Definitie

Cultura de celule - metoda de creştere a celulelor animale si umane în condiţii artificiale, in afara actiuniilor sistemice ale organismului

Istoric

• 1907 – Harrison: 1912 – Carrel (primii care au folosit metoda pentru studiul comportamentului celulelor animale in afara variatiilor sistemice si a stresului)

• Metoda la inceput – migrarea celulelor din fragmente de tesut nedezagregat (metoda folosita inca timp de 50 ani)

Alte evenimente importante • 1916 – metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice

• 1940 – introducerea antibioticileor in tehnica de lucru

• 1952 – transplant de nucleu

• 1955 – medii artificiale complexe

• 1964 – celule stem de soarece (pluripotente)

• 1966 – primul factor de crestere (NGF)

• 1970 – aparitia primelor hote cu flux laminar

• 1976 – medii sintetice, fara ser sanguin bovin

• 1980 – dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara

• 1998 – cultura de celule umane stem

• 2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro (in cultura celulara)

• Controlul mediului extracelular

– pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera

– Componente nutritive

– Micromediu (celule-celule, celule-MEC)

• Omogenitatea materialului – Medii selective , clonare

• Economie, scara redusa, mecanizare – Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice

– Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost avantajos

– Dispozitive automatizate

• Modelarea conditiilor in vitro – Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)

• Control permanent al produsului – Manipulare in conditii sterile

– Contaminare chimica

– Contaminare microbiana

• Control permanent al mediului – Sterilitatea spatiului de lucru

– Controlul incubatorului

– Deseuri periculoase, cu risc biologic

• Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de cultura – Materiale de unica folosinta

– Medii scumpe

– Ser fetal de vitel

• Instabilitatea genetica – Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

• Identificarea dificila a celulelor

• Diferente majore intre comportamentul in vivo si in vitro

Tipuri de culturi celulare

• După sistemul de cultură – Celule aderente – Celule în suspensie

• După tipul celulelor din cultură – Celule normale (nediferenţiate, epiteliale, conjunctive) – Celule tumorale

• După sursa celulară – Celule embrionare şi fetale – Celule din ţesuturi adulte (stem sau diferenţiate)

• După modul de iniţiere – Culturi primare – Culturi de linii celulare

• După dimensiunea culturii – Culturi în condiţii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi multicelulare) – Culturi la scară industrială (în bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor tehnici de initiere a culturilor de celule

(Ian Freshney, 2005)

BIOLOGIE CELULARA

Structura celulei eucariote animale

ÎNVELIŞUL CELULAR

• Plasmalema – membrana celulara (componenta de bază a invelişului celular)

• Citoscheletul membranar (pe faţa citoplasmatică a plasmalemei)

• Glicocalixul (pe partea externa a plasmalemei, care vine în contact cu matricea extracelulară)

ÎNVELIŞUL CELULAR

PLASMALEMA

• Plasmalema - 6-8 nm

• structura complexă şi dinamica

• Principiul de organizare a plasmalemei este comun cu cel al membranelor intracelulare

• Singer si Nicolson în 1972 descriu membrana celulară prin modelul mozaicului fluid lipo-proteic

Mozaicul fluid lipo-proteic • Bistrat lipidic în stare de cristal lichid

• Proteine care strabat in intregime sau parţial bistratul lipidic

Compoziţia chimică a membranelor celulare

• Lipide 52%

• Proteine 40%

teaca de mielina - 25%

plasmalema – 50%

membrana interna a mitocondriilor - 75%

• Glucide - aproximativ 8%

Lipide Plasmalema celulei hepatice Plasmalema eritrocitului Teaca de mielina

Fosfolipide 54% 60% 42%

Glicolipide 7% 3% 28%

Colesterol 17% 23% 22%

Alte lipide 22% 13% 8%

FOSFOLIPIDELE MEMBRANARE

• esteri fosforici ai glicerolului

• aprox. 60% din totalul lipidelor membranare

• 2 acizi grasi de 14-24 atomi de carbon, unul nesaturat

• Capul polar al fosfolipidului poate fi – fosfatidilcolină

– fosfatidiletanolamina

– fosfatidilserina

– fosfatidilinozitol

– fosfatidilserină

• Sfingomielina face parte din clasa fosfolipidelor

GLICOLIPIDELE MEMBRANARE

• aprox. 5% din totalul lipidelor membranare;

• sunt localizate doar în stratul extern al plasmalemei;

• capul hidrofil alcătuit dintr-un radical glucidic;

• coada - o molecula de sfingozină legată de un acid gras;

