului din fagul T4

clar nici nu este asamblat în componente

ribosomaie (care, după cum se ştie, se

formează doar prin asociere de proteine cu

ARN r). în schimb, ARN-ul fagului T 4, după

prima ataşare la rîbosomii deja existenţi, se

mişcă în lungul suprafeţei lor, până ce se

cuplează în aşa fel încât să fie posibilă

cuplarea ARN t, cu aminoacidul specific legat

la el, la locul unde nodocul (anticodonul)

este complementar codonului. întrucât poartă

informaţia de la ADN la locurile cu aglo­

merări ribosomaie, pentru sinteza proteică,

acesta a primit şi poartă denumirea de

ARNm (adică ARN mesager). Primele

observaţii relative la aceste fenomene au fost

efectuate în anul 1960.

Doar 4% din totalul ARN-ului celular

este ARNm, a cărui mărime prezintă variaţii

de largă amplitudine în lungime, în funcţie

de proteina pe care o codifică. Deci numai

o mică moleculă de ARN mesager este a¬

taşată, la un moment dat, la un ribosom, ca­

re este purtat (glisat) în lungul său. Astfel,

o singură macromoleculă ARNm poate fi citi­

tă simultan de mai mulţi ribosomi.

Acizii nucleici 13

1.1.6 Sinteza enzimatică a ARN pe

matriţa ADN. Prima dintre enzimele care

transcriu ARN din ADN a fost izolată,

independent, de către J. Hurwitz, A.

Stevens şi S. B. Weiss. Denumită polime-

rază-ARN, această enzimă funcţionează

numai în prezenţa ADN-ului care serveşte ca

matriţă, pe care se formează lanţul ARN-

ului, folosindu-se nucleotidele ATP, GTP,

CTP şi UTP, ca precursori. In bacterii,

aceeaşi enzimă realizează sinteza pentru

fiecare dintre tipurile de ARN (ribosomal,

transportor, mesager), folosind secvenţe de

ADN ca matriţe. Dovada directă a faptului

că ADN-ul ordonează corect precursorii

nucleotidici, provine din aceea că, în ARN,

compoziţia bazelor variază în corelaţie cu

rata AT/GC din ADN. în aproape toate

cazurile, raportul AU/GC din ARN este

similar raportului AT/GC din ADN.

în timpul transcripţiei, numai una dintre

catenele ADN-ului este transcrisă în

macromolecula ARN r a. Acest lucru este

normal deoarece mesajul purtat de cele două

catene, fiind complementar dar nu identic,

poate codifica polipeptide complet diferite.

Sinteza ARN-ului se desfăşoară, întotdea­

una, într-o singură direcţie (mereu aceeaşi).

Există argumente clare pentru mişcarea

ARN-ului de la ADN-ul nuclear către

ribosomii din citoplasmă. Prin marcare

radioactivă s-a demonstrat că locul sintezei

ARN-ului este nucleul. în decurs de o oră

după sinteză, acest ARN părăseşte nucleul.

1.1.7 Represia şi activarea represiei

genice. Suscită deosebit de mult interes

faptul că unele proteine înregistrează

fluctuaţii cantitative dramatice, în funcţie de

necesităţile celulei. Ca exemplu, în acest

sens, poate fi luată j3-gaîactozidaza bacteri-

ană. în absenţa lactozei, bacteria Escherichia

coli conţine mii de astfel de molecule. F.

Jacobs şi J. Monod au elucidat acest aspect,

prin explicarea modalităţilor concrete prin

care poate fi reglat procesul sintezei prote­

ice. Ei au introdus şi explicat noţiunile de

genă reglatoare, genă promotor, genă

operator, gene structurale, represor şi

corepresor, inducţie şi retroinhibiţie

genetică şi enzimatică e t c , - noţiuni pe

care le vom explica, la rândul nostru, atunci

când vom aborda procesul autoreglabil al

sintezei proteice la procariote.

1.1.8 Colinearitatea. Este un fenomen

genetic deosebit de important. A fost sesizat

şi demonstrat prin analize ale mutaţiilor

14 Ion I. Băra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu

manifeste în proteinele bacteriene. Experi­

mentele au fost efectuate la Stanford, în

1960, de către C. Yanofsky şi la Cam-

bridge, de către Brenner. în 1961, Brenner

şi Crick au stabilit că grupele de trei

nucleotide sunt folosite spre a specifica

aminoacizii. Dar ce codon specifică un

anumit aminoacid ?. M. W. Nirenberg şi J.

H. Mathaei, din Bethesda (Maryland) au

observat, în 1961, că polimerizarea nucle-

otidului U, pentru formarea pol inucleotidului

UUUUUUUU.. . . , prin adăugare de U la un

sistem acelular, conduce la sinteza poiifenil-

alaninei. Pe această cale (prin această

metodă) s-au identificat toţi ceilalţi codoni.

H. G. Khorana (Madison, Wisconsin) a

sintetizat AGUAGUAGU e t c , etc. S-a

constatat, prin această metodologie, că doar

61 dintre cei 64 de codoni au capacitatea de

a codifica aminoacizii (de a specifica locul şi

numărul fiecăruia dintre cei 20 aminoacizi în

cadrul unei polipeptide). Ceilalţi trei codoni,

identificaţi ulterior a fi UAA, UAG şi UGA

s-au dovedit a avea rolul de terminatori ai

sintezei polipeptidei, fiind denumiţi codoni

STOP. Evident (s-a demonstrat tot prin

experimente), aşa cum există semnale

STOP, există şi semnale START, semnale

care declanşează procesul biosintezei.

