metoda PCR
57
B u n v e n i t l a B u n v e n i t l a Laboratorul Laboratorul de de Microbiologie Microbiologie IRASM IRASM LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Aleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6 tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: [email protected] Sistem de manegement al calitatii certificat ISO 9001:2000 INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI
Transcript of metoda PCR
B u n v e n i t l a B u n v e n i t l a
LaboratorulLaboratorul
de de MicrobiologieMicrobiologieIRASMIRASM
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIEAleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6
tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: [email protected]
Sistem
de manegemental
calitatii
certificatISO 9001:2000
INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI
Cine Cine suntemsuntem
??
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIEAleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6
tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: [email protected]
Sistem
de manegemental
calitatii
certificatISO 9001:2000
INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI
Cu Cu cece nene ocupamocupam ??LaboratorLaborator de de MicrobiologieMicrobiologie independentindependent
AnalizeAnalize pentrupentru produseproduse farmaceuticefarmaceutice ((medicamentemedicamente, , suplimentesuplimentealimentarealimentare) ) sisi dispozitivedispozitive medicalemedicale
Document de Document de referintareferinta: : European PharmacopoeiaEuropean Pharmacopoeia, ed. a V, ed. a V--aa
ClientiClienti: : producatoriproducatori de de farmaceuticefarmaceutice sisi dispozitivedispozitive medicalemedicale, in , in deosebideosebi interniinterni
OfertaOferta actualaactuala cuprindecuprinde::
TesteTeste de de SterilitateSterilitate ((metodametoda filtrariifiltrarii sisi inoculariiinocularii directedirecte))
AnalizeAnalize de de ContaminareContaminare MicrobianaMicrobiana::--
NumarareNumarare
Total Total GermeniGermeni
AerobiAerobi
MezofiliMezofili
(TAVC) (TAVC) sisi
--
DetectiaDetectia
prezenteiprezentei: : Salmonella spSalmonella sp., ., E. coliE. coli, , St. St. arureusarureus sisi
Ps. Ps. AeruginosaAeruginosa--
DetectieDetectie
sisi
cuantificarecuantificare: : EnterobacteriiEnterobacterii
totaletotale
sisi
altealte
bacteriibacterii
gram negative gram negative
AnalizeAnalize de de ContaminareaContaminarea a a mediuluimediului de de productieproductie ((TAVCTAVC):):aeraer, , suprafetesuprafete de de lucrulucru, , apaapa, , amprentaamprenta manusiimanusii
Am Am testattestat panapana acumacum ……ComprimateComprimate ((filmatefilmate sausau nunu ..)..)MateriiMaterii primeprime ((lactozalactoza, , celulozaceluloza, talc ..), talc ..)Capsule Capsule gelatinoasegelatinoase ((goalegoale, , plinepline, , moimoi, , uscateuscate ..)..)GeluriGeluri ((unguenteunguente) ) SupozitoareSupozitoareRasiniRasini farmaceuticefarmaceuticeMateriiMaterii prime de prime de origineorigine vegetalavegetala ((tutuntutun, , ghiaraghiara diavoluluidiavolului ..)..)SiropuriSiropuriCompreseComprese de de tifontifon sisi netesutnetesut –– simple simple sausau impregnate cu impregnate cu gelurigeluri / / unguienteunguienteSeringiSeringi, ace , ace seringaseringa, , perfuzoareperfuzoare ....PansamentPansament toracictoracic ((tifontifon + + vatavata))
SiSi
chiarchiar
……FlacoaneFlacoane goalegoale (plastic, metal, (plastic, metal, susu sausau farafara capaccapac ..)..)
Spray cu antibioticSpray cu antibioticMojaratMojarat din din insecteinsecte ……
CartiCarti vechivechi ale ale BiblioteciiBibliotecii NationaleNationale ………… VarVar razuitrazuit de de pepe peretipereti ......
In total > 100 de In total > 100 de tipuritipuri
de probe de probe diferitediferite
……
IIdentificarea microrganismelor patogene dentificarea microrganismelor patogene prin analiza secventelor genice prin analiza secventelor genice conservateconservate
––
metoda PCR: principiu, metoda PCR: principiu, pprocedura standard de operare, rocedura standard de operare, metoda de laborator, metoda de laborator, avantaje, limitariavantaje, limitari
Proiect CEEX 78 / 2005 (“BIOM”)
“Implementarea analizelor de identificare a microorganismelor patogene
prin metode de biologie moleculara
si extinderea acreditarii laboratorului IRASM“
LaboratorulLaboratorul de de MicrobiologieMicrobiologie
DetectiaDetectia microorganismelormicroorganismelor
patogenepatogene prinprin
MetodaMetoda PCRPCR
… Reactia de polimerizare in lant a Acidului Dezoxiribonucleic (ADN)
• Este o tehnica prin care se genereaza multiple cópii identice, pornind de la (ipotetic) 1 singura molecula de ADN - template.
• Mai multe molecule sunt mai usor de detectat / analizat si de prelucrat ulterior (transfer pe membrana, hibridizare, secventiere etc)
• Copiaza in vitro procesul biologic de Replicare a ADN
PCR PCR == Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction
Reactia PCR a Reactia PCR a fostfost descoperitadescoperita in in 1983 de 1983 de catrecatre KaryKary B. Mullis B. Mullis
(1993(1993--
PremiulPremiul
Nobel)Nobel)
sisi, , dupadupa
1988 1988 a cunoscut o dezvoltare exploziva a cunoscut o dezvoltare exploziva sisi
o o rafinarerafinare
extraordinaraextraordinara, fiind reactia care a revolutionat , fiind reactia care a revolutionat
Biologia Moleculara a Biologia Moleculara a AAcizilor Nucleici.cizilor Nucleici.
