Culturi de Calus

7/25/2019 Culturi de Calus

http://slidepdf.com/reader/full/culturi-de-calus 1/21

ASPECTE GENERALE PRIVIND OBŢINEREA DE CALUS ŞI SUSPENSII DE CELULE

VEGETALE

Culturile de calus

Calusul este ţesutul vegetal care se formează în mod natural la nivelul suprafeţelor

tăiate sau rănite cicatrizându-le, dar se poate forma şi la baza butaşilor, constituind zona

de geneză a rădăcinilor adventive.

Calusul tânăr este o masă de ţesut care conţine celule nediferenţiate care se divid

activ. Calusul primar este cel care se dezvoltă dintr-un organ al unei plante, iar cel

subdivizat şi repicat reprezintă calusul secundar. Se mai distinge un calus de tip

regenerativ (embriogen care dă naştere întotdeauna la neoplantule, şi unul neregenerativ

(neembriogen, din care se diferenţiază rădăcini şi uneori muguraşi, dar niciodată

neoplantule. !n timp ce calusul regenerativ este dens optic, translucid sau opac, de culoare

albă-lăptoasă, gălbuie sau galbenă - verde, prezentând zone compacte cu celule

nediferenţiate, calusul neregenerativ este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă,

de culoare albă, brunie sau verde, cu o consistenţă mai la"ă, mai friabil, desfăcându-se

uşor în pac#ete de celule. $egiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. %ceste

regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi, dar niciodată plante. &otrivit lui

'%)$S (Cac#iţă-Cosma,*+, cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinutătimp îndelungat, o prezintă calusul regenerativ. ot el a observat că acest tip de calus

tinde să devină neregenerativ/ după producerea acestei reversibilităţi funcţionale,

procesul este definitiv, cele două tipuri de calus, diferite funcţional, nefiind

interconvertibile. 0e altfel, cele două forme de calus necesită #ormoni diferiţi, în doze

variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. 0e

regulă, calusul regenerativ are o creştere mai lentă, spre deosebire de cel neregenerativ.

S-a constatat că se generează mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric

decât din cei crescuţi la lumină, mediul optim pentru formarea calusului embriogen fiind

particular fiecărei specii. Creşterea calusului se consideră a fi nedefinită, el putând fi

înmulţit şi cultivat la infinit, în condiţiile repicării periodice. 0acă subcultivarea nu are

loc în timp util, are loc îmbătrânirea culturii, ea îşi sc#imbă culoarea din gălbui, galben-

verzui ori verde, la cenuşiu sau galben-brun/ uneori calusul poate căpăta o culoare

*



roşiatică sau vişinie datorită formării şi acumulării pigmenţilor antocianici în sucul

vacuolar.

&entru inducerea calusului poate fi utilizat orice organ (rădăcini, frunze, flori, etc.

sau ţesut. !n cazul în care inducerea este dificilă, ori dacă este nevoie de calus 1uvenil, se

folosesc embrioni imaturi, seminţe tinere ori părţi ale acestora (&ieri2, *++.

3tilizarea ţesutului calusal este variată. %supra acestui tip de material biologic se

pot aplica cu succes diferiţi agenţi stresanţi obţinându-se astfel linii rezistente sau

tolerante la condiţii de mediu e"treme. Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de

cercetare în diferite e"perimente de fiziologie, în studiul problemelor de morfogeneză, în

urmărirea unor modificări ultrastructurale, (sub acţiunea unor anumiţi factori,

administraţi e"ogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul, în

analize de ordin bioc#imic, etc. %stfel, calusul poate fi utilizat ca indicator al reacţieicelulei vegetale la o serie de substanţe sau condiţii de cultură permiţând efectuarea unor

e"perienţe de fiziologie privind influenţa unor regulatori de creştere, reacţia la pesticide,

no"e ori ioni grei, respiraţia, morfogeneza, testarea viabilităţii celulare, a biogenezei unor

produşi primari sau secundari de metabolism, cercetări de enzimologie, etc.

4nconvenientul acestui tip de cultură îl constituie instabilitatea genetică a celulelor

calusale care se pot poliploidiza în anumite condiţii (natura şi concentraţia #ormonilor

prezenţi, şocuri e"treme, anaerobioza, având loc modificări sub acţiune a factorilor stresanţi şi a agenţilor mutageni. %cest nea1uns poate fi în sc#imb valorificat în sensul

selectării liniilor cu calităţi speciale. 5a dicotiledonate inducerea calusului este realizată

cu mai multă uşurinţă decât la monocotiledonate sau la gimnosperme.

Sterilizarea materialului biologic şi a incintelor de lucru

) condiţie esenţială în realizarea culturilor de e"plante pe medii aseptice este

aceea a asigurării asepsiei nu numai a recipientelor, a instrumentelor cu care se operează

şi a mediilor de cultură, ci şi a incintei (a bo"ei şi a nişei în care se inoculează, şi

respectiv a materialului vegetal care va servi la prelevarea e"plantelor. Contaminarea cu

microorganisme a recipientelor, a mediilor de cultură şi a materialului biologic se poate

realiza foarte uşor, atât în fazele incipiente, cât şi în momentul inoculării, iar în mod

secundar, în momentul transferului, respectiv al repicării culturilor. !n alte cazuri,

6



infecţiile se pot produce în mod pasiv, din cauza ineficienţei de înc#idere a flacoanelor de

cultură, a lipsei de atenţie în manipularea lor (manevrarea recipientelor nu se efectuează

prin prinderea lor în zona de obturare, ci prinzându-le din porţiunea baza4ă, ori a

dezvoltării întârziate a unor germeni care au stat latenţi în ţesuturile profunde ale

inoculilor.

Sterilizarea încăperilor şi a suprafeţelor

) condiţie esenţială menţinerii unui mediu aseptic este păstrarea unei curăţenii

temeinice în încăperi, dar nu mai puţin importantă este ferirea de praf a recipientelor de

cultură şi a instrumentelor. 7ste recomandabil ca personalul să poarte #alate, bonete şi

încălţăminte sterile, îmbrăcămintea de stradă şi părul constituind surse de infecţii.

o"a sterilă este de dorit a fi montată într-un loc lipsit de pulberi, fum, igrasie,vapori, din cauza faptului că aceşti agenţi obturează filtrele de aer, depreciind calităţile

acestora.

