Metodele PCR Utilizate Pentru Determinarile de Biologie Moleculara

7/24/2019 Metodele PCR Utilizate Pentru Determinarile de Biologie Moleculara

1/71

Metodele PCR utilizate pentrudeterminarile de biologie

moleculara


2/71

Crearea reaciei n lan a polimerazei, dectre Mullis i colaboratorii si n 198, a

re!oluionat ramurile moleculare alebiologiei i medicinei "#ai$i et al.1988, n#omma i %uerci, &''(b),

nainte de apariia acestei te*nici put+ndi obinute doar cantiti inime dintr-unragment de ./0 int

Reacia PCR permite ampliicareaenzimatic ace posibil multiplicarea uneisingure copii a ragmentului de interes npeste un milion de copii, n doar c+te!a

ore


3/71

2e*nica PCR este esenial pentru multeprocedee de analiz molecular3

clonarea unor ragmente speciice de ./04 detecia i identiicarea genelor n !ederea

diagnosticrii sau in!estigrii criminalistice4

analiza modelelor de e5presie genic 6n ultimii ani, reacia PCR a cut posibil

iniierea cercetrilor n domenii noi precum

controlul autenticitii produselor alimentare,prezenei ./0-ului M7 i a comtaminriimicrobiologice


4/71

Constituirea catenei de ./0 prinadugarea nucleotidelor libere


5/71

tapa 13 denaturareatapa &3 alipirea "*ibridarea molecular)primerilortapa 3 e5tensiaig ('tapele ampliicrii PCR3denaturarea, alipirea i e5tensiaFig. 40. The three steps of a PCRreaction: denaturation, annealing and extension./up :ierstraete"1999) n #omma and %uerci "&''(b)


6/71

Reactia de polimerizare in lant PCR "polimerase c*ainreaction) are la baza o te*nologie in vitrocare imitacapacitatea naturala de replicare a ./0 si care

consta in generarea rapida a unor copii multiple aunei sec!ente nucleotidice tinta "./0 sau .R0) dintr-o gena de interes sau un patogen speciic4 produsulampliicat

Numarul de copii ale secventei tinta cresteexponential cu iecare ciclu de ampliicare, deoareceiecare sec!enta nucleotidica nou sintetizata constituieo matrita pentru o noua copie

Produsul PCRcare reprezinta o copie a ./0;.R0tinta original este denumit amplicon.

.ceasta metoda permite detectarea cu speciicitateoarte mare a unor concentratii oarte scazute alesec!entei tinta


7/71

.mpliicarea se realizeaza intr-un analizor special"thermal cycler), iar amestecul de reactie trebuie sacontina urmatoarele elemente3-ADN sau ARN tinta:e5tras din proba in cursul

etapei de prelucrare4-enzima care aciliteaza sinteza lantuluicomplementar de acid nucleic3ADN polimerazaTaq"izolata din 2*ermop*ilus a


8/71

- cofactori enzimatici3 Mg&= si;sau Mn&=4-primeri (P1 si P2)3 sec!ente scurte,monocatenare, cu lungimea ma5ima &'-'

nucleotide, care se leaga de o matritamonocatenara prin imperec*ereacomplementara a bazelor4

ser!esc ca punct de plecare pentru sintezalantului complementar cu a>utorul ./0polimerazei, marcand inceputul si sarsitulregiunii care trebuie sa ie ampliicata4


9/71

- deoxinucleotidele(dTP, d!TP, dCTP si d"TP#3olosite pentru sinteza noii catene ./0 prin atasarealor la capatul primerilor, complementar cu matrita"o!servatie" ampliconul va contine deoxiuridina inloc de o deoxitimidina, deose!indu-l de ANnativ#$- a$pera%a3 enzima care promo!eaza ampliicareaselecti!a a tintei si distrugerea produsilor de

contaminare din cursul reactiilor de ampliicareanterioare4 catalizeaza cli!area ./0-ului care contine

deo5iuridina la inceputul primului ciclu de ampliicare

si nu degradeaza ./0-ul sau .R0-ul tinta


10/71

Reactia PCR se des%asoara in & etape"'. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului dereactie la 9(?C, ./0-ul tinta este separat "denaturat)in & catene4

2. i!ridizarea primerilor3 ca urmare a scaderiitemperaturii la @@-A'?C, primerii se !or atasacomplementar la capetele B ale celor & catene42emperatura necesar pentru alipirea primerilordepinde n principal de caracteristicile acestora

2eoretic, aceasta este cu c+te!a grade mai mic dec+tT$, ceea ce asigur ormarea unor structuri stabiledoar ntre primeri i ragmentele int complementare"ubista et al., &''D)

". #lon$atia3 la temperatura de A&?C, ./0

polimeraza termostabila in prezenta Mn&= si ae5cesului de deo5inucleotid-triosati "deo5iadenozina,deo5iguanozina, deo5icitidina si deo5iuridina) !ae5tinde primerii atasati in lungul matritei tinta si !aproduce un a$plicon &'


