METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR B. Stoica (ver. 1.0, necorectat) Nucleotidele sunt compui care ndeplinesc o multitudine de funcii celulare. Cea mai important s-ar prea c este funcia de suport informaional deoarece nucleotidele intr n structura acizlior nucleici. Se pot aminti i alte funcii cum ar fi: depozite energetice, transportori pentru unii intermediari activai din sinteza unor carbohidrai, lipide i proteine, componente eseniale ale unor coenzime (FAD, NAD+, NADP+ i coenzima A), reglatori pentru unele ci din metabolismul intermediar, inhibnd sau activnd enzimele cheie din diferite ci metabolice, etc. Bazele purinice i pirimidinice din nucleotide pot fi sintetizate de novo sau pot fi obinute prin ci de salvare care permit reutilizarea bazelor preformate rezultate din turnoverul celular normal sau din diet. STRUCTURA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt formate dintr-o baz azotat (purinic sau pirimidinic), o pentoz (riboza sau 2-deoxiriboza) i una sau mai multe molecule de acid fosforic. Derivaii purinici majori din celul sunt adenina i guanina. Alte baze ntlnite sunt hipoxantina i xantina, intermediari din mettabolismul adeninei i guaninei.

Nucleozidele derivate din aceste molecule conin riboz sau deoxiriboz legat la nucleul purinic printr-o legtur -N-glicozidic la atomul N-1. Ribonucleozidele conin riboz n timp ce deoxiribonucleozidele conin deoxiriboz (o molecul de riboz n care gruparea hidroxil din poziia 2 lipsete, fiind inlocuit cu hidrogen).

Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor. 3-nucleotidele ca de exemplu adenozin-3-monofosfatul (3-AMP) se gasesc n celul ca rezultat al degradrii acizilor nucleici. n celulele normale, di i tri fosfat nucleozidele se gsesc n concentraie mai mare dect monofosfat nucleozidele, nucleozidele sau bazele libere.

Nucleotidele pirimidinice gsite n concentraie mare n celul sunt acelea care conin baze azotate cu nucleu pirimidinic (uracil, citozin i timin).

Citozina i uracilul sunt pirimidinele din nucleotidele care intr n structura ARN n timp ce timina i citozina se gsesc n compoziia ADN. Ca i derivaii purinici, nucleozidele sau nucleotidele pirimidinice conin fie riboz, fie deoxiriboz. Glucidul este legat la pirimidin printr-o legtur -Nglicozidic la atomul N-1. Nucleozidele pirimidinice sunt uridina, citidina sau timidina (respectiv deoxiuridina, deoxicitidina sau deoxitimidina). Esterii monofosforici ai nucleotidelor pirimidinice sunt UMP, CMP i TMP. n celul compuii majori

pirimidinici conin 2 sau 3 resturi de fosfat. Grupele fosfat sunt responsabile de ncrcarea negativ a nucleotidelor i a acizilor nucleici.

n concluzie se poate vorbi de mai multe structuri care sunt strns legate unele de altele. Astfel avem 5 baze azotate mai importante (2 cu heterociclu purinic adenina i guanina i 3 cu heterociclu pirimidinic uracil, timina i citozina), 5 nucleozide (care conin pentoze) i 5 nucleotide (care conin 1,2 sau 3 resturi de acid fosforic). De menionat c numrul acestor structuri este de fapt dublu dac inem cont c putem avea ca pentoze i riboza i deoxiriboza. In afara de cele 5 baze azotate numite i majore, se mai cunosc baze azotate minore. Acestea se gasesc ntr-o cantitate relativ mic att n structura ADN-ului ct i a ARN-ului, caracterizndu-se prin mici modificari ale nucleelor purinice sau pirimidinice (metilri, prezena sulfului, izomeri ai nucleelor, etc).

PROPRIETILE NUCLEOTIDELOR Componentele celulare coninnd fie baze purinice, fie pirimidinice pot fi evideniate uor datorit absorbiei puternice n ultraviolet a acestora. Bazele purinice, nucleozidele i nucleotidele corespunztoare au absobie mai puternic dect pirimidinele i derivaii acestora. Lungimea de und la care se afl maximul de absobie a acestor compui este n funcie de baza component, dar n cele mai multe cazuri este n jur de 260 nm. Spectrul de absobie n UV pentru nucleozide sau nucleotide variaz n funcie de pH. Absorbia n UV i diferenele care apar datorit structurii specifice a bazelor reprezint o metod de cercetare pentru acesti compui. Legtura N-glicozidic din nucleozidele purinice sau pirimidinice este stabil fa de alcalii, n timp ce stabilitatea acestor legturi la hidroliza acid difer: legtura Nglicozidic din nucleozidele i nucleotidele purinice este uor hidrolizat de acizi diluai la temperatur ridicat (60C) cnd se elibereaz baza purinic i glucidul sau glucid-fosfatul. Legtura Nglicozidic din nucleozidele i nucleotidele pirimidinice este foarte stabil la acest tratament. Totui, condiii mai severe ca de exemplu acid percloric 60% i 100C hidrolizeaz aceste legturi elibernd pirimidina cu distrugerea complet a pentozei. Datorit naltei polariti a grupului fosfat, nucleotidele purinice sau pirimidinice sunt mult mai solubile n soluii apoase dect nucleozidele i bazele lor

libere. n general nucleozidele sunt mai solubile dect bazele purinice sau pirimidinice libere. Datorit caracterului aromatic al purinelor i pirimidinelor, substituenii oxo sau amino particip la tautomeria: ceto enol i amino imino.

DISTRIBUIA NUCLEOTIDELOR N CELUL Derivaii 5-nucleotidici sunt formele principale ale compuilor purinici i pirimidinici. Concentraia intracelular a nucleotidelor variaz mult i depinde de tipul de celul. ATP ul este nucleotidul cu cea mai mare concentraie intracelular. De exemplu n globulele roii adenin-nucleotidele se gsesc n exces fa de alte nucleotide prezente n concentraii extrem de mici. n ficat i alte esuturi este prezent spectrul complet de mono, di i trifosfonucleotide ca i UDP-glucoza, acidul UDP-glicuronic NAD+ i NADP+. Bazele libere, nucleozidele sau 2 i 3 nucleotidele din fracia acid solubil din celul reprezint produi de degradare ai nucleotidelor endogene i exogene sau acizilor nucleici. Prezena aa numitor baze minore este datorat degradrii acizilor nucleici. Concentraia ribonucleotidelor din celul este de ordin milimolar n timp ce concentraia deoxiribonucleotidelor din celul este de ordin micromolar. Nivelu de deoxiribonucleotidelor este subiectul flutuaiilor majore din timpul ciclului celular, comparativ cu nivelul ribonucleotidelor care rmne relativ constant. n condiii normale, concentraia total a nucleotideor oscileaz n limite foarte stricte, ns concentraia componentelor individuale poate varia. De exemplu concentraia total a adenin-nucleotidelor (AMP, ADPi ATP) este constant dar variaz raportul ATP/AMP+ADP, dependent de starea energertic a celulei. Aceste concentraii fixe se datoreaz faptului c sinteza nucleotidelor este una din cile metabolice cele mai fin reglate din celul. FUNCIILE METABOLICE ALE NUCLEOTIDELOR Toate tipurile de celule (mamifere, bacterii i plante) conin o mare varietatede nucleotide i derivaii lor. Unele din aceste nucleotide se gdsesc n concentraii relativ mari (de ordin milimolar) n celule. Numrul mare de nucleotide i derivate ale acestora din celul este motivat de implicarea acestora ntr-o multitudine de procese metabolice importante pentru dezvoltarea i creterea normal a celulelor. Principalele roluri lae nucleotidelor sunt: - uniti monomerice ale macromoleculelor informaionale, ADN i ARN. n sinteza acizilor nucleici, nucleozid-5-trifosfaii sunt substrate i sunt legai n polimer prin legturi 3,5-fosfodiesterice (cu eliberare de pirofosfat). - mediatori fiziologici: nucleotidele sau nucleozidele servesc ca mediatori ai proceselor metabolice cheie. AMPc este unul dintre cei mai cunoscuti mesageri secunzi (ex:reglarea glicogenolizei mediat de epinefrin i glucagon). - GMPc activeaz ca mediator i alte evenmente celulare. - ADP este indispensabil agregrii plachetare normale i deci coagulrii sngelui. - adenozina produce dilataia vaselor coronare i prin urmare este important pentru reglarea circulaiei coranariene. - GTP este necesar pentru funcii ca: transducerea semnalului de ctre proteinele G care leag GTP n scopul activrii acestora.