• clasificare: – Glicolipide neutre - gruparea hidrofilă este alcătuită din unul sau mai

multe reziduri glucidice neutre. Cel mai simplu glicolipid – galactocerebrozida – glicolipid neutru

– Glicolipide polare (gangliozidele) – au o structura complexa. Contin mai multe resturi glucidice (galactoza, glucoza, N-acetilgalactozamina) si unul sau mai multe resturi de acid sialic (acid-N-acetilneuraminic, sau NANA), care confera moleculei o incarcatură electrică negativă

STRUCTURA GLICOLIPIDELOR NEUTRE POLARE

COLESTEROLUL

• Moleculă specifică doar membranelor celulare din lumea animală;

• Se găseşte în proporţie de 3-23% din totalul lipidelor membranare;

• Molecula de colesterol este amfipatica, prezentând un segment hidrofil (anionul OH), ataşat la primul inel sterolic in pozitia C3. Restul moleculei de colesterol poartă un caracter hidrofob

• Aranjamentul specific al moleculelor de colesterol în membrana celulară duce la ordonarea şi imobilizarea lipidelor, crescând rigiditatea membranară

Proteinele membranare

• In general, continutul proteic al membranelor celulare reflecta intensitatea functionala a structurii din care fac parte

Clasificare

• proteine integrale (intrinseci) - traversează integral sau partial dublul strat lipidic, stabilind legaturi puternice cu lipidele a)transmembranare – străbat membrana în întregime, au proprietăţi amfifile. Au un mijloc hidrofob si extremităţi hidrofile b)superficiale - strabat partial membrana (se găsesc doar în unul din

straturi). Au un domeniu hidrofil si unul hidrofob

• proteine periferice (extrinseci) - stabilesc legaturi necovalente cu gruparile polare de pe suprafeţele dublului strat lipidic sau cu domeniile extra- si intracelulare ale proteinelor intrinseci. Sunt proteine cu înveliş în totalitate hidrofil

Clasificarea proteinelor membranare după structură

• Proteine globulare -rezulta din plierea lanturilor polipeptidice (în general proteinele intergrate în membrană)

• Proteine fibrilare – lanţuri polipeptidice liniare (localizate pe superfaţă înternă sau externă a membranei, alcătuiesc structura MEC sau fac parte din citoscheletul membranar)

GLICOCALIXUL • GLICOCALIXUL - zona periferica externa a suprafetei celulare

(ÎNVELIŞUL DULCE AL CELULEI);

• Alcătuit din resturile glucidice ale componentelor stratului extern al plasmalemei (glicolipide, glicoproteine);

• Se continuă cu matricea extracelulară (MEC)

• Funcţiile glicocalixului:

- recunoasterea celulara,

- adeziunea intercelulară şi de substrat,

- distributia sarcinilor electrice pe suprafata celulara,

- depozite de calciu ionic

- depozite de factorilor de crestere tisulara sub formă inactivă

CITOSCHELETUL MEMBRANAR

• reţea proteică fibrilară pe faţa internă a plasmalemei;

• alcatuit în cea mai mare parte din filamente de actina si filamente intermediare;

• funcţiile citoscheletului membranar:

– determină forma specifică a celulei;

– este implicat în motilitatea celulară;

– formează specializările plasmalemei polului apical (microvili, stereocili, cili vibratili);

– participă la formarea joncţiunulor celulare

FUNCŢIILE PLASMALEMEI • Transport transmembranar

– pasiv, activ, microtransport, macrotransport

• Controlul fluxului de informaţie – recunoasterea, recepţia si transmiterea moleculelor semnal

• Funcţia enzimatică – cataliza unor reacţii specifice intercelulare

• Formarea conexiunilor intercelulare şi celulă-MEC – joncţiuni adeziune, comunicare, strânse

– ancorarea celulelor la matricea extracelulara prin jonctiuni de adeziune şi contacte focale

Funcţiile plasmalemei sunt asigurate de proteinelele membranare

MACROTRANSPORT Endocitoza, Exocitoza, Transcitoza

SEMNALIZAREA CELULARĂ

Localizarea receptorilor

• Receptori membranari

(proteine membranare)

• Receptori citoplasmatici

(proteine-enzime citoplasmatice)

• Receptori nucleari

(proteine reglatoare de gene)

Receptori membranari

• Sunt proteine transmembranare • Recunosc specific o anumita molecula – ligand

specific • Legatura ligand - receptor se caracterizează printr-o

afinitate mare o concentraţie foarte mica (10-9–10-

11 Mol) a ligandului poate fi detectată de receptor şi poate declanşa fenomenele intracelulare de transmitere a mesajului