Se recomandă ca, în cursul nopţii, toate încăperile din perimetrul destinat

laboratorului de culturi de ţesuturi, să fie iradiat cu lumină 38. $adiaţiile 38 vor fi

întrerupte cu apro"imativ 9: de minute înainte de începerea operaţiunilor în zona sterilă,

din cauza faptului că ele sunt nocive sănătăţii umane. )zonul acumulat în încăperi în

cursul iradierii cu 38 va fi lăsat să difuzeze pasiv din zonele sterilizate, fără utilizareaventilatoarelor.

o"ele cu flu" laminar de aer steril vor fi puse în funcţiune cu puţin timp înaintea

începerii operaţiunilor de inoculare. !n cazul unor lucrări de mai mare importanţă, această

operaţiune se va efectua c#iar cu 6; de ore înainte de începerea lor, pulverizându-se nişa

sau bo"a sterilă cu alcool etilic ::. (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.

Sterilizarea instrumentelor

!naintea începerii operaţiunilor, instrumentele vor fi introduse în alcool şi

flambate/ apoi vor fi aşezate pe suporturi, pentru a se răci. 0in cauza faptului că este

obligatorie ştergerea periodică a mâinilor cu alcool şi sterilizarea instrumentelor, e"istă

pericolul aprinderii alcoolului, iar de la eventualele picături de alcool arzânde, aprinderea

dopurilor de vată. 0in acest motiv trebuie să se acorde o atenţie deosebită tuturor

9



operaţiunilor. <âna proaspăt ştearsă cu alcool nu se va apropia de flacără/ instrumentele

scoase din alcool vor fi introduse în flacără în poziţie oblică, cu vârful în 1os, evitându-se

astfel scurgerea alcoolului aprins.

Se recomandă utilizarea instrumentelor în scopul dimensionării e"plantelor, abia

după răcire. !n caz contrar, temperatura ridicată a acestora poate traumatiza profund

e"plantul. 4nstrumentele tăioase, după introducere în alcool, se trec prin flacără timp de o

fracţiune de secundă, pentru a nu se deteriora tăişul lor, mai apoi fiind plon1ate într-un

recipient cu apă sterilă. &ensele, scalpele, acele vor fi menţinute în flacără, până la

înroşirea vârfului lor.

Sterilizarea recipientelor de cultură

0eoarece o serie de microorganisme au spori rezistenţi la temperaturi ridicate şi la

diferiţi agenţi dezinfectanţi, se recomandă presterilizarea sticlăriei timp de minimum treiore la *=::C, prin intermediul căldurii uscate (în etuve, prealabil introducerii în

recipiente a mediilor de cultură. 3lterior, recipientele cu medii vor fi resterilizate prin

căldură umedă (autoclavare. 0urata e"puneri sticlăriei la temperaturi ridicate depinde şi

de modul spălării ei, de sterilizarea prin autoclavare prealabil desc#iderii flacoanelor

infectate, precum şi de gradul de infectare a atmosferei din laborator. !n funcţie de

calitatea sticlei, presterilizarea la temperaturi ridicate (*::C, sau peste această valoare,

poate provoca o degradare a calităţii acesteia şi la eliberarea în mediile de cultură decompuşi to"ici.

!n scopul preîntâmpinării infecţiilor, se recomandă o corectă curăţire a sticlăriei

prin menţinerea acesteia (pe o perioadă de minim patru ore în amestec cromic. Capsulele

&etri, pipetele, lamele de microscop se împac#etează în #ârtie, iar pac#etele se aşază în

tăvi metalice sau în coşuri de sârmă, după care se sterilizează în etuvă, timp de *- 6 ore,

la *6::C. ) foarte bună curăţire a recipientelor poate fi asigurată prin intermediul

ultrasunetelor.

uburile şi dopurile din cauciuc, precum şi cele confecţionate din material plastic

termorezistent, se spală bine, se fierb şi se sterilizează prin autoclavare. 0opurile de vată

se recomandă a fi şi ele autoclavate prealabil utilizării lor (deoarece, cu ocazia primei

sterilizări produc o substanţă to"ică, iar dacă ele provin de la flacoane de cultură

infectate, se aruncă, de asemenea şi cele îmbibate accidental cu mediu. 4n general,

;



dopurile de vată pot fi reutilizate, dar nu de prea multe ori. Ca o măsură preventivă, se

recomandă ca dopurile să fie autoclavate şi uscate în etuvă, la temperaturi moderate.

Capacele metalice, folia de aluminiu dimensionată, buşoanele din bac#elită ori de

alt tip, se sterilizează, prealabil folosirii, în etuvă şi prin autoclavare. $ecipientele de

cultură se introduc în autoclav printr-o încăpere situată în afara perimetrului steril, fiind

scoase apoi printr-o a doua uşă, direct în perimetrul steril, ele fiind astfel transportate cu

un risc minim de contaminare cu germeni. %paratele introduse în nişă sau în bo"ă

(stereomicroscop, lampă, etc. se sterilizează prin ştergere periodică, cu alcool ::.

Sterilizarea mediilor de cultură şi a apei

!n cel mai scurt timp de la prepararea mediilor de cultură se va efectua

autoclavarea acestora. !n acest scop, după porţionarea mediilor, recipientele vor fiînc#ise, de preferinţă cu dopuri de vată dense care înc#id bine flaconul. 0acă se

întrebuinţează recipiente care se înc#id cu capace, acestea nu trebuie să asigure

etanşeitate, pentru a permite accesul aburului încălzit în recipientele cu mediu. !n cazul

nerespectării acestei recomandări, sterilizarea mediilor se va produce defectuos, căldura

umedă (aburul fiind cea care distruge germenii. !n cazul recipientelor (înc#ise cu vată

care prezintă o desc#idere mai mare, se recomandă acoperirea gurii flaconului şi cu

#ârtie, fi"ată cu aţă, sfoară sau leucoplast, deoarece acestea rezistă la autoclavare.<anipularea recipientelor sterile se face cu multă prudenţă. 7ste interzisă

prinderea lor în apropierea zonei de obturare, deoarece prin mişcarea capacului ori a

dopului se poate provoca un sc#imb de aer între mediul e"tern şi atmosfera din vas,

facilitându-se astfel accesul germenilor şi instalarea unor infecţii secundare.