-

-

-

componente ale coenzimelor: NAD+, NADP+, FAD, FMN, adenozilcobalamina, S-adenozil-metionina i CoA sunt constitueni celulari implicai direct n multe mecanisme enzimatice. rol n metabolismul energetic: ATP este principala form de stocare a energiei chimice n celulele vii. Sinteza ATP se poate face cu ajutorul reaciilor de fosforilare oxidativ cuplate cu lanul respirator mitocondrial i cu ajutorul reaciilor de fosforilare la nivelul substratului. ATP este utilizat pentru a dirija reaciile metabolice i este implicat n diverse procese consumatoare de energie: contracia muscular, transportul activ prin membrane, generarea potenialelor de aciune n celule specializate, etc. Ca agent de fosforilare ATP servete ca donor de fosfat pentru generarea altor nucleozid-trifosfai (GTP, UTP, CTP i TTP). intermediari activai: nucleotidele servesc ca transportori de intermediari activai necesari pentru o varietate de reacii. Ca exemple se pot da: UDPglucoza este intermediar cheie n sinteza de glicogen, glicoproteine i acid glucuronic; GDP-manoza, GDP-fucoza, UDP-galactoza, acidul CMP-sialic sunt intermediari cheie n reaciile n care restul de zahr este transferat pentru sinteza de glicoproteine; CDP-colina, CDP-etanolamina sau CDPdiacilglicerolul cu rol n metabolismul fosfolipidelor; S-adenozil metionina (SAM) i 3-fosfoadenozin-5-fosfosulfatul (PAPS) sunt compui donori de metil respectiv sulfat n diverse ci metabolice. efectori alosterici: multe trepte reglate din cile metabolice sunt controlate de concentraia intracelular a nucleotidelor.

BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt sintetizate prin 2 tipuri de reacie: de novo, adic din molecule mici precursoare i de salvare din purinele i pirimidinele care pot fi reutilizate dup catabolismul acizilor nucleici. BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR PURINICE A. Sinteza de novo a nucleului purinic n celulele mamiferelor utilizeaz aminoacizi ca donori de C i N iar CO2 i formiatul ca donor de C. n figura .... sunt indicate sursele de C i N din bazele azotate purinice. S-a demonstrat c nivelul glutaminei i aspartatului influeneaz rata sintezei acestor nucleotide n celulele tumorale. Multe din reaciile acestei ci necesit ATP.

Toate enzimele implicate n sinteza purin-nucleotidelor se gsesc n citoplasma celular dar nu toate celulele sintetizeaz nucleotide. O serie de 10 reacii conduc la sinteza de novo a inozin-monofosfatului (IMP) care servete ca precursor pentru adenozin-5-monofosfat (AMP) i guanozin-5monofosfat (GMP).

CONVERSIA IMP LA AMP I GMP Conversia IMP la GMP necesit ATP ca surs de energie n timp ce conversia spre AMP necesit GTP. Prin urmare, dac n celul exist suficient ATP, IMP va fi convertit la GMP i invers, cnd este suficient GTP n celul IMP este convertit la AMP.

Rata sintezei depinde de disponibilitatea R-5-P i de activitatea PRPP-sintetazei, o enzim sensibil la concentraia de fosfat i la purin-ucleotidele care acioneaz ca reglatori alosterici. Reacia 2 de formare a 5-fosforibozil aminei este trepta de control n cadrul sintezei i este puternic reglat de nucleotidele IMP, GMP i AMP. La punctul de ramificare al cii, cele 2 enzime IMP dehidrogenaza i adenilosuccinat sintetaza au valori ale KM similare pentru IMP, AMP este un inhibitor competitiv al adenilosuccinat sintetazei n timp ce GMP este inhibitor competitiv pentru IMP-dehidrogenaza. Printr-un mecanism de feed-back AMP i GMP inhib PRPPamidotransferaza. Produii finali ai biosintezei de novo acioneaz ca efectuori negativi asupra enzimei care catalizeaz reacia 2. Concentraia PRPP n celul este un determinant major n sinteza nucleotidelor purinice i reflect rata sintezei, utilizarea i degradarea lor. CALEA DE SALVARE Eficiena metabolismului celular n condiii normale se datoreaz aa numitei ci de salvare n care bazele preformate (din surse exogene sau din turn-over-ul acizilor nucleici) pot fi reutilizate, cu economisirea unor mari cantiti de energie pentru celul.

Enzima care catalizeaz ambele reacii este hipoxantin-guanin-fosforiboziltransferaza (HGPRT) i necesit ioni de magneziu. Este reglat de prezena IMP sau GMP care acioneaz ca inhibitori competitivi.

Nucleozid difosfaii sunt sintetizai din NMP corespunztor i ATP care se gsete n concentraie mai mare n celul. Enzimele implicate sunt adenilat chinaza sau guanilat chinaza.

Adenilat chinaza este acctiv n ficat i muchi unde concentraia ATP este mare. NDP i NTP sub aciunea nucleozid difosfat chinazei sunt interconvertibili.

Enzima care catalizeaz aceast reacie este adenin fosforibozil transferaza (APRTaza) i necesit ioni de Mg. Produsul reaciei este AMP care funcioneaz i ca inhibitor al enzimei. Aceste reacii sunt importante nu numai pentru faptul c se conserv energia, dar permit unor celule (ex.: eritrocitul) s formeze nucleotide din baze azotate simple. Aceste celule nu sintetizeaz 5-P-ribozilamin din PRPP din cauza lipsei enzimei PRPP-amidotransferazei, motiv pentru care depind de fosforiboziltransferaze pentru a sintetiza nucleotide. DEGRADAREA PURINELOR Nucleotidele, nucleozidele i bazele purinice parcurg o cale comun de degradare. Produsul final al acestei degradri la om este acidul uric. Enzimele implicate n degradarea acestori compui variaz ca specificitate.

Xantin oxidaza (XO) este o enzim care conine FAD, Fe (III) i Mo (VI) n reaciile catalizate oxigenul este substrat genernduse ap oxigenat ca produs de reacie.

Exist afeciuni clinice n care nivelul seric al acidului uric este crescut. Guta primar este un deficit metabolic de reglare al catabolismului purinelor i se caracterizeaz prin hiperuricemie. Clinic guta se manifest prin crize de artrit acut (atac de gut) legat de inflamaia produs prin depozitarea cristalelor de urat de sodiu greu solubil la nivelul articulaiilor. Prin acelai fenomen precipitarea uratului de sodiu la nivel renal poate produce litiaz renal. Exist i hiperuricemie secundar datorat unei superproducii de acid uric n cadrul unor afeciuni n care catabolismul purinelor este accelerat: cancer, iradiere, boli endocrine, etc. Tratamentul clasic cu alopurinol inhib competitiv xantin oxidaza scznd n acest fel produsul final de catabolism care este greu solubil. Deficiena de adenozin dezaminaz (ADA) cauzeaz imunodeficien, implicnd disfuncia celulelor T i B. Deficiena de purin nucleozid fosforilaza duce la creterea nivelului de purin nucleozide i nucleotide. METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE A. SINTEZA Pirimidinele sunt sintetizate de novo n celulele mamiferelor din aminoacizi. Se folosesc glutamina i aspartatul ca donor de azot i carbon, iar CO2 ca donor de carbon.

Secvena de reacii care duce la sinteza nucleotidelor este: 1. formarea carbamil fosfatului (C-2 i N-3 din nucleu de pirimidin). 2. adiia aspartatului (N-1, C-4, C-5 i C-6). Reacia este considerat treapta de reglare n sinteza de pirimidine. 3. nchiderea nucleului cu formarea acidului dihidroorotic. 4. oxidarea la acid orotic. 5. adiia ribozo-5-fosfatului sub aciunea orotat fosforibozil transferaza. PRPP este donor de ribozo-5-P. 6. decarboxilarea orotidin-monofosfatului. Enzima implicat se numete OMPdecarboxilaza i lipsa acesteia duce la aciduria orotic. 7. sinteza de UTP, CTP sau TTP.

