CAPITOLUL II

2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO

Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu (temperatură, lumină, compoziţia mediului de cultură, pH, umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o anumită direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari (micropropagarea).

Tehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui număr de probleme:

-menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ; -permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură

organizată (meristem, vârf de creştere sau mugure);-inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus

pentru formarea de organe sau embrioni somatici;-inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor explante formate

din celule diferenţiate (fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.) rezultând o nouă organizare tisulară;

-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.

Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. Aceste substanţe par a determina orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice.

2.1.1 Regulatorii de creştere

Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. Numeroase lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu le-au putut identifica decât mult mai târziu. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa auxinelor, în jurul anului 1934, giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu, în anii ’50. Aceste trei tipuri de regulatori de creştere exercită o acţiune stimulativă asupra metabolismului celular. Există şi substanţe cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice identificate câţiva ani mai târziu. De asemenea, etilena,

165

un compus gazos, a fost recunoscută ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor.

Aceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. Există şi fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali, prezentând o acţiune fiziologică similară. Toate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de creştere şi au anumite caracteristice comune:

-acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt toxice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide;

-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de balanţa hormonală stabilită între ei;

-intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel încât noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonată.

O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi suficient de repede, pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor practice.

2.1.1.1 Auxinele

Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae. Numele de auxine provine din grecescul auxein – a creşte, determinând elongarea celulelor (auxesis – creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule).

Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut sub numele de acid β- indolil acetic (Fig.1).

Fig.1 Acidul β- indolil aceticA. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor

166

Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că:

-exercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii plasticităţii peretelui celular şi penetrării apei în celulă. Apoi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime;

-modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de H+, determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o absorbţie de ioni de K+;

-influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal (ribozomii participă la sinteza proteinelor);

-stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat insuccesele din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus;

-acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb în reglarea nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare;

-acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular asupra fenomenelor de dominanţă apicală;

-determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor;-au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor

ornamentale destinate comerţului de flori tăiate;Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a

auxinei deoarece concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de concentraţia celorlalţi fitoregulatori.

Modul de acţiune al auxinelor. Nu se poate da un răspuns precis, dar cercetările în domeniu au evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei ipoteze au rezultat următoarele concluzii:

-în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon;

-în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii.

Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se poate extinde ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.

B. Auxinele în plante

167

Toate plantele sintetizează auxine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere.

Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele tinere, dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce înseamnă că auxinele sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. Astfel, auxinele sunt prezente într-o concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea şi elongarea celulelor.

C. Auxinele sintetice

De când au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora, care au generat în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirmă existenţa receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxin-enzimelor , vor putea avea un efect prelungit în plante.

Printre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt:-acidul.indolil butiric (AIB);-acidul naftalen acetic (ANA – Fig.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic

(ANOA) şi naftilacetilamida (NAD);-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).

Fig.2 Acidul naftalen α-acetic

În practică, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.

În aplicaţiile agricole, compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în urma tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea

168

fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic.

Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează.

2.1.1.2 Giberelinele

Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate. Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă (Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Extractul apos din ciupercă a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenţei unei substanţe responsabile de aceste efecte.

Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în 1939 şi numit „giberelina A”). Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci de gibereline. Aceştia sunt toţi compuşi endogeni. În practică, giberelinele folosite sunt extracte purificate.

Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau GA7. Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având în vedere că primele gibereline sintetice au fost obţinute prin anii ’80.

Fig.3 Acidul giberelic

Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate şi poziţia substituenţilor în nucleu.

A. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor

169

Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline.

Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt:-acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate

spectaculoase (ex: s-au obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3, în general varietăţile pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acţionează şi asupra pedunculilor florali, împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate (ex: la viţele de vie cu ciorchini denşi, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe);

-în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa acestora, prezintă un aspect globular;

-stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit că la seminţele de orz, acumularea α-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea amidonului în zaharuri solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau după asocierea cu un receptor. Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa auxinelor, şi sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;

-acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori, astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute (morcov). La alte specii, ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire, prezenţa giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fără formarea florilor (sfeclă). Aceste contradicţii în aparenţă au o explicaţie simplă: în plantele prezentate mai sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii, pe când în celălalt caz asupra procesului de înflorire. Astfel, giberelinele, îşi exercită doar rolul de stimulatori ai elongaţiei neinfluenţând, în acest caz, procesele fiziologice normale;

-acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun;

-exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor dorminzi, atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest lucru, inducând şi ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea;

-în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. Par a se opune fenomenului de dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă asupra meristemelor apicale sau axilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora.

170

B. Giberelinele în plante

Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. Unele gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe (acizii giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află şi acţionează mai multe tipuri de gibereline.

Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii foliari şi florali, în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni.

Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori zaharurilor, eliberându-se în situsurile ţintă.

2.1.1.3 Citochininele

Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire. Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de natură purinică, care nu a putut fi iniţial identificat. Aceste rezultate au dat posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor şi în 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o substanţă activă numită „chinetina”.

Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni:

-zeatina (Fig.4)-izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –

Fig.4) (6-furfurilaminopurina) şi benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).

a) b)Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina

Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu zaharuri.

171

A. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor

Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care:

-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. În acest proces citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fără acţiunea auxinelor, cele două complementându-se reciproc. Auxinele favorizează duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;

-au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă antagonice rizogenezei;

-exercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza proteinelor, prin rolul ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii de acţiunea enzimelor hidrolitice. Acest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic;

-exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară;

Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. Proprietăţile citochininelor permit rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dediferenţiere.

B. Citochininele în plante

Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb, de unde şi numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina (IPA), descoperită puţin mai târziu în plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conţin citochinine sintetizate în special în rădăcini şi în embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor endogene localizate în aceste organe.

Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se presupune ca ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca în cazul aplicaţiilor pe frunze.

172

2.1.1.4 Etilena

Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Etilena se află în plante în cantităţi infime şi poate fi produsă de toate părţile acesteia.

Fig.5 Etilena

Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt:-determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind

folosită la început pentru coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş;

-accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se urmăreşte recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini;

-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosită în horticultură;

-modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii transportului auxinelor;

-are acţiune favorabilă asupra tuberizării.Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea

Bromeliaceaelor, corelaţii de creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea). Acţiunea antagonică a etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza, concentraţia şi circulaţia lor.

Aplicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut progrese doar după descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetrează ţesuturile, unde se eliberează etilena.

Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare se sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.

2.1.1.5 Inhibitori ai creşterii

Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele endogene enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.

173

A. Inhibitorii fenolici

Inhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. Ei intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin încetinirea creşterii acestora urmată de stoparea totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi mecanismul lor în inducerea stării de latenţă.

În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură, unde se oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea în unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau adsorbanţi pentru a detoxifia mediul.

Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.

B. Acidul abscisic

Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele. Acest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante (lipsa apei, rănire, căldură excesivă). Existenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. Încetinirea activităţii plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.