11/71

Eltima etap bazele complementare sec!eneiint sunt ataate n continuarea primerului, la

captul B al acestuia "reamintim c polimerazaadaug nucleotide n direcia @B-B, citindsec!ena int de la B la @B)

2emperatura optim de uncionare a Ta./0polimerazei este de apro5imati! A& FC, acestni!el iind utilizat n ma>oritatea protocoalelorPCR "ubista et al., &''D)

/e asemenea pentru ma>oritateae5perimentelor PCR, durata de '-(@ secunde a

acestei etape asigur e5tensia complet aragmentului de interes, iind necesar un inter!alde timp mai lung n cazul n care lungimeasec!enei int depete 1''' pb


12/71


13/71

.nalizorul !a repeta automat acest proces pentru unnumar stabilit de cicluri "de obicei '-@), la iecareciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ./0

(a randul sau, procesul )lo!al de ampli%icaredesasurat de-a lungul unui numar deinit de cicluripoate i di!izat in aze3- *xponentiala3 la iecare ciclu se dubleazacantitatea de amplicon ./0 "se admite o eicienta de1''G a reactiei)4

- (ineara"pe masura ce componentele reactiei suntconsumate, se produce o incetinire a reactiei iarprodusii PCR incep sa se degradeze4-Platou +end-point)3

reactia este stopata, nu se mai ormeaza alti produside ampliicare, iar daca aza se prelungeste multprodusii PCR !or sueri o degradare importanta


14/71

Metodele PCR traditionale "con!entionale) aula baza o detectie a produsilor PCR in %azade platou a procesului "detectie end-point)

Hn ultimii ani, te*nologia PCR a ostre!olutionata prin dez!oltarea metodelor de

detectie in %aza exponentiala"detectie in timpreal3 real-time PCR)


15/71

%nstrumentele &i componentele necesarereac'iilor PR

/ou mari ino!aii au permis automatizareaprocesului de ampliicare PCR "#omma i%uerci, &''(b)3

introducerea ./0 polimerazelor termosta!ile,care nu sunt inacti!ate la temperaturi ridicate4astel, cantitatea de ./0 polimeraz repartizatiniial poate aciona de-a lungul mai multor cicluri

PCR4 crearea unor blocuri de temperatur a crorni!el termic poate i crescut sau cobor+t rapid, nmod automatizat4 un astel de instrument poart

denumirea de t*ermal cIclersau main PCR


16/71

"a)"b)ig (1 2*ermal cIcler-ul "a) #istmul de bi marine utilizate pentru e5perimentelePCR iniiale "b) 2*ermal cIcler modern ":eriti 8(-Jell 2*ermal CIcler, .ppliedKiosIstems) care permite desurarea automatizat a ampliicriiFig. 4). The ther$alc*cler. (a# The te$perature +aths used for the initial PCR experi$ents. (+# odernther$al c*cler (eriti /4-ell Ther$al C*cler, pplied 1ios*ste$s# that allo2sauto$ati%ation of the PCR process.#urse3 Molecular #tation "&''9b)4 .ppliedKiosIstems "&''9)


17/71

ecvena int 2eoretic, ampliicarea PCR se poate desura

dac e5ist cel puin o copie intact a sec!enei

int "ubista et al., &''D), iind ns necesar unnumr mai mare de copii pentru ca deteciaprodusului de ampliicare s ie posibil

Mrimea acestei sec!ene poate i cuprins ntre',1 "sau c*iar mai puin, n special pentru real-

time PCR) i p+n la c+te!a $ilobaze Cantitatea total de ./0 utilizat n mod

obinuit pentru PCR este de ','@-1' Lg /ei o prob nu trebuie s ie nalt puriicat,

cum se impune n cazul altor aplicaii "e5sec!eniere), eliminarea unor contaminani capoliza*aride, polienoli, lipide, *eparin,agenide c*elatizare ai Mg&=, ormalin sau detergenieste esenial pentru desurarea procesului de

ampliicare

P i ii


18/71

Primerii component oarte important a reaciei PCR

este reprezentat de primeri #ec!ena acestora inlueneaz poziia i lungimea

produsului de ampliicare, temperatura de alipire icantitatea de produs obinut "Hnnis i 7eland, 199(,n #omma i %uerci, &''(b)

Proiectarea necorespunztoare a primerilor

determin obinerea unor cantiti reduse de produssau c*iar lipsa produsului de ampliicare doritlementele importante pentru construiereaprimerilor sunt3 lun)imea$ temperatura de alipire$)radul de omolo)ie cu alte secvene dec/t cea

pe care dorim s o ampli%icm$ )radul decomplementaritate dintre secvenelorprimerilor$ coninutul 01C$ secvenelepolipirimidinice +T, C# sau polipurinice +A, 0#$secvena de la captul &2 +omma 3i 4uerci,

5667!#.