Dei calea de sintez de novo necesit prezena a 6 activiti enzimatice care catalizeaz 6 trepte, acestea sunt produse numai de 3 gene: - Carbamil fosfat-sintetaza, aspartat carbamil-transferaza i dihidro-orotaza, (abreviate PYR 1-3 sau CAD) se gsesc pe acelai lan polipeptidic ( 200000 Da). - Dihidro-orotat-DH este o protein separat. - Orotat-fosforibozil transferaza i OMP-decarboxilaza (PYR 5-6) sunt pe acelai lan polipeptidic (51000 Da). Enzimele multifuncionale PYR 1-3 i PYR 5-6 se gsesc n citozol, n timp ce dihidroorotat-DH este o enzima mitocondriala. Deci produsul final al acestor reacii este UMP. Formarea citidin nucleotidelor are loc din uridin nucleotide, cu precdere din derivaii trifosforici mai curnd dect monofosforici.

Concentraii mai mici de 0,2 mM GTP stimuleaz activitatea CTP sintetazei de 5-10 ori. Dei carbamilfosfat sintetaza I mitocondrial este diferit de cea citoplasmatic II, n condiii de stres fiziologic, cnd n ficat este un exces de amoniac, enzima I sintetizeaz carbamilfosfat care trece din mitocondrii n citoplasm i devine substrat pentru aspartat carbamil transferaz. Cnd concentraia de amoniac este mare (toxic) sa observat o eliminare mai mare de acid orotic. Calea de sintez a pirimidinelor difer de cea a purinelor: - n sinteza purin nucleotidelor legtura N-glicozidic se formeaz n prima treapt care este i treapta de reglare n timp ce n sinteza pirimidin nucleotidelor mai nti se formeaz nucleul de pirimidin i apoiu legtura Nglicozidic. - toate enzimele implicate n sinteza de nucleotide purinice sunt n citoplasm n timp ce n sinteza pirimidin nucleotidelor una se gsete n mitocondrii (orotatDH) i celelalte cinci fiind prezente n dou proteine din citosol. REGLAREA SINTEZEI Are loc la nivelul a dou enzime: - carbamil fosfat sintetaza care este inhibat de UTP. - OMP-decarboxilaza (inhibitorii enzimei sunt UMP i ntr-o msur mai mic CMP). Deoarece OMP-decarboxilaza i orotat fosforibozil transferaza sunt pe acelai lan polipeptidic, funcionarea lor este simultan. B. CALEA DE SALVARE Pirimidinele provenite numai din acizii nucleici celulari (nu i cele din aportul exogen) pot fi salvate cu ajutorul unei reacii de fosforilare a nucleozidelor corespunztoare:

Exist 2 tipuri de kinaze: o enzim accept ca substrat uridina i citidina i alta timidina. S-ar prea ca acest tip de reutilizare e mai important dect in cazul purinelor. FORMAREA DEOXIRIBONUCLEOTIDELOR Concentraia deoxiribonucleotidelor este extrem de redus pentru celulele n repaus. Numai n timpul replicrii n ADN (faza S) fondul de nucleotide crete pentru a susine aceast sintez. Deoxiribonucleotidele se formeaz prin reducerea direct n poziia 2 a ribonucleotidelor corespunztoare.

Reacia este reglat nu numai de efectori alosterici dar i de modificri ale concentraiilor enzimelor implicate. Enzima care catalizeaz transformarea este nucleozid difosfat reductaza (ribonucleotid reductaza). Aceast reducere a NDP necesit un nucleozid trifosfat specific (NTP) ca efector alosteric pozitiv sau negativ al enzimei. Ribonucleotid reductaza este format din 2 subuniti identice care separat nu a activitate enzimatic. Una din subunti conine centrii de legare a efectorului n timp ce a 2-a subunitate conine fier neheminic i un radical liber tirozil (probabil care face parte din centrul aactiv al enzimei). Cele 2 subuniti care formeaz enzima activ sunt codificate de gene separate care sunt exprimate difereniat n timpul ciclului celular. La mamifere nu este clar dac exist o singur enzim pentru toate substratele (CDP, UDP, ADP, GDP) sau dac sunt enzime i centri de legare separai. Deoxi-ATP este un puternic inhibitor al reductazei celor 4 substrate. Acest fapt furnizeaz bazele biochimice pentru toxicitatea deoxiadenozinei pentru multe celule mamifere. Tioredoxina este o protein cu mas molecular mic (12000) care este oxidat n timpul reducerii grupului 2-OH din restul de riboze. Pentru a completa ciclul catalitic tioredoxina redus este regenerat de ctre tioredoxin-reductaz (o flavoprotein) i ENADPH. Ribonucleotid reductaza este singura enzim responsabil de cataliza reaciei de formare a deoxinucleozid trifosfailor necesari pentru replicarea ADN. n controlul nivelului deoxiribonucleotidelor din celul sunt utilizate cel puin 2 ci: - concentraia celular a reductazei. - reglarea strict alosteric a activitii enzimei de ctre NTP. SINTEZA DEOXITIMIDILATULUI Deoxitimidilatul se formeaz prin transferul concomitent cu reducerea unei uniti cu un singur atom de carbon (metil) pe deoxiuridin monofosfat (dUMP). Reacia este catalizat de timidilat sintaza i necesit N5N10-metilen-FH4 ca transportor de fragmente cu un carbon.

dUMP pentru aceast reacie provine din 2 ci diferite: dezaminarea dCMP sub acinea enzimei dCMP-dezaminaza i reducerea UDP la dUDP care este convertit apoi la dUMP. CATABOLISMUL PIRIMIDIN NUCLEOTIDELOR

Din turnover-ul acizilor nucleici se formeaz pirimidin nucleotide care se afl ntr-o continu dinamic, fiind consttant sintetizate i degradate.

Prin catabolism nucleotidele sunt degradate la nucleozide i apoi la baze libere (uracil i timin). Conversia la nucleozide este catalizat de fosfataze nespecifice. Deoxicitidilat dezaminaza are preferin pentru dCMP dar poate utiliza i CMP ca substrat. Citidina i deoxicitidina sunt dezaminate la uridin i respectiv deoxiuridin de ctre nucleozid dezaminaza. Uridin fosforilaza catalizeaz fosforoliza nu numai a uridinei dar i a deoxiuridinei i deoxitimidinei. Trebuie subliniat c celulele mamiferelor conin o deoxi-UTP fosforilaz specific n concentraie mare care catalizeaz reacia: dUTP dUMP + pirofosfat Uracilul i timina sunt degradate mai departe la -alanin i -amino izobutirat. Enzimele implicate n aceast etap de degradare sunt: - dihidropirimidin-dehidrogenaza - dihidropirimidinaza - ureidopropionaza

Acidul -amino izobutiric este excretat prin urin i nivelul lui crete la pacieni cu cancer supui chimioterapiei sau radioterapiei (la acetia un nr. Foarte mare de celule sunt omorte i ADN-ul degradat). NUCLEOZID I NUCLEOTID KINAZELE Purin i pirimidin nucleotidele sunt sintetizate de novo ca monofosfat. Totui cele mai multe reacii dac nu toate necesit nucleotide ca difosfai sau trifosfai. n acest sens exist kinaze specifice care salveaz nucleozidele ca nucleotide i care convertesc nucleozid monofosfaii la di i trifosfai. De exemplu:

Alte kinaze care catalizeaz astfel de reacii sunt: - pirimidin nucleozid monofosfat kinaze a cror substrate sunt CMP, UMP i dCMP. - timidin kinaza - timidilat kinaza - adenozin kinaza - nucleozid difosfokinaza - AMP kinaza - GMP kinaza COMPUI CARE INTERFER CU METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PURINICE I PIRIMIDINICE AGENI CHEMOTERAPEUTICI Sinteza de nucleotide purinice i pirimidinice este necesar pentru replicarea, meninerea i funcionarea normal a celulelor. Reglarea acestei sinteze are o deosebit importan deoarece defecte ale unor etape din aceste ci sunt la originea difweritelor afeciuni. Muli compui care au fost sintetizai sau izolai ca produi naturali din

plante, bacterii sau fungi sunt inhibitori relativ specifici ai enzimelor implicate n producerea sau interconversia nucleotidelor. Aceti compui utilizai n terapia multor afeciuni au fost clasificai ca: antimetabolii, antifolai, antagoniti ai glutaminei i ali compui. ANTIMETABOLIII sunt analogi structurali ai bazelor azootate purinice sau pirimidinice sau ai nucleozidelor i interfer cu enzimele din cile specifice acestora. Dintre acetia amintim: 1. 6-mercaptopurina i 6-tioguanina sunt utilizate n tratamentul leucemiei cronice. Activitatea citostatic este legat de formarea 6-mercaptopurin ribonucleotidelor de ctre celulele tumorale.