Fig.6 Acidul abscisic

Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici. Astfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt:-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor;-determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu,

ceea ce poate influenţa închiderea stomatelor;

174

-acţionează asupra înfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în condiţii perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parţial (Chenopodium rubrum), sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). În cazul în care plantele de zi scurtă sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora. Aplicat asupra plantelor de zi lungă, acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt supuse unor condiţii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaţii pot conduce la supoziţia că nopţile lungi favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este prea simplă pentru explicarea modului diferit de acţiune a acidului abscisic.

Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile folosite şi de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat.

Concluzii

Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora, dar prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică. Variaţia continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea momentului de recoltare a explantului.

Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai importante sunt auxinele şi citochininele.

Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante, determinând evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. Astfel, după Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi:

-dacă raportul auxine – citochinine este mare, se induce rizogeneza;-dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, explantele tind spre o

funcţionare caulogenică;-dacă raportul este apropiat de unitate, explantele au tendinţa să genereze

formaţiuni calusare.Această schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă există

variaţii în funcţie de tipul de explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. Pe lângă aceşti fitoregulatori principali există şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar în cele mai multe cazuri aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.

175

2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un individ întreg similar plantei donor. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”, indică faptul că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi, proprietate ce este tot mai mult exploatată în culturile in vitro.

Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se folosească în practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul acestora va creşte.

Este mai uşor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil să reacţioneze în condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. Micropropagarea face posibilă obţinerea de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică atunci când explantul este supus anumitor condiţii.

Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea evoluţiei fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plantă atunci când este detaşat de planta mamă.

2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante

În contextul reproducerii sexuate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul de viaţă al unei plante se împarte în patru stadii principale.

A. Embriogeneza

Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. Oul astfel format este protejat de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o masă sferică (faza globulară a embrionului), apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare (faza cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se dezvoltă structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula şi radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu începe diferenţierea celulară. Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări programate şi mai mult datorită unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în anumite condiţii se vor comporta similar unor celule gametice, dând naştere unor organe sau embrioni, de această dată somatici.

În momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se presupune că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar

176

şi cu mediul de cultură, determină un schimb de semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule.

În contextul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a două cauze: pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi echipament informaţional genetic), în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă parte, datorită poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. Aceste structuri filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice programul informaţional spre un anumit tip de celulă.

Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt depozitate în albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea embrionului în starea de latenţă. Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din mediul înconjurător.

B. Stadiul vegetativ

Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează şi din embrion ia naştere o nouă plantă. De creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular, ce determină creşterea părţii subterane a plantei.

Meristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte externă, epiderma de două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. Într-o secţiune transversală se poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă, înconjurată de un inel de celule aflate în diviziune activă, celule responsabile de creşterea tulpinii. Diviziunea începe de la inelul iniţial: zona epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior în parenchim cortical şi vase conducătoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul caulinar are o funcţionare ritmică programată genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii) şi, în al doilea rând, în forma frunzelor. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi clasificarea plantelor se bazează aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentată mai sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar celei privitoare la meristeme.

La început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei, primele frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de frunze juvenile. Planta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură, rădăcinile transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. În schimb, rădăcinile primesc de la frunze substanţe

177

nutritive bogate în glucozide, vitamine şi de asemenea în regulatori de creştere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei.

Fig.7 Meristem apical

Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore, tufiş, tulpini întortochiate sau împrăştiate, etc). Această arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. În contrast frunzele îşi menţin forma.

Fig.8 Meristem radicular

178

Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii despre întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de moştenirea genetică.

Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. În ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. Această succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului înconjurător, este determinată de stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu (temperatură, lumină, secetă, umiditate, etc). Plantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene ale plantelor ierboase se usucă. Atunci când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă de obicei de temperaturile scăzute) reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene.

C. Stadiul reproductiv

Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar. Inelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. Diferenţierile încep la margini unde se formează staminele şi părţile fertile ale plantei: staminele şi pistilul. Florile angiospermelor sunt considerate lăstari modificaţi constituite dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele şi pistilul).

Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de diferenţiere sunt similare. Instalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă, în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.

Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice (temperatură, lumină, umiditate), caz în care planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul reproductiv. La unele specii, existenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate duce la împiedicarea înfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani (Saintpaulia, cerenţel-Geum urbanum, căpşun, etc). Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să înflorească, plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale.

179

Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt concludente, ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita câteva modele de culturi in vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi proporţia fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.

D. Stadiul de senescenţă

Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod normal, schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. La speciile perene, această etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante, ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor să intervină cel puţin la începutul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena, alături de alţii).

Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. Astfel, interacţiunile pe distanţă scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor vegetative şi regenerative. Alt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor să recunoască mediul înconjurător şi variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea să se adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce răspunde la acel stimul. În cursul deplasării lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat, nu doar starea prezentă a mediului înconjurător al celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. Datorită acestui fapt, la recoltarea unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă, precum şi de mărimea şi natura fragmentului excizat.

2.2.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă

În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la condiţiile culturii in vitro. În general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante, potenţialul de adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta plantei mamă.

180

În cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură dacă se află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet. Această tehnică prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea (potenţialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu excepţia cazului strict de autogamie). Pe de altă parte, această tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. În unele cazuri, de încrucişare interspecifică sau intergenerică, când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul, această tehnică permite creşterea şi dezvoltarea normală a acestor embrioni.

Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obţinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din explante bătrâne. În unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută.

După germinarea în stadiul juvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi este sursa multor succese în domeniu. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor, potenţialul de cultură in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene, şi în mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnică a lemnului nu este măsurabilă, cu excepţia arborilor adulţi. În acest stadiu, totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii doar din butaşi nu mai este posibilă, deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică ridicată.

Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole:

-una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. În acest caz lăstarii par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi eucalipt). La aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil, probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor;

-a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a coniferelor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. Altoiul creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire.

La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă ce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea observată este deseori obţinută din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în funcţie de specie.

181

Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule. Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure.

Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro.

Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar rezultatele sunt în general slabe sau incomplete.

2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului

Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate distinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.

De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara organele cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor, giberelinelor şi citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul că explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu.

De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de auxină este maximă.

La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern în vederea stimulării rizogenezei.

182

2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor

După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul de organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri:

1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, apexurilor caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dacă mediul de cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantului şi conduce la dediferenţierea celulelor, generând calus.

Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii.

Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această „memorie” aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.

2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze, flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică.

Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar, în acest caz, diferenţele între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile să regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane.

În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar şi tulpini tinere.

2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora

Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât explantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al

183

acestuia este mai determinant şi mediul de cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece explantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii de creştere existenţi.

Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni foarte mici, există o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub această mărime supravieţuirea explantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor.

Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare a materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri de rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol, pe când în cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii endogeni.

Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim medular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. Parenchimul medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi citochinine.

Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.

Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ

Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului.

184

Deseori se poate observa, după fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură, fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant şi mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).

Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de natura sa, în direcţia dorită de operator.

2.3.1 Explante cu structură rudimentară

Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul

de cultură a fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică.

După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui dezechilibru între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea calusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutăşire). Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).

A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea şi dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină (de la 1 la 10mg/l). Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu acid giberelic în concentraţie mică. În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor, mediu adiţionat în general cu auxine.

185

Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate.

2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut

Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini) sau generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).

Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere, adică sa se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. Acest tip de reversie este mai uşor de obţinut la celulele vegetale şi mai greu la cele animale.

Observaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în procesul dediferenţierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se măreşte, citoplasma devine mai densă. După realizarea acestor modificări celulele încep să se dividă, stadiu denumit histogeneză, uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a auxinelor. În al doilea stadiu, numit organogeneză, citoplasma celulară devine şi mai densă, cu vacuole mici şi nucleu voluminos. Celulele păstrează capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o masă meristematică ce se va dezvolta într-un nou individ.

Observând un explant în cultură se observă formarea, mai întâi, a unei formaţiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să se dediferenţieze.

Dacă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică, nu se mai formează calus şi deci tot explantul moare. Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă, de exemplu la Begonia rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor glandulari. În general celulele ţintă, adică celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, în special cele provenite din tunică, dar pot avea şi alte origini. Aceste celule se vor organiza într-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantulă întreagă cu tulpini şi rădăcini, cum este cazul la Begonia şi Saintpaulia.

La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observă în primul stadiu formarea de calus (calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, şi doar în al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelaşi mediu de cultură sau pe alt mediu, se dezvoltă meristemul ce va da naştere noii plantule. Când se formează meristemul prezintă, în funcţie de specie, acelaşi mod de a se dezvolta ca şi explantele organizate, doar că se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltării complete până la stadiul de plantulă.

186

Al doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogeneză somatică. Acest fenomen, descris pentru prima dată la celule de morcov, a fost descoperit la mai multe specii, atât anuale cât şi perene.

Ca o trăsătură generală, inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de compoziţia mediului de cultură, dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare. În multe cazuri embriogeneza somatică, este precedată de formarea de calus, în acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv (Fig 9).

În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul globular, apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un embrion capabil să genereze o plantulă (Fig 10).

Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de cultură. Primul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor.

Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări are loc diluţia fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor.

Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus

Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de explante este nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. În funcţie de răspuns, aceste explante prezintă unele dezavantaje la nivel genetic.

În primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există probabilitatea ca celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.

187

Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular, b) în stadiul cordiform, c) generând o plantulă

În al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz în care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta modificări la nivel genetic (modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificări citoplasmatice). Această variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a fost chiar folosită pentru inducerea de mutanţi, prin stimularea formării calusului pe medii adecvate fitohormonal şi chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creşterea probabilităţii mutaţiilor. După fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat că printre plantulele neoformate unele prezentau modificări morfologice evidente mai ales citoplasmatice. În consecinţă, de fiecare dată când propagarea unei specii necesită trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calităţii genetice a plantelor obţinute.

Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetările asupra culturilor ce au pornit de la explante diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere, a căror echilibru în mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să funcţioneze într-un ritm ales de operator, ţinând cont de echilibrul endogenic. Nu se ştie nici în prezent care este modalitatea de a determina exact concentraţia şi balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori exogeni, dar pe de altă parte, aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul dorit. Aceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor aplicaţii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a început să fie tot mai mult folosit.

188

a b c

CAPITOLUL IV

4.1 CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE

4.1.1 Mediul de cultură

Explantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au nevoie de condiţii speciale de cultură, să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie totală) şi să aibă ca sursă de hrană o soluţie nutritivă complexă, formată din apă, săruri minerale, substanţe organice şi fitohormoni. Pentru menţinerea explantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfixiate, mediul de cultură se solidifică cu un agent de solidificare. Soluţia nutritivă complexă lichidă sau solidă se numeşte mediu de cultură sau substrat de cultură. Acest mediu de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie complexă deoarece explantul nu are capacitate de a se hrăni autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza substanţelor existente în mediu. În funcţie de scopul urmărit, evoluţia explantului poate fi dirijată prin modificarea compoziţiei mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei.

Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de dezvoltare, cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit, momentul de prelevare şi zona din care s-a prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi. În prezent se cunosc şi se utilizează o serie de medii de cultură ce poartă numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul 4.1).

Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât şi prin studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi desorbţia, schimbul ionic care există între plantă şi mediul înconjurător. În prezent se cunosc destul de bine modificările pe care le suferă plantele când elementele chimice sunt în exces sau în deficit. Trebuie evitate pe cât posibil aceste stări de stres pentru plante atât la cultura în câmp, cât mai ales la culturile in vitro.

4.1.1.1 Compoziţia chimică

A. Compuşii anorganici şi rolul lor

ApaApa reprezintă componentul esenţial al vieţii, al materiei vii. Este

utilizată în tot „fluxul tehnologic” de producere a plantelor in vitro, de la spălarea materialului vegetal şi a vaselor de cultură, până la utilizarea ei ca

189

solvent pentru celelalte componente şi elemente de diluţie până la concentraţia dorită. Pierderea apei din ţesuturi provoacă perturbări metabolice direct proporţionale cu cantitatea de apă pierdută. Stresul hidric este suportat de plante dacă este de scurtă durată şi dacă nu se atinge nivelul de veştejire. În această ultimă fază plantele sunt capabile de rehidratarea ţesuturilor puse în condiţii favorabile de umiditate, dacă deficitul de apă se menţine plantele mor.

La culturile in vitro există momente când explantele pot să-şi piardă turgescenţa prin pierderea apei, momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită, pentru asigurarea succesului culturii.

Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere, deoarece soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni. Trebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiilor utilizate în funcţie de starea de vegetaţie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoză. Prelevarea explantelor trebuie făcută repede, altfel datorită dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraţie, prin rănile care sunt mari comparativ cu mărimea lui. Manipulările sub hotă trebuie făcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidratează relativ uşor explantele care stau descoperite.

Pe timpul creşterii explantelor în camera de creştere, vasele trebuie să fie închise pentru a evita pierderea apei prin transpiraţie, ce ar determina concentrarea mediului în elemente nutritive, ar provoca crăparea mediului şi ca atare slaba creştere a culturilor. Pentru respectarea strictă a concentraţiilor soluţiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilată, deci eliberată de ionii minerali pe care îi conţine. La spălarea materialului vegetal după sterilizare se foloseşte apă sterilă, sterilizare ce se face în autoclav odată cu sterilizarea mediului sau separat.