DezvoltareaDezvoltarea tehniciitehnicii aare la baza descoperirea re la baza descoperirea TaqTaq--PolimerazPolimerazeiei,,enzimenzimaa--cheiecheie
a a reactieireactiei, o , o polimerazapolimeraza
stabila la temperaturi inalte (~stabila la temperaturi inalte (~9494oo
C), C),
la care moleculele de ADN, in mod normal dublu catenare, la care moleculele de ADN, in mod normal dublu catenare, disociazadisociaza
sisi
astfelastfel
fiecarefiecare
catena catena poatepoate
fifi
copiatacopiata..
Licenta de utilizare a reactieie PCR este detinuta de compania HLicenta de utilizare a reactieie PCR este detinuta de compania Hoffman La Rocheoffman La Roche
-
Instrument: termocycler
-
Program de incalziri / raciri repetate,
la to C bine precizate …
Principiul tehnicii PCR:
--
……
moleculelemoleculele
de ADN se de ADN se separasepara
……
--
……
in in prezentaprezenta
enzimeienzimei
TaqTaq--polimerazapolimeraza + + primeriprimeri
+ + amestecamestec
de de
dNTPdNTP--uriuri
((monomeriimonomerii) + MgCl) + MgCl
2 2 ……..
--
……
fiecarefiecare
catena se catena se ““lasalasa
copiatacopiata””, , danddand
nasterenastere
uneiunei
catenecatene--surorisurori, ,
completcomplet
nouanoua
sisi
identicaidentica
--
La La randulrandul
lorlor, , noilenoile
catenecatene
se se vorvor
separasepara
sisi
vorvor
serviservi
dreptdrept
matritematrite
--
AstfelAstfel, din 1 , din 1 moleculamolecula
initialainitiala
dubludublu
catenaracatenara 2 molecule 2 molecule dubludublu--
catenarecatenare identiceidentice 4 molecule 4 molecule ……
-- …… dupadupa 32 de 32 de cicluricicluri: > 1 : > 1 milionmilion de de catenecatene identiceidentice
Denaturarea
moleculei
de ADN-matrita
ADNADN--ulul esteeste o o macromoleculamacromolecula polimericapolimerica, , alcatuitaalcatuitadin 2 din 2 catenecatene complementarecomplementare, , antiparaleleantiparalele
3’
5’
5’
3’
La 94La 94oo C, C, celecele 2 2 catenecatene se se separasepara““DeanaturareaDeanaturarea””
5’
3’
3’
5’
Alinierea
primerilorPrimerii = oligonucleotide (15-20 pb), complementare cu capetele fragmentului de amplificat; folosite ca amorsa pentru polimerizarea dNTP-urilor
PrimeriiPrimerii se se aliniazaaliniaza la ~52la ~52oo CC5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’5’3’ 5’
3’ 5’3’5’
TaqTaq extendsextends at 72at 72ooCCTaq polymeraza recunoaste capatul 3’ al primer-ului atast la catena-matrita si incepe elongarea lui
Elongarea Nucleotidele (caramizile) se asaza pe baza de complementaritate la matrita si vor fi legate intre ele de catre Taq- polimeraza
…… DenaturareDenaturare / / alinierealiniere / /
elongareelongare –– repetaterepetate in in
catevacateva zecizeci de de cicluricicluri
succesivesuccesive ……
Cycle 1
Cycle 2
Cycle 3
Detectarea
/ recunoasterea
ampliconilor
•
Ulterior, ampliconii (fragmentele ADN obtinute) se detecteaza prin electroforeza in gel de agaroza
•
avand aceeasi dimensiune, toate moleculele vor avea acceasi mobilitate electroforetica si vor genera benzi
la aceeasi
distanta;
•
greutatea moleculara a ampliconilor se poate afla prin compararea cu un marker de greutate care migreaza in paralel.
•
In PCR-ul in timp real (Real-Time PCR), produsul de amplificare este detectat prin intermediul colorantilor fluorescenti (“probe”).
•
In chimia
reactiei
sunt
incluse diferite
tipuri
de sonde oligonucleotidice
care, intr-o
anumita
etapa
a amplificarii, se prind
specific
fie de produsul
amplificarii, fie de fragmentul-tinta
ce urmeaza
a fi copiat.
•
FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer; Fluorescence Resonance Energy Transfer; fenomenulfenomenul are loc are loc numainumai
candcand
fluorescentfluorescent--ulul
sisi
quencerquencer--ulul
suntsunt
apropiatiapropiati
•
Fluorescenta
emisa
se cumuleaza
si creste
in intensitate
pe
masura ce cantitatea
de ampliconi
creste
Real-Time PCR Reactia
de polimerizare
in lant
a ADN,
monitorizata
in timp real
•
Monitorizarea
intensitatii
fluorescentei
chiar
in timpul reactiei
PCR permite
detectia si cuantificarea
produsului
acumulat, fara a fi nevoie
de a mai deschide tuburile dupa terminarea reactiei.