Se recomandă autoclavarea mediilor şi a apei distilate la *6* :C (ec#ivalent cu

presiunea de o atmosferă. 0urata menţinerii recipientelor cu medii în autoclav depinde

de volumul de lic#id, respectiv de mediul introdus în flacoane. !n general, autoclavarea

durează *> minute, cea mai uzuală fiind cea de 6: de minute. <ediile de cultură care

conţin ingrediente care sunt termolabile (vitamine, #ormoni, aminoacizi, se recomandă a

fi sterilizate la *6::C, timp de 6: de minute. %cest tip de substanţe se recomandă a fi

adăugate mediului (care a fost în prealabil sterilizat prin autoclavare prin filtrare.

Supraautoclavarea, mediilor de cultură determină alterarea proprietăţilor şi calităţilor

>



acestora, precum şi la deteriorarea raportului ionic, în timp ce subautoclavarea lor duce la

dezvoltarea de colonii de microorganisme care fac ca mediul să devină inutilizabil.

<ediile de cultură lic#ide pot fi sterilizate şi la rece, prin filtrare. !n acest scop, se

recomandă utilizarea filtrelor de sticlă care oferă avanta1ul de a fi refolosite, putându-se

curăţa prin spălare cu acid sulfuric şi lava1 îndelungat, la curent de apă, iar la final, cu apă

bidistilată. &realabil utilizării, nucile filtrante şi vasul de aspiraţie se autoclavează, fiind

înfăşurate în #ârtie sau în folie de aluminiu. Sterilizarea la rece a unor substanţe

termolabile se mai poate realiza şi prin dizolvarea lor în alcool ori în eter etilic, acetonă,

substanţe care se evaporează uşor. Substanţa solidă se va dizolva în apă bidistilată sterilă

şi, în condiţii aseptice se va adăuga mediul de cultură aseptic.

) practică mai puţin utilizată constă în introducerea în mediu a unor substanţe

dezinfectante, ca de e"emplu o"idul de propilen (împiedică dezvoltarea ciupercilor şi a bacteriilor, sulfamidele (au acţiune bacteriostatică, ori antibioticele ca penicilina,

streptomicina sau cloramfenicolul deoarece acestea pot cauza mutaţii, reducându-se şi

organogeneza la nivelul inoculilor şi capacitatea adaptivă a neoplantulelor.

%pa sterilă, de preferinţă bidistilată, se pregăteşte pentru autoclavare fie în vase

7rlenme?er, fie în baloane cu fund plat, sau în borcane înc#ise cu capac. 8asele vor fi

umplute pe trei sferturi. 0opul de vată va fi îmbrăcat, la e"terior, în #ârtie. !ndepărtarea

învelişului de #ârtie se va face în condiţii aseptice, iar anterior turnării apei, se va flambagâtu4 recipientului. 0upă turnarea cantităţii dorite, desc#iderea flaconului se va flamba

din nou, iar dopul de vată (îmbrăcat în tifon va fi trecut de asemenea prin flacără,

urmând ca recipientul să fie acoperit. %ceste operaţiuni se efectuează ori de câte ori se

desc#ide şi se înc#ide un flacon aseptic.

Prepararea mediilor de cultură

7"istă o mare diversitate de medii de cultură care servesc pentru diferite culturi

vegetale. <ediile de cultură sunt fie solide (gelificate, fie lic#ide. &entru asigurarea unui

randament sporit în prepararea mediilor de cultură se folosesc soluţii concentrate, stoc,

separat de@ microelemente, macroelemente, Ae70%, vitamine, aminoacizi şi #ormoni. !n

momentul utilizării, aceste soluţii se diluează la cantităţile recomandate de reţeta utilizată.

Bormonii se folosesc în soluţii stoc pure, nu în amestec. Soluţiile de substanţe organice

vor fi păstrate la frigider, la o temperatură de ;:C, vitaminele în congelator, iar #ormonii

=



în apropierea congelatorului. Soluţiile de #ormoni vor fi împrospătate cel mult la două

săptămâni.

%legerea compoziţiei mediului de cultură se face în raport cu scopul urmărit. !n

literatura de specialitate e"istă foarte multe reţete de medii de cultură, printre cele mai

întrebuinţate fiind următoarele@ <uras#ige - S2oog (*+=6 (<S, Damborg şi colab.

(*+= (>, 5insmaier - S2oog (*+=> (5S, Enop, Beller, 'itsc# şi 'itsc#, 7ri2sson,

etc. (Cac#iţă - Cosma, *+.

!n cazul celor mai multe e"perienţe, autorii acestora combină diferite tipuri de

reţete clasice, alegând macroelementele după indicaţiile unui autor anume,

macroelementele după un alt autor, iar substanţele organice fie după indicaţiile din

literatura de specialitate, fie potrivit cerinţelor proprii speciei, soiului, e"plantului, etc. 'u

se recomandă modificarea cantităţilor din reţetele de soluţii anorganice, deoarece se produc sc#imbări în privinţa proporţiei diferiţilor compuşi, alterându-se ec#ilibrul ionic

fi"at ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilităţii în timp a pB -ului, etc.

!n preparare soluţiilor stoc, trebuie avute în vedere următoarele@

- 0izolvarea substanţelor se va face numai în apă bidistilată.

- Aiecare compus se va dizolva într-o anumită cantitate de apă (proporţională cu

numărul ingredientelor care urmează să fie amestecate şi cu volumul final al soluţiei

stoc, după care soluţiile obţinute (omogene optic se vor amesteca succesiv, în ordineaindicată în reţetar.

- 0acă substanţa se dizolvă greu, amestecul se va încălzi uşor pe baia de apă (dacă

reţeta prevede această indicaţie, agitând uşor/ flaconul poate fi aşezat şi pe un agitator

magnetic, încălzind moderat plita electrică.

- $egulatorii de creştere vor fi solubilizaţi fiecare în parte, potrivit indicaţiilor din

literatura de specialitate

- !ntrucât autorii e"primă în mod diferit concentraţia soluţiilor, se va avea în

vedere calcularea cantităţii de substanţă care trebuie cântărită pentru a asigura

ec#ivalenţa.