• Mecanismele de actiune intacelulare ale receptorilor membranari sunt de tip ionotrop sau chimiotrop

BIOLOGIA CELULELOR IN

CULTURA

Micromediul celular in vitro

(asigura expresia functiei specifice in vitro)

• Substratul de cultura – Solid (material plastic sau sticla),

– Semisolid (gel de agar sau colagen)

– Lichid (pentru cultura in suspensie)

• Contactul cu alte celule – de acelasi tip

– de tip diferit

• Constituientii fizico-chimici si fiziologici ai mediului – Tipul si concentratia constituientilor nutritivi din mediu

– Tipul si concentratia constituientilor moleculari ce regleaza activitatea functionala a celulalor

– Sistemul de cultura (static, dinamic)

• Compozitia fazei gazoase – CO2, O2, N2,, amestec de gaze, imersia completa a celulelor in

mediu lichid, interfata straturilor superficiale cu aerul • Temperatura de incubare

Adeziunea celulara • Diviziunea majoritatii celulelor in cultura depinde de

interactiunea cu suportul de cultura.

• Pentru a se divide, celulele ancoraj-dependente se

aplatizeaza, realizand contact cu suportul de cultura cu o

suprafata cat mai mare (se intind pe suprafata)

• Majoritatea celulelor ancoraj-dependente formeaza

monostraturi confluente

• Celulele ancoraj-dependente pot deveni ancoraj-

independente ca urmare a transformarilor genotipice si

fenotipice

• Celulele nu adera de suport direct, ci prin intermediul

proteinelor sintetizate si eliberate in mediul extracelular

de acestea, depuse pe suport

Molecule de adeziune • Moleculele de adeziune sunt proteine transmembranare

sau proteoglicani. Pot fi clasificate in trei categorii: – Proteine pentru adeziunea de tip celula-celula:

• CAM-proteine Ca-independente

• Cadherine Ca-dependente

– Proteine pentru adeziunea de tip celula-MEC (matrice extracelulara)

• Integrine (ligand ce contine arginina-glicina-asparagina – RGD)

– Proteoglicani (structuri transmembranare care nu interactioneaza cu RGD; pot avea rol si de receptori sau molecule asociate cu receptorii pentru factorii de crestere tisulara)

Matricea extracelulara (MEC)

• MEC umple saptiile intercelulare din tesuturi

• Componentele MEC sunt produse in celula, apoi sunt secretate si depuse pe suprafata acesteia

• Compozitia MEC depinde de tipul celulelor din tesut – (Ex. fibroblastele produc colagen tip I,

condrocitele – colagen tip II, celulele epiteliale – laminina etc)

• Celulele aderate de MEC controleaza compozitia MEC si invers – compozitia matricii influenteaza fenotipul celular

Elementele structurale ale MEC

• Proteine structurale –

colagen

• Proteine de adeziune

– fibronectina,

laminina

• Proteiglicani

(GAG+proteine) -

componenta

polizaharidica cu un

continut crescut de

apa (hidrogel)

Motilitatea celulara in cultura

• Celulele din cultura pot migra pe suprafata

substratului. Migrarea are caracter diferit, in functie

de tipul de celula

• Cele mai mobile celule – fibroblastele in cultura (cu

densitate celulara mica)

– Se stabileste o polaritate de migrare (intr-o

anumita directie) prin extinderea de lamelipode)

– La intalnirea unei alte celule, polaritatea se

inverseaza

– La atingerea unui monostrat confluent se produce

inhibitia de contact (incetarea migrarii si a

diviziunilor celulare)

Motilitatea celulara in cultura

• Mioblastele si celulele endoteliale au aceleasi

caracteristici de motilitate in vvitro, iar la

atingerea monostratului confluent se diferentiaza

• Majoritatea celulelor epiteliale sunt mai putin

mobile, in special la densitate celulara mare

– La o densitate mica, celula epiteliala va migra

pana va intalni o alta celula (nu isi va schimba

polaritatea si se opreste din migrare)

– Se pot aduna in conglomerate, care, uneori,

se pot deplasa organizat, in grup

Diferentierea in vitro Conditiile necesare pentru diferentierea in vitro:

- densitate celulara mare

- interactiuni celula-celula si celula-MEC bine

exprimate

- prezenta factorilor de diferentiere

Daca in cultura se urmareste diferentierea, este

necesara definirea a doua tipuri de conditii – la

inceput pentru proliferare si apoi pentru diferentiere

Caracteristicile de diferentiere se mentin in cultura

pentru mai mult timp daca este creat sitemul de

cultura 3D – geluri de colagen, celuloza, gelatina

Mediile pentru diferentiere sunt medii selective, fara

ser fetal

Dediferentiere

• Dediferentierea este un fenomen specific

culturilor celulare

• Cauze:

– Selectia gresita a liniei progenitoare

– Diviziunea excesiva a celulelor nediferentiete

ale aceleeasi linii progenitoare

– Absenta unor factori reglatori sau aplicarea

incorecta a acestora

– Absenta conexiunilor specifice de tip celula-

MEC

Cai de semnalizare intercelulara

in vivo

Heparan sulfatul(HS) din MEC, solubil sau asociat cu membrana celulara poate

activa, stabiliza sau transloca factorii de semnalizare

Semnalizarea intercelulara

in vitro • Intr-un monostrat celular in vitro se poate

discuta doar de actiuni homocrine si

autocrine

• Evolutia culturilor initiate la densitate mica

de multe ori esueaza, ca urmare a dilutiei

unor factorilori cu actiune paracrina,

• Una din solutii – cultura conditionata (pe

strat de celule doica – feeder layer)

Evolutia celulelor in cultura

• Cultura primara este prima etapa de

evolutie a celulelor in conditii in vitro, care

are loc dupa migrarea celulelor din explant

sau dupa dezagregarea enzimatica a

tesutului

• Dupa cultura primara urmeaza procedeele

de subcultivare si selectie a celulelor care

duc la obtinerea de liniil celulare

Evolutia celulelor in cultura

Evolutia culturilor seriale

Rolul subculturilor

• Permit diviziunea continua a celulelor sensibile la inhibitia de contact

• Permit mentinerea densitatii reduse, cu mentinerea fenotipului normal in culturile cu un risc de transformare spontana crescut, la o densitate mare a celulelor (ex. fibroblastele de soarece)

• Subcultura trebuie realizata la aproximativ 2/3 din panta fazei Log (inainte de a obtine monostratului confluent)

TIPURI DE CELULE

SI

SURSE CELULARE

Celulele implicate în regenerarea tisulară

• Majoritatea celulelor dintr-un ţesut sunt celule diferenţiate, care si-au perdut proprietatea de a se divide

• Toate ţesuturile au o rezervă de celuele incomplet diferenţiate, care în anumite condiţii pot intra in diviziune celulară

• Celulele nediferenţiate, care au proprietatea de a se divide sunt CELULE STEM

• Diviziunea are loc atata timp cât actionează un stimul specific al diviziunii celulare. După încetarea acţiunii acestuia, celulele nou- formate vor intra în procesul ireversibil de diferenţiere.

Celulele Specializate

Celule de tip epitelial

Keratinocite

Hepatocite

Diverse alte epitelii

Celule conjunctive

Fibroblaste

Osteoblaste

Condrocite

Tenocite

Celule endoteliale

mezenchimale

Celulele epiteliale • Asigura functii complexe in organele din care provin:

– secretie – hepatocite, insule pancreatice si epiteliul

ductului pancreatic si multe altele

– transport dirijat – epiteliul renal, intestinal etc;

– schimb de gaze – epiteliul tractului respirator

– rol protector - keratinocite

• In cultura primara, adesea isi pierd functiile specifice

• In cultura primara, sunt dominate de celulele

mezenchimale si eliminate in timp, daca nu se aplica

conditii preferentiale de crestere, specifice

metabolismului celulelor epiteliale - manipulari

nutritionale ale mediului.

Factorii cu actiune diferentiata in cultura

mezenchimala si epiteliala

• Serul fetal are actiune puternic mitogena asupra

componentei mezenchimale si efect inhibitor asupra

celulelor epiteliale

• Mediile pentru celule epitelialle - fara ser fetal, cu factori de

crestere specifici

• Izolarea celulelor cu ajutorul colagenazei, care

disperseaza celulele stromei, pastrand celulele epiteliale in

clastere (le asigura viabilitatea post-izolare)

• Utilizarea substraturilor de cultura (monostraturi

subconfluente de celule doica, inactivate mitotic)

• Medii de cultura cu o concentratie mica de Ca ionic (0,03-

0,06 mM vs. 1,2-1,4 mM)

• Asigurarea unor densitati celulare mai mari la subcultivare

Freshnei I.(2005) Culture of animal cells

Celule mezenchimale

• Celule rol structural

– Celulele tesutului conjunctiv (fibroblaste)