•
Asadar, un instrument de Real-Time
PCR este in acelasi
timp
si un analizor in sine
(spre
deosebire, un
PCR simplu
realizeaza
doar
etapa
de amplificare, urmand
ca
analiza
si detectia
produsilor
sa fie facuta
intr-o
etapa
post
PCR)
LightCyclerRoche
real-timereal-time real-time
realreal--time PCRtime PCR
iCyclerBioRad
7700Applied Biosystems
5700Applied Biosystems
FluorTrackerStratagene
hardwarehardware
6000 Rotor GeneCorbett Research
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Model de actiune folosind “sonde de hibridizare” adiacenteFRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Model de Model de actiuneactiune folosindfolosind ““sondesonde de de hibridizarehibridizare”” adiacenteadiacente
ReporterQuencher
P Phosphate
Emission
real-timereal-time real-time
FRETFRET
Amplicon
FRET
P
Excitation
Alinierea
DenaturareaDenaturarea
95oC
FRET Emission
P
ExcitationTm
55oC
Alinierea primer-ilorsi a sondelorAlinierea primer-ilorsi a sondelor
CitireaFluorometrica
CitireaFluorometrica
real-timereal-timereal-time
LightCyclerLightCyclerOperation
72oC
Elongarea(extensia primerilor)Elongarea(extensia primerilor)
AplicatiiAplicatii
ale ale tehniciitehnicii
PCR PCR (conventional)(conventional)
PrinPrin detectareadetectarea prezenteiprezentei unuiunui fragment de ADN, fragment de ADN, consideratconsiderat dreptdrept ““markermarker””, , intrintr--un un genomgenom ……
--
PrezentaPrezenta
uneiunei
anumiteanumite
speciispecii
sausau
tulpinitulpini
bacterienebacteriene
intrintr--oo
populatiepopulatie
mixtamixta (ex. (ex. confirmareconfirmare
diagnostic bacteriologic)diagnostic bacteriologic)
--
CaracterizareaCaracterizarea
sisi
deosebireadeosebirea
unorunor
taxonitaxoni
infraspecificiinfraspecifici
(ex. (ex. tulpinatulpina) ) ––
cu cu aplicatiiaplicatii
in in epidemiologieepidemiologie
--
DiferiteDiferite
modurimoduri
de de utilizareutilizare
a a tehniciitehnicii
pot pot dada
combinatiicombinatii
de de markerimarkeri
genomicigenomici cece
pot pot constituiconstitui
un un pasaportpasaport geneticgenetic pentrupentru
respectivarespectiva
varietatevarietate
((licentalicenta
pentrupentru
tulpinitulpini
de de interesinteres, , soiurisoiuri
sisi
hibrizihibrizi
––
in in agriculturaagricultura))
--
Diagnostic Diagnostic umanuman
pentrupentru
maladiimaladii
nonnon--infectioaseinfectioase
((genagena
mutantamutanta
existaexista
sausau nunu, , individulindividul
esteeste
homohomo--
sausau
heterozigotheterozigot))
AplicatiiAplicatii
ale ale tehniciitehnicii
RealReal--Time PCRTime PCR
DetectiaDetectia
calitativacalitativa
((prezentprezent / absent/ absent) ) sisi
cantitativacantitativa
((cuantificarecuantificare absolutaabsoluta) a ) a unorunor
agentiagenti
infectiosiinfectiosi
((microorganismemicroorganisme
sisi
virusurivirusuri) )
CaracterizareaCaracterizarea
uneiunei
gene de gene de interesinteres
intrintr--un un genomgenom
((nivelnivel
de de expresieexpresie) = ) = cuantificarecuantificare relativarelativa
ConfirmareaConfirmarea unorunor maladiimaladii metabolicemetabolice de suprade supra-- sausau subsub--exprimareexprimare a a uneiunei gene (gene (fatafata de un de un nivelnivel ““normalnormal””))
EfecteleEfectele unuiunui tratamenttratament--pilot pilot asupraasupra exprimariiexprimarii uneiunei genegene--tintatinta ((fatafata de o de o genagena househouse--keepingkeeping -- al al careicarei nivelnivel de de transcrieretranscriere nunu se se modificamodifica in in urmaurma tratamentuluitratamentului))
DiscriminareaDiscriminarea
aleleloralelelor
DetectiaDetectia
SNPSNP--urilorurilor
(Single Nucleotide Polymorphism)(Single Nucleotide Polymorphism)
Detectia microorganismelor prin reactia PCR clasic se bazeaza pe amplificarea unor regiuni specifice din genomul acestora.
•
Permite
confirmarea sau infirmarea prezentei microorganismului
suspectat
•
Rezultatul
este
de tip “Microorganism X PREZENT / ABSENT in Y grame
(ml) proba
•
Exista
pe
piata
truse
de diagnostic PCR (kit-uri) - sisteme ready to use. Ele
includ
moleculele-
cheie
pentru
asigurarea
specificitatii
reactiei: “primerii”
–
precum
si
celelalte
componente
(Taq, buffer etc.) care asigura
amplificarea
unei regiuni
din genomul
tinta
Etapele
analizei
folosind
tehnica PCR (clasic):
•
Precultivarea esantionului
de proba
(5-10 h) -
optional dar
recomandabil, in functie
de natura
probei
•
Extractia ADN
•
Verificarea calitatii ADN-ului
extras (spectrofotometric
si
/ sau electroforetic)
•
Reactia
PCR
•
Electroforeza pentru
revelarea
ampliconilor Rezultat: “prezent / absent”
•
Timp
de realizare: ~ 24-48 h de la primirea
probei
(cu comanda anticipata
!!)