Sărurile anorganice Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri. Cele

mai utilizate sunt: azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni, utilizarea uneia sau alteia din săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie. În funcţie de cantitatea de elemente ce se foloseşte în mediu, elementele se împart în:

-macroelemente - utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor – C, O, H, N, K, Ca, P, S, Mg;

-microelemente sau oligoelemente, utilizate în concentraţii de micromoli.

190

Tabelul 4.1Principalele medii de cultură utilizate în culturi

in vitro (după Street, 1977)Constituenţi Heller White Nitsch Murashige

SkoogGamborg

Macroelemente mg/lKCl 750 65 - - -

NaNO3 600 - - - -MgSO4 x 7H2O 250 720 185 370 250NaH2PO4 x H2O 125 16,5 - - 150CaCl2 x 2H2O 75 - - 440 150

CaCl2 - - 166 - -KNO3 - 80 950 1900 2500

Na2SO4 - 200 - - -(NH4)2SO4 - - - - 134NH4NO3 - - 720 1650 -KH2PO4 - - 68 170 -

Ca(NO3)2 x 4H2O

- 300 - - -

MicroelementeFeSO4 x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8Na2EDTA x

2H2O- - 37,3 37,3 -

MnSO4 x H2O - - - - 10,0MnSO4 x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -

KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75NiCl2 x 6H2O 0,03 - - - -CoCl2 x 6H2O - - - 0,025 0,025ZnSO4 x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0CuSO4 x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025

H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0FeCl3 x 6H2O 1,0 - - - -Na2MoO4 x

2H2O- - 0,25 0,25 0,25

AlCl3 0,03 - - - -Fe(SO4)3 - 2,5 - - -

Constituenţi organiciInozitol - - 100 100 100

Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0Piridoxină HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0Tiamină HCl - 0,01 0,5 0,1 10

Glicină - 3,0 2 2,0 -Acid folic - - 0,5 - -

Biotină - - 0,05 - -Zaharoză - 2% 2% 3% 2%

Diferenţele ce există între diferite reţete de mediu, constau în raportul dintre diferiţi ioni. Rolul fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte în mediu, de concentraţia lui, de natura explantului. În prezent se cunosc principalele reţete utilizate pentru speciile cultivate care se pretează la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat încă, trebuie făcute tatonări

191

pentru găsirea celei mai adecvate compoziţii pentru mediu. Carenţele pentru elementele minerale in vitro se manifestă după 2-3 subculturi, deci târziu, când nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. De exemplu N are rol important în embriogeneza somatică, în funcţie de forma lui nitrică sau amoniacală influenţează vitrificarea. Carenţa de N duce la acumulări de antociani în vacuolele celulelor, iar dacă aceasta persistă provoacă dereglări în metabolismul glucidelor şi proteinelor.

Potasiul influenţează creşterea ţesuturilor, carenţa determină o dezvoltare slabă. Împreună cu calciul, reglează permeabilitatea membranelor celulare, a fluidităţii protoplasmei, intervine în schimbul ionic la nivelul membranelor.

Magneziul întră în compoziţia clorofilei, carenţa provocând dereglări grave în structura frunzei.

Microelementele exercită roluri metabolice şi fiziologice diferite de cele ale macroelementelor. Intră în compoziţia multor combinaţii organo-metalice complexe, cu valoare biologică ridicată de tipul enzimelor, care controlează întreg procesul metabolic al plantelor.

B. Compuşii organici

Sursele de carbon Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă, în special în

primele faze ale existenţei, până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare plantulă sau lăstar. Datorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus care să asigure carbonul organic necesar în metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanţele cele mai utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă energetică. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% în funcţie de faza de vegetaţie şi tipul de explant folosit. Dintre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor culturilor in vitro.

AminoaciziiSunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule

şi ţesuturi, faşă de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaugă în mediu sub formă de compuşi simpli sau complecşi. Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina etc.

VitaminelePlantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor,

dar nu şi ţesuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi plantulele răspund favorabil la adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la

192

temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavării, dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil asupra culturii.

Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt:-tiamina (vitamina B1, aneurina), se foloseşte în concentraţii cuprinse

între 0,1-10 mg/l; stimulează creşterea vegetativă, sporirea biomasei produsă in vitro;

-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, catalizând reacţii de baza în metabolismul aminoacizilor;

-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistentă la temperaturi ridicate (280oC); inhibitor al creşterii rădăcinilor, rol în metabolismul celular;

-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puţin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,5-2,5 mg/l;

-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosită, stimulează sinteza nucleoproteidelor;

-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234-237oC); rol în metabolismul intermediar;

-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor;

-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină; la întuneric are efect toxic;

-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei;

-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge în bună parte; este activator general al metabolismului celular;

-vitamina E (tocoferolul), măreşte sensibilitatea celulelor la auxine;-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan),

100-1000 mg/l; este considerat atât vitamină cât şi glucid; stimulează diviziunea celulară.

FitoregulatoriiFitohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt

substanţe organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de creştere şi dezvoltare. Există fitohormoni endogeni, sintetizaţi de plante şi fitohormoni exogeni sau de sinteză.

Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au nevoie, fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună creştere a explantelor. Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele, citochininele şi giberelinele.

Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de citochinine. Auxina naturală descoperită este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce şi prin sinteză pe cale industrială. Cele mai folosite auxine de sinteză sunt:

193

-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic); ANOA (acidul beta naftoxiacetic).

Acţiunea auxinelor este foarte complexă datorită intreacţiunii pe care o are cu alte substanţe regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi redat astfel:

-stimulează diviziunea celulară;- influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui

celular;-modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni;-rol important în dominanţa apicală;-inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare;Auxinele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri, frunze,

fructele tinere şi bobocii florilor de unde circulă în toată planta. Cel mai mult se folosesc ANA şi 2,4D care sunt mai stabile, nu se oxidează în prezenţa luminii. 2,4D este mult utilizată pentru inducerea şi creşterea calusului şi pentru rizogeneză. La calus asigură friabilitate mare uşurând separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza somatică.

Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe, seminţe, etc., iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic.

Prima citochinină izolată a fost chinetina, experimentată cu succes la culturile in vitro. La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). În prezent se folosesc pentru culturile de ţesuturi patru citochinine dintre care două naturale (2 IP şi zeatină) şi doua de sinteză (chinetina şi BAP).

Efectul fiziologic al citochininelor constă în:-acţionează asupra diviziunii celulare alături de auxine;-stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus;-stimulează formarea lăstarilor laterali;-stimulează sinteza proteică;-inhibă formarea rădăcinilor.Biosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni, iar

migrarea este dependentă de cea a glucidelor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor autoclavarea.

Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra celulei, cu rol în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării. Cea mai utilizată giberelină este acidul giberelic (GA3) fiind şi cea mai activă.

Acţiunea fiziologică este următoarea:-produce alungirea internodiilor tulpinilor;-stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor.Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere, în mugurii

activi, în embrioni şi vârful rădăcinilor, circulând în plante prin vasele liberiene. Pentru meristeme giberelina este indispensabilă în vederea alungirii lor. La alte

194

tipuri de explante nu se recomandă giberelina deoarece inhibă dediferenţierea celulară.

Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în culturile in vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel:

-exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor;-induce senescenţa ţesuturilor;-are rol în transportul auxinei;-se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite;-inhibă extensia celulară.Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi

seminţelor. Poate fi utilizat pentru:-inducerea latenţei embrionilor somatici;-inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o

perioadă mai lungă;-inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării;-are rol antagonist cu auxinele şi giberelinele.Agenţii de solidificareSubstratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau

solid, utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele caracteristici:

-formează cu apa un gel care se topeşte la 100oC şi se solidifică la 45 oC, rămânând solid în condiţii normale de cultură;

-nu este toxic pentru plante şi nu este asimilat de plante;-nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în

mediul de cultură, faţă de reţeta de mediu folosită;-nu reacţionează cu constituenţii mediului.Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de

consistenţa dorită, între 0,5-1%.Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc:-agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru

cultura protoplaştilor şi în prepararea gelului pentru electroforeză; -acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor

celulare şi pentru încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale;

-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se foloseşte în concentraţii de 1,5-2,0 % şi se gelifica la 27-31oC. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un pH mai acid, asigurând solidificarea mediului şi în aceste condiţii.

195

C. Alte substanţe utilizate

Adenina are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor adventivi, stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare. Se pare că are o acţiune sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. De regulă se foloseşte sub formă de sulfat de adenină, în doză de 40-80 mg/l.

Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea, creşterea lăstarilor şi a ratei de multiplicare. Are o acţiune sinergică cu a auxinelor, în special cu AIA. După unii autori are rol în prevenirea degradării auxinelor. Dintre compuşii fenolici cel mai utilizat este fluoroglucinolul şi procaina.

Floroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi arborilor, se găseşte în seva brută, mai ales la măr.

Procaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor, stimulează creşterea biomasei explantelor, a conţinutului în pigmenţi, stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea plantelor. Dozele utilizate sunt cuprinse între 0,1-10 mg/l.

Substanţele antioxidante se utilizează pentru prevenirea brunificărilor explantelor şi a mediului, în special, la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari, evitând oxidarea lor. Se folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea prelevării explantelor, fie se adaugă în mediul de cultură. Dintre substanţele antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100 mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).

Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea fenolilor, împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului. Se foloseşte în concentraţii de 250-1000 mg/l.

Cărbunele activ este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu scopul de a absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu. Poate avea acţiune şi asupra fitohormonilor (auxine), blocându-le parţial efectul, are acţiune de inhibare a formării calusului, stimulează embriogeneza, favorizează formarea rădăcinilor.

Uneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii, de a completa compoziţia mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. Prezenţa acestora în mediul de cultură este facultativă.

4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultură

Metabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa mediului de cultură. Rădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu mediu lichid pot produce doar lăstari vegetativi, în timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea tipului de mediu de cultură, lichid sau solid, prezintă o importanţă deosebită.

196

La mediul solid, concentraţia de agar-agar, precum şi calitatea acestuia au un efect distinct. Masa calusului de cartof se dublează atunci când concentraţia de agar-agar din mediu creşte de la 0,8 la 1%, iar microbutaşii de anghinare prezintă fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraţie de agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci când concentraţia agarului creşte la 1,1%.

Concentraţia optimă de agar variază în funcţie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului folosit şi de pH-ul mediului. În general, consistenţa mediului de cultură creşte odată cu pH-ul acestuia.

Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o fază necesară în procesul de micropropagare, ca în inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus în mediu lichid. În cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate în mediu lichid cu agitare pentru a induce lăstărirea axilară multiplă. Viteza de agitare a mediilor lichide este în general scăzută atunci când se cultivă organe (cca 1rpm) şi ridicată în cazul culturii de suspensii celulare (cca 100 -150rpm).

Dacă în alte tipuri de culturi nu se acordă o mare importanţă schimbului de gaze, la culturile in vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezintă o mare importanţă pentru inoculi. Schimburile de gaze se realizează prin difuzie, diferenţele de concentraţie între gazele din interiorul containerelor şi cele din mediul ambiant exterior, precum şi variaţiile de temperatură influenţând aceste schimburi. Organogeneza indirectă la morcov este stimulată de reducerea concentraţiei de oxigen, pe când înrădăcinarea lăstarilor a fost stimulată de creşterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit că difuzia liberă a oxigenului în ţesuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenică a acestora. Alte studii au demonstrat că intervenirea unei modificări în schimburile de gaze dintre ţesuturile cultivate in vitro şi mediu a indus apariţia unor modificări în morfologia plantulelor. De aceea, este demn de luat în considerare şi tipul de vas de cultură folosit pentru culturile de celule şi ţesuturi, precum şi de capacele utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.

Un alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele regenerate in vitro este pH-ul. În practică, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 în timpul preparării mediului de cultură. Totuşi, în dese cazuri pH-ul mediului scade în timpul autoclavării sau chiar în timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se ştiu încă foarte puţine despre efectele acestor variaţii ale pH-ului şi despre cauzele determinante.

4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZĂ CULTURILE DE ŢESUTURI

Principalii factori ai mediului înconjurător sunt lumina şi temperatura. Umiditatea relativă este irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge valori de aproximativ 100%.

197

4.2.1 Lumina

Cerinţele faţă de lumină pot fi divizate în mai mulţi parametri:-intensitatea luminii pe unitatea de suprafaţă exprimată în W/m2

(unitatea lux nu ar mai trebui folosită ca unitate de măsură a intensităţii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesităţilor unei plante);

-durata iluminării, exprimată în ore/zi;-calitatea spectrală a luminii primite de plante. Pentru culturile de ţesuturi, fotosinteza nu este o activitate necesară atâta

timp cât energia este furnizată sub forma carbohidraţilor. Totuşi, unele cercetări au evidenţiat că fotosinteza nu este eliminată în totalitate din culturile de ţesuturi vegetale, dar este considerabil redusă probabil datorită prezenţei zaharurilor în mediu.

Numeroase studii au dovedit că lumina este indispensabilă reglării multor procese morfogenetice.

A.Intensitatea luminoasă

O intensitate luminoasă foarte mare poate duce la pierderi importante în culturile in vitro. Utilizarea unei intensităţi luminoase de 50 W/m2 (aproximativ 10000lucşi) în camerele de creştere, intensitate folosită în mod obişnuit în fitotron, duce la încetinirea creşterii şi scăderea capacităţii de regenerare la multe specii vegetale. Intensitatea luminoasă optimă culturilor in vitro variază între 5 şi 25 W/m2 (1000-5000 lucşi) cele mai folosite valori fiind de 10 până la 15 W/m2. deseori, în faza a treia a micropropagării, se urmăreşte creşterea treptată a intensităţii luminoase în vederea aclimatizării plantulelor la condiţiile de lumină din fitotron.