– Celule musculare striate si cardiomiocite

– Celule osoase

• Celule vasculare

– Endotelilale (in cultura se comporta ca celule epiteliale, necesitand medii specifice acestora)

– Celule musculare netede

CELULE STEM

• Se clasifica în funcţie de sursa celulara in:

– Celule stem embrionare şi fetale

– Celule stem adulte, sau celule stem somatice (responsabile pentru creşterea, menţinerea si regenerarea ţesuturilor diferentiate)

• Se clasifica in functie de potentialul de a

genera celule diferentiate in:

– Totipotente

– Pluripotente

– Multipotente

– Oligopotente si unipotente

Tipuri de celule STEM cu potentiale

aplicatii in medicina regenerativa

Celulele Stem

Celule Stem Embrionare

totipotente

pluripotente

Celule Stem Adulte

multipotente pluripotente unipotente

maduva os

tesut adipos

sange

altele

Celule stem pluripotente induse (iPSC

si piPSCs)

2006

Prof Shinya Yamanaka (Kyoto,

Japonia)

Dr. James Thomson (Univ.

Wisconsin, SUA)

Premiu Nobel 2012

John Gordon si Shinya

Yamanaka

– Celulele stem totipotente

• pot forma un organism întreg (ovocitul fertilizat şi celulele formate după primele diviziuni ale zigotului)

– Celulele stem pluripotente

• formează cele 3 foiţe germinative ale embrionului, inclusiv celulele germinale.

• nu pot forma celulele placentei si a cordonul ombelical

• Provin din masa celulară internă a blastocistului

– Celulele stem multipotente

• Pot forma multiple celule (ex. celulele stem mezenchimale -osteoblaste, condrocite, miocite si adipocite

– Celule stem oligopotente

• Pot forma un anumit numar de linii celulare specifice unui tesut (ex. celulele stem neurale pot forma un subset de neuroni cerebrali; celulele stem hematopoietice pot forma subseturile de celule sanguine)

– Celule stem unipotente

• Celule care fortează o singură linie celulară (ex. Spermatogoniile se diferenţiază doar în spermatozoizi)

Proprietatile celulelor stem

Auto-replicare

Diferenţiere in celule specializate

Markeri nucleari:

Oct4

Sox2

Nanog

Markeri de suprafata:

TRA-1-81

TRA-1-60

SSEA-4

SSEA-3

A-Stem/B-Progenitoare/C-Diferentiata

Etape de dezvoltare embrionară, în care

se obtin celulele stem embrionare

Celule stem adulte • Sunt celulele nediferentiate (nespecializate) localizate în

ţesuturile diferenţiate • Au fost descoperite cu aproximativ 50 de ani in urma. În 1961

si 1963 apar primele publicaţii care relatau prezenta a doua tipuri de celule stem în măduva hematopoietică – Celule stem hematopoietice, cele din care iau nastere

elementele figurate ale sangelui – Celule medulare stromale (celule stem mezenchimale), o

populaţie heterogenă de celule precursoare, care se pot diferenţia în celule osoase, cartilaj, adipocite si celulele tesutului conjunctiv al măduvei hematopoietice

• Până în prezent, celule cu proprietati asemanatoare celulelor stem mezenchimale au fost descoperite în toate ţesuturile diferenţiate (cord, ficat, pancreas, creier, pulpa dentara, epiderm etc.)

Plasticitatea celulelor stem adulte

Surse de celule stem adulte, usor

accesibile

– Măduva hematopoietică

– Sângele periferic, după mobilizarea celulelor stem din măduva hematopoietică cu ajutorul tratamentelor cu citokine (G-CSF)

– Placenta şi cordonul ombelical – sursa celulara productiva si uşor de recoltat

– Ţesut adipos obţinut prin liposucţie

Capacitatea funcţională a celulelor

stem mezenchimale umane

• Demonstratii in vitro (culturi de celule)

• In vitro celulele stem mezenchimale pot genera adipocite, condrocite si procese de mineralizare specifice osului

• Primele celule stem mezenchimale au fost izolate de Friedenstein, în 1979, din grasime, prin centrifugarea în gradient de densitate.

