Procesul de normalizare in RT-PCR

1. Introducere

Specificitatea, intervalul dinamic larg și ușurința de utilizare a reacției de polimerizare in lant cantitativa in timp real (qRT-PCR) a făcut-o metoda preferata pentru cuantificarea nivelurilor de ARN. Cu toate acestea, ca în cazul oricarei masuratori stiintifice, qRT-PCR suferă de aparitia erorilor (Huggett colab., 2005). Prin urmare, normalizarea de date este o componenta indispensabilaa procesului de analiză qRT-PCR, și este esențială pentru compararea exacta a măsurătorilor qRT-PCR între diferite probe. Normalizarea verifica variațiile din masa totală a ARN-ului analizat si, corectează pentru orice variabilități biologice și tehnice. Ambele pun probleme serioase pentru analiza expresiei genelor și pot masca sau supraestima nivelurile sau modelele de expresie adevărate. In timp ce obligația de a include unele metode de normalizare pentru a controla erorile este evidentă, în practică rămâne una dintre cele mai discutate, dar nerezolvate problemele de analiză qRT-PCR (Huggett colab., 2005).

2. Eroarea generala si schimbarea directionala

Există două tipuri de eroare care trebuie controlate într-un test qRT-PCR.

Unul este eroare generală (zgomot) și schimbarea de direcție: Schimbare de direcție se produce atunci când normalizarea deficitara fie creează un artefact sau ascunde o diferenta reala intre grupurile de experiment. RT- PCR masoara de două ori cantitatile de acid nucleic (Bubner et al., 2004) și este cu siguranță capabilă de un coeficient de variatie (CV) <1%. Cu toate acestea, realizarea în mod constant de CV-uri mici în testele qRT-PCR nu este la fel de simplu, chiar si cele mai bune CV-uri sunt în mod semnificativ mai mari de 1% (Melo et al., 2004). Principalul motiv pentru aceasta este faptul că nu este posibil să se determine în mod direct ARN-ul țintă. În schimb, cuantificarea ARN-ului impune includerea mai multor etape care în cele din urmă măsoară numarul de copii al ADNc-ului, dar care de asemenea servesc ca surse de variație sistematică, crescând CV-ul și limitand rezoluția testului. Variabilitatea este introdusa în timpul prelevarii eșantionului, extracția ARN, sinteza ADNc și compararea cu controalele dependente PCR, și este esentiala normalizarea adecvata a fiecarui pas.

3. Metode de normalizare

3.1 Marimea esantioanelor Cea mai simpla metoda de normalizare asigură ca un experimentcompară dimensiunile eșantioanelor similare și acest lucru se realizează prin măsurarea greutatii tesutului, volumului sau numărului de celule. În cazul în care nu se folosesc esantioane de marimi similare, erori inutile pot aparea în prima etapă a testului. Mai mult decât atât, diferite protocoale de extracție pot creste variabilitatea, mai ales ca extracția ARN din diferite cantități de țesut are de obicei eficienta variabila. Aceasta este o problemă deosebită atunci când metoda de extracție duce la saturatie și la extragerea ineficienta de ARN din eșantioanele mari. Din păcate, calibrarea probelor nu este la fel de simpla pe cat s-ar putea

presupune. Exemplele de mai jos demonstrează că utilizarea unor esantioane de marimi similare poate însemna totuși extragerea ARN-ului de la probe diferite.

Figura 1. Biopsie Cancer colorectal. Doar peste o treime din secțiune este alcătuită din tumora, restul din cellule normale adiacente ale colonului. Cel puțin trei tipuri de celule (epiteliale, stromale și celulele T) se disting clar.

1. Prelevarea de sange de la pacienții infectați cu HIV (Huggett et al., 2005) permite o stratificare în grupuri bazata pe numarul lor de celule T CD4 +. Pacienții cu> 200 celule / ml pot fi sanatosi în timp ce cei cu număr de <200 / ml sunt considerati ca ar fi

dobândit Sindromul imuno deficientiei (SIDA). În mod evident, in timp ce bolnavii de SIDA au mai putine celule CD4 +per volum de sânge, normalizarea numarului de copii de ARNm raportat la volumul de sânge ar duce la o cunatificare inexacta.2. Biopsiile in vivo conțin numeroase tipuri de celule din diferite linii și pot conține diferite tipuri de țesut, de exemplu adiacent normal si cancer. Acest lucru are ca rezultat o utilizare mai răspândită a microdisectiei cu laser și face posibila normalizarea zonei disecate, permițând stabilirea numarului de copii pe arie excizata. Desigur, trebuie să presupunem că eficiența de extracție și integritatea ARN-ului extras din diferite zone sunt similare, darn u se intampla intotdeauna asa. Se poate face aceasta atunci când se compară modele de expresii din aceeași lamă, atunci cand tesuturile fost supuse unui tratament identic. Este, de asemenea, acceptabil pentru a se utiliza această metodă de normalizare atunci când se compară diferite sectiuni din același țesut-bloc. Rămâne de văzut dacă este acceptabil de a folosi această metodă de comparație între probele obținute din diferite blocuri de țesuturi.