- !n prepararea mediului de bază fiecare compus în parte (fie soluţie stoc, fie

ingredient solid, se adaugă eşalonat, într-o anumită cantitate de apă bidistilată, cantitatea

fiind apreciată proporţional cu volumul final al soluţiei.



- !n funcţie de aparatura din dotare, timpul de autoclavare se va ma1ora cu :,* -

:,6 unităţi de pB, ştiind că are loc de regulă scăderea valorii acestuia în timpul sterilizării

- pB-ul mediului se reglează înainte de adăugarea agarului

- agarul se adaugă mediului de cultură după introducerea celorlalte ingrediente.

&entru solubilizarea acestuia, se procedează la topirea lui fie prin introducerea

recipientului cu mediu într-o baie de apă, agitând conţinutul din când în când, fie prin

autoclavarea agarului într-o anumită cantitate de apă (apreciată în funcţie de volumul

final al soluţiei sau împreună cu ingredientele anorganice, după care în bo"a sterilă este

încorporat în restul amestecului de ingrediente organice, sterilizate prin diferite procedee.

<ediul agarizat, cu agarul lic#efiat, se repartizează în recipiente de cultură (omogenizând

tot timpul amestecul şi la nevoie încălzindu-l, pentru a preîntâmpina solidificarea

acestuia. 5a pB prea acid sau la autoclavare incorectă (la temperaturi prea înalte agarulrămâne în stare lic#idă şi mediul de cultură este nefolosibil, ne mai putând fi nici

recondiţionat. (Cac#iţă - Cosma şi &etrescu, *+>

Compoziţia chimică a mediilor de cultură

7"plantele vegetale sunt menţinute în viaţă prin inocularea şi creşterea lor F in

vitroF pe medii aseptice comple"e din punct de vedere al compoziţiei lor c#imice.

Compuşii anorganici din mediile de cultură

Apa

%pa este cel mai important şi răspândit component al materiei vii, pierderea ei din

ţesuturi ducând la pierderea turgescenţei acestora. !n recipientele care conţin culturi F in

vitroF, în urma procesului de transpiraţie, o parte din apă este pierdută în atmosfera din

recipiente iar o alta se eliberează în mediul de cultură prin evaporare. !n camerele de

creştere neclimatizate se observă procesul de condensare a apei pe pereţii recipientelor.

0escreşterea treptată a gradului de umiditate în recipientele de cultură conduce la

concentrarea substanţelor din mediul de cultură, iar, în timp, substratul gelificat crapă.

)dată cu acest proces, are loc şi o dezec#ilibrare a raportului ionic iar culturile pot intra

în senescenţă şi pot muri. !n acest caz este necesară repicarea culturilor pe medii de

cultură proaspete.



$olul apei în viaţa plantelor@

- contribuie la formarea membranelor plasmatice

- participă la ve#icularea substanţelor

- reprezintă mediul pentru desfăşurarea reacţiilor bioc#imice

- participă la reacţiile de o"idoreducere care stau la baza metabolismului vegetal

(scindarea apei în cursul fotosintezei permite eliberarea #idrogenului necesar pentru

reducerea C)6

- este un agent esenţial în creşterea plantelor

- factor de reglare a temperaturii plantelor

- mecanic/ intervine în turgescenţa celulei (oldor şi colab., *+*

%pa de robinet conţine diferiţi compuşi anorganici (ioni grei şi săruri ori organici

(cloroderivate, detergenţi, microorganisme în descompunere, diferite reziduuri, diverşigermeni ori spori sau particule aflate în suspensie, ceea ce o face improprie utilizării în

prepararea mediilor de cultură. 0in aceste considerente, se recomandă prepararea

mediilor doar cu apă bidistilată, deoarece apa distilată (mai ales cea obţinută în

distilatoarele metalice mai conţine şi ioni (de regulă de cupru, care sunt to"ici pentru

celulele vegetale (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.

Sărurile anorganice

Substanţele anorganice sunt introduse în mediile de cultură sub formă de săruri.Cele mai uzuale săruri utilizate în mediile de cultură sunt@ fosfaţii, azotaţii clorurile şi

sulfaţii de@ Ca, E, <g, <n, %l, Ae, <o, Gn, Cu, 'a, etc.

7lementele c#imice folosite în prepararea mediilor de cultură se împart în@

- <acroelemente@ C, ), B, ', E, Ca, &, S, <g, necesare în cantităţi de ordinul milimolilor

(m<@ (' anorganic cca. 6>- ;: m< sau mai mult, &, <g, Ca şi S în doze de *-9 m<,

respectiv 9:: - ;:: mgHl

- <icroelemente (oligoelemente@ Ae, <n, Gn, %l, , Cu, <o, 'a, Co şi 4, administrate în

concentraţii de ordinul micromolilor (mM), respectiv de cca. :,> - :,:* mg/ l. 0eoarece

anionul de clor este bine tolerat de e"plante, cationii - în numeroase reţete - se

administrează sub formă de cloruri.

+



'atura compuşilor c#imici, proporţia şi concentraţia în care diferitele elemente

c#imice intră în alcătuirea mediilor de cultură pot influenţa creşterea şi morfogeneza la

nivelul ţesuturilor inoculate.

&rintre rolurile macroelementelor şi a microelementelor din compoziţia mediilor

de cultură se numără următoarele@

- componenta principală a fosfolipidelor, fosfoproteinelor şi a lecitinei (&

- 4ntră în alcătuirea - acizilor nucleici (&, <g, Cl, , Gn

- coenzimelor (&, S

- enzimelor (Ca, Cl, Cu, Gn, <n

- aminelor (Cl

- vitaminelor (Cl, Co

- #emurilor (Ae - alcaloizilor (Cl (<ilică şi colab., *+

- &articipă în reacţiile de o"idoreducere (Cu, <n, S o"idare (&- rol energetic, E- reglează

o"idarea amoniului sinteză a@

- aminoacizilor (E, Cl

- proteinelor (E,C4, S, Gn

- vitaminelor (Gn, E, S-*, 6,,

- #ormonilor (- clorofilei( Cu, Gn, <n, <o

- vitaminei C în frunze (<o

- fosfolipidelor (<o

- !n procesele de@

- Aosforilare (&, S

- Aotosinteză (&, Ca, <g, C4, E, , Cl, <n, Gn, <o Dlicoliză (&

- $espiraţie (E, S, <g, <n

- $eglare a absorbţiei (', E

- $educere a nitraţilor (E, <n

- !n ciclul Erebs (&

- )rganizarea cromozomilor (Ca

- Creşterea meristemelor şi a vârfului rădăcinilor (Ca

*:



- Auncţionarea normală a mitocondriilor şi a ribozomilor (<g

- Creştere şi dezvoltare (

- Stimularea formării membranei celulare (

- %bsorbţia microelementelor şi a macroelementelor (

- Aormarea nodozităţilor la plante (

- <etabolismul glucidelor (Ca, <g, Cu

- <itoză (Ca

- 'eutralizarea acizilor organici to"ici, de e"emplu acidul o"alic to"ic(Ca

- %ctivarea unor enzime sau comple"e enzimatice (<n (rifu şi ărbat, *++

$aportul dintre Ca şi E contribuie la ec#ilibrul #idric celular. Co măreşte

conţinutul de amidon din tuberculii de cartof, stimulează creşterea membranelor celulare

şi stimulează creşterea plantei, în timp ce4 favorizează creşterea în lungime şi greutate a plantelor (<ilică şi colab.,*+6.

) bună aprovizionarea plantelor cu &, E, <g şi Ca măreşte rezistenţa la ger

(oldor şi colab.,*+*.

Compuşii organici din mediile de cultură

Surse de carbon organic

7"plantele inoculate pe medii aseptice sunt tributare mediului în privinţa sursei decarbon organic, c#iar dacă celulele lor conţin clorofilă. %cest inconvenient se datorează

faptului că ţesuturile crescute Fin vitro" sunt #eterotrofe sau mi"otrofe, pe perioada în

care se află în condiţii artificiale de cultură, pe medii cu adaos de carbon glucidic. 4n

momentul transferării lor în mediul septic şi pe un substrat anorganic, ele redevin

autotrofe.

Glucidele

7ste necesară introducerea în mediul de cultură a carbonului organic sub forma

compuşilor glucidici, deoarece numai glucidele pot fi folosite de către plantele superioare

cu eficienţă energetică ma"imă, ca substrat respirator. &rin degradarea glucidelor, celulele

obţin energia necesară funcţionării, respectiv realizării creşterii şi multiplicării.

!n celulele ţesuturilor verzi cultivate Fin vitroF fotosinteza este slabă. 0e regulă

cloroplastele au capacitatea de a utiliza dio"idul de carbon în sinteza glucidelor, dar

**



cantitatea de glucide realizată în condiţii artificiale este insuficientă pentru susţinerea

proceselor vitale.

5a plante, glucidele constituie şi componenţii structurali de bază ai membranelor

celulare, ai rezervelor nutritive. 7le intră în alcătuirea unor enzime ai acizilor nucleici. !n

mediile de cultură s-au dovedit a fi utile şi indispensabile numai glucoza şi za#aroza.

7"plantele vegetale se dezvoltă cel mai bine în prezenţa za#arozei în concentraţie de 6 - 9

I, dar aceasta poate varia între *,6 - I, în funcţie de natura e"plantului, de specie şi de

scopul urmărit. Creşterea concentraţiei de za#aroză peste pragul de toleranţă duce la

creşterea presiunii osmotice a mediului, fapt care conduce la instalarea plasmolizei şi

moartea ulterioară a celulei. $idicarea concentraţiei de glucide în mediul de cultură are ca

rezultat acumularea amidonului în cloroplaste. &uţine ţesuturi prezintă o creştere

corespunzătoare pe medii cu glucoză.Alcoolii

0oar glicerolul s-a dovedit a fi eficient din punct de vedere energetic,

monoalcoolii (metanol, etanol, propanol, butanol, fiind inutilizabili ca sursă de carbon

anorganic. <etanolul, eritrolul şi glicerolul, adăugaţi mediului cu glucide în concentraţii

scăzute (de :,>I, pot potenţa efectul glucidului/ propanolul şi butanolul s-au dovedit a fi

to"ici, c#iar şi în diluţii minime. Dlicerolul, manitolul şi sorbitolul se utilizează în

prote1area inoculilor în vederea criostocării şi în te#nicile care operează cu protoplaşti.Acizii organici

%ceşti compuşi au o valoare energetică minoră. Creşterea ţesuturilor în prezenţa

acizilor succinic, glutaric, fumaric, malonic, piruvic, etc. a fost de numai *>I în raport cu

cea înregistrată în prezenţa za#arozei, folosită ca sursă de carbon. %cizii fumaric, succinic

şi citric, utilizaţi în concentraţii de *: m<, e"ercită un rol favorabil asupra creşterii.

Surse de azot organic

Jesuturile vegetale cultivate Fin vitroF, ca şi plantele superioare, sunt autotrofe

faţă de azot, preluându-l din substanţe anorganice şi încorporându-l în structuri celulare.

otuşi, s-a constatat că adăugarea în mediul de cultură a unor surse de azot organic@

aminoacizi sau uree, duce în unele cazuri la optimizarea creşterii celulare. S-au dovedit a

fi eficiente ca surse de azot organic unele baze azotate cum ar fi de e"emplu alantoina şi

*6



omitina. 0intre aminoacizi, asparagina, arginina, tirozina şi glutamina e"ercită un efect

favorabil, moderat, asupra creşterii unor culturi. (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.

Vitaminele

0eşi plantele verzi sunt autotrofe faţă de vitamine, în condiţiile cultivării plantelor

pe medii aseptice, s-a constatat că prezenţa lor este indispensabilă multiplicării şi creşterii

celulare.

iamina (vitamina * se recomandă frecvent în prepararea mediilor de cultură.

&rezenţa ei în mediu stimulează creşterea biomasei celulare şi tisulare.

&irido"ina (vitamina = este în general nelipsită din mediul de cultură, fiind

precursorul a o serie de enzime.

$iboflavina (vitamina 6 şi %cidul pantotenic (vitamina = sunt în mai mică

măsură recomandate în reţetele de mediu. Se foloseşte cu mai bune rezultate pantotenatulde calciu.

Cobalamina (vitamina *6 este de asemenea mai rar întrebuinţată.