• Doar 0,001-0,01% din celulele zolate s-au doveedit a fi cele stem

• După o amplificare prin multiplicare in vitro, au fost obtinute culturi de celule diferenţiate de tipul celor adipoase, condroide şi osteoide

Senescenţa replicativă a celulelor stem

• Celulele stem mezenchimale au o viaţă replicativă mai scurtă decât a celulelor stem embrionare – 50-70 diviziuni celulare

• Senescenţa replicativă este determinată de scurtarea telomerelor - regiunea terminală a cromizomului, alcătuită din terminaţia repetitivă de tipul TTAGGG

• La fiecare diviziune celulară, se pierde o parte din secvenţa repetitivă, din cauză replicării incomplete

• Scurtarea treptată a telomerelor duce la alterarea progresivă a ADN şi implicit la moartea celulară

Aspectul celulelor stem adulte in cultura in vitro

Celule stem

embrionare

vs

Celule stem

pluripotente adulte

PESC (pluripotent embryonic stem cells) vs iPSC (induced pluripotent stem cells)

Oct4

Sox2

Nanog

Lin28

Corp embrioid obtinut

din iPSC

CULTURA PRIMARA

Generalitati • Definitie:

–Cultura celulara initiata cu celule dispersate din tesuturi

• Evenimentele principale:

–Recoltarea tesutului

–Fragmentarea/dezagregarea tesutului

–Repartizarea celulelor in vase de cultura

–Subcultivarea seriala

Enzimele de dezagregare tisulara

• Tripsina

• Colagenaza

• Elastaza

• Pronaza

• Dispaza

• Hialuronidaza

• DNAza - inlatura ADNul eliberat din celulele lezate. Lizatul celular incurajeaza reagregarea

celulara

Conditii specifice in obtinerea culturilor primare

• Inlaturarea grasimii si a fragmentelor de tesut necrozat

• Folosirea unui instrumentar cat mai ascutit pentru minimizarea lezarii

• Enzimele utilizate la dezagregare trebuie inlaturate eficient, prin mai multe centrifugari

• Cultura primara se initiaza cu un numar de celule mult mai mare in comparatie cu subcultura (o parte mica de celule vor adera pe supostul de cultura)

• Sunt folosite medii de cultura mai bogate in constituenti organici (Ham F12) si ser fetal de vitel

• Pentru celule specializate sunt recomandate medii selective

• Tesuturile embrionare se dezagrega mai usor decat tesuturile adulte , iar viabilitatea celulara este mai mare

• Tesuturile recoltate pot fi pastrate in mediu de cultura special (de transport)

Izolarea tesuturilor embrionare animale

• Tesut embrionar de soarece – Cultura fibroblatica nediferentiata, folosita frecvent pentru

obtinerea straturilor doica (feeder) si studii de proliferare (inclusv citotoxicitate)

– Recoltarea se face in ziua 12-13 de gestatie (>50% din perioada gestationala- 19-21 zile) pentru a avea embrioni destul de mari, dar cu un raport mare de celule nediferentiate

• Tesut embrionar de pui – Embrionii sunt mai mari (se recolteaza la 10 zile de

incubare a oualor de pui)

– Celulele embrionare sunt folosite pentru studii de proliferare, straturi doica si suport pentru propagarile virale

– Embrionii recoltati in perioade de gestatie mai mari sunt utilizati pentru obtinerea de celule specializate (hepatocite, cardiomiocite sau celule epiteliale pulmonare

Recoltarea tesuturilor embrionare de soarece

Recoltarea tesuturilor embrionare de pui

Cultura primara prin explant

Cultura prin explant este indicata pentru fragmente tisulare mici, ale caror celule se pot pierde in urma tratamentelor enzimatice

Dezagregare enzimatica la cald • Durata intregului proces 3-4 ore • Pentru evitarea reagregarii

celulare, la suspensiile celulare inainte de centrifugare poate fi adaugata DNAza

• Tehnica este folosita pentru digestia relativ rapida a unor fragmente tisulare mari (embrioni intregi de soarece sau pui)

• Nu este o tehnica potrivita pentru tesuturile adulte. Digestia prelungita pentru dezagregarea tesutului fibros poate afecta celulele epiteliale

Metoda de tripsinizare la rece • Durata intregului proces – aprox. 6-18 ore

• Consta in mentinerea fragmentelor celulare in solutie de tripsina pentru 6-18 ore la temperatura de +4oC (la gheata), urmata de expunerea amestecului la 37oC pentru 20-30 min.