Controale
asociate
unei
analize prin
PCR (clasic)
•
Un ADN -
Control Pozitiv
(CP)
•
Un Control Negativ
(CN)•
Un Control Intern (CI)
•
Marker de greutate
moleculara
pentru confirmarea
identitatii
fragmentului
obtinut
Aplicarea
tehnicii Real-Time PCR in microbiologie
•
Permite
in plus cuantificarea(nr. de genoame
/ gram proba)
•
Analiza
este
mai
rapida
(nu
este
nevoie
de electroforeza)
Etapele
analizei
calitative
prin Real-Time PCR
•
Precultivarea esantionului
de proba
(5-10 h)
- optional dar
recomandabil, in functie
de natura
probei
•
Extractia ADN
•
Verificarea calitatii ADN-ului
extras
•
Reactia
PCR Rezultat: “prezent / absent”
Etapele
analizei
cantitative prin Real-Time PCR
•
Extractia ADN•
Verificarea calitatii ADN-ului
extras
(spectrofotometric
si
/ sau
electroforetic)•
Reactia
PCR Rezultat: “Nr. Cópii/ g (ml)”
•
Analiza
foloseste
strategia
Absolute quantification: cu ajutorul
unei
curbe
standard
se genereaza
un rezultat
= o valoare
absoluta
0.5
1.5
2.5
0 10 20 30 40 50 60 70
Cycles
F2
/F
1
NEG
10
100
1000
10000
100000
1000000
real-timereal-timereal-time
realreal--timetimePCR quantitationPCR quantitation
Threshold Cycle
Incarcatura microbiana
Th
resh
old
Cycl
e
0.5
1.5
2.5
0 10 20 30 40 50 60 70
Cycles
F2
/F
1
Test SampleThreshold
Threshold Cycle
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 5 6
Concentration log 10
Threshold Cycle = 35Load = 103.8 copies/ml
Controale
asociate
unei
analize prin
Real-Time PCR
•
Internal control (IC) –
un ADN diferit
de cel
tinta, cu primerii
specifici
lui, care se amplifica
in paralel
cu proba
de testat, in fiecare
tub probeaza buna desfasurare a reactiei (surprinde posibilele inhibari); Metoda devine de fapt un « multiplex PCR »
•
Unul
sau
mai multe
Controale Pozitive (CP). La analizele
cantitative
–
minim
3 CP, diferite
concentratii
curba standard
•
Cel
putin
un Control Negativ per
sesiune surprindeposibile contaminari incrucisate
RezultateleRezultatele
proiectuluiproiectului CEEX 78/2005 (CEEX 78/2005 (““BIOMBIOM””) ) ––
modulmodul
IVIV
ImplementareaImplementarea urmatoarelorurmatoarelor analizeanalize::
--
DetectieDetectie
sisi
cuantificarecuantificare
Salmonella sp.Salmonella sp. prinprin
Real Time PCR Real Time PCR ––
folosindfolosind
kitkit--ulul: : ArtusArtus Salmonella sp. RG Salmonella sp. RG ((QiagenQiagen))
--
DetectieDetectie
sisi
cuantificarecuantificare
ListeriaListeria monocytogenesmonocytogenes PrinPrin
real Time PCR real Time PCR –– folosindfolosind
kitkit--ulul: : ArtusArtus L. L. monocytogenesmonocytogenes RGRG ((QiagenQiagen))
--
DetectieDetectie
sisi
cuantificarecuantificare
LegionellaLegionella pneumophillapneumophilla din din apaapa, , prinprin
Real Time PCR Real Time PCR ––
folosindfolosind
kitkit--ulul: : Aqua Screen L. Aqua Screen L. pneumophillapneumophilla Detection Kit for Real Detection Kit for Real
Time PCR Time PCR (Minerva)(Minerva)
--
DetectieDetectie
sisi
cuantificarecuantificare
LegionellaLegionella sp.sp. din din apaapa, , prinprin
Real Time PCR Real Time PCR ––
folosindfolosind kitkit--ulul: : Aqua Screen Aqua Screen LegionellaLegionella sp. Detection Kit for Real Time PCR sp. Detection Kit for Real Time PCR
(Minerva)(Minerva)
--
DetectieDetectie
LegionellaLegionella pneumophilapneumophila din din apaapa, , prinprin
PCR PCR clasicclasic
––
folosindfolosind
kitkit--ulul: : Aqua Screen Aqua Screen LegionellaLegionella pneumophillapneumophilla PCR Detection Kit PCR Detection Kit (Minerva)(Minerva)
IncercarileIncercarile de de maimai sussus suntsunt un un inceputinceput de drum de drum ……
ProceduraProcedura
standard de standard de operareoperare
pentrupentru analizeleanalizele
efectuateefectuate
prinprin
tehnicatehnica
PCR PCR sisi
realreal--Time PCR (IRASMTime PCR (IRASM--SOPSOP--T05):T05):
--
DefinireaDefinirea
fluxuluifluxului::Camera de Camera de reactivireactivi ((portionareportionare
reactivireactivi
pentrupentru
a a evitaevita
dezghetaridezghetari
repetaterepetate
sisi
pipetareapipetarea
mixmix--
uluiului
de PCR, de PCR, farafara
ADN) ADN) Camera de ADNCamera de ADN ((izolariizolari sisi adaugareadaugare ADN in mix PCR: ADN in mix PCR: probaproba sisiCP CP Camera de Camera de amplificareamplificare sisi PostPost--amplificareamplificare
--
PrecautiiPrecautii
sisi
regulireguli
de de bunabuna
practicapractica
de de lucrulucru
in in LaboratorulLaboratorul
de de BiologieBiologie
MolecularaMoleculara
--
FisaFisa
de de urmarireurmarire
a a probeiprobei, , asociataasociata
analizeianalizei
prinprin
tehnicatehnica
PCR (de la PCR (de la primireaprimirea
probeiprobei efectuareaefectuarea analizeianalizei eliberareaeliberarea rezultatuluirezultatului))
--
InterpretareaInterpretarea
controalelorcontroalelor
sisi
criteriicriterii
de de acceptare/respingereacceptare/respingere asociateasociate
fiecareifiecarei
etapeetape
a a analizeianalizei
ElectroforezaElectroforeza
in gel de in gel de agarozaagaroza
2% a 2% a ampliconilorampliconilor
de de LegionellaLegionella
pneumophilapneumophila ((Aqua Screen L. Aqua Screen L. pneumophillapneumophilla PCR Detection Kit PCR Detection Kit -- Minerva)Minerva)
CPM CP10-1 CN
L. monocitogenes undiluted
L. monocitogenes dilution 10-1
TreshlodQS1
QS3
QS4
QS2
.