Utiliznd PRPP i HGPRT-aza, 6-mercaptopurin ribonucleozid 5-monofosfatul se acumuleaz n celul i servete ca efector negativ al PRPP amidotransferazei, blocnd etapa de reglare n sinteza de novo. Acest nucleotid acioneaz i ca inhibitor al conversiei IMP la GMP n calea IMP dehidrogenazei i a IMP la AMP n calea adenilosuccinat sintetazei. Deoarece GMP este substrat pentru xantinoxidaza se formeaz prin oxidare acid tiouric i alopurinolul poate fi admnistrat pentru a inhiba aceast degradare i a potena activitatea antitumoral. 2. 5-fluorouracilul (F-ura) este un analog pirimidinic care nu are aciune citotoxic

Metabolitul activ al F-ura este fluorodeoxiuridilatul (F-dUMP) i FUTP. F-dUMP este inhibitor al timidin sintetazei iar FUTP mpiedic transformarea pre ARN-mesager la ARNm funcional (deci maturarea ARNm). 3. Citozin-arabinozidul (Ara-C) este utilizat n tratamentul mai multor forme de cancer. Pentru a-i exercita efectele citotoxice trrebuie s fie transformat n citozin-arabinozid-5-trifosfat. Acest compus intr n competiie cu dCTP n reacia ADN polimerazei.

Clinic, eficacitatea ara-C ca medicament antileucemic se coreleaz cu concentraia ara-CTP n celulele tmorale care determin nivelul de ara-CMP incorporat n ADN. Formarea ara-CMP via deoxicitidin kinaza este etapa limitant n activarea araCTP. 4. Azatioprina este folosit pentru imunosupresie la pacienii cu transplant de organe. 5. Alopurinolul este folosit pentru tratamentul gutei i hiperuricemiei. 6. Aciclovirul este util n tratamentul infeciei cu virusul herpetic i tratamentul zonei Zoster. ANTIFOLAII sunt compui care interfer cu formarea FH4 din FH2 sau din acid folic prin inhibiia folat reductazei. Metotrexatul estre un exemplu de antifolat utilizat ca agent antitumoral i acioneaz prin inhibiia competitiv a folat reductazei.

ANTAGONITII GLUTAMINEI inhib utilizarea acesteia ca donor de azot. Glutamina are rol de a asigura atomii de azot din poziia 3 i 9 n sinteza de novo a purinelor dar i n conversia IMP la GMP, UTP la CTP i a nicotinat adenin dinucleotidului la NAD. Compuii care inhib aceste reacii sunt antagoniti ai glutaminei: 1. azaserina (O-diazoacetil-L-serina) izolat din culturi de Streptomices este un inhibitor al utilizarii glutaminei.

Un dezavantaj al acestui tip de compui este toxicitatea. ALI AGENI CARE INHIB CRETEREA CELULAR 1. Hidroxiureea inhib specific sinteza de ADN i n mai mic msur sinteza de ARN i de proteine. Mecanismul implic inhibiia ribonucleotid reductazei, deci blocarea reducerii celor 4 nucleozid-difosfai la derivai 2deoxi. Toxicitateaei rezult din depleia 2deoxi NTP necesari pentru replicarea ADN. Utilizarea ei n clinic este limitat de clearence-ul prea rapid i necesitatea unor concentraii mari terapeutice. 2. Tiazofurin este convertit la tiazofurin adenin dinucleotid (TAD) care inhib IMP-dehidrogenaza cu diminuarea concentraiei intracelulare de GMP.

ANALOGI PURINICI I PIRIMIDINICI CA AGENI ANTIVIRALI Mai cunoscui sunt compuii care acioneaz mpotriva infeciei cu HIV i cu virus herpes simplex. 1. Aciclovirul (acicloguanozina) 2. AZT (3-azido-2-deoxiimidina)

Aciclovirul este activat la monofosfat de ctre o kinaz specific doar virusului herpes i oprit de ctre enzimele celulare la forma di i trifosfat. Rezult un fals substrat pentru ADN-polimeraza fiind incorporat n ADN viral. AZT este fosforilat la AZT trifosfat de ctre o kinaz celular. Este inhibat astfel HIV-ADN polimeraza pentru care s-ar prea c exist o mai mare specificitate.

ACIZI NUCLEICI STRUCTURA SI FUNCTII Acizii nucleici reprezinta moleculele care pastreaza, transporta si manipuleaza informatia in orice celula vie. Codul de scriere a acestei informatii este universal valabil iar mecanismele biochimice implicate sunt pe de o parte complexe si pe de alta parte foarte precise.

Unitatile de baza din compozitia acizilor nucleici sunt reprezentate de nucleotide - structuri care contin pentoze ( riboza sau deoxiriboza ), acid fosforic si baze azotate cu nucleu purinic sau pirimidinic:

Acizii nucleici pot fi impartiti in 2 mari clase, intre care exista diferente structurale si functionale: acizii ribonucleici (ARN sau RNA) si acidul dezoxiribonucleic (ADN sau DNA). Ambele macromolecule prezinta din punct de vedere chimic o structura polinucleotidica, construita cu ajutorul legaturilor fosfodiesterice si avand in componenta pentoze facand din ADN si ARN molecule inrudite. Exista insa diferente nete la nivelul structurii: - pentoza din ARN este reprezentata de riboza iar in ADN de deoxiriboza, o riboza in care gruparea hidroxil de la carbonul 2 lipseste fiind, inlocuita cu hidrogen. - ARN are o structura predominant monocatenara iar ADN are o structura bicatenara. - Timina din ADN este inlocuita cu uracilul in molecula de ARN.

ADN-ul, structura polinucleotidica dublu catenara, formeaza genomul unui organism, cu alte cuvinte, totalitatea genelor care poarta informatia acelui sistem biologic. ADN-ul este prezent in nucleul celulelor (si in mitocondrii) sub forma de cromatina sau cromozomi pentru animalele eucariote.Pentru procariote exista un cromozom circular in citoplasma, compactat -prin formarea unor superhelixuri cu ajutorul unei enzime numita ADN giraza. Plasmidele sunt unitati mici de ADN specifice bacteriilor (exemplu: plasmidele care codifica rezistenta la antibiotice). La eucariote cromatina apare in nucleul celulelor in perioadele de repaus. In momentul inceperii mitozei cromatina se organizeaza in cromozomi, complexe ADNproteine cu numar diferit de la specie la specie (la om 44xy sau 44xx). Lungimea de aproximativ 2m a ADN-ului eucariotelor face necesara o supercompactare a acestei molecule care trebuie sa incapa intr-un nucleu cu dimensiuni de ordinul micronilor. Aceasta superhelicare se realizeaza cu ajutorul unor proteine speciale numite histone. Histonele contin cantitati mari de lisina si arginina, aminoacizi bazici care sunt incarcati pozitiv la pH fiziologic. Din acest motiv aceste protine pot sa adere usor la structura ADN care contine grupari fosfat cu sarcini negative. Exista 5 clase de histone (H1, H2a, H2b, H3, H4) care realizeaza un miez proteic pe care ADNul se infasoara de aproximativ doua ori. Histona H1 nu intra in structura miezului dar are un rol in stabilizarea structurii. Celelalte histone formeaza un octamer(2H2a-2H2b2H3-2H4) care impreuna cu 2 spire de ADN formeaza un nucleozom. Deci cu ajutorul histonelor ADN-ul eucariot este impachetat de mai multe ori formandu-se o structura super spiralata.