( i i il t i d bi i t 1D i '


19/71

(un)imea primeriloreste cuprins de obicei ntre 1D i 'nucleotide, iar cu c+t aceasta este mai mare alipirea"*ibirdarea) se realizeaz mai greu "temperatura de alipireeste mai ridicat), speciicitatea reaciei crete "cu c+tsec!ena este mai lung cu at+t probabilitatea e5istenei unorsec!ene similare scade), dar se reduce cantitatea de produsacumulat

Temperatura de alipire. reacie PCR necesit utilizareaunor primeri cu temperaturi de alipire "*ibridare) similare

/ac cele doutemperaturi sunt %oarte di%erite,ampli%icarea nu se va des%3ura corespunztor deoareceprimerul cu temperatur de *ibridare mai ridicat se poatealipi nespeciic dac ni!elul de temperatur este optim pentrucellalt primer, iar acesta din urm nu !a rm+ne alipit la

temperatura speciic primului primer, care este prea ridicat 6n practic temperatura de alipire se determin cu a>utorultemperaturii de denaturare "T$) menionate anterior


20/71

Regiunile poli-7 sau poli-C crescprobabilitatea alipirii nespeciice, iar

regiunile poli-2 sau poli-. sunt instabiledin punct de !edere al legturilorcomple5ului primer-sec!en int

Cu toate acestea, trebuie e!itatnlnuirea mai multor baze de acelai el

Hdeal, succesiunea nucleotidelor n cadulsec!enei primerilor trebuie s ie

nt+mpltoare, 01C s reprezinte 869, iartotalul bazelor s ie de apro5imati! &' 6naceast situaie, T$!a i cuprins ntre @Di D& FC


21/71

Concentraia primerilor.ligonucleotidele

sunt utilizate de obicei n concentraii de 1 LM,suiciente pentru ' cicluri de ampliicare Prezena unor concentraii mai mari poate

cauza ampliicarea unor sec!ene nedorite /ac ns concentraia primerilor n mediul de

reacie este redus, eiciena reaciei PCR !ascdea


22/71

AN polimeraza Metoda conceput de Mullis utiliza o ./0

polimeraz termosensi!il, iind necesaradugarea enzimei n mediul de reacie nainteaiecrei etape de e5tensie

Hntroducerea ./0 polimerazelor sta!ile latemperaturi ridicate a uurat mult metodologia

de lucru, adugarea enzimei dup iecare etapde denaturare nemaiiind necesar Prima ./0 polimeraz termostabil utilizat a

ost Ta./0 polimeraza, pro!enit de la

bacteria Ther$us auaticuscare triete niz!oarele termale din NelloOstone 0ational Par$,#E., la temperaturi de apro5imati! 8@ FC "#ai$iet al., 1988, n #omma i %uerci, &''(b)


23/71

/atorit mediului din care pro!ine, Ta./0polimeraza uncioneaz optim la o temperatur deA'-8' FC i este, probabil, cea mai utilizatpolimeraz n aplicaiile PCR

5ist i alte tipuri disponibile "e5 Pfu./0polimeraza, pro!enit de la P*rococcus furiosus) ide asemenea di!erse companii productoare punla dispoziie o multitudine de !ersiuni ale aceleiai

enzime "e5 n cazul Ta./0 polimerazei3 Ta/0. PolImerase i ot#tar Ta/0. PolImerasede la %iagen4 Ma5ima ot #tart Ta/0.PolImerase de la ermentas4 Ta/0. PolImerasenati! i recombinant, Platinum Ta/0.

PolImerase de laHn!itrogen4 .mpli2a< /0.PolImerase i .mpli2a< 7old /0. PolImerase dela .pplied KiosIstems4 7o2a< le5i /0.PolImerase de la Promega), modiicate ioptimizate pentru dierite aplicaii


24/71

Nucleotidele li!ere 0ucleotidele libere reprezint elementele

de baz pentru sinteza ./0-ului Concentraia acestora trebuie s ie

cuprins ntre &' i &'' LM pentru iecare

din cele patru tipuri, n proporiiec*i!alente, pentru a reduce erorile dencorporare n moleculele nou sintetizate"Hnnis et al., 1988, n #omma i %uerci,

&''(b) 0ucelotide nalt puriicate sunt urnizate iutilizate ca stocuri, de obicei n amestec


25/71

oluia tampon 3i ionii de :) /ei nu particip direct la desurarea reaciei de

polimerizare, prezena unei soluii tampon n mediul

de ampliicare este indispensabil, aceasta a!+ndrolul de a asigura un mediu optim, din punct de!edere c*imic, pentru acti!itatea i stabilitatea ./0polimerazei

Compoziia soluiei tampon este optimizat pentruenzima creia i este destinat, cei doi reacti!i iindcomercializai sub orm de pac*et