L. monocitogenes nediluat
QS4 QS3
QS1
L. monocitogenes diluat 10-1
QS2
Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards )
Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR – analiza pe probe de Listeria monocytogenes (suspensie din cultura de 24 h), folosind kit-ul Artus L. monocytogenes RG
CN
Izolat
din cultura“Albendazol -
tablete”
Quantitaive
StandardsQS1, QS2, QS3, QS4
Treshold
Izolat
din cultura“Fish Gelatine –
Materie
prima”
Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR - analiza pe 2 izolate din probe farmaceutice, folosind kit-ul Artus Salmonella sp. RG
QS3
QS2
QS4
QS1
Cultured isolate from“Fish Gelatine – Materie
prima
Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards)
AvantajeleAvantajele DetectieiDetectiei
microorganismelormicroorganismelor prinprin
PCR:PCR:MaterialulMaterialul geneticgenetic ((ADNADN--ulul) este ) este componentacomponenta celularacelulara ceacea mai mai stabilastabila (nu se (nu se modificamodifica cucu stareastarea fiziologicafiziologica, , mediulmediul de de culturacultura sausau varstavarsta celuleicelulei) si ) si definitoriedefinitorie pentrupentru caracterulcaracterul de de speciespecie. . SecventaSecventa codificatacodificata in ADN in ADN stasta la la bazabaza tuturortuturor reactiilorreactiilor metabolicemetabolice si a si a celorlaltecelorlalte trasaturitrasaturi fenotipicefenotipice((caracterecaractere de de culturacultura, forma si , forma si aranjamentularanjamentul celulelorcelulelor dupa dupa diviziunediviziune etcetc) ) care se care se constituieconstituie in in criteriicriterii taxonomicetaxonomice si au si au conduscondus la la cheilecheile de de identificareidentificare actualeactuale. .
De De aceeaaceea, , verificareaverificarea prezenteiprezentei uneiunei anumiteanumite secventesecvente de ADN de ADN tipicatipica pentrupentruo o speciespecie//tulpinatulpina de de microorganismmicroorganism este este dovadadovada ceacea mai mai obiectivaobiectiva a a prezenteiprezentei lui, lui, metodametoda detectanddetectand practicpractic bazabaza fizicafizica ((biologicabiologica) a ) a criteriilorcriteriilor taxonomicetaxonomice..
DetectareaDetectarea prezenteiprezentei unuiunui fragment fragment tipictipic urmariturmarit constituieconstituie dovadadovadainechivocainechivoca a a prezenteiprezentei aceluiacelui microorganism.microorganism.
TehnicaTehnica esteeste inaltinalt sensibilasensibila, , putandputand detectadetecta ((intrintr--oo reactiereactie optimizataoptimizata) ) chiarchiar 1 1 singurasingura moleculamolecula de de ADNADN--tintatinta / tub/ tub
DetecteazaDetecteaza sisi formeleformele viabileviabile dardar necultivabilenecultivabile, , precumprecum sisi celulelecelulele moartemoarte dardar intacteintacte((PoatePoate
surprindesurprinde
aplicareaaplicarea
unuiunui
tratamenttratament
de de
decontaminaredecontaminare
a a unuiunui
material care a material care a fostfost
initial initial infectatinfectat
cu cu microorganismulmicroorganismul
respectivrespectiv conditiiconditii
de de igienaigiena -- AVANTAJ ?)AVANTAJ ?)