3. O altă problemă atunci când se utilizează esantioane de marimi similare poate apărea atunci când se compara probe care diferă din punct de vedere histologic. În situațiile în care a aparut fibroza sau cand un țesut tânăr este comparat cu țesut mai în vârstăeficiența prin care acidul nucleic este extras din proba poatefi foarte diferita. Dacă diferite cantitati de acizi nucleici sunt extrase din aceeași cantitate de probe histologic diferite atunci acest lucru va conduce la o schimbare de direcție și orice măsurătoare va fi influențată de scaderea eficientei de extracție dintr-un grup. Alta problemă se referă la probele care conțin tipuri de celule care diferă semnificativ prin dimensiunile lor; din nou, acest lucru poate interfera cu cuantificarea lor exactă.

4. Multe dintre problemele asociate cu probele in vivo pot fidepășite în sisteme in vitro. Cu toate acestea, cultura poate

furniza propriile probleme în cazul eșantionării. Celulele care nu formeaza aggregate reprezinta materialul de pornire ideal, desi acest scenariu este mai degrabă o excepție decât o regulă. Mai mult, celulele pot deveni fenotipic diferite ca urmare a variabilei ce se testeaza in cadrul experimentului. Celulele pot fi tratate cu solutii tampon și / sau enzime care sa le produca detasarea sau segregarea pentru a facilita numararea, însă aceste tratamente vor afecta expresia genelor.

Deși este esențial să se compare probe de dimensiuni și compoziție similară, realizarea acetui fapt este de multe ori mult mai complicata decât ar părea la prima vedere. Prin urmare, subliniem importanța selectionarii cu atentie a eșantionului și subliniem faptul că metode suplimentare de normalizare trebuie să fie utilizate.

3.2 Valoarea totală ARNOdată ce ARN-ul a fost extras, următoarea etapă de normalizare poate fi efectuată asigurandu-se că aceeași cantitate este folosită pentru fiecare reactie de transcriptie inversa. Nu numai ca acest lucru facilitează normalizarea dar evita problemele asociate cu liniaritatea reverstranscriptazei. Cu toate acestea, normalizarea totala a ARN-ului necesită măsurarea exacta a cantității ARN-ului și, din nou acest lucru nu este simplu. Sunt disponibile mai multe metode diferite; cele mai frecvente, sunt metodele optice care utilizează spectrometrie sau fluorometrie cu vopsele fluorescente (Ribogreen) și care oferă diferite grade de precizie. Ce este, de asemenea importantă, dar adesea trecuta cu vederea, este necesitatea de a evalua calitatea ARN-ului deoarece ARN-ul degradat ar putea afecta negativ rezultatele (Bustin și Nolan, 2004). Cel mai frecvent, este folosita electroforeză în gel sau analiză folosind Agilent Bioanalyser / Biorad Experion pentru a determina integritatea benzii de ARN ribozomal (ARNr).

Există mai multe dezavantaje la normalizarea totala a ARN: nu este ușor să se ia în considerare diferențele de integritate a ARNm, aceasta nu ține cont de diferențele cauzate de prezența inhibitorilor și ignoră eficiența conversiei ARN în ADNc. Chiar dacă integritatea ARN-ul este evaluată, orice referire la calitate se referă la ARNr, nu ARNm. ARN-ul total cuprinde ~ 80% ARNr (cu proteina de codificare a ARNm in cantitate de ~ 2-5%, în funcțietipul de celula); prin urmare, degradarea ARNr nu reflecta direct degradarea ARNm. În plus, cantitățile relative de ARNr și ARNm adesea diferă între eșantioane, în special atunci când ARNm provine din tesuturi prolifice, de exemplu, cancere. Desigur, este posibil să se extragă ARNm, dar acest lucru presupune pasi suplimentari crescand astfel potentialul de eroare experimentala, lucru care poate reduce în mod semnificativ randamentul și poate duce la probleme de stabilitate pe termen lung. Mai mult decât atât, extracția ARNm este in prezent limitată la extragerea ARNm poli-adenilat si astfel nu va purifica ARNm nonadenilat.