Cele mai utilizate soluii tampon conin 1' mM 2ris,

p 8,4 @' mM Cl4 1,@-&,@ mM MgCl& .cestor componente li se mai pot aduga i altesubstane, ca P:P, K#. sau glicerol, ad>u!ani ceau rolul de a mbunti modul n care decurgeampliicarea


26/71

Reac'ii PR specializate Nested PCR

En e5periment de tip Qnested PCR presupuneutilizarea unui set de primeri localizat ntre ali doiprimeri perec*e, de-a lungul aceluiai ragment de

./0 "igura (&)

6ntr-o prim reacie se realizeaz ampliicarea cuprimerii e5terni, urmat de ampliicarea cu ceilali doiprimeri "#omma i %uerci, &''(b)

/eoarece ragmentul mai lung, ampliicat n primaetap, este utilizat ca matri n cadrul celei de-a

doua reacii, metoda se caracterizeaz printr-o maresensibilitate i speciicitate "Simmermann et al.,1998, n .ngonesi Krod et al., &''A4 #omma i%uerci, &''(b)


27/71

/etecia genei lectineide la soia utiliz+nd unprotocol nested PCR

ensi!ilitatea cre3te datorit reampli%icrii


28/71

ensi!ilitatea cre3te datorit reampli%icriire)iunii de interes,iar sporirea speciicitii sebazeaz pe probabilitatea e5trem de redus ca

e!entualele ragmente ampliicate nespeciic nprima etap s ie ampliicate nespeciic i ncea de-a doua reacie

. doua reacie poate i considerat o strategie

de conirmare a identitii produsului PCR #ensibilitatea mrit a acestei te*nici este ns

susceptibil potenialelor contaminri care potapare n timpul e5ecutrii protoculului 2rebuiedeci acordat o atenie deosebit acestuiaspect, mai ales n cazul laboratoarelor detestare


29/71

PCR multiplex PCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perec*i de

primeri n cadrul unei reacii, a!+nd ca rezultat obinerea unuisingur amplicon speciic

6n cadrul unei reacii PCR multiple5 sunt utilizate mai multeperec*i de primeri, iind ampliicate simultan mai multe sec!eeint

.cest tip de aplicaie s-a dez!oltat n ultimii ani, mai ales dupintroducerea unor noi tipuri de polimeraze "7ermini et al.,

&''() Prezena mai multor perec*i de primeri n acelai mediu dereacie determin sporirea numrulului de *ibridri nespeciicei construcii primer-dimer, ampliicarea preerenial aragmentelor de ./0 mai scurte ".tlas i KeI, 199(, n #ommai %uerci, &''(b), precum i reducerea limitelor de detecie

"7ermini et al., &''(), c+nd destul de diicil optimizareaprotocoalelor de acest tip Cu toate aceastea, metoda genereaz mult mai mult

inormaie, ntr-un timp mai scurt i cu costuri mai reduse dec+tampliicrile PCR clasice "singleple5) "7ermini et al., &''()


30/71

Perec*ile de primeri trebuie s aib

temperaturi de alipire c+t mai apropiate /e asemenea este necesar ca lungimearagmentelor ampliicate s ie similar,cele mai scurte iind ampliicate

preerenial Etilizarea soluiilor tampon cu aditi!i

speciali reduc de asemenea problemele

generate de prezena unui numr maimare de primeri


31/71

PCR-ul ARNm prin intermediul revers transcriptazei .mpliicarea prin PCR necesita o matrita de ./0

bicatenar

Materialul de start pentru aceasta te*nica este .R0 .cesta trebuie intai con!ertit in ./0 bicatenar .cest rol este indeplinit prin actiunea re!ers

transcriptazei "R2), o enzima izolata din !irusurile .R0 .ceasta enzima copie mai intai .R0-ul monocatenar in

molecula *ibrid .R03./0 si oloseste o ormatiune acde par la sarsitul ./0-ului nou sintetizat, inlocuind .R0-ul original din *ibrid

Catena dubla de ./0 rezultata este numita c./0pentru ./0-ul copiat sau complementar

Ca si alte ./0 polimeraze, re!ers transcriptaza necesitaprimeri Primerii speciici, oli)o dT sau hexamerii aleatori, sunt

adesea olositi ca primeri in sinteza catenei de ./0initiala

Primerii oligo d2 au sec!ente polI2 monocatenare de


32/71

Primerii oligo d2 au sec!ente polI2 monocatenare de18-b-lungime ce !or prima sinteza c./0 doar din.R0-ul mesager cu cozi polI.