• La rece are loc doar difuzia enzimei in intreaga structura a tesutului, iar digestia propriu-zisa la cald a tesutului are loc in doar 20-40 min

• Avantaj – minimizeaza leziunilor celulare si munca laborioasa

– Supravietuirea diferitor tipuri de celule

• Metoda potrivita pentru fragmente de tesuturi nu foarte mari (organe embrionare)

Dispersia enzimatica utilizand colagenaza

• Colagenaza este utilizata pentru dispersia tesuturilor prea froase sau prea sensibile la tripsina

• Este o metoda frecvent utilizata pentru dezagregarea tumorilor (in general al epiteliilor)

Dezagregare mecanica

Utilizare

Pentru tesuturi moi:

- splina,

-ficat embrionar,

- tesut cerebral,

- tumori moi

SUBCULTURA CELULARA

SI LINII CELULARE

Notiuni generale • Cresterea celulelor din cultura primara duce la epuizarea

substratului si oprirea diviziunilor produsa de “inhibitia de

contact”

• Odata subcultivata (pasaj celular) cultura devine linie

celulara

• O linie celulara contine mai multe tipuri de descendente

celulare, cu fenotip asemanator sau diferit

• Prin selectia unui singur tip de descendenta celulara prin

clonare se obtin o tulpina celulara (susa celulara)

• Linie celulara continua – o linie celulara transformata in vitro

• Tulpina celulara continua (susa celulara continua) – un

anumit tip (fenotip) celular, selectata prin clonare si

caracterizata, necontaminata cu alte tipuri celulare

• Foarte multe linii celulare sunt linii contaminate (contin mai

multe tipuri celulare)

Varsta cultuii celulare

• Numarul de pasaje – numarul subculturilor celulare realizate

• Numarul de generatii – numarul de dublari a populatiei celulare – numar care indica varsta culturii

• Linii celulare limitate (finite) – linii celulare cu durata de viata limitata la un anumit numar de generatii (aproximativ 20-80, in functie de tipul celulelor)

Nomenclatura

• Cod (nume) – ex. Normal Human Brain (NHB)

• Numarul liniei daca din aceeasi sursa au fost selectate mai multe linii – Ex. NHB1, NHB2 etc

• Numarul clonei, daca exista mai multe (NHB1-1, NHB2-1 etc)

• Numarul pasajelor dupa ultima dezghetare NHB1-1/p3

• Laboratorul din care provine (Ex. WI – Wistar Institute, NCI – national cancer institute etc)

Mentinerea de rutina a liniilor celulare

• Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea perioadica a mediului de cultura

• Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor (viteza de multiplicare)

• In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul celular se face la aproximativ fiecare 4-5 zile, iar schimbarea mediului se face la 2-3 zile

• In cazul celulelor cu o crestere lenta pasajul se realizeaza la fiecare 2,3 sau chiar 4 saptammani, iar schimbarea mediului intre perioadele de subcultivarese face saptamanal

Alegerea momentului de schimb al mediului

Ciclul de crestere si

numarul de dilutii

Verificarea de rutina a calitatii liniilor celulare

• Verificarea pH – Majoritatea celulelor isi opresc cresterea la pH 7–6,5 – Majoritatea celulelor isi pierd viabilitatea la pH 6,5-6. – Acidifierea mediului de cultura poate fi urmarita folosind indicatorul pH

din mediu (phenol red), care la acidifiere vireaza de la rosu la portocaliu sau galben

• Determinarea concentratiei celulare (se rasfrange si asupra pH)

• Morfologia celulara. Semne de deteriorare a culturii: – Vacuolizarea – Granulatiile in jurul nucleului – Aspectul sferic

• Adaptarea grosimii stratului de mediu, in functie de consumul de O2 – Culturi consumatoare de O2 – 2 mm – Culturi cu un consum scazut de O2 – 5 mm

Morfologie celulara anormala

Caracterizarea morfologica a celulelor in cultura

• Metoda simpla si des utilizata

• Este relativa si depinde de momentul examinarii, de

localizarea celulelor in cultura (central sau spre periferie)

sau de densitatea celulelor.

• Pentru morfologie se utilizeaza frecvent termenii “tip

fibroblastic” (daca lungimea celulei depaseste de cel

putin 2 ori latimea) si “tip epiteloid” (daca celulele sunt

poligonale, cu dimensiuni uniforme si formeaza grupari

celulare)

• Se recomanda examinarea morfologiei in starea vie a

celulei (nefixata, necolorata) cu ajutorul microscopiei

fotonice prin contrast de faza

• Daca se recurge la coloratie – Giemsa este cel mai des

utilizat colorant

Exemple de morfologie celulara in cultura

Identificarea prin metode de colorare imunocitochimice

Metoda citochimica de identificare cu anticorpi monospecifici

generatori de produsi insolubili sau colorati sau anticorpi

monospecifici cuplati cu fluorocromi. Permite identificarea,

vizualizarea, localizarea si apreciarea cantitativa a unor constituenti

celulari specifici.