Exista si proteine nehistonice in nucleu, mai mult de 1000 de tipuri, cu functii diverse: diferiti factori de transcriptie, polimeraze, receptori hormonali, etc. Hertonele, de exemplu, au rol in modificarea structurii hipercompactate a ADN-ului in vederea citirii genelor existente la acest nivel. Nu toate nucleotidele din lantul ADN (numarul lor total fiind de aproximativ 3,5 miliarde de perechi) codifica informatia necesara sintezei de proteine. Exista 3 tipuri de portiuni in aceasta molecula: - Zone inalt repetitive construite din 6-10 perechi de baze ce se repeta de sute de mii de ori. - Zone moderat repetitive - Zone non-repetitive, portiuni corespunzatoare genelor, detinatoare de informatii ce sunt stocate prin insiruirea intr-o anumita ordine a celor 4 litere ale alfabetului genetic: A, T, C, G. La eucariote, o gena apare doar o singura data in tot genomul, exceptie facand doar cateva gene care se pot repeta, de exemplu genele care codifica histonele sau ARN-ul ribozomal. Tot in cazul eucariotelor, s-a observat in ADN prezenta unor portiuni nepurtatoare de informatie chiar in interiorul genelor. Acestea poarta numele de introni si, in procesul de biosinteza proteica vor fi copiate pe ARN mesager dar vor fi apoi excizate. Doar genele pentru histone si genele procariotelor nu prezinta introni. Lantul unei catene de ADN este format prin insiruirea celor 4 tipuri de nucleotide care se unesc intre ele cu ajutorul acidului fosforic. Astfel, se formeaza legaturi fosfodiesterice intre deoxiriboza unui nucleotid si o deoxiriboza a urmatorului, in pozitiile 5 si 3. Scheletul va fi deci construit dintr-o succesiune deoxiriboza-acid fosforic, de fiecare pentoza fiind legata cate o baza azotata. Legaturile 5-3 vor conferi un sens pentru fiecare dintre cele 2 catene care se infasoara una in jurul celeilalte deci se poate vorbi de o catena cu sens 5-3 si de o catena cu sens invers, 3-5 numita si catena antisens (catene antiparalele). S-a demonstrat ca ADN-ul adopta aceasta conformatie dublu helicoidala din ratiuni de stabilitate energetica. Structura este stabilizata astfel prin interactiunea dintre bazele azotate care se plaseaza in interiorul dublului helix. Aici apar legaturi de hidrogen intre bazele de pe o catena si bazele de pe cealalta catena conform unui principiu al complementaritatii. Acest principiu postuleaza ca intotdauna adenina se leaga de timina prin 2 legaturi de hidrogen si guanina se leaga de citozina prin 3 legaturi de hidrogen.

Cele 2 catene pot fi despartite in anumite conditii (de exemplu temperatura si pH) prin desfacerea legaturilor de hidrogen. Acest fenomen se numeste denaturare si este reversibil, prin revenirea la conditiile initiale, procesul numindu-se renaturare. S-a observat ca zonele cu o cantitate mai mare de guanina si citozina sunt mai greu de denaturat din cauza legaturii de hidrogen in plus dintre acestea. Hibridizarea reprezinta procesul de renaturare a doua catene provenind de la 2 acizi nucleici diferiti, tehnica prin care se poate aprecia de exemplu, gradul de potrivire a acizilor nucleici provenind de la specii diferite. Exista mai multe posibilitati de structurare a dublului helix (A,B,Z), cea mai raspandita fiind forma B. Aceasta forma se prezinta ca o elice formata din doua lanturi antiparalele, stabilizata prin legaturile de hidrogen din interior. Diametrul este de 20 A, pasul elicei (distanta pentru o rotatie completa de 360) este de 34 A si cuprinde o spira cu 10 perechi de nucleotide. Deci distanta dintre 2 nucleotide de pe acelasi lant este de 3,4 A. Exista doua zone numite jgeaburi (unul mare si unul mic), importante penru ca aici se poat face un contact mai intim intre diferite substante (medicamente, proteine) si molecula de ADN. Se poate vorbi deci de mai multe posibilitati de abordare structurala a ADNului: - Structura primara, care ne arata insiruirea bazelor azotate pe scheletul format din pentoze unite prin punti fosfodiesterice. (vezi figura 2) - Structura secundara, care ne arata forma de dubla elice stabilizata de puntile de hidrogen dintre bazele azotate complementare.

-

Structura tertiara, ce explica superhelicarea si compactarea moleculei cu ajutorul proteinelor, fenomen necesar potrivirii cu dimensiunile reduse ale nucleului.

ACIZI NUCLEICI PROCESE BIOCHIMICE GENETICE Dogma centrala a geneticii postuleaza urmatoarea transformare: ADN ARN proteine sau O GENA UN ARN MESAGER O PROTEINA. Descoperirile din ultimii ani nu au contrazis transformarile clasice care sunt fundamentul acestei stiinte ci au completat in mod fericit dogma centrala, facand-o mai complexa si mai apropiata de adevar.

Exista 3 procese esentiale in manipularea informatiei genetice pentru orice celula vie: 1. Replicarea ADN - reprezinta procesul prin care cantitatea de ADN dintr-o celula se dubleaza si se regaseste practic neschimbata in fiecare dintre celulele fiice. 2. Transcriptia - reprezinta procesul prin care o parte din informatia de pe ADN este copiata pe ARN (o genaun ARN mesger). 3. Translatia reprezinta procesul prin care informatia din ARN este folosita la sinteza unei proteine in ribozomi.

REPLICAREA ADN Toate celulele se divid in timpul vietii, unele dintre ele sufera mai multe diviziuni si altele se divid de un numar limitat de ori. In timpul diviziunii celulare informatia prezenta la nivelul ADN-ului se conserva de la o generatie la alta din punct de vedere cantitativ si calitativ. Acest proces care se numeste replicare este semiconservativ deoarece in celulele noi constituite se regaseste o structura a ADN-ului construita dintr-o catena mama si o catena noua, complementara. Replicarea semiconservativa a fost demonstrata clar la bacterii: administranduse ca unica sursa de azot, clorura de amoniu marcata cu azot radioactiv sa observat ca dupa prima diviziune bacteriana azotul radioactiv s-a regasit doar in procent de 50%. La urmatoarea diviziune acest procent scade inca odata la jumatate, s.a.m.d.. Replicarea ADN necesita un sistem biochimic si enzimatic complex format din: - ADN matrita (ADN-ul mama) - Deoxinucleotidele necesare sintezei (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - Ribonucleotidele necesare sintezei unui ARN care va folosi ca punct de plecare pentru sinteza ADN (ATP, GTP, CTP, UTP) - Ioni de magneziu - Un sistem multi enzimatic compus din: a. topoizomeraze enzime care detensioneaza elicea ADN-ului in timpul replicarii. b. ADN primaza enzima care produce mici fragmente de ARN, necesare inceperii procesului de replicare.

c. ADN polimeraza ADN dependenta si care are o serie de caracteristici: sintetizeaza ADN in directia 5`-3`, are si activitate exonucleazica pentru ca elimina unele nucleotide in timpul replicarii, are o inalta fidelitate pentru ca exercita un control strict al replicarii. La procariote existe 3 ADN polimeraze. d. ADN ligaza enzima care reuneste fragmentele de ADN rezultate in timpul replicarii. Intregul complex de factori care participa la acest proces se mai numeste replizom. Exista diferente in replicarea la procariote si eucariote. Replicarea la procariote ADN-ul procariotelor este compus dintr-un singur cromozom circular. Replicarea incepe in puncte bine determinate numite regiuni de origine (ori). La unele bacterii exista o singura regiune de origine (punct de plecare). De aici procesul se desfasoara pa ambele catene ale ADN-ului circular astfel incat la un moment dat un ADN bacterian poate lua forma literei grecesti theta. Initierea replicarii incepe prin desfacerea legaturilor de hidrogen dintre nucleotidele de pe cele doua catene ale ADN-ului mama, in punctul de origine (reamintim ca adenina se leaga de timina prin 2 legaturi de hidrogen si guanina de citozina prin 3 legaturi de hidrogen, conform principiului complementaritatii;A=T, G=C). Enzimele implicate in acest proces se numesc helicaze. Astfel pe catenele eliberate se poate construi o noua catena de ADN. Deci in fata enzimelor care realizeza replicarea se afla aceste helicaze care separa cele 2 catene. Prin separarea celor 2 catene dubla elice a ADN-ului devine din ce in ce mai tensionata. Aceasta situatie ar putea duce la oprirea replicarii daca nu ar exista topoizomerazele care detensioneaza ADN-ul. Topoizomeraza 2 numita si ADN giraza poate induce tensionari negative, inverse tensionarilor produse de helicaza permitand continuarea procesului. Astfel se poate explica actiune antimicrobiana a acidului nalidixic (negram) care inhiba ADN giraza si blocheaza deci diviziunea bacteriana. Topoizomeraza 1 detensioneaza ADN-ul suprahelicat pentru ca poate sa desfaca o legatura fosfodiesterica de pe o catena a ADN-ului permitand relaxarea elicei (catena rupta se roteste in jurul celelalte catene). Dupa detensionare catena desfacuta se poate reface deoarece fenomenul este reversibil, mai mult decat atat neavand nevoie de energie pentru ca aceasta energie este conservata cu ajutorul unui rest de tirozina din enzima. Odata desfacut si detensionat, pe ADN-ul mama se poate incepe construirea celor 2 catene a noului ADN. Pentru aceasta este nevoie de mici molecule de ARN numite primeri sau initiatori (au 5-10 nucleotide). Acestea sunt realizate cu ajutorul ADN primazei. De la capatul 3` al ARN-ului initiator pleaca sinteza ADN-ului propriu zis prin adaugarea succesiva a deoxinucleotidelor care se unesc prin legaturi fosfodiesterice. Molecula fiica nou constituita respecta cu strictete ADN-ul matrita astfel incat daca pe ADN-ul mama exista timina acolo va veni adenina, pentru citozina va veni guanina, s.a.m.d. , conform principiului complementaritatii. Enzima necesara este ADN polimeraza III.