B.Durata iluminării

Nu există multe date cu privire la influenţa fotoperiodismului asupra morfogenezei ţesuturilor in vitro, aşa cum există dovezi clare ale influenţei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo. Se pare că în medie, calitatea luminii (intensitatea × durata luminii) este importantă dezvoltării armonioase a plantulelor în condiţii aseptice de cultură.

În practică, marea majoritate a camerelor de creştere au o durată a iluminării de 16-18 ore/zi.

Cerinţele faţă de durata de iluminare, din camerele de creştere sunt diferite în funcţie de natura explantului, scopul urmărit dar şi de specia la care se experimentează. Astfel, la grâu, în cazul culturii de antere, în vederea obţinerii

198

de produşi androgenetici, s-a dovedit că, anterele cultivate în primele şase săptămâni la întuneric, vor forma un procent mai ridicat de produşi androgenetici. După această perioadă, culturile vor fi incubate în condiţii normale de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.

C.Calitatea luminii

Numeroase studii au evidenţiat că spectrul luminos influenţează procesele fiziologice şi morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina albastră (cca 467nm) sau violetă (cca 419nm) induce formarea de lăstari din calus de tutun, iar cea roşie (cca 660nm) induce rizogeneza. Aceste rezultatele asemănătoare altora indică faptul că procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenţii fotoreceptori, cum ar fitocromul. În mod normal, lumina „de zi” conţine radiaţii în principal albastre, iar lumina numită „lumină albă” conţine radiaţii roşii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale de emisie ale acestora. În general, tuburile fluorescente albe aflate în comerţ sunt adecvate culturilor de ţesuturi.

În ultimul timp au apărut în comerţ două tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu „lumină caldă” şi tuburi cu „lumină rece”, astfel că, o combinaţie între cele două tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivită pentru culturile incubate în camerele de creştere.

4.2.2 Temperatura

În general, temperatura folosită în camerele de creştere este de 22-24oC. Aceste temperaturi sunt la pragul critic, deoarece în interiorul vaselor de cultură temperatura poate fi cu 2 până la 4oC mai mare decât în camera de creştere. Practic, temperatura din camera de creştere trebuie să fie cu 2 oC mai mică decât cea necesară speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt obişnuite la temperaturi mai scăzute decât speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate să se seteze temperatura în camera de creştere la 20±1 oC , iar pentru cele tropicale la 25±1 oC.

De asemenea, temperatura în camera de creştere va fi diferită şi în funcţie de scopul urmărit în cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat că o temperatură de cca 19oC, influenţează pozitiv formarea minituberculilor, în timp ce la grâu, cultura de antere necesită o temperatură de cca 27oC.

De aceea, se recomandă ca fiecare unitate de cercetare să beneficieze de cel puţin două camere de creştere, în care temperatura să poată fi reglată în funcţie de necesităţile explantelor şi tipurilor de culturi existente. În natură, plantele sunt supuse unor fluctuaţii de temperatură, iar reproducerea lor în camera de creştere ar fi fără îndoială avantajoasă. Totuşi, prea puţine studii au fost făcute în aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevantă.

199

CAPITOLUL VI

6.1 INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

6.1.1 Aspecte generale privind condiţiile aseptice de cultură

Prima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este asepsia. Mediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor, creşterea cărora este mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea proceselor fiziologice ale ţesuturilor cultivate. De aceea un laborator de culturi de ţesuturi este organizat şi păstrat într-o asepsie strictă asemeni unei săli de operaţie.

Principalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt:1) Aerul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul

bacteriilor sau fungilor.2) Ţesuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şi/sau bacterii.

Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ (rădăcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile şi ciupercile se dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor, în vasele conducătoare libero-lemnoase sau în spaţiile intercelulare, caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este recomandată.

3) Corpul uman, care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie.

Metodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt:a) Produsele chimice , care distrug microorganismele:-hipoclorit de sodiu;-hipoclorit de calciu;-mercurobutol;-cloridă mercurică;-produse bactericide şi fungicide;-etanol 70-80%.b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), căldură umedă

pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore, căldură uscată (etuvă) pentru sterilizarea sticlăriei.

d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit

trecerea particulelor mai mari de 0,22µm. Filtrarea este realizată de un ventilator-extractor ce asigură o ventilaţie constantă cu o viteză optimă şi are avantajul de a menţine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. În momentul

200

de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevăzute cu hote cu flux laminar de aer steril.

6.1.2 Prepararea mediului de cultură

Datorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este necesară alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparării se vor bifa, pe rând, toate elementele măsurate şi introduse, ţinându-se seama cu stricteţe de volumul final al mediului.

Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a soluţiilor stoc, erorile, corecţiile, provenienţa agarului, calitatea apei. În aparenţa sunt factori ce nu prezintă o mare importanţă, dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte mare măsură de calitatea mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus.

Etapele preparării unui mediu de cultură sunt:1)Diluţia sărurilor minerale: macro- şi microelemente, apoi ajustarea la

volumul final.2)Măsurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; în general pH-ul este de

5,5-5,8.3)Adiţia zaharurilor (sucrozei) urmată de adiţia agarului, care se adaugă

în ploaie în timp ce mediul este amestecat tot timpul.4)Sterilizarea mediului de cultură la 120oC între 20-30 minute, în funcţie

de cantitatea de mediu din recipient. 5)Adăugarea vitaminelor şi hormonilor (sterilizaţi prin filtrare) în mediu

se face atunci când temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.6)Repartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după

adiţia vitaminelor şi fitohormonilor.

Observaţii Mediile de cultură pot fi preparate în vase Erlenmeyer, dacă se prepară

cantităţi mici (mai puţin de un litru), iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în kuktă. Pentru cantităţi mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent.

Dacă mediul conţine substanţe labile termic, substanţele vor fi dizolvate separat, apoi sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil. Acest procedeu se execută în hota cu flux laminar de aer steril.

Dacă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate, adiţia mediului de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40oC, după ce gura vasului Erlenmeyer în care se află mediul s-a trecut prin flacără pentru flambare.

201

Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul înainte de sterilizarea mediului. A se evita hârtia de pH deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui pH corect se reflectă în succesul culturii in vitro. Agarul şi zaharoza nu schimbă pH-ul mediului, de aceea ajustarea acestuia se face înainte de adiţia celor două componente.

Pentru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente auxiliare, în care se va goli o cantitate aproximativ egală cu cea necesară preparării mediului de cultură, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optimă.

6.1.3 Izolarea şi inocularea explantelor

Din punct de vedere teoretic, toate părţile unei plante pot constitui explante pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, datorită totipotenţei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera în mod normal un individ întreg, identic cu planta donor.

Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse două tehnici obligatorii:-stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă

întreagă cultivată în condiţii nesterile (prima etapă a micropropagării vegetale);-menţinerea asepsiei unei culturi deja iniţiate prin transplantarea

inoculilor în condiţii aseptice pe alte medii de cultură (etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare vegetativă).

Prima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei sterilizări corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură.