• Filamentele intermediare specifice unui anumit tip celular • Keratine – in celulele epiteliale

• Vimentinele – in celulele de origine mesodermica

• Desminele – in celule musculare

• Proteina gliala acida – in astrocite

• Neurofilamentele – in neuroni etc.

• Componente specifice de suprafata • Proteine de legare intercelulara – de tip CAM

• Markeri specifici de suprafata de tip CD • Componente ale metabolismului specific

• Albumina – in hepatocite adulte

• Α feto-proteine (AFP) – in hepatocitele embrionare

• Hormoni – in celule secretoare specifice

Imagini imunocitochimice

Proangiogenic astrocytes. (A) fibronectin (FN, green), PECAM-1 (red), PDGFRα

(blue); lectin (red), integrin α5 or β1 (green) at the sprouting vascular edges of P5

retina. (B and C) Retinal vessels. (B) PECAM-1 (red), PDGFRα (green) . (C) PECAM-

1 staining. (D) PDGFRα (red) and fibronectin (green) in P7 retina.

CRIOCONSERVAREA SI CRIOSTOCAREA

Motivele pentru care se conserva celulele prin inghetare

• Amanarea in timp a modificarilor genotipice • Prelungirea perioadei de utilizare inainte de atingerea

senescentei • Conservarea liniilor valoaroase sau de interes • Amanarea in timp a transformarilor in comportamentul de

crestere a celulelor • Evitarea (reducerea) contaminarii cu microorganisme • Evitarea (reducerea) trans-contaminarii cu alte linii celulare • Minimizarea efectelor de manevrare improprie • Minimalizarea eventualelor deficiente de incubare • Economia de timp si de material • Distributia catre alti utilizatori

Preconditii de inghetare

• Absenta cantaminarii cu microorganisme

• Confirmarea tipului celular prin autentificarea liniei celulare (verificarea caracteristicilor si a provenientei)

Principiul crioconservarii • Pentru mentinerea viabilitatii celulare la maxim in urma

ciclului de inghetare dezghetare, trebuie avute in vedere: – Minimizarea formarii cristalelor de gheata in celula – Evitarea efectelor citotoxice solutiilor concentrate de

criocprotectie

• Crioconservarea cu pastrarea calitatii materialului conservat se obtine prin: – Inghetarea lenta (maxim 1oC/min) – Utilizarea crioprotectantilor care leaga apa – Stocarea la temperaturi foarte joase, pentru evitarea efectului

nociv a solutiilor concentrate de saruri si proteine, sub forma de micelii in gheata

– dezghetarea rapida, pentru evitarea formarii cristalelor de gheata si a gradientilor de concentratie a sarurilor si proteinelor

Concentratia celulelor la criostocate

• O concentratie mai mare la inghetare determina o eficienta mai mare la reluarea culturii dupa dezghetare

• Daca o subcultura normala este initiata cu 1x105 cel/ml, concentratia indicata la inghetare va fi de 1x 107 cel/ml, ca dupa dezghetare si dilutia de 1:20 cu mediu de cultura, sa se obtina o concentartie de insamantare de 5x105 cel/ml – de 5 ori mai mare in comparatie cu cea necesara pentru o subcultivare proaspata

• Prin raportul de 1ml celule dezghetate/20ml mediu, se asigura dilutia crioprotectantului, cu minimizarea efectului sau citotoxic

Crioprotectanti

• Glicerina - devine toxica dupa un an de pastrare

• DMSO (dimetil sulfoxid) in concentratie de 7 – 10 %. Este un produs toxic pentru unele celule. Dupa adaugarea DMSO la suspensia celulara, amestecul trebuie tinut la rece (+4oC)

• Polivinilpirolidona (PVP)

• Polietilenglicolul (PEG)

• Concentratii crescute de ser fetal (40 – 100%)

Viteza de inghetare

• Racirea la +4oC

• Racirea lenta pana la 0oC

• Inghetarea lenta, (1oC/min), pana la -50oC

• Inghetarea rapida (50oC/min) pana la -196oC

Dezghetarea

• Criotubul cu celulele se introduce rapid in baia de apa, la +37oC

• Se diluiaza foarte lent cu mediu, 1/20 (celulele dezghetate sunt sensibile la actiunile mecanice si osmotice)

• Se centrifugheaza imediat dupa dilutie, pentru a minimiza efectul crioprotectantului

• Se determina viabilitatea celulelor. O viabilitate acceptabila pentru reluarea normala a culturii este de > 65%