'icotinamida (vitamina && este nelipsit din mediile de cultură.

iotina (vitamina B are efect stimulator în proliferarea celulelor

%cidul ascorbic (vitamina C este recomandat ca agent antio"idant a produşilor

melaminici (eliminaţi în mediul de cultură de către e"plante, au acţiune nocivă asupra

inoculilor.%cidul folic se pare că prezintă o acţiune stimulatoare în creşterea ţesuturilor

tumorale, menţinute la lumină (la întuneric poate deveni to"ică, efect datorat

descompunerii sale în acid paraaminobenzoic (& - %%, cunoscut ca factor de creştere

pentru microorganisme.

8itaminele liposolubile 7 şi 0 se folosesc în mai mică măsură.

Soluţiile stoc de vitamine se păstrează în congelator, proporţionate în flacoane

mici, din material plastic, ele fiind decongelate în momentul folosirii. (Cac#iţă - Cosma şi

Sand, 6:::.

Regulatorii de creştere

Aito#ormonii (regulatorii de creştere 1oacă un rol primordial în multiplicarea,

creşterea, diferenţierea e"plantelor cultivate Fin vitroF, indiferent de tipul acestora.

iogeneza fito#ormonilor este localizată în alte organe decât în cele FţintăF. !n funcţie de

*9



natura lor, sinteza fito#ormonilor este localizată în diferite zone ale plantelor, ei putând fi

păstraţi un timp la locul de origine (sub formă activă sau inactivă sau pot migra în

diferite organe ale plantelor, acumulându-se în celule sau ţesuturi.

A Au!inele

&rincipalele au"ine sunt@

- acidul indolilacetic (%4%

- acidul indolilbutiric (%l

- acidul indolilpropionic (%l&

- acidul naftilacetic (%'%

- acidul nafto"iacetic (%')%

- acidul 6,; diclor-feno"i-acetic (6,; - 0

- acidul paraclorofeno"iacetic (pcp% , etc.%u"inele au rol fiziologic multiplu@

- in#ibă creşterea mugurilor laterali

- acţionează în alungirea celulelor

- măresc permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi anumiţi ioni

- influenţează sintezele proteice acţionând asupra sintezei de %$' ribozomal

- stimulează diviziunea celulară şi fotosinteza (oldor şi colab., *+*

- influenţează sinteza de etilenă (care la rândul ei acţionează în stabilirea nivelului deau"ină şi transportarea acesteia prin corpul plantelor

- in#ibă formarea embrionilor în suspensiile celulare (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::

" Citochininele

Citoc#ininele constituie un grup de substanţe cu efect în inducerea diviziunilor

celulare. Cele mai utilizate citoc#inine sunt@

# benziladenina (%

# 6- izopentil adenozina (6 i&

# zeatina (G

# c#inetina (E

$egulatorii de creştere din grupa citoc#ininelor îndeplinesc următoarele roluri@

- Stimulează sinteza proteică

- %cţionează asupra diviziunii celulei vegetale

*;



- &rote1ează metaboliţii de acţiunea enzimelor #idrolizante

C Giberelinele

Aito#ormonii din această clasă se folosesc în mai mică măsură. 3n reprezentant al

clasei este D%9, care e"ercită o acţiune specifică asupra alungirii meristemelor apicale,

care în absenţa D%9 prezintă o creştere globulară. 0eoarece giberelinele in#ibă

dediferenţierea celulelor, ele se folosesc în mediile de cultură numai în cazul în care

e"plantul posedă meristeme în structura sa. 7le sunt termolabile şi se sterilizează numai

prin filtrare.

$ Acidul abscisic %A"A&

%cest fito#ormon e"ercită o influenţă in#ibitoare asupra creşterii şi dezvoltării,

fiind implicat în procesele de latenţă la muguri şi la seminţe. 0e asemenea, el in#ibăsinteza acizilor nucleici, grăbeşte îmbătrânirea ţesuturilor (pierderea turgescenţei,

degradarea clorofilelor, accentuarea sintezei carotenilor, căderea frunzelor şi a fructelor

(oldor şi colab., *+*. !n culturile de ţesuturi şi celule se foloseşte în mai mică măsură.

!n ultimul timp este utilizat în culturile de embrioni somatici pentru inducerea intrării

acestora în repaus şi în procese de conservare Fin vitroF. (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::

' 'tilena

%cest regulator de creştere se utilizează mai puţin în culturile de ţesuturi şi celule,datorită noutăţii acceptării acesteia ca fito#ormon, a faptului că efectele fiziologice ale ei

sunt multiple şi incomplet cunoscute. 7a îndeplineşte următoarele funcţii@

- 7"ercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor, precum şi

asupra inducerii senescenţei ţesuturilor

- 4nduce senescenţa ţesuturilor

- 7ste implicată în transportul au"inei

0in cauza stării gazoase în care se află, ea difuzează în recipientele de cultură

fiind imposibil de sterilizat prin autoclavare.

Compuşii fenolici

%cţiunea acestor compuşi c#imici este antagonică celei e"ercitate de substanţele

de creştere, ei oprind acest proces şi provocând c#iar necroza celulelor. 5a e"plantele

cultivate Fin vitroF, compuşii fenolici sunt desorbiţi în mediul de cultură de către celulele

*>



traumatizate (sau c#iar de către cele aflate în profunzimea ţesuturilor inoculate. reptat,

fenolii se o"idează, se brunifică şi, ca o consecinţă se brunifică şi mediul de cultură.

Aenolii o"idaţi sunt to"ici pentru celulele din cultură, aceasta necrozându-se şi provocând

moartea inoculului.

Agenţii gelificanţi

&entru obţinerea de medii solidificate, agarul este cel mai comun agent

solidificator. %garul este un poliza#arid e"tras din algele roşii. Se comercializează sub

diferite forme@ fibre, solzi, pulbere. calitatea cea mai bună este 0ifco 'obel acto-%gar.