AvantajeleAvantajele metodeimetodei PCR PCR fatafata de de metodelemetodele clasiceclasiceeste este foartefoarte specificaspecifica (nu (nu lasalasa locloc de de interpretariinterpretarisubiectivesubiective), ), cucu conditiaconditia caca primeriiprimerii sa fie sa fie propriipropriidoardoar unorunor anumiteanumite speciispecii sausau grupurigrupuri de de microorganismemicroorganisme
tehnicatehnica este este rapidarapida, , evitandevitand timpiitimpii mari de mari de incubareincubare
permitepermite analizaanaliza simultanasimultana a a tuturortuturor izolateizolate lorlorsuspectesuspecte prezenteprezente intrintr--oo probaproba ((prinprin metodelemetodeleconventionaleconventionale, , inclusivinclusiv prinprin testeletestele biochimicebiochimicetip API, tip API, izolateleizolatele suspectesuspecte se se repicarepica sisi se se testeazatesteaza separatseparat))
LimitarileLimitarile metodeimetodeiEsantionulEsantionul de de probaproba din care se face din care se face extractiaextractia ADN ADN esteeste ((prinprin specificulspecificultehniciitehnicii) ) micmic sisi, in , in uneleunele cazuricazuri, , poatepoate devenideveni nereprezentativnereprezentativ: : esteeste dificildificil de de concentratconcentrat 10 g 10 g probaproba solidasolida (ex. (ex. pulberepulbere –– pentrupentru SalmonellaSalmonella) in ~ 100) in ~ 100--200 200 ццl de l de solutiesolutie ADN ADN –– care care vava intra in intra in reactiereactie
De De aceeaaceea esteeste recomandabilarecomandabila o o etapaetapa de prede pre--cultivarecultivare (ex. (ex. pestepeste noaptenoapte) a ) a intreguluiintregului esantionesantion de de probaproba pentrupentru a a ““imbogatiimbogati”” populatiapopulatia tintatinta sisi a a usurausuradetectiadetectia
AbiaAbia luandluand in in consideratieconsideratie sisi acesteaceste date, date, tehnicatehnica devinedevine MetodaMetoda ((““MethodMethod””))
AdunandAdunand sisi timpultimpul pentrupentru EF, EF, analizaanaliza vava duradura ~ 24~ 24--48 h (48 h (desidesi tehnicatehnica in in sine se sine se poatepoate efectuaefectua in ~4in ~4--5 ore)5 ore)
SensibilitateaSensibilitatea metodeimetodei este este puternicputernic dependentadependenta de de etapaetapa de de extractieextractie ADN ADN –– si si anumeanume de de catcat de de eficienteficient ADNADN--ulul dindin masamasa probeiprobei de de testattestat poatepoate fi in fi in final final concentratconcentrat in in catevacateva sutesute de de ццl de l de extractextract. In . In cazulcazul abordarilorabordarilorcantitativecantitative, , factorulfactorul «« eficientaeficienta extractieiextractiei »» trebuietrebuie introdusintrodus in calcule la in calcule la ajustareaajustarea rezultatelorrezultatelor
Prezenta inhibitorilor procesului enzimatic poate conduce la Prezenta inhibitorilor procesului enzimatic poate conduce la rezultate fals negative (situatie care se surprinde cu ajutorul rezultate fals negative (situatie care se surprinde cu ajutorul unei unei reactii paralele cu rol de Control Intern). Situatia este criticreactii paralele cu rol de Control Intern). Situatia este critica daca se a daca se doreste izolarea ADN direct din proba (pentru cuantificare).doreste izolarea ADN direct din proba (pentru cuantificare).
FiindFiind inaltinalt sensibilasensibila,, tehnica este predispusa la contaminari tehnica este predispusa la contaminari incrucisate de la amplificarile anterioare, putand conduce la incrucisate de la amplificarile anterioare, putand conduce la rezultate fals pozitive (situatii surprinse prin asocierea unui rezultate fals pozitive (situatii surprinse prin asocierea unui Control Control Negativ, prevenite prin regulile de buna practica de laborator sNegativ, prevenite prin regulile de buna practica de laborator si i reduse ca sansa prin folosirea Realreduse ca sansa prin folosirea Real--Time PCR la care tuburile cu Time PCR la care tuburile cu amplicon raman inchise)amplicon raman inchise)
Analiza cantitativa este considerabil limitata de matricea probeAnaliza cantitativa este considerabil limitata de matricea probeii ((maimaiales ales pentrupentru ca ca metodametoda nunu permitepermite preincubarepreincubare) ) in in cazulcazul unoraunoradintredintre matricimatrici, ea , ea esteeste practicpractic inaplicabilainaplicabila (ex. (ex. pulberipulberi insolubileinsolubile in in apaapa))
NecesesitaNecesesita personal cu personal cu pregatirepregatire de de specialitatespecialitate sisi experientaexperienta
DefinireaDefinirea
domeniuluidomeniului
de de rezultaterezultate
Analiza prin Analiza prin tehnicitehnici PCR este din start (prin conceptie) directionata spre un anumitPCR este din start (prin conceptie) directionata spre un anumitmicroorganism. Un rezultat negativ infirma prezenta acelui micromicroorganism. Un rezultat negativ infirma prezenta acelui microorganism, fara a organism, fara a spune ceva despre microorganismul prezent spune ceva despre microorganismul prezent de de faptfapt in proba. in proba.
Consecutiv, un rezultat pozitiv insotit de o valoare indica numaConsecutiv, un rezultat pozitiv insotit de o valoare indica numarul de crul de cóópii genomice pii genomice (care se echivaleaza cu numarul de indivizi prezenti in unitatea(care se echivaleaza cu numarul de indivizi prezenti in unitatea de proba). de proba).