A.Sterilizarea ţesuturilorSterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro

este dificilă deoarece gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substanţe chimice, în diferite concentraţii cu durate diferite de timp pentru imersarea ţesuturilor. În general, părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin infectate cu bacterii şi fungi decât cele subterane. Dificultatea sterilizării constă în necesitatea absolută de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel încât să nu se distrugă şi celulele vegetale (care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesară stabilirea unui timp optim de imersare a ţesuturilor în soluţiile sterilizante.

Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt:

-fasonarea peţiolului în fragmente de aproximativ 1cm lungime;-imersia fragmentelor de peţiol în etanol 70% timp de 20 secunde;

202

-imersia în hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continuă a vasului în care se realizează imersia;

-efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului de sterilizare.

Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2

deoarece nu penetrează ţesutul vegetal. Este totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie preparat imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin agitare continuă timp de aproximativ 10 minute, după care, soluţia formată se filtrează, iar filtratul se utilizează imediat. Concentraţiile standard folosite sunt de 4% şi 8%, iar timpul de imersie variază între 5 şi 30 de minute.

Alţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt:

Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat în pungi de plastic cu titrul colorimetric de 48o. Se folosesc concentraţii între 5% şi 20% v/v. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizări optime la o diluţie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetrează ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea capacităţii regenerative a ţesuturilor cultivate in vitro.

Biclorura mercurică (otravă puternică), HgCl2 – este un sterilizant foarte eficient, folosit în doze mici de ordinul 0,01% până la 0,05%. Este dificil de înlăturat deoarece are aderenţă crescută la ţesuturi, necesitând clătiri repetate, fiind recomandate cinci-şase clătiri comparativ cu trei în alte cazuri.

Mercurobutol – este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii. Conţine un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa, dar este foarte dificil de înlăturat necesitând efectuarea a două, trei clătiri cu alcool etilic de 70%.

Trebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează numai la suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă sterilizarea lor.

În unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesară, cum ar cazul meristemelor bine protejate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor protejate în spic.

B.Pregătirea echipamentului necesar sterilizării şi lucrului la hota cu flux laminar steril

Înainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de fasonare şi inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal, activităţi ce se realizează în condiţii sterile, este necesară pregătirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate.

Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape:

203

- se şterg, cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de 70%, toate suprafeţele orizontale şi verticale din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru;- se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei;- se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei;- se porneşte lampa UV, iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia.

În cazul hotelor cu flux de aer laminar (alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele) steril este suficient, ca înainte de utilizare, să se şteargă cu alcool etilic 70% toate suprafeţele interioare, în special suprafaţa de lucru. La acest tip de hotă, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil.

Pregătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului:- se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz, după înmuierea în alcool 90%; este recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument;- instrumentele se imersează în alcool etilic 70% în vase de sticlă dacă nu se foloseşte flambarea şi în alcool de 90-96% dacă se doreşte flambarea acestora;- hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizează prin autoclavare;- vasele Petri sterilizate în prealabil în etuvă la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de hârtie sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate, doar în hota sterilizată;- mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil doar la hotă, când aceasta este pornită;- se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu;- se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă, pentru clătirea materialului vegetal, sau a instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool, fără flambare.

C.Operaţiunile ce se execută la hota cu flux de aer sterilMenţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi

necesare:- înainte de a începe lucrul la hotă, operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun (preferabil cu mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă), să-şi suflece mânecile halatului până mai sus de coate, să-şi frece palmele, încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool 70% sau cu mercurobutol şi să se clătească cu apă distilată sterilă;- mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dată când vin în contact cu materiale nesterile (păr, haine, etc);- instrumentarul se schimbă des, după două până la maximum cinci explante, şi se sterilizează prin flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă;

204

- explantele se fasonează cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină, mai ales când se doreşte obţinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vârf subţire, în cazul anterelor, ovulelor, etc;- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro;- orice explant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de lucru sterilă, va fi eliminat;- dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura în jos;- gâturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra becului de gaz;- odată cu terminarea lucrului, alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise, pentru siguranţă.

6.1.4 Menţinerea culturilor

În general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-25o şi un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric.

Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd în general după câteva zile.

6.1.5 Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora

Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. După simptomele manifestate putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie.

Dacă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textură mată sau pufoasă, de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. Penicillium generează un miceliu de culoare gri mat, pe când Rhizopus nigricans, care se şi multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau aruncare, formează miceliu de culoare închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră.

Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase în interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. Această pastă este uneori colorată roz sau galben.

Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de cultură, şi dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi explantul. Dacă infecţia porneşte din alt punct al mediului de cultură, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficientă a mediului sau din apa condensată pe

205

capacul recipientului de cultură. În unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavării, de aceea este necesară clătirea sticlăriei în clorură lichidă. Atunci când se observă dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a operatorului. Manipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de cultură in vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la hota cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului, transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.

Se poate ca, în cursul culturii, să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii, caz în care mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totuşi, culturile pot fi infectate şi cea mai sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu 2g/l peptonă (un component obligatoriu în mediile de creştere ale bacteriilor). Prin această metodă se testează culturile şi de elimină vasele de cultură infectate, obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii.

6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi în culturile in vitro

Se poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii, iar alteori, în aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. Problema poate fi dată de condiţiile de cultură, care sunt rareori identice, condiţiile climaterice din camera de creştere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor în aparenţă, poate schimba întreaga evoluţie a culturii, de aceea atenţia şi meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui operator in vitro.

În continuare se prezintă câteva exemple concludente:- creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la încetinirea creşterii inoculilor;- utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica funcţionarea ţesuturilor;- unele capace căptuşite conţin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare în apa condensată, să otrăvească ţesuturile; de aceea, este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli înainte de folosirea capacelor;- condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din exteriorul vasului este cu câteva grade mai mică decât cea din interior, cauza putând fi expunerea directă a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare.

206

6.1.7 Metode de iniţiere a unor tipuri de culturi din diferite explante

6.1.7.1 Cultura de rădăcini

Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate. Tehnicile de cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a cercetărilor efectuate în această direcţie. Astfel, White a dovedit că rădăcini detaşate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate.