!n condiţiile folosirii gelatinei ca agent solidificant, creşterea ţesuturilor vegetale

este frânată, aceasta datorându-se unei aerări insuficiente, a îngreunării sc#imburilor

ionice, a frânării absorbţiei substanţelor din substratul de cultură. Cu rezultate bune se

folosesc biogelurile, silicagelurile, gelurile de poliacrilamidă.Compuşii speciali

!n te#nicile de culturi de celule ori de protoplaşti se folosesc, pentru o anumită

perioadă de timp, o serie de enzime (celulaze, pectinaze, #emicelulaza, sau alţi compuşi

cu utilizare mai de durată (sorbitolul, manitolul, polietilenglicolul, etc., care, introduse în

mediul de cultură, produc liza pereţilor celulari în scopul obţinerii de protoplaşti.

Cărbunele activ (de lemn se recomandă a fi adăugat mai ales mediilor de cultură utilizate

în scopul cultivării Fin vitro

F a e"plantelor de conifere, în concentraţie de 6I (0avid şicolab., *++ după Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.

(niţierea culturilor ) in vitro )

&entru obţinerea culturilor de e"plante trebuie avute în vedere câteva etape

operaţionale, şi anume@

*. înfiinţarea unei culturi aseptice

6. incubarea şi creşterea diri1ată a cormofitoinoculilor

9. subcultivarea (repicarea culturii

;. conservarea culturii

>. transferarea Fex vitroF a vitroplantulelor şi aclimatizarea acestora la regimul de viaţă

septic.

*=



) cultură de e"plante este considerată ca fiind reuşită atunci când inoculul creşte,

se multiplică şi poate fi sub cultivat. Cultura trebuie să se menţină în timp şi să poată fi

direcţionate procesele de morfogeneză, de organogeneză sau de embriogeneză, potrivit

dorinţei operatorului (Cac#iţă - Cosma şi Sand, 6:::.

*nfiinţarea unei culturi aseptice

Asepsizarea materialului +egetal destinat prele+ării de e!plante

Selectarea metodei de asepsizare şi a substanţelor care servesc acestui scop se

realizează în funcţie de calitatea materialului vegetal, estimările bazându-se pe e"ecutarea

unor e"perienţe de tatonare. &roblemele se ridică la nivelul rădăcinilor sau al organelor

subterane (purtătoare de germeni. &e de altă parte, mugurii şi tulpinile, respectiv

ramurile cu lenticele, dar şi organele cu pilozitate ridicată, prezintă inconvenientul

aderării sporilor şi a germeni lor la nivelul formaţiunilor epidermale, sau în rugozităţilede pe suprafaţa organelor iar în momentul introducerii lor în lic#idul dezinfectant, între

suprafaţa epidermei şi soluţie se interpune un strat de aer care împiedică accesibilitatea

dezinfectantului la epidermă. &entru a înlătura acest inconvenient, în soluţia asepsizantă

se pot adăuga câteva picături de Keen 6: sau :. 0ezinfectantul selectat trebuie să fie

suficient de puternic pentru a distruge microorganismele de la suprafaţa organelor, fără a

pătrunde în profunzimea acestora, putând fi în acelaşi timp uşor îndepărtat de pe

materialul biologic prin simple spă4ări repetate cu apă distilată, sterilă.&entru a îndepărta o parte din germenii aderenţi la suprafaţa materialului vegetal,

sau pentru a induce germinarea sporilor, adeseori se indică spălarea prealabilă de durată a

fragmentelor, ori păstrarea materialului vegetal (introdus în săculeţe de tifon amplasate

sub robinet, un timp, sub 1et de apă, sau clătirea acestuia în detergenţi dezinfectanţi

(0omestos materialul biologic fiind apoi trecut prin dezinfectanţii clasici. 7"istă însă şi

cazuri în care agenţii patogeni sunt localizaţi în profunzimea organelor, caz în care se

recomandă efectuarea unui e"amen fitopatologic, în prealabil e"plantării. 3n dezinfectant

frecvent utilizat, cu acţiune rapidă, este alcoolul etilic (în concentraţii de ::, +=: sau

c#iar alcoolul absolut. 0atorită acţiunii coagulante e"ercitată asupra proteinelor şi a celei

liposolubilizante, unele tipuri de organe sau de fragmente vor fi plon1ate în alcool doar 9:

- =: de secunde, fiind apoi introduse în apă sterilă.

*



!n mod obişnuit, pentru asepsizarea materialului biologic se utilizează soluţii

diluate de hipoclorit de calciu sau de natriu în concentraţii variabile. 0e regulă, se

introduc în dezinfectant fragmente mult mai mari decât viitorul e"plant, pentru a prote1a

celulele inoculului de necrozele provocate de agentul sterilizant. %deseori, seminţele se

sterilizează fie prin imersie în alcool etilic absolut, fie în soluţie de clorură mercurică.

%stfel, la gerbera, această substanţă a fost utilizată cu succes în concentraţie de :.* I sub

* min. (%ntofie şi %ntofie, *++.

%lte substanţe dezinfectante care se utilizează cu rezultate bune sunt@ clorura de

var (de uz sanitar, cloramina, mai rar formolul, permanganatul de potasiu, etc. (Cac#iţă-

Cosma şi Sand, 6:::.

(nocularea)peraţiunea de introducere a inoculului, respectiv a e"plantului sau a unei

porţiuni dintr-o cultură aseptică, pe medii de cultură sterile constituie procedura de

inoculare. )peraţiunea se e"ecută numai în spaţii aseptice special amena1ate, unde piesa

cea mai importantă o constituie bo"a sau #ota cu flu" laminar de aer steril. Se porneşte

ventilatorul #otei astfel încât după apro"imativ *> minute să se poată începe prelevarea şi

inocularea. Alacoanele se flambează înainte de desc#idere, iar instrumentele se

sterilizează prin introducere în alcool şi flambare. 7ste indicat să se lucreze, pe cât posibil, în profunzimea #otei şi să nu se scoată mâinile în afara mesei de lucru, pentru a

se evita contaminarea perimetrului steril cu diferiţi agenţi patogeni din zona nesterilă.

0ezinfectarea mâinilor şi a mesei de lucru se face des, prin ştergere cu un tampon îmbibat

în alcool :I. &entru a reduce factorul de risc, materialul vegetativ asepsizat se

repartizează în capsule &etri de capacitate mică şi, pe măsură ce se epuizează materialul

dintr-o capsulă, desc#idem alta.