3.3 Cuantificarea ADNc

După transcrierea inversă o metodă pentru măsurarea cantității de ADNc care a fost transcris invers ar fi de dorit; singura metodă sigura de a face acest lucru este de a cuantifica sinteza de ADNc radio-marcat. Acesta strategie a fost mai frecvent utilizata acum 10 ani, dar cerința pentru utilizarea radio-izotopilor corelata cu creșterea extensivă a utilizării qRTPCR a dus la utilizarea rara a acestei metode in ziua de azi. S-au propus metode alternative, folosind spectrofotometrie saucoloranti AND specifici, dar problema majoră este că există, de obicei, mult mai mult decât ARN decat ADNc prezent după o transcriere inversă. Cu toate acestea, acestea nu sunt satisfăcătoare, deoarece nivelurile de zgomot de fond pot genera erori suplimentare care tind să mascheze capacitatea noastră de a cuantifica exact valoarea de ADNc sintetizat. Cu toate acestea, noi

metode mai precise, de a cuantifica non-radioactiv eficienta sintezei ADNc-ului sunt în curs de dezvoltare și este probabil ca normalizarea ADNc va deveni posibila în viitorul nu prea îndepărtat.

3.4 PCR referință dependentă

Utilizarea unei referințe dependente PCR este de departe cea mai atractiva optiune de normalizare. În teorie, este, de asemenea, metoda cea mai simplă, deoarece atât gena țintă și referinta dependente de PCR sunt măsurate de RT-PCR și tot ce este necesar pentru măsurarea lor sunt reactii PCR suplimentare. Există patru tipuri de referinte PCR dependente disponibile:

ADN genomic

ADN-ul genomic (gADN-ul) măsoară cantitatea de gADN-ul co-extras cu ARN. Această metodă nu necesită transcriere inversă și nu verifica erorile introduse prin această metodă. Cu toate acestea, problema cu măsurarea gADN-ul este ca majoritatea tehnicilor de extracție a ARN încerca eliminarea AND-ului co-extras cât mai mult posibil, deoarece ADN-ul poate inhiba RT-PCR test. Cu toate acestea, afilierea PCR dependentă a gADN a jucat un rol important în cercetarea în stadiu incipient de dezvoltare embrionară ca se poata furniza informații foarte precise despre ce stadiu diviziune este în curs demăsurare (Hartshorn et al., 2003).

Varful

Marcarea probei cu un acid nucleic distinctiv (strain) permite o evaluare a eficienței de extracție și poate fi utilizat pentru normalizare. Varful, atâta timp cât aceasta nu se găsește în eșantionul de interes, poate fi sintetic sau de la un alt organism.

Această metodă beneficiază de faptul că a definit cu exactitate numarul de varfuri ce pot fi introduce înainte de extracție care să permită o buna estimare a erorilor ce pot aparea in cele mai multe dintre etapele de prelucrare. Dacă se utilizează vârfuri ARN reacția de transcriere inversă poate fi, de asemenea,controlată ceea ce este esențial pentru masuratori fine. Critica principală adusa folosirii acestei metode este că, în timp ce ele pot fi introduse înainte de extracție, spre deosebire de ARN-urile celulare, nu sunt extrase din interiorul țesutului.Prin urmare, pot exista situații (de exemplu, în cazul în care probele diferă histologic) în care dispozitivul nu poate fi un bun control pentru procedura de extracție.

Gene de referință

Genele de referință reprezinta cea mai comuna metoda de normalizare a datelor qRT-PCR. Această strategie vizează RNAs care sunt, se speră / asumate / demonstrat, exprimat în mod universal și constitutiv, și a cărei expresie nu diferă între loturile experimentale și de control, să raporteze orice variație care apare din cauza unei erori experimentale. Teoretic, genele de referinta sunt ideale deoarece acestea sunt supuse la otate variatiile care afecteaza gena de interes. Problema apare atunci când o genă de referință se utilizează fără validare.Genele de referință (denumite anterior gene menaj), cum ar fi GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) generează rezultate mai calitative (northren blotting, test de protecție la ARNază). Aceste gene s-au dovedit a fi esențiale pentru metabolismul celular și, mai important, mereu active. Întrucât analiza Northern blot se ocupa in principal cu reglare brută sus-jos, ele erau perfect adecvate ca martori de încărcare. Dezvoltarea qRT-PCR a transformat analiza ARN dintr-un test calitativ si semi-cantitativ, intr-unul foarte cantitativ. Dintr-o data a devenit posibil să se măsoare mult mai mult decât modificările