Energia necesara procesului provine din legaturile fosfat tmacroergice ale nucleotidelor folosite. Pirofosfatul rezultat este desfacut in 2 molecule de fosfat impingind reactia ireversibil spre dreapta. Replicarea continua astfel pana la intalnirea unei noi unitati de origine. Finalul replicarii necesita eliminarea ARN-ului initiator si asigurarea continuitatii catenei nou formate. Enzima necesara este ADN polimeraza 1 care este deci si polimeraza si exonucleaza. Asta inseamna ca ribonucleotidele din ARN-ul initiator sunt inlocuite pe rand cu deoxinucleotidele necesare noului ADN. Exista proteine specifice legate pe catena ADN, cu rol in reglarea si optimizarea interactiunii dintre catena si enzime. Acest mecanism explica foarte bine sinteza lantului polinucleotidic cu directia 5`-3`. Insa este demonstrat ca ADN polimeraza nu poate functiona decat in aceasta directie, deci la prima vedere s-ar putea crede ca cealalta catena a ADN-ului mama care are directie inversa nu poate fi folosita in acelasi fel. S-a demonstrat ca si cealalta catena poate fi copiata cu ajutorul aceleiasi ADN polimeraze printr-un mecanism asemanator dar care pleaca in sens invers. Deci de data asta punctul de plecare a polimerazei este bifurcatia de replicare construindu-se astfel catena in directia 5`-3`. Procesul este discontinuu, pentru ca dupa ce punctul de bifurcatie avanseaza suficient de mult o noua sinteza pleaca din dreptul noului punct de bifurcatie. Astfel se vor forma mai multe fragmente mici de ADN numite fragmente Okazaki.Fragmentele Okazaki au o lungime de cateva sute de nucleotide la eucariote si cateva mii la procariote. Fragmentele vor fi reunite dupa excizia fiecarui fragment de ARN initiator care insoteste lanturile Okazaki. Cu excizia ARN-ului se ocupa tot ADN polimeraza 1 iar cu unirea lanturilor de ADN ramase se ocupa ADN ligaza (necesita cosum de ATP).

In final de pe fiecare catena a ADN-ului mama se construieste cate o catena noua rezultand 2 molecule polideoxinucleotidice bicatenare cu un lant vechi (matrita sau mama) si un lant nou sintetizat de complexul enzimatic numit replicare. Intregul mecanism este extrem de fidel astfel incat erori nu apar decat cu o frecventa de una la un milion zece miloane de nucleotide. ADN polimeraza are o extraordinara capacitate de autocontrol astfel incat daca o nucleotida nu este pusa conform principiului complementaritatii aceasta este imiediat eliminata si inlocuita cu nucleotidul corespunzator. Viteza replicarii este de sute de nucleotide pe secunda si se face aproape perfect.

Replicarea la eucariote Se face asemanator cu cea de la procariote. Exista totusi o serie de particularitati: - ADN polimerazele: aici sunt in numar de trei , si . polimeraza este implicata in replicarea ADN-ului nuclear, polimeraza este implicata in replicarea ADN-ului mitocondrial. Pe de alta parte nici una din enzime nu are activitate exonucleazica. - originea replicarii: la eucariote viteza este mai mica si s-ar parea ca nu exista explicatie cum aprope 2 metri de ADN care contine in jur de 3 miliarde jumatate de baze nucleotidice pot fi copiate doar in aproximativ 8 ore. Dar explicatia este foarte simpla pentru ca exista mai multe origini de replicare, aproximativ una la cateva zeci de mii de baze care functioneaza in acelasi timp. Aici, in momentul inceperii copierii fiecare origine are cate un replizom care se ocupa de ambele catene ale ADN-ului. Fidelitatea este si mai mare, riscul erorii fiind de una la cateva miliarde. - exista un mecanism propus pentru catena 5`-3` a ADN-ului mama in momentul copierii. Se pare ca la nivelul replizomului aceasta catena poate face o bucla care permite folosirea complexului de sinteza in acelasi sens ca in cazul catenei 3`-5`. - biosinteza ADN apare in faza S a diviziunii celulare, intreaga cantitate de ADN si histone (necesare impachetarii) fiind dublata complet. ADN ligazele si fragmentele Okazaki se regasesc si la mamifere deci si aici procesul este discontinuu. Diferite situatii (radiatii puternice, toxice, etc.) pot provoca mutatii in timpul replicarii. De exemplu, radiatiile ultraviolete pot genera formarea dimerilor intre 2 nucleotide pirimidinice (exemplu timina-timina). Acest defect poate fi inlaturat prin

actiunea unor enzime specializate care excizeaza si repara bazele anormale. Cel mai puternic generator de mutaii ramane stressul oxidativ (de diverse cauze) care poate sa produca diverse oxidari (de exemplu transformarea guaninei in oxiguanina), intreruperi ale catenei acizilor nucleici, modificari ale pentozelor, etc. Consecinta poate fi (in cazul in care repararea este depasita) oprirea ciclului celular la nivelul punctelor de control (checkpoint) si chiar moartea celulara programata (apoptoza). Molecula de ADN poate fi sintetizata folosindu-se ca matrita o molecula de ARN. Este o situatie mai rar intalnita, de exemplu in cazul anumitor virusuri ARN. Acestia prezinta o enzima speciala numita revers transcriptaza care este o ADN polimeraza ARN dependenta si are capacitatea de a copia informatia de pe ARN-ul virusului care a patruns in celula pe o molecula de ADN care dupa ce devine dublu catenar se insera in genomul gazdei. Celula astfel parazitata va fabrica inconstient proteine si ARN, acesta fiind modul de inmultire a unui virus. Cel mai bun exemplu este virusul HIV care infecteaza in special limfocitele T helper si care poate fi partial inhibat cu medicamente care blocheaza revers transcriptaza. Revers transcriptaza modifica intr-o mica masura teoria clasica mendeliana a geticii care postuleaza procesul ADNARN proteine. Intre ADN si ARN informatia poate fi copiata in ambele sensuri. Pe de alta parte revers transcriptaza este utila obtinerii genelor sintetice plecandu-se de la diferiti ARN mesageri, usor de izolat. Exista o multitudine de baze azotate modificate artificial care pot sa inhibe replicarea normala a AND-ului. Unele dintre acestea pot fi folosite ca medicamente antivirale sau citostatice (ex. : 5-fluorouracil, 5-bromouracil etc.) TRANSCRIPTIA ARN Reprezinta un proces absolut necesar de transfer a informatiei genetice de pe ADN (o portiune a ADN-ului numita gena) pe ARN-ul mesager. Acesta este modalitatea de transport a informatiei care se gaseste in nucleu la ribozomii din citoplasma in vederea sintezei proteinelor. Exista 3 tipuri importante de ARN: 1. ARN mesager (ARNm). 2. ARN de transfer (ARNt). 3. ARN ribozomal (ARNr). Deci transcriptia reprezinta sinteza ARN-ului mesager. Structura acestuia este dictata de matrita ADN-ului copiat (gena). Aceasta matrita sau portiune de ADN numita gena se poate afla pe oricare dintre cele 2 catene ale ADN-ului si este transcrisa in functie de necesitatile proteice ale fiecarei proteine. La procariote exista o singura ARN-polimeraza care catalizeaza formarea tuturor tipurilor de ARN (ribozomal de transfer si mesager). La eucariote procesul este mai specializat in sensul ca exista 3 tipuri de ARNpolimeraza: - ARN-polimeraza I pentru sinteza ARN ribozomal - ARN-polimeraza II pentru sinteza ARN mesager - ARN-polimeraza III pentru sinteza ARN de transfer a. Transcrierea informatiei pe ARN necesita la inceput un semnal de initiere. Deci ARN-polimeraza se fixeaza pe o portiune a ADN-ului numita promotor. Acest locus promotor este constituit din aproximativ 40 de perchi de nucleotide specifice inceputului fiecarei gene. Mai exista o secventa de 6 nucleotide situata inaintea celei

dintai care mareste exactitatea initierii transcrierii, si un factor sigma care creste afinitatea enzimei pentru promotor.