0upă dimensionare, se ia cu fineţe e"plantul, cu vârful braţelor pensei (flambată

şi răcită în prealabil şi se inoculează astfel încât să se respecte polaritatea, înfigându-l cu

polul radicular în mediul de cultură şi orientându-l cu polul caulinar în afara mediului.

0acă acest lucru nu este posibil, e"plantul va fi orientat orizontal sau uşor oblic, în

poziţie plagiotropă pe suprafaţa mediului, adâncindu-l uşor în acesta. lnoculii

meristematici este de dorit să fie amplasaţi cu suprafaţa secţionată în contact cu mediul de

*



cultură. !n cazul culturilor de celule, ori al utilizării mediilor lic#ide, inoculul se depune

printr-o uşoară lovire a vârfului instrumentului de inoculare în porţiunea de desc#idere a

vasului de cultură, e"plantul căzând în mediu. !n cazul culturilor solide sau semisolide,

inoculii trebuie afundaţi uşor în substrat.

!n timpul inoculării eprubeta sau sticla cu mediu solid se recomandă a fi ţinută

orizontal în scopul reducerii semnificative a numărului de infecţii. Seminţele, ca şi

meristemele, se inoculează de preferinţă pe suprafaţa mediului şi nu în profunzimea

acestuia, pentru a preveni apariţia deficitului de o"igen. (&ieri2, *++.

(ncubarea şi creşterea diri,ată a inoculilor

0upă inoculare, flacoanele sunt trecute în camera de creştere (de vegetaţie şi sunt

menţinute într-un regim climatizat. Camera de creştere este destinată păstrării în condiţii

optime a cormofitoinoculilor, în vederea asigurării dezvoltării acestora. Alacoanele cucormofitoinoculi trebuie e"puse la lumină, pe eta1ere metalice iluminate în regim

prestabilit, reglabil, preferabil automatizat. !ncepe acum perioada de incubare şi de

creştere a culturilor, perioadă variabilă ca durată, în funcţie de@

- tipul culturilor

- specie

- natura e"plantelor

- condiţiile din camera de creştere!n această perioadă se urmăreşte - în primul rând - apariţia infecţiilor. )dată

constatat acest fapt, recipientele de cultură infectate trebuie eliminate.

0e regulă, în apro"imativ una sau două săptămâni de la inoculare, la inoculii

proveniţi de la plante ierboase se observă de1a manifestarea proceselor regenerative. 5a

inoculii proveniţi de la plantele lemnoase, procesele de proliferare sunt mult mai lente.

3neori, la scurt timp de la inoculare, mediul de cultură se brunifică, fapt vizibil,

evident, dacă în substratul de cultură nu s-a introdus cărbune activ. !n acest caz se

recomandă transferarea plantulelor pe medii proaspete, caz în care vor demara procesele

regenerative. $ecipientele infectate nu vor fi desc#ise decât după sterilizarea lor prin

autoclavare. &e mediile solide infecţiile pot să apară la suprafaţa mediului, mai aproape

sau mai departe de e"plante, sub forma unor mucegaiuri ori sub forma unor colonii

bacteriene (colorate galben - verzui, roşu ori negru care -în unele cazuri - pot lic#efia pe

*+



alocuri mediile agarizate. 4nfecţiile bacteriene pot învălui inoculul, iar mediul aflat în

imediata vecinătate a acestuia, privit prin transparenţă, prezintă (în 1urul ţesutului

infectat un aspect opalescent. %lteori, în mediile solide, infecţiile apar în profunzimea

acestora, având o formă lenticulară, ovală sau sferică, dovadă a faptului că mediul a fost

sterilizat necorespunzător, sub temperatura de *6::C. !n cazul mediilor lic#ide,

sterilizarea incorectă a acestora cauzează o mărire e"agerată a turbidităţii lor, aspect care

apare la câteva zile după autoclavarea acestora. <ediile infectate în etapa de

preinoculare, nu sunt indicate a fi folosite printr-o reautoclavare, deoarece în ele se

produc sc#imbări de pB şi modificări în ceea ce priveşte calitatea substanţelor organice.

!n mediile lic#ide, infecţiile se propagă mult mai repede decât în culturile efectuate pe

medii solide. 5a culturile lic#ide se va avea în vedere posibilitatea ca turbiditatea să fie o

consecinţă a precipitării unor săruri din cauza preparării incorecte a mediilor. (Cac#iţă -Cosma şi Sand, 6:::.

Subculti+area inoculilor

&entru păstrarea vitalităţii unei culturi, se impune operarea de subculturi şi în

cazul culturilor de celule, precum şi ori de câte ori se semnalează apariţia în culturi a unor

perturbaţii alarmante, de natură variată@ spumare, turbiditate e"agerată - cauzată de o

rapidă multiplicare a celulelor aflate în cultură - o sc#imbare a culorii suspensiilor

celulare (ca un semn de necrozare a celulelor, ele devenind cenuşii sau brune, etc. )cultură de celule este îmbătrânită după cca. trei săptămâni de la iniţierea ei, în funcţie de

specie, de provenienţă şi de condiţiile de cultură. &entru subcultivare sunt necesari doar

câţiva cm9 de mediu din cultura vec#e ce vor fi inoculaţi în cca. *:: - 6>: cm 9 de mediu

proaspăt.

0acă, însă, se doreşte formarea de calus din culturi de celule, la subcultură, câţiva

cm9 de mediu sunt dispersaţi şi etalaţi pe o placă subţire de mediu agarizat, te#nică ce

permite izolarea de linii celulare.

Subcultivarea poate fi necesară din mai multe motive@

- <ediul nutritiv s-a epuizat (fenomene de deficienţă

- <ediul nutritiv s-a uscat (rezultând concentraţii mari de săruri şi de glucide

- 0atorită creşterii, s-a umplut flaconul sau eprubeta

- <aterialul este necesar propagării ulterioare

6:



- %pariţia coloraţiei brune şi H sau negre a agarului (ţesuturile vegetale elimină uneori în

primele săptămâni substanţe to"ice care difuzează în mediul de cultură

- 7ste nevoie să se ofere materialului izolat un nou tipar de creştere şi dezvoltare pe un

mediu de cultură cunoscut, mediul s-a lic#efiat datorită scăderii pB-ului (&ieri2, *++

Culturi de Calus

Documents

Transcript of Culturi de Calus