Translaţia unei macromolecule ARNm

începe de la un capăt şi se termină când

întregul mesaj ereditar a fost transferat într-

o macromoleculă proteică. Dar translaţia

începe şi sfârşeşte în poziţii interne ale

macromoleculei ARNm. Prin urmare trebuie

să existe nişte semnale în interiorul ARNm

(corespunzătoare catenei antisens a ADN-

ului), semnale care să declanşeze şi, apoi, să

stopeze translaţia. Cei trei codoni menţionaţi

anterior - UAA, UAG şi UGA- cunoscuţi ca

nonsens, nu corespund nici unui aminoacid

dar servesc drept semnale stop. Mai com­

plicată este problema codonului START.

Aminoacidul metionină începe toate lanţurile

polipeptidice dar tripleta AUG, care codifică

acest aminoacid, codifică şi metionină din

interiorul unui poiipeptid. Codonul AUG,

care iniţiază lanţul polipeptidic, este prece­

dat de un bloc de nucleotide predilect

purinice, care are roiul de a ataşa ARNm la

ribosomi.

1.1.9 Utilitatea enzimelor care secţio­

nează ADN în fragmente bine definite.

Semnalele pentru iniţierea şi stoparea

sintezei catenelor ARNm sunt codificate în

ADN. Acestea sunt mai complicate decât

semnalele implicate în declanşarea sau

Acizii nucleici 15

stoparea translaţiei şi sunt evidenţiate doar

atunci când sunt disponibile tehnicile de

secvenţiere. în 1970, Hamilton Smith a

izolat prima enzimă care taie ADN-ul la o

secvenţă nucleotidică foarte specifică. Peste

puţin timp, au fost izolate câteva astfel de

enzime, fiecare de la o anumită bacterie. Se

cunosc, acum, peste 100 de tipuri de

enzime. în general, o asemenea enzimă,

numită enzimă de restricţie, recunoaşte o

secvenţă unică de 4 sau 6 nucleotide şi astfel

taie o macromoleculă de ADN peste încă

câteva sute sau chiar mii de baze (tabel 2).

Tabelul 2

Secvenţele recunoscute de unele enzime de restricţie

Specia microbiană Enzimă Locusul de recunoaştere

Escherichia coli KY13 Eco RI 5' GAA TTC

Hemophilus influenzae Rd Hin dll 5' GTPy

CAPu

PuAC

PyTG

Hemophilus parainfluenzae

H p a l 5' GTT

CAA

AAC

TTG Hemophilus parainfluenzae

Hpa II y CC

GG

GG

CC

Hemophilus aegyptius Hae III

i

5 ' GG

CC

CC

GG

Existenţa acestor enzime a schimbat

rapid cursul cercetărilor privitoare la ADN,

dând biochimiştilor posibilitatea, pentru

prima oară, să experimenteze pe fragmente

de ADN bine definite. Aceste procedee s-au

dovedit deosebit de eficiente în izolarea de

fragmente ADN distincte, din ADN-ul viral

a cărui lungime varia de la câteva mii, până

la 50. 000 nucleotide..

1.1.10 Acidul dezoxiribonucleic recom-

Ion I. Bara, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vântu 16

binant. Cea mai importantă consecinţă,

sesizată destul de timpuriu, a posibilităţii de

a utiliza enzimele de restricţie, a fost

dezvoltarea şi definitivarea tehnicilor de

obţinere a ADN-ului recombinam. S-a

descoperit, spre exemplu, existenţa enzimei

ADN-ligaza. Prin intermediul ei, fragmen­

tele ADN, obţinute sub incidenţa restricta-

zei (o altă enzimă), au fost reunite, rando-

mic. Apoi s-au reunit fragmente provenind

din molecule diferite (P. Berg, în 1972). S.

Cohen şi H. Boyer au reunit cromosomul

bacterian cu o piasmidă. Acum, în 2-3 zile,

este posibilă citirea unei secvenţe de câteva

sute de nucleotide.

1.1.11 ARN-ul poate funcţiona ca

material genetic. în 1930 s-a constatat că

unele virusuri ale plantelor conţin ARN şi

nu ADN. Abia în 1956, A. Gierer, în

Germania, a demonstrat că ARN-ul purificat

din mozaicul tutunului este infecţios, în

absenţa proteinelor. în urma acestor con­

statări cercetările s-au intensificat şi s-au

descoperit şi alte virusuri, dintre care

amintim virusul polioma şi cel al gripei,

care au ARN-ul ca suport material al

eredităţii. Dovezile în conformitate cu care

virusurile cu ARN se replică identic celor cu

ADN, au fost furnizate de experimentele

efectuate cu virusuri mici, care se multiplică

în bacterii şi care conţin molecule de ARN

monocatenare. în 1965, I. Haruna şi S.

Spiegelman au izolat o repîicază virală - o

enzimă care catalizează formarea de noi

molecule de ARN, în prezenţa precursorilor.

Modalităţile concrete prin care se formează

aceste molecule au fost demonstrate abia în

1968, de către C. Weissmann şi J. August,

independent unul de altul. Ei au relevat

faptul că are loc implicarea unei molecule

ARN dublu catenar, ca intermediar.