Metoda nu poate identifica / cuantifica alte microorganisme decaMetoda nu poate identifica / cuantifica alte microorganisme decat cele pentru care a t cele pentru care a fost prfost prooiectata. Proiectarea se face in mod primar, din alegerea primeriiectata. Proiectarea se face in mod primar, din alegerea primerilor si a lor si a conditiilor de reactie si nu poate fi ulterior conditiilor de reactie si nu poate fi ulterior „„ajustataajustata”” in sensul modificarii domeniului in sensul modificarii domeniului de detectie. De aceea, rezultatele generate de metoda sunt de detectie. De aceea, rezultatele generate de metoda sunt „„absent / prezentabsent / prezent, , respectiv respectiv prezent in numar de ...prezent in numar de ... / unitatea de proba/ unitatea de proba””
AnalizeleAnalizele posibileposibile prinprin tehnicatehnica PCR se PCR se incadreazaincadreaza decideci la la ““DetectareaDetectarea prezenteiprezentei”” sisirespectivrespectiv ““CuantificareCuantificare sausau DetectieDetectie cantitativacantitativa””
In In ambeleambele cazuricazuri, , LaboratorulLaboratorul vava stabilistabili pentrupentru fiecarefiecare microorganism in microorganism in partepartedomeniuldomeniul pepe care care metodametoda se se poatepoate aplicaaplica: : limitalimita minima minima sisi maxima de maxima de detectiedetectie. .
AlteAlte
conditiiconditii
pentrupentru
efectuareefectuare
analizeloranalizelor prinprin
tehnicatehnica
PCR PCR sisi
RealReal--Time PCRTime PCR
TimpTimp de de realizarerealizare pentrupentru fiecarefiecare tip de tip de analizaanaliza: 24: 24--48 h, 48 h, in in functiefunctie de data de data comenziicomenzii sisi de de altealte analizeanalize solicitatesolicitate la la aceaacea probaproba
AnalizaAnaliza pentrupentru respectivarespectiva probaproba a a fostfost anterior anterior validatavalidata la la laboratorullaboratorul nostrunostru pentrupentru metodelemetodele conventionaleconventionale ((nunuesteeste la prima la prima analizaanaliza))
Pharmacopoeia Europeana Pharmacopoeia Europeana ––
utilizarea utilizarea metodelor de biologie moleculara in metodelor de biologie moleculara in controlul calitatii microbiologice controlul calitatii microbiologice
(Eur. Ph., ed. a V(Eur. Ph., ed. a V--a, a, Metode alternativeMetode alternative –– cap.5.1.6)cap.5.1.6)
CerinteCerinte privindprivind
validareavalidarea metodeimetodei
MetodaMetoda
introdusaintrodusa
pentrupentru
prima data in ed. a Vprima data in ed. a V--a (2006), a (2006), la cap. 5.1.6. la cap. 5.1.6. ““MetodeMetode alternativealternative””
(versus (versus
““ConventionaleConventionale””))
ValidareaValidarea
metodeimetodei
esteeste
o o necesitatenecesitate
FiecareFiecare
tip de tip de ““IncercareIncercare
((MasuratoareMasuratoare))””
necesitanecesita validareavalidarea
a a diferitidiferiti
““parametriparametri””
ValidareaValidarea
vizeazavizeaza
analizaanaliza
in in ansamblulansamblul
sausau
(include (include toatetoate
etapeleetapele
““procesuluiprocesului””))
ToateToate
rezultatelerezultatele
parametrilorparametrilor
validativalidati
suntsunt
raportateraportate
la la metodelemetodele
conventionaleconventionale
(care (care suntsunt
luateluate
dreptdrept
““referintareferinta””))
ValidareaValidarea
AnalizelorAnalizelor
de de DetectieDetectie ((calitativecalitative))
AcurateteaAcuratetea sisi preciziaprecizia = = rata rata relativarelativa
de de aparitieaparitie
a a rezultatelorrezultatelor
falsfals--negativenegative si si falsfals
pozitivepozitive
prinprin
comparatiecomparatie
cucu
metodelemetodele
conventionaleconventionale, , atunciatunci
candcand
se se
folosestefoloseste
un un inoculinocul
standardizatstandardizat
((referintareferinta) de ) de densitatedensitate
micamica
SpecificitateaSpecificitatea = = abilitateaabilitatea
metodeimetodei
alternative de a alternative de a detectadetecta
in in probaproba
intregaintrega gamagama
de de microorganismemicroorganisme
pentrupentru
care a care a fostfost
conceputaconceputa
sisi
numainumai
pepe
acesteaacestea
((asumaasuma
sisi
demonstrareademonstrarea
selectivitatiiselectivitatii; ; esteeste
opusulopusul
““reactivitatiireactivitatii
incrucisateincrucisate““))
Limita minima de Limita minima de detectiedetectie = = celcel
mai mai micmic
numarnumar
de microorganisme de microorganisme prezentprezent
intrintr--oo
probaproba, ce , ce poatepoate
fi fi detectatdetectat
urmandurmand
un un anumitanumit
protocolprotocol
(se (se iauiau
in in considerareconsiderare
decatdecat
microorganismelemicroorganismele
dindin
probaproba
originalaoriginala, , nesupusanesupusa diluariidiluarii
sausau
incubariiincubarii))
RobusteteaRobustetea = = masuramasura
capacitatiicapacitatii
metodeimetodei
de a de a ramaneramane
neafectataneafectata
de de modificarimodificari
micimici
si si intentionateintentionate
in in parametriiparametrii
de de testaretestare; da ; da indicatiiindicatii
despredespre
corectitudineacorectitudinea
metodeimetodei
atunciatunci
candcand
se se modificamodifica
conditiiconditii
precumprecum
diferitidiferiti operatorioperatori
((analistianalisti), instrumente, ), instrumente, loturiloturi
de de reactivireactivi
si si laboratoarelaboratoare
ValidareaValidarea
analizeloranalizelor
de de CuantificareCuantificare ((DetectieDetectie
