229166906-Elisa-Pcr-Cromat-Electroforeza.ppt

Tehnica ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Biochimie Medicina dentara

•Ce este ELISA?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu

ELISA


ELISA


Ce este? • Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

• Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru screeningul HIV

• O tehnica biochimica folosita in special in imunologie

• Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea unui patogen dintr-o proba

• Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml) - cantitativa - reproductibila - format de kit

ELISA


Tipuri • ELISA Calitativa- rezultatele sunt pozitive sau negative

• ELISA Cantitativa- densitatea optica a probei este comparata cu un standard

• ELISA - indirecta - competitiva - sandwich (directa)

ELISA


Aplicatii • Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

• Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni (sarcina)

• Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare lapte, alune, oua

• Toxicologie: detectarea drogurilor

• Cercetare

ELISA


Principiu •Ce este un antigen? •Ce este un anticorp?

Anticorp

Antigen

Epitop

•Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza 3 componente

Anticorp - permite detectia analitului de interes Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalul

ELISA


Primul anticorp

Antigenul

Al doilea anticorp conjugat cu enzima

ELISA-sandwich direct

Principiu

2

1

3

ELISA


Principiu

substrat

produs

standard

proba

Tehnica PCRPolymerase Chain Reaction


PCR

•Ce este PCR?

•Tipuri

•Aplicatii

•Principiu


PCR

Ce este?


• Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a polimerazei)

• Mullis & Faloona – Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, 1987

• Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993

• Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-polimeraza) a numărului de copii ale unei regiuni specifice dintr-un lanţ ADN

Kary Mullis

PCR

Tipuri


• Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR in situ PCR, colony PCR, single cell PCR

• Cele mai folosite:

- standard PCR- RT-PCR ( real-time)

PCR

Aplicatii


•Testarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)

•Testare prenatala (si screening preimplantare)

•Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)

•Teste de histocompatibilitate

•Medicina legala

•Teste de paternitate

•Identificarea de persoane

•Cladisticaclade

PCR

Principiu


Materiale

•ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina

•Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5’ sau 3’ ale fragmentului de amplificat

•ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea primerilor)

•dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

•Solutie tampon

Colectare probe ADN

PCR

Principiu


Etapele PCR

• Denaturarea ADN-ului dublu catenar

• Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu catenar

• Extensia primerilor

PCR

Principiu


Denaturarea ADN

• 94-98 ºC, 20-30 de secunde• ADN-ul este desfasurat in doua lanturi ADN simplu-catenare complementare

Cuplarea primerilor

• 50-65 ºC, 20-40 de secunde• Lant dublu-catenar hibrid – primeri si ADN de amplificat

Extensia primerilor• ADN-polimeraza: Se leaga de lantul hibrid „Citeste” secvenţa lantului ADN-tinta; Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritatii

PCR

Principiu


Amplificarea

MW: dimensiuni cunoscute1: ~1850 bp2: ~800 bp3: nu s-a amplificat4: ~800 bp5: benzi multiple

Vizualizare produsi de amplificare

2. PRINCIPIUL SEPARĂRII CROMATOGRAFICE

Principiul de bază al separării cromatografice constă în distribuţia inegală a componentelor unui amestec între faza mobilă şi faza staţionară. Acest amestec străbate sistemul cromatografic, fiind antrenat de către faza mobilă. Distribuţia inegală este determinată fie de afinitatea diferită a componentelor amestecului faţă de cele două faze, fie de capacitatea diferită de a difuza în acestea. Acest principiu este ilustrat în Figura 1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizează prin faptul că faza staţionară se găseşte depusă în strat foarte subţire pe pereţii coloanei.

Fig.1.- Principiul separării cromatografice

Moleculele celor doi compuşi, 1 şi 2 care se găsesc în momentul iniţial ametecate, într-un volum restrâns, vor avea tendinţa de a se transfera continuu din faza mobilă în faza staţionară şi invers, din cauza agitaţiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare faţă de faza staţionară, ele vor fi mai puternic reţinute în această fază. Drept urmare, după un anumit interval de timp se va înregistra o rămânere în urmă a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab reţinută 1. Trebuie remarcat faptul că această separare are loc în timpul deplasării în coloană, deci este in proces dinamic.

4. SCHEMA DE PRINCIPIU A CROMATOGRAFULUI

1 - rezervor fază mobilă2 - dispozitiv de reglare şi măsurare a debitului3 -dispozitiv de introducere a probei4-coloană cromatografică5 - detector6-înregistrator sau integrator

Fig. 2.- Schema de principiu a cromatografului

SDS

SDS

SDS

Proteina Proteina + SDS SDS-PAGE

1 2 1 2

1Proteina de determinat

2SDS confera o sarcina negativa uniforma proteinei

3Proteina se incarca pe gel.1: proteine marker 2: proteina de determinat

Curent electric

4Proteinele migreaza in campul electric in functie de dimensiune

ELECTROFOREZA PROTEINELOR IN GEL

Extract proteine Focalizare izoelectrica

Pun

ct is

oele

ctric

(pI)

(-)

(+)

Gre

utat

e m

olec

ular

a Curent electric

(+)

(-)

Electroforeza SDS-PAGE

ELECTROFOREZA BI-DIMENSIONALA

g=600 10’

g=15000 15’

g=100000 60’

g=300000120’

NucleuCitoschelet

MitocondrieLizozomADN

Membrana plasmaticaReticul endoplasmicProteine

RibozomMacromolecule

Extract celular

CENTRIFUGAREA

Centrifugarea schema: componentele subcelulare pot fi separate folosind forte centrifuge diferite ( vezi g) pentru anumite perioade de timp ( exprimate in minute)

Centrifuga cu spirală (an 1905)Folosita pentru urina, apa şi lapte (2-3000 rotaţii pe minut) si pentru sânge şi sputa (10-12000 rotaţii pe minut)

Centrifuga digitala cu sistem de refrigerare ( an 2010)Pentru extragerea si purificarea acizilor nucleici, procesarea probelor de sange sau probelor PCR

229166906-Elisa-Pcr-Cromat-Electroforeza.ppt

Documents

Transcript of 229166906-Elisa-Pcr-Cromat-Electroforeza.ppt