b. Odata fixata, ARN-polimeraza va incepe elongarea moleculei de ARN folosind ribonucleotide care se ordoneaza conform matritei ADN-ului ce se copie. Deci gena impune cu ajutorul enzimei aranjarea nucleotidelor intr-o ordine stricta care respecta principiul complementaritatii (A=U, C=G). Acum factorul sigma se disociaza de ADN permitand ARN-polimerazaei sa gliseze dea lungul moleculei si sa adauge rand pe rand ribonucleotidele necesare elongarii moleculei de ARN. Prin atacuri nucleofile ribonucleotidele se leaga una de alta fiecare la capatul 3`-OH a celei din urma.

c. Terminarea transcrierii se face cand ARN-polimeraza ajunge la capatul genei unde intalneste un numar mare de nucleotide C si G. Aici, cu ajutorul factorului aceste semnale sunt recunoscute, enzima paraseste gena matrita si poate sa isi reia functionarea in alta parte prin reasocierea cu factorul sigma.

Exista situsuri reglatoare ale transcriptiei situate in fata situsurilor promotoare care supravegheaza frecventa transcrierii. Pe de alta parte promotorii pot imprima viteze diferite procesului ceea ce face ca anumite gene sa fie mai active decat altele.

Exista diferite substante care pot bloca transcrierea. Exemple: actinomicina modifica structura ADN-ului matrita si acesta nu mai poate fi copiat; rifampicina, chimioterapic folosit in tratarea TBC-ului si activ pe un spectru larg microbian inhiba ARN-polimeraza bacteriana. ARN-ul mesager astfel obtinut difera la procariote fata de eucariote. Astfel in ARN-ul procariot molecula este continua deci intreaga informatie de aici poate fi folosita pentru sinteza proteinelor. In ARN-ul eucariot s-a observat prezenta unor

portiuni repetitive de nucleotide numite introni care nu detin nici o informatie pentru sinteza proteica. Acesta este motivul pentru care ARN-ul mesager primar este mult mai lung decat ARN-ul mesager folosit de ribozom. Deci intronii trebuie excizati si pastrate doar portiunile cu informatie utila numite exoni.

Excizarea intronilor se poate face in 2 feluri: - Cu ajutorul unor enzime speciale care recunosc capetele fiecarui intron (exemplu: ARN U1) acestia sunt eliminati si capetele libere ale exonilor sunt sudate. - Prin autocataliza, fenomen remarcabil care pune pentru prima data in discutie posibilitatea catalitica a unui compus neproteic. Deci chiar ARN-ul ribozomal isi autoelimina intronii printr-un proces care genereaza o bucla (reprezentata de intron), eliminarea acestei bucle cu ajutorul guanozinei si coaserea exonilor. O astfel de posibilitate surprinzatoare a facut ca primul ARN mesager descoperit cu aceasta insusire sa fie denumit ribozim. S-a reconsiderat viziunea asupra acizilor nucleici care erau vazuti doar ca molecule informationale si care acum sunt priviti si ca enzime. Rolul intronilor, departe de a fi pe dea intregul cunoscut, se conturreaza in directia reglarii procesului de diferentiere celulara. Mai mult chiar, s-ar parea ca detin controlul transportului ARN-ului mesager din nucleu in citoplasma. Este posibila biosinteza ARN pe matrita de ARN, de exemplu in cazul unor virusuri. Acestea isi injecteaza materialul genetic in celula gazda si cu ajutorul unei ARN-polimeraze ARN dependenta numita si replicaza reuseste sa isi multiplice molecula informatinala. Procesul este analog unei replicari obisnuite.

Un exemplu clasic de inhibitie a transcriptiei este mecanismul de blocare a ARN polimerazei II de catre amanitina. Aceasta molecula toxica este un octapeptid ciclic produs de Amanita phalloides (buretele viperei) cea mai toxica ciuperca din aceasta zona geografica. Astfel, o singura ciuperca matura poate sa omoare doi oameni. TRNSLATIA(BIOSINTEZA PROTEINELOR) Este un fenomen foarte complex care necsita conlucrarea a peste 300 de enzime si diverse tipuri de acizi ribonucleici. Informatia necesara ordonarii aminoacizilor in proteine (deci constituirea structurii primare) este transportata de pe gena de la nivelul ADN-ului nuclear in citoplasma cu ajutorul ARN-ului mesager. Deci fiecare acid ribonucleic are fuctii specifice: a. ARN-ul ribozomal intra in structura ribozomului care reprezinta fabrica de proteine. b. ARN-ul de transfer este molecula care transporta fiecare din cei 20 de aminoacizi la locul de sinteza. c. ARN-ul mesager detine informatia constructiei corecte a proteinei. a. ARN-ul ribozomal prin asociere cu proteine si lipide constituie ribozomul sau corpusculul lui Palade. Ribozomul este construit din 2 subunitati, una mica (30S la procariote si 40S la eucariote) si una mare (50S la procariote si 60S la eucariote). Astfel ribozomul va avea constanta de sedimentare 70S la bacterii si 80S la organismele superioare. Precum am vazut, ribozomul prezinta 2 situsuri speciale: situsul A care este sediul ARN-ului de transfer ce vine cu aminoacizii necesari sintezei proteice si situsul P ce gazduieste ARN-ul de transfer legat de un lant polipeptidic deja sintetizat. Procesul de sinteza proteica poate fi schitat sumar prin interactiunea celor 3 tipuri de ARN. Cu alte cuvinte informatia din ARN-ul mesager este citita in ribozom si transpusa in proteine, aminoacizii necesari fiind adusi de ARN-ul de transfer. Mai multi ribozomi pot citi simultan acelasi ARN mesager pe care il parcurg in acelasi sens. Se constituie astfel un poliribozom, structura ce permite accelerarea sintezei proteice.

b. ARN-urile de transfer sunt molecule mici cu o forma care poate fi asemanata cu un trifoi cu patru foi sau cu o cruce. La un capat al unuia din brate (capatul 3`

terminal) toti ARNt au secventa CCA. Aici se fixeaza unul din cei 20 de aminoacizi. Deci exista cel putin 20 de tipuri de ARNt. In realitate exista mai multe tipuri pentru ca un aminoacid poate fi transportat de diferiti ARNt. O regula este insa sigura: fiecare ARNt ce transporta un aminoacid are la bratul diametral opus o secventa de 3 nucleotide numita anticodon care este strict specifica aminoacidului transportat. Anticodonul trebuie sa se potriveasca perfect prin complementaritate cu codonul corespunzator de pe ARN-ul mesager. S-a demonstrat ca informatia genetica este foarte bine organizata. Astfel la nivelul ADN-ului, exceptand portiunile care nu codifica nici o informatie si sunt doar zone polinucleotidice repetitive sau moderat repetitive, informatia pentru fiecare proteina este organizata in gene. O gena reprezinta deci un grup mai mare sau mai mic de nucleotide purtatoare de informatie. Un codon reprezinta 3 nucleotide. Fiecare codon codifica un aminoacid. Fiecare gena codifica o proteina. Deci ARN-ul mesager copie toti codonii unei gene transportand in acest fel informatia pentru fiecare aminoacid. La nivelul ribozomului fiecare codon se potriveste cu anticodonul complementar de pe ARNt si aceasta este modalitatea prin care aminoaciziii sunt adusi in ordine, uniti prin legaturi peptidice si transformati in proteine. Se poate face o comparatie intre modul de stocare a informatiei in meomoria calculatoarelor si acizii nucleici. Pentru calculatoare limbajul primar este in baza 2 (binar), pentru acizii nucleici limbajul este in baza 4 (patru nucleotide) si este transferat proteinelor ca limbaj in baza 20 (20 de aminoacizi). Codul genetic reprezinta alfabetul necesar sintezei de proteine si ne arata care codoni (3 nucleotide) corespund fiecaruia dintre cei 20 de aminoacizi. Biosinteza proteinelor (translatia) se realizeaza in 5 etape: 1. Activarea aminoacizilor. 2. Initierea lantului polipeptidic. 3. Elongarea lantului polipeptidic. 4. Terminarea lantului polipeptidic si eliberarea acestuia. 5. Prelucrari post traducere ale proteinei sintetizate. 1. Activarea aminoacizilor este necesara inceperii biosintezei si poate fi explicata in 2 etape: - In prima etapa aminoacidul reactioneaza cu ATP rezultand un complex aminoacilAMP. Pirofosfatul eliberat este hidrolizat si in acest fel reactia este impinsa spre dreapta, fiind ireversibila. - In a doua etapa complexul cedeaza aminoacidul unei molecule de ARNt, specifica acelui aminoacid (deoarece anticodonul ARN-ului corespunde codonului de pe ARN-ul mesager care codifica aminoacidul respectiv). Precum se observa, activarea se face cu consum de energie, enzimele implicate sunt ligazele (aminoacil-ARNt sintetaze) care au o specificitate absoluta. Aminoacidul este legat deci de carausul sau specific la capatul CCA al acestuia, la gruparea OH din pozitia 2 sau 3 de pe riboza restului adenilic. Enzima poate recunoaste daca un aminoacid gresit s-a fixat pe ARNt, situatie in care il elimina si il inlocuieste cu aminoacidul corespunzator deoarece prezinta si un locus hidrolitic. 2. Initierea lantului polipeptidic incepe prin legarea ARN-ului mesager de subunitatea mica a ribozomului. Reasocierea prematura a celor 2 subunitati ribozomale este prevenita de factorul de initiere 3 (IF3). Legarea se face la codonul aminoacidului amino-terminal, aminoacid de initiere care este formil-metionina sau metionina, deci codonul AUG sau GUG este codonul de initiere. Se consuma energie generata de GTP.