brute in expresia ARN-ului; a fost posibila detectarea celor mai mici modificări ale nivelurilor de ARNm și să ofere valori numerice care ar putea face obiectul analizei statistice.Accentul tot mai mare pus pe cuantificare a însemnat că cerințapentru omniprezenta expresiei nu mai era suficienta. Acum, expresia trebuia să fie stabilă și să nu fie afectata de designul experimental. În cel mai bun caz o gena de referinta prost aleasa ar reduce rezoluția a testului prin introducerea zgomot suplimentar și, în cel mai rău caz, gena de referință ar fi direct afectata de sistemul experimental; schimbarea de direcție ar ascunde o adevărata schimbare în gena de interes sau ar prezenta un rezultat complet fals.Ceea ce a devenit evident în ultimii ani este că nu există o singurăgena de referință pentru toate sistemele experimentale (cel puțin nici una nu a fost descoperita).Vandesompele si colab., (2002) au cuntificat erori legate de utilizarea unei gene unice de referință ca mai mult de trei ori în 25% și mai mult de șase ori în 10% din probe. Tricarico si colab., (2002) au arătat că nivelurile de VEGF mARN ar putea fi făcute să apară crescute, scazute sau neschimbate între perechile de probe normale si canceroase, în funcție doar de metoda de normalizare aleasa. Astăzi este clar că genele de referință trebuie să fie validate cu atenție pentru fiecare situație experimentală și că noile condiții experimentale sau probe de țesut diferite necesită re-validare a genelor de referință alese (Schmittgen, 2000). Există două strategii care pot fi folosite pentru a valida o genă de referință:

(a) prima metodă este de a aborba eroarea direct; această strategie măsoară eroarea direct din datele brute obtinute de la genele de referinta din sistemul experimental așa cum este ilustrat in Dheda și colab. (2004).Eroarea măsurata cuprinde atât eroarea experimentală cat si fluctuatia biologica a genei de referinta aleasa. Această metodă este dependentă de o tehnica de laborator buna care sa nu introduca erori tehnice ce pot reduce rezoluția si sa fie nevoie de

utilizarea unei metode de normalizare discutata mai sus pentru a crește această rezoluție, și este de asemenea dependentăpe alegerea referinței corecte. Această abordare definește rezoluția analizei individuale și astfel oferă un parametru măsurabil pentru evaluarea probabilitatea ca un rezultat sa fie semnificativ. Această metodă furnizează o strategie simplă pentru normalizarea genelor de referință și este ideal atunci când resursele sunt limitative și când măsurarea diferențelor mari (> de cinci ori) sunt obligatorii. Cu toate acestea, această strategie nu este adecvată atunci când se măsoară modificări mai subtile în nivelurile de mRNA (<de două ori). Aceasta se datorează faptului că validarea inițială trebuie să fie normalizata la un alt factor (de exemplu, ARN total) și astfel este limitată de rezoluția acestui factor, care nu poate fi măsurat cu exactitate.

(b) A doua metodă utilizează tendinta indusa de eroare. Această strategie măsoară, de asemenea, eroarea din datele brute ale genelor de referință în cadrul sistemului experimental. Totuși, această strategie diferă de abordarea prin validarea unei singure gene de referinta, prin compararea fluctuațiilor între genele de referință respective. Prin urmare, daca eroarea este introdusa de un anumit eșantion care mărește artificial măsuratoarea acest lucru va fi observat în toate genele de referință măsurate și pot fi compensate. Influența valorilor extreme poate fi foarte mult redusă, prin măsurarea mediei geometrice spre deosebire de media aritmetică (Vandesompele colab., 2002). Ca și în cazul unei singure gene validate, această metodă definește rezoluția de analiză; cu toate acestea se poate da o mult mai bună estimare a acestei rezoluții, deoarece este independenta de erori tehnice astfel încât măsurătorile mici ca de 0,5 ori, au fost raportate (Depreter colab., 2002). Dezavantajul acestei metode este că necesitămăsurarea a cel puțin trei gene de referință și, pentru a obtine o rezolutie foarte fina , poate solicita masurarea a 10 gene. Acest lucru este greu realizabil atunci când se compara modele de expresie în numeroase țesuturi, sau atunci când se utilizează mai

multe regimuri diferite de tratament. Mai mult decât atât, poate fi necesar să se revalideze gene de referință atunci când se schimbă procedurile de extracție, folosind noi enzime sau proceduri de analiză.4. Concluzie

qRT-PCR a revoluționat măsurarea expresiei ARN-ului care a condus la o explozie de publicații în ultimii ani. În mod ironic, metode de normalizare acceptabile, în special cu gene de referință, au rămas o problemă controversată și a fost doar în ultimii patru ani a fost abordată. În ciuda acestui fapt, chiar și astăzi datele de expresie ARN sunt publicate cu nici o mențiune dacă metodele utilizate pentru normalizare au fost validate. Cu toate acestea, fără aceasta validare testul nu poate avea rezoluția de a detecta schimbari mici sau mai rău poate produce artefacte. Ingrijorator, lucrările sunt încă în curs de publicare, chiar dacă autorii au nu demonstrat nici o validare a strategiilor lor de normalizare.