Tegarea c./0 !a i mai mare cu primerii oligo d2 si potinclude tot m.R0-ul din specimen Cea mai reusita legare este indeplinita de *e5ameri

aleatori sau decameri

.cesti sunt oligomeri monocatenari in lungime de D-1'b se ataseaza de .R0-ul tinta, cu o anumitarec!enta #ec!entele de D-1'b se !or potri!i cusec!entele din .R0-ul tinta cu o anumita rec!enta

ibridarea aleatorie !a genera c./0 din toate .R0-urile "si ./0) din specimen Pentru toate strategiile de preparare a c./0,

speciicitatea produsului inal este inca determinata de

primerii PCR


33/71

R2 PCR-ul este utilizat pentru


34/71

R2-PCR a ost realizat original in doua etape3c./0 sinteza si PCR

Tth./0 polimeraza are acti!itate mi5t R2 si de./0 polimeraza, etape ale procedurii R2-PCR

Programul de ampliicare este modiicat astel incatsa includa oincu!are initiala de 78-86 )rade Cpentru &6-;6 minutes, timp in care RT, %ace

cAN-ul din ARN .cti!itatea R2 !a i apoi inacti!ata in primul pas aldenaturarii din procedura PCR

/esi R2 PCR-ul este rec!ent olosit si este dea>utor analizelor moleculare, este subiectul!ulnerabilitatii degradarii .R0

.u ost descrise metode pentru ampliicarea R2-PCR a specimenelor de interes ca tesuturileincluse in paraina4 totusi specimenele i5ate sunt

diicil de analizat "1A)


35/71

%ntroducerea analizei realtime PR

Caracterul cantitati! al metodei real-time PCR esteconerit de posibilitatea de a detecta produ3ii deampli%icare odat cu %ormarea 3i acumulareaacestora"ubista et al., &''D4 Jeig*ardt, &''()

#istemul de analiz n timp real olosea tKr pentrudetecia ./0-ului i un t*ermal cIcleradaptat s

iradieze mediul de reacie cu lumin E: i snregistreze luorescena emis de luorocrom 5citaia moleculelor de tKr i nregistrarea

luorescenei se realizau la s+ritul iecrui ciclu deampliicare, dup etapa de e5tensie

:aloarea intensitii luorescente nregistrate inumrul ciclurilor PCR au ost introduse ntr-un graiccare a oerit o imagine a procesului de ampliicare,prezent+nd acumularea produsului de ampliicare n

uncie de timp


36/71

Metodologia real-time PCR utilizat astzi este o mbuntirea te*nicii iniiale create de iguc*i et al.i reprezint cea maiperormant strategie de cuantiicare a acizilor nucleici

"Can$ar et al., &''D4 Miraglia et al., &''(, i .n$lam et al.,&''&, n ngel et al., &''D4 ubista et al., &''D4 Jeig*ardt,&''(4 .larI et al., &''&)

Pe l/n) precizia cuanti%icrii, a crescut 3i capacitatea deanaliz, iar incidena erorilor 3i a rezultatelor %als pozitive

este mult redus +Can


37/71

Real-time PCR este de asemenea cea maiutilizat i mai precis metod de cuantiicare a

coninutului M7 al dieritelor materii prime sauprocesate de origine !egetal destinateconsumului alimentar al oamenilor sauanimalelor "Can$ar et al., &''D4 #R 0 #&1@A'3&''D, ubista at al, &''D4 /eising* iKadrie, &''@)


38/71

Tehnolo)ia real-time PCR prezintanumeroase a!anta>e ata de cea

con!entionala3 - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute"eectuarea detectiei se realizeaza in %aza

precoce a reactiei, respectiv in %aza de crestere exponentiala aampli%icarii, cand se produce o du!lare

exacta a cantitatii de amplicon la %iecareciclu$


39/71

-detectia in acest moment este optima in sensulca rezultatele se coreleaza mai !ine cu

nivelul initial al tintei, comparativ cu tehnicaPCR conventional, unde detectia are loc inaza de platou, dupa ce reactia a ost stopataiar produsii au inceput sa se de)radeze4- domeniu de linearitate mult e5tins "suntnecesare mai putine dilutii ale probelor)4- limita inerioara de detectie mult imbunatatita

"se pot detecta cantitati mai mici ale ./0-uluitinta, a!anta> esential, spre e5emplu, ine!aluarea raspunsului !irusologic sustinut la

pacientii cu *epatita cronica cu !irus C


40/71

Principiul real time PR


41/71

Principiul realtime PR

2e*nica real-time PCR utilizeaz primerispeciici pentru ampliicarea sec!enei int, iar

n tandem cu acetia, constructeoligonucleotidice "sonde#speciale sau alte tipuri

de molecule incluse n mediul de reacie indicacumularea produsului PCR "Kurns et al.,&''()

.stel, de-a lungul mai multor cicluri de

ampliicare, constructele oligonucleotidice caresunt de asemena speciice sec!enei int !ordetermina modi%icarea semni%icativ asemnalului %luorescent"Kurns et al., &''()


42/71

2eoretic, n cadrul ampliicrii, acumulareaproduilor PCR se desoare5ponenial 6n practic ns, reacia nu

atinge niciodat eicien ma5im Maimult, dup '-(' cicluri de ampliicareinter!ine enomenul de plaonare ".*med,

&''&) care aecteaz reaciile n modindependent i dierit "igura (9)


43/71

aca numarul de copii tinta in PCRsunt dispuse pe un )ra%ic in comparatiecu numarul de cicluri, rezultatul ar %i ocur!a exponentiala unde numarul decopii tinta = 5N, N %iind numarul de

cicluri. /aca numarul de copii este masurat prindetectarea luorescenta, curba aratasimilar cu o curba de crestere bacteriana,cu o %aza de la), o %aza exponentiala+lo)#, o %aza liniara si o %aza stationara.