cantitativacantitativa))
AcurateteaAcuratetea = = celcel
mai mai apropiatapropiat
rezultatrezultat
alal
metodeimetodei
alternative de o alternative de o valoarevaloare obtinutaobtinuta
prinprin
metodametoda
conventionalaconventionala. . TrebuieTrebuie
demonstratademonstrata
pepe
tottot
domeniuldomeniul de de lucrulucru
alal
testuluitestului
((atatatat
in in termenitermeni
de de speciespecie
detectatadetectata catcat
si in si in termenitermeni
de de numarnumar
de de indiviziindivizi
cuantificaticuantificati). Se exprima ). Se exprima caca
% %
de de recuperarerecuperare
a a microorganismuluimicroorganismului
dupa dupa aplicareaaplicarea
metodeimetodei
PreciziaPrecizia = = gradgrad
de de potrivirepotrivire
intreintre
diferitediferite
incercariincercari
((diferentadiferenta
intreintre rezultaterezultate) ) atunciatunci
candcand
proceduraprocedura
este este aplicataaplicata
repetatrepetat
la mai la mai multemulte
esantioaneesantioane
dintrdintr--oo
suspensiesuspensie
omogenaomogena
de microorganisme de microorganisme ––
in in conditiileconditiile
de de testaretestare. Se exprima de . Se exprima de obiceiobicei
caca
variatievariatie, , deviatiedeviatie
standardstandard sausau
coeficintcoeficint de de variatievariatie alal
uneiunei
seriiserii
de de masuratorimasuratori
SpecificitateaSpecificitatea = = abilitateaabilitatea
metodeimetodei
alternative de a alternative de a detectadetecta
in in probaproba intregaintrega
gamagama
de de microorganismemicroorganisme
pentrupentru
care a care a fostfost
conceputaconceputa
sisi
numainumai
pepe
acesteaacestea
((asumaasuma
sisi
demonstrareademonstrarea
selectivitatiiselectivitatii; ; esteeste
opusulopusul ““reactivitatiireactivitatii
incrucisateincrucisate““))
LinearitateaLinearitatea = abilitatea metodei alternative de a genera rezultate = abilitatea metodei alternative de a genera rezultate propotionale ca valoare cu concentratia microorganismelor prezenpropotionale ca valoare cu concentratia microorganismelor prezente in te in proba, pe un domeniu definit de concentratii; se determina pe proba, pe un domeniu definit de concentratii; se determina pe domeniuldomeniul corespunzator scopuluicorespunzator scopului
DomeniulDomeniul = = intervaluiintervalui
intreintre
nivelulnivelul
inferior inferior sisi
celcel
superior de superior de microorganismemicroorganisme
cece
pot pot fifi
detectatedetectate
cu cu precizieprecizie, , acurateteacuratete
sisi
linearitatelinearitate, ,
folosindfolosind
metodametoda
alternativaalternativa; ; se determina prin studii de precizie, se determina prin studii de precizie, acuratete si linearitateacuratete si linearitate
RobusteteaRobustetea = masura capacitatii sale de a ramane neafectata de variatii = masura capacitatii sale de a ramane neafectata de variatii mici dar voite ale parametrilor. Ea ofera o indicatie asupra mici dar voite ale parametrilor. Ea ofera o indicatie asupra increderii in increderii in rezultaterezultate, in diferite conditii de lucru considerate , in diferite conditii de lucru considerate ““normalenormale””, precum: , precum: operatorul, instrumentele, diferite loturi de reactivi, diferiteoperatorul, instrumentele, diferite loturi de reactivi, diferite
labpratoare; se labpratoare; se
poate defini ca poate defini ca rezistenta intrinseca a metodeirezistenta intrinseca a metodei la diferite la diferite influenteinfluente exercitate de variabile din mediul operational sau inconjurator,exercitate de variabile din mediul operational sau inconjurator,
asupra asupra
rezultatelor. rezultatelor. RobusteteaRobustetea este un parametru ce trebuie determinat de producatorul este un parametru ce trebuie determinat de producatorul
metodei, insa daca utilizatorul modifica parametri considerati cmetodei, insa daca utilizatorul modifica parametri considerati critici, ritici, acesta trebuie sa evalueze efectele acestei modificari asupra roacesta trebuie sa evalueze efectele acestei modificari asupra robustetii bustetii metodei. Robustetea unei metode cantitative se judeca drept abilmetodei. Robustetea unei metode cantitative se judeca drept abilitatea itatea de a cuantifica, cu o relevanta statistica, diferite microorganide a cuantifica, cu o relevanta statistica, diferite microorganismesme--test in test in concentratii cunoscute, in urma varierii a diferiti parametriconcentratii cunoscute, in urma varierii a diferiti parametri
BibliografieBibliografieEuropean Pharmacopoeia, ed. a VEuropean Pharmacopoeia, ed. a V--a (2006), cap. 5.1.6 a (2006), cap. 5.1.6 Alternative MethodsAlternative Methods
Quality Assurance / Quality Control Guidance for Quality Assurance / Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples Environmental Samples ––
EPA (United States EPA (United States
Environmental Protection Agency), October 2004Environmental Protection Agency), October 2004
Guidelines for Guidelines for AcreditationAcreditation
of Swiss Medical of Swiss Medical Laboratories performing Nucleic AcidLaboratories performing Nucleic Acid--based Diagnostic based Diagnostic Procedures Procedures ––
Doc. Nr. 323.e / 2004, rev. 00, Doc. Nr. 323.e / 2004, rev. 00,
SchweizerischeSchweizerische
AkkreditierungsstelleAkkreditierungsstelle
(SAS)(SAS)