Unele molecule de ARN mesager pot codifica mai multe proteine pe acelasi lant, deci asta inseamna ca vor fi prezenti mai multi codoni de initiere pe lantul acestui tip de ARN. Exista o secventa polinucleotidica bogata in purine situata in fata codonului de initiere care mareste afinitatea subunitatii mici ribozomale pentru acesta. Urmeaza legarea primului aminoacid care reste bineinteles formil-metionina. Acesta este adus de ARN-ul de transfer specific si pozitionat in situsul p ribozomal in dreptul codonului corespunzator prin potrivirea codon-anticodon(deci anticodonul ARN-ului de transfer se potriveste numai cu codonul initiator al ARN-ului mesager). Etapa necesita factorii de initiere 1 si 2(IF1, IF2). Ultima etapa a procesului de initiere implica legarea subunitatii ribozomale mari care reintregeste ribozomul. S-a format acum un complex intre ribozom, ARN mesager si primul ARN de transfer. Constructia proteinei va necesita mai departe miscarea lantului ARNm in ribozom care este citit, si informatia va servi sintezei proteinei. 3. Elongarea lantului polipeptidic se face prin adaugarea succesiva a aminoacizilor necesari sintezei. Fiecare dintre acestia este adus de ARN-ul sau de transfer specific si pozitionat corect prin potrivirea codon-anticodon intre ARN-ul mesager si ARNul de transfer. Este nevoie de factorul de elongare si energie sub forma de GTP. Intregul mecanism consta de fapt in miscarea ARN-ului mesager in ribozom care isi expune codonii rand pe rand pentru a fi cititi. Citirea reprezinta contactul intre acesti codoni si anticodonii ARN-urilor de transfer, care vin rand pe rand cu aminoacizii ce vor constitui proteina. Intregul proces se desfasoara deci in ribozom, la nivelul situsurilor p si a. ARNt vine cu aminoacidul 2 in situsul a, aminoacidul initiator se leaga de al doilea formandu-se un dipeptid pozitionat deci in situsul a, ARNt ramas liber pleaca din situsul p si ARNt-dipeptidul se muta in situsul p prin miscarea ARN-ului mesager in ribozom. Procesul continua in aceeasi maniera pana la elongarea completa a proteinei. Deci, spre exemplu, aminoacidul 3 vine in situsul a, se formeaza legatura peptidica intre aminoacizii 2 si 3, ARN-ul mesager se muta in ribozom astfel incat complexul ARNttripeptid se va muta la randul lui din situsul a in situsul p, s.a.m.d. Miscarea ARN-ului mesager in ribozom consuma GTP si este posibila datorita unei translocaze. Aminoacidul initiator (formil-metionina) va fi inlaturat din lantul polipeptidic deorece nu are decat un rol de start al sintezei proteice. Pentru realizarea legaturii peptidice intre aminoacizi este nevoie de o enzima numita peptidiltransferaza, un factor de elongare G si consum de energie. Toxina difterica, molecula foarte toxica fabricate de Corynebacterium diphtheriae microorganismul care provoaca difteria blocheaza sinteza proteica prin inhibarea unui singur factor de elongare. Astfel, o singura molecula poate distruge o celula. 4. Terminarea sintezei se face cand pe ARN-ul mesager ce trece prin ribozom apare un codon care nu codifica nici un aminoacid. Acesta se mai numeste codon stop sau nonsens si nu exista un ARN de transfer cu anticodonul corespunzator. In acest moment polipeptidul sintetizat se desface de ARNt, acest ultim ARNt este eliberat din ribozom si ribozomul se desface din nou in cele doua subunitati fiind pregatit pentru o noua sinteza. ARNm dupa copiere este eliminat prin hidroliza. Sinteza de proteine necesita deci un complex de factori, o mare cantitate de energie si se desfasoara foarte rapid (100 de aminoacizi pot fi legati in 5 secunde). La eucariote aminoacidul initiator este metionina, si viteza de sinteza este mult mai mare decat la procariote.

4. Prelucrarile postraducere ale proteinelor sunt necesare definitivarii sintezei si transformarii acestor molecule in compusi functionali. In aceasta ultima etapa se va elimina formil-metionina initiatoare, se hidroxileaza unii aminoacizi (prolina, lizina), unlele proteine se pot iodura (tireoglobulina), altele se pot combina cu molecule neproteice (fosfoproteine, glicoproteine), altele se pot desface in fragmente mai mici (preproinsulina).

Biosinteza proteinelor dispune de mecanisme exacte de reglare. Cel mai acceptat este cel descris de Jacob si Monod care au dezvoltat teoria operonului. S-ar parea ca exista inductori si represori ai biosintezei care mentin o balanta a procesului.

Inhibitori ai sintezei proteice Sunt in general antibiotice, compusi care pot astfel sa blocheze activitatea celulara la procariote. Inhibitorul Mitomicina Acid nalidixic Rifampicina Actinomicina Streptomicina Cloramfenicol Tetraciclina Eritromicina,Azitromicina Puromicina Kanamicina Procesul inhibat Replicare Replicare Transcriere Transcriere Translatie Translatie Translatie Translatie Translatie Translatie Mecanismul de actiune Impiedica separarea catenelor de ADN Inhiba ADN giraza Inhiba ARN polimeraza Se fixeaza pe ADN Inhiba legarea ARNt initiator la subunitatea 30S Inhiba peptidil transferaza Inhiba legarea ARNt la ribozomi Blocheaza subunitatea 50S Blocheaza elongarea inhiband competitiv ARNt Inhiba citirea codului genetic

Sinteza proteica vedere de ansamblu: (dupa Grays anatomy)

Exist numeroi compui de origine bacterian care interfera sinteza proteica in celulele eucariote. Acestea sunt toxinele proteice produse de bacterii (exotoxine termolabile), heteropolimeri compusi in general din 2 fragmente: un fragment A cu rol

determinant in actiunea toxica a toxinelor si fragmente B cu rol de liganzi la diferite tipuri de receptori specifici ai celulelor eucariote. Fragmentul A poate sa catalizeze transferul ADP-ribozei din molecula de NAD pe diverse molecule tinta implicate in sinteza proteica. Astfel functia acestora va fi modificata si apare efectul toxic ca in urmatoarele exemple: Toxina (bacteria) Difterica (C. Diphtheriae) Toxina A (Bacilul pioceanic) Toxina Shiga (S. dysenteriae) Mecanisme de actiune (acceptori de ADP-riboza) Factorul de elongare 2 (EF2) EF-2 Fractiunea ribozomala 60S si factorul EF-1 Efecte biologice sau clinice Stopeaza sinteza proteica: efecte necrotice, miocardosi neurotoxice Stopeaza sinteza proteica: efecte necrotice Stopeaza sinteza proteica: efecte enteroneurotoxice