44/71

2rebuie remarcat c n ciclurile iniialesemnalul generat este slab i nu poate i

deosebit de semnalul de ond "bac$groundsignal;luorescence) dat cu acumularea unei cantitai mai mari

de produs semnalul crete semniicati!,ridic+ndu-se deasupra celui de ond "igura@1)

/in acest moment acumularea produsuluide ampliicare este e!ident, put+ndu-seace colectarea datelor pentru analizacantitati!


45/71

tapa de plaonare

aza liniar,semnal de ond

Curbe de ampliicare


46/71

Pentru estimarea eicienei ampliicrii esteutilizat tot curba standard

.ceasta este construit ntr-un graic olosind!alorile CT "obinute prin ampliicare)aerente probelor standard, n uncie delogaritmul concentraiei numrului iniial de

copii ale sec!enei int sau logaritmulactorului de diluie ".pplied KiosIstems,&''1)

Pentru iecare curb standard este calculati ecuaia de regresie asociat, care descrierelaia dintre !ariabilelex"logaritumulconcentraiei sec!enei int) i *"CT)3

dat cu desurarea ampliicrii n cadrul unui


47/71

dat cu desurarea ampliicrii n cadrul unuisistem real-time PCR, semnalul %luorescent dinmediul de reacie este msurat, iar pe !azaacestor date se va realiza o reprezentare )ra%ic a

acumulrii produ3ilor PCR >n %uncie de numrulciclurilor de ampli%icare +?i)ura 85# #cala pentru luorescen poate i normal sau

logaritmic, cea de-a doua acilit+nd distingerea celor

trei aze ale ampliicrii, menionate i n igura @13 %aza iniial, n care intensitatea luorescenei !arizoarte puin, corespunz+nd semnalului de ond4

%aza liniar, n care reacia se desoare5ponenial iar acumularea ampliconilor estee!ident4

stadiul de platou "plaonare), n care rata ampliicriise reduce considerabil

Pragul limit reprezint punctul de ec*i!alen


48/71

Pragul limit reprezint punctul de ec*i!alenpentru toate reaciile incluse ntr-o analiz4

pra)ul limit +de%init de so%t@are# este punctul

>n care semnalul %luorescent dep3e3te de zeceori deviaia standard a mediei intensitiimsurate >ntre al treilea 3i al '8-lea ciclu.

6n acest moment, ntre !aloarea CTi logaritmul

concentraiei moleculei int e5ist o relaie liniar"Kurns et al., &''() 6n practic, alegerea pragului limit este cut de

ctre operator, reprezent+nd unul dintre elementele

subiecti!e al analizei real-time PCR Punctul n care acesta este plasat trebuie alesoarte atent "igura @&b) 6n primul r+nd trebuie sie situat n cadrul azei e5poneniale i deasupra

semnalului de ond


49/71

Pe scal logaritmic, aza de creteree5ponenial apare sub orma unei drepte, ntimp ce pe o scal normal corelaia ntre rata

de acumulare a ampliconilor i alura curbei estemai greu de cut /e asemenea ni!elul de poziionare al pragului

trebuie ales astel nc+t, n acel punct, graicele

probelor s ie liniare i paralele, iar cele alerepetiiilor s coincid c+t mai mult

/up poziionarea pragului limit, sotOare-ul


50/71

/up poziionarea pragului limit, sotOare ulcalculeaz automat !alorile CT Ciclul pragului limit"t*res*old cIcle;CT) reprezint ciclul PCR n caresemnalul luorescent generat prin ampliicareamoleculei int atinge pragul limit deinit de sotOaresau de ctre operator "Kurns et al., &''(4 Rott et al.&''()

Practic, Treprezint o valoare zecimal, ceexprim numrul de cicluri PCR la care cur!a deampli%icare )enerat de modi%icarea intensitiisemnalului %luorescent intersecteaz pra)ul limit"Corbett Researc*, &''(4 :aUtilingom et al., 1999)

Corelaia dintre numrul iniial de copii ale sec!eneiint i !aloarea CTeste urmtoarea3 cu c/tcantitatea iniial de AN int este mai mare, cuat/t produsul PCR se acumuleaz 3i este detectat

mai repede, iar valoarea T este mai mic.


51/71

Hn cazul te*nologiei real-time PCR, ampli%icarease %ace in prezenta unui sistem raportor careemite %luorescenta.

/etectia se realizeaza cu a>utorul sondelor de tip @Bnucleaza-sonde Taq:an,dublu marcate3 la uncapat cu o substanta luoroora "Vreporter dye R)si la celalat capat cu o molecula !locanta

+Bquencher dye 4#. Cat timp sonda este intacta, luorescentasistemului R !a i in*ibata de molecula %

Hn cazul in care ampliicarea este eicienta,moleculele de AN nou %ormate vor %ixa prinhi!ridizare sonda Taq:an$

in cursul etapei de elongatie, AN polimeraza Taqva de)rada sonda prin activitatea sa enzimaticade 82 endonucleaza si va eli!era ast%el

%luoro%orul.


52/71

*ner)ia emisa de %luoro%or in urma excitarii in D


53/71

)va %i inre)istrata la s%arsitul %iecarui ciclu deampli%icare, %iind proportionala cu cantitatea deAN tinta prezenta in tu! pana in momentulrespectiv.

Hnregistrarile sunt olosite pentru generarea uneicur!e de ampli%icare cu & re)iuni3

o re)iune de latenta in care acumularea de ./0 nuatinge inca punctul limita de detectie a semnalului4 o re)iune de ampli%icare exponentialasi o re)iune de platou, in care ampli%icarea sec!entei

tinta inceteazain special datorita epuizarii enzimeisi inhi!itiei prin cantitatea mare de AN.


54/71


55/71

Hn cazul determinarii .R0 !iral *epatita C,procesul se desasoara intr-un mod similar,

dar se adauga si etapa de transcrierein!ersa a .R0-ului tinta pentru a genera./0-ul complementar "./0c)

.ceasta etapa este realizata tot de ./0polimeraza, ceea ce permite ca atattranscrierea in!ersa cat si ampliicarea PCRsa se produca impreuna cu detectia in timp

real a ampliconului

*CD*NEF*R*A AN


56/71

E #ec!enierea const stabilirea compoziiei i ordinii

nucleotidelor care compun i caracterizeaz o gen

.cest aran>ament permite, cunoaterea de e5emplu aamplasrii dieritelor situsuri de restricie a genelor cuscopul manipulrii lor

6n s+rit, traducerea pe calculator a sec!enelornucleotidice n sec!ene de aminoacizi permitee!entual, s se conirme sau s se stabileasc unciaproteinei codat prin gen

5ist mai multe te*nici de sec!eniere a ./0 dar sedescriu ca principiu de sec!enialitate enzimatic prin

ncorporare de didezo5inucleotide

Principiu an)er


57/71

Principiu an)er Materialul de pornire este un produs PCR

puriicat #e utilizeaz o amors de secven

complementar cu >nceputul secvenei ANde determinat

Poate i marcat amorsa n @W cu d.2P cu &P,P, @# prin intermediul 2(polinucleotid$inazei

Marcarea se mai poate ace n timpul reacieide sec!enializare caz n care amorsa nu estemarcat dar se utilizeaz un nucleotid marcat.

Pentru sec!enializare se pot utiliza dou


58/71

e t u sec e a a e se pot ut a douenzime 2A ./0 polimeraza i Taq ANpolimeraza.Principiul de baz este

asemntor pentru ambele enzime TG AN polimeraza .morsa de se!enializare se *ibrideaz prin

complementaritate .mestecul reacional esterepartizat n ( tuburi marcate 7.2C 6n iecaretub se adaug TG AN polimeraza, cele 7

deoxinucleotide +dATP ...# 3i c/te undideoxinucleotid di%erit +ddATP ...#.

2A ./0 polimeraza !a aduga nucleotidele


59/71

gcomplementare de la e5tremitatea W a amorsei i !acontinua de la @W la W "la AXC)

Hn timpul acestei polimerizri vor %i >ncorporateuneori ddNTP >n loc de dNTP. C/nd se >ncorporeazun ddNTP polimeraza nu mai poate continuapolimerizarea.

/idezo5inucleotidele "dd02Ps) sunt dezo5inucleotide

"baze) modiicate capabile de a se integra ntr-un lan de./0 n sintez, care s mpiedice ncorporareanucleotidei urmtoare

Reacia se oprete pentru c dd02P nu posed )rupul

&IJK necesar >n reaciile de polimerizare cu enzime. Reacia se !a opri pentru c+te un dd02P dierit n iecare

tub e o!in >n tu! produ3i de mrime di%erit Reacia de sec!enializare se ace pornind de la lanul

antisens care ser!ete ca matrice


60/71

#e analizeaz, se depun rezultatele reaciilor de


61/71

p sec!enializare pe un )el de poliacrilamid de maridimensiuni >n condiii denaturante +uree sau%ormaldehid#.

iecare tub de reacie ., 7, 2, C, !a i depus ntr-ungodeu dierit /eci ( godeuri pentru o reacie dese!enializare

Migrarea se ace pe gel !ertical ntre &-( ore, uneorimai mult dup lungimea ragmentelor Apoi )elul esteuscat 3i expus pentru autoradio)ra%ie. Pentrueliminarea urmelor de acrilamid nepolimerizat estenecesar o premigrare de 1@-' minute

?ra)mentele mai scurte sunt cele mai apropiatede amors. Citirea se %ace de la %ra)mentele scurtedin partea de Los, ctre cele mai lun)i.

#ensul de citire este al catenei sens


62/71


63/71

ecvenializarea cu Taq polimeraza


64/71

.celai principiu dar enzima olosit este dierit, 2an loc de dou, care poate %i intern sauuna din cele dou utilizate pentru PCR +>n ultimulcaz nu tre!uie s avem !enzi parazite pentruevitarea hi!ridrilor nespeci%ice de amors cu!anda anormal#.

Reacia PCR nu este e5ponenial, PCR iindasimetric #e pornete de la produsul PCR dublu catenar dar

produsul monocatenar de!ine repede ma>oritar

.!anta>e Y e!it structurile secundare ale ./0 de


65/71

sec!enializat Reacia ncepe cu denaturarea la M8C nainte de

*ibridarea amorsei la temperaturi ridicate "('-A'XC) Reacia de sec!enializare se ace ca i pentru PCR,

dar cu o singur amors n '-(' cicluri care constaun denaturare, *ibridare, e5tensie

ste posibil sec!enializarea produilor subclonai n!ectori "plasmide sau agi)

Produsul subclonat !a i sec!enializat dup principiul

anterior .morsa de sec!en utilizat poate i complementar

!ectorului i orientat ctre produsul de sec!enializat

ecvenializarea manual


66/71

#ec!enializarea manual prezint numeroase

incon!eniente3

- riscurile radioacti!itii, necesitatea depunerii probein mai muli timpi &-( ore ceea ce limiteaz locul pegel, necesit depozitarea de noi probe 7elul nupermite depozitarea pentru analize dec+t a &'' pb

Pentru un ragment de ('' pb este necesar a douareacie pentru autoradiograie este necesar ateptarea

re!elaiei n cazul @P (8-A& ore

este necesar citirea !izual a gelului care poate daerori .ceste incon!eniente a cut necesarautomatizarea

En alt mi>loc de migraie n plin dez!oltare este

electrooreza capilar

*lectro%oreza capilar


67/71

2e*nica de sec!enializare este aceeai dar semodiic suportul de migrare al produsului de

sec!enializat .!anta>ul ma>or este creterea considerabil a !itezei

de separaie electrooretic a ragmentului 7elurile sunt ultraine i n c+mp electric intens permit

migraia n &,@ ore pentru circa @'' pb n timp ce pegel clasic necesit (-D ore

#e utilizeaz ie geluri de poliacrilamid cu sau r

Kis, ie geluri cu ali polimeri3 poli!inilalcool,al$ilceluloz 6n plus aceste geluri pot i reutilizate demai multe ori "unii autori au utilizat acelai capilar de19 ori)

Automatizarea secvenialializrii


68/71

2e*nica descris anterior este manual #e poate nlocui marca>ul radioacti! cu cel nereacti!

olosind mar$eri ca rhodamina 3i derivaii si, careemit semnal luorescent "numii luoroori)

#e marc*eaz luorescent ie o amors, ie unprecursor nucleotidic adugat n amestecul reacional

Y polimeraza !a introduce nucleotida luorescent n

reacia de sec!enializare Ta s+ritul reaciei amestecurile din iecare tub suntdepuse n sec!enializator autormat ie n acelaigodeu "dac mar$erul luorescent este dierit pentru

cele ( tuburi, sistemul de detecie recunosc+ndluorescenele dierite), ie n ( godeuri dac mar$eruleste acelai

7elul este acelai ca i la sec!enializare manualopus prii inerioare a gelului se gsesc diode

sensibile la luorescena emis

luorescena emis este nregistrat automat decalculator


69/71

calculator Hn cazul depunerii >ntr-un )odeu rezult semnale

cu lun)imi de und di%erite.

#ec!ena d un aspect de succesiune de picuri deculori dierite, iecare corespunz+nd unei nucleotide

dat nceput reacia, migrarea se poate derula p+na HH-a zi

Citirea se ace imediat pe graic i anomaliile see!ideniaz rapid Rezultatul sec!enializrii poate inregistrat ntr-un iier de calculator i pstat sauar*i!at

#ec!enializatorul automat este oarte scump dat sec!ena cunoscut se pot utiliza programe decalculator pentru compararea sec!enelor, cercetareae5onilor, a situsurilor de restricie i c*iar pentru apreigura structura proteic c+nd s-a sec!enializat o

gen


70/71


71/71

Metodele PCR Utilizate Pentru Determinarile de Biologie Moleculara

Documents

Transcript of Metodele PCR Utilizate Pentru Determinarile de Biologie Moleculara