În general, se utilizează rădăcina primară, embrionară, prelevată de la plantulele formate prin germinarea seminţelor în condiţii aseptice. Principala problemă care se ridică, în acest caz, este aceea a realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. Sămânţa sănătoasă, cu tegumentele întregi, nelezate, are ţesuturi embrionare neinfectate. Seminţele pot fi dezinfectate folosind agenţi puternici de sterilizare întrucât prezenţa tegumentului protejează formaţiunile embrionare de toxicitatea soluţiei de sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare a sterilizării, izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei rădăcini primare prelevate de la o plantulă de mazăre. Aproximativ 20 seminţe de mazăre, cu tegumentul întreg, se introduc într-un vas Erlenmayer, în aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agită seminţele, iar după cca 10 secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de hipoclorit de calciu 10%, timp de 20 minute, toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. După cele 20 minute se decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de apă distilată sterilă. După clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide, ca urmare a infiltrării apei sub tegument, iar seminţele întregi se inoculează, tot în condiţii sterile, în vase Petri, în care a fost repartizat un mediu de cultură MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluţia stoc de macroelemente şi agar 6,5%. Seminţele se incubează la întuneric, în condiţii controlate, timp de 48 ore, după care, când rădăciniţa plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm, în condiţii aseptice, se detaşează vârful rădăciniţei (cca 5-10 mm) şi se inoculează tot în vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un mediu de cultură constituit din macroelemente şi zaharoză, pH-ul fiind 5,8 (Reinert şi Yeoman, 1982).

Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza şi medii mai complexe, clasice, iar ca sursă de carbon organic poate fi folosită glucoza în loc de zaharoză. Creşterea rădăcinilor in vitro are loc pe medii de cultură lichide neagitate. Zilnic se poate urmări dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia Petri a unei hârtii milimetrice.

De obicei, după 21 zile de cultură se constată o plafonare a creşterii, moment în care se recomandă subcultivarea rădăcinilor, prin excizarea apexului şi transferarea lui pe mediu proaspăt. Subcultura se poate face şi la interval de 7

207

zile. După aproximativ două subculturi, este oportună introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic, în dozele normale, utilizate pentru alte tipuri de explante.

Prin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street precizează că auxina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de tomate cât şi diviziunea celulelor meristemului apical. Utilizând culturi de rădăcini, pe diferite tipuri de medii, ca şi compoziţie şi consistenţă, s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni de creştere, al elementelor chimice sau al unor substanţe organice, în formarea rădăcinilor, în creşterea lor, precum şi urmările carenţării celulelor lor în anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuşit îmbogăţirea, an de an, a cunoştinţelor privind funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general.

De asemenea, din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus, mai ales din cele principale sau din cele îngroşate secundar. Procesele de organogeneză, la nivelul rădăcinilor netransformate în calus, se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. Geneza de muguraşi şi tulpiniţe are loc la nivelul ţesutului calusal, provenit din rădăcini, sau pe explante radiculare.

6.1.7.2 Cultura de meristeme

Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-şi menţin, în tot cursul vieţii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formând mereu noi celule. Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor (tulpini sau rădăcini), fiind meristeme apicale, de tip primar, cu rol în creşterea în lungimea organelor; meristeme primare găsim şi în straturile profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. La organele ce suferă procese de modificare secundară morfo-anatomică, îngroşări, întâlnim meristeme secundare, respectiv cambiul şi felogenul. De regulă, prin termenul de cultură de meristeme se înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.

Masivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară maximum 500 µ (Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru şi 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). În cazul în care se depăşeşte această dimensiune, vorbim despre o cultură de apex.

Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare, ce le conferă capacitatea de a se menţine într-o continuă stare de proliferare, cum ar fi:

-au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar;-sunt bogate în citoplasmă, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare,

cu nucleoli bine reliefaţi;-vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.

208

În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonală iar meristemele secundare au formă tabulară. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziţie radială, respectiv toate celulele generate dintr-o celulă meristematică mamă sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat naştere.

Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi corpusul.

La meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă la tulpină.

Forma, mărimea şi conformaţia meristemului apical, caulinar variază mult la diferitele specii dar, în mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme şi meristemul de angiosperme.

Meristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă, este protejat în mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.

Mugurele este constituit dintr-un ax, în apexul căruia se află meristemul. Prin diviziunea continuă a meristemului rezultă celule care, pe măsură ce se îndepărtează de apex se diferenţiază funcţional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de creştere sau vârf vegetativ) se pliază, iar protuberanţele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se diferenţiază în primordii foliare sau florale. De regulă, în primordiile florale se produce o creştere a intensităţii ratei de multiplicare celulară, aceşti muguri devin mai bombaţi, mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se diferenţiază în xilem, floem şi ţesut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se întâlnesc primordii transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai mari, fie în boboci, respectiv în componente florale. Mugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată, graţie faptului că deţin ţesuturi tinere, slab diferenţiate şi celule meristematice. Meristemele apicale posedă o relativă autonomie, fapt încă insuficient argumentat şi dovedit experimental. În evoluţia in vitro a explantelor meristematice, un rol important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale recoltate în faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transformă în floare. Adeseori, funcţie de specie, la nivelul învelişurilor florale se poate induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive.

Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în cele metamorfozate (rădăcini tuberizate). De regulă, cambiul constituie o principală zonă regenerativă.

Ţesuturile inoculate pe medii aseptice, de regulă, diferenţiate morfofuncţional, trebuie să se dediferenţieze, fenomen ce se petrece în etape succesive, până la reîntoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv

209

neoformarea de meristeme. Fenomenul de dediferenţiere celulară se produce şi spontan, de exemplu în cazul iniţierii unor meristeme, sau al genezei de rădăcini secundare din celulele periciclului radicular.

Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus, dediferenţiere primară, din care se poate ajunge la un stadiu de dediferenţiere secundară, când o parte din celulele calusului se transformă în meristeme, generatoare de rădăcini sau tulpini.

Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de promeristeme şi de iniţiere a organogenezei.

În cultura de meristeme, meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare subiacente acestuia.

Ball (1946) a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de Lupinus albus şi Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenţialitatea organogenetică a diferitelor părţi ale apexului.

În prezent, o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei meristemului cultivat in vitro, în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ, precum şi a rolului primordiilor. Este evident faptul că un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, îşi poate manifesta totipotenţialitatea sa reală; în condiţiile inoculării lui împreună cu primordiile, ori in situ, această capacitate este mascată de corelaţiile existente ca urmare a prezenţei alături de meristem şi a celorlalte ţesuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui însoţit de primordii, este dependentă de fitohormonii de creştere prezenţi în mediul de cultură. Se pare că primordiile, chiar în faza în care frunzele sunt abia schiţate, se pot transforma fie în frunze, fie în muguri floriferi. Experienţele de microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight şi Koehnert (1969), precum şi ale altor autori, au permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă morfofuncţional. Problema transformărilor morfologice şi structurale, în cadrul proceselor de tranziţie care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală, precum şi a celor legate de reversia meristemelor iniţial florale, în meristeme vegetative constituie punctul de plecare în multiplicarea vegetativă in vitro, pornind de la explante constând din boboci sau din învelişuri florale. La conopidă, în faza de preinflorescenţă, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme: vegetativ, de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor.

Definitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical, din vegetativ în floral, depinde de o serie de factori exogeni – fotoperioadă, temperatură – sau endogeni – specie, hormoni.

În condiţiile cultivării unor explante in vitro, celulele ţesuturilor inoculate pe medii aseptice suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme. Din aceste meristeme, prin rediferenţiere, vor lua naştere organe.

210

Organogeneza constituie momentul de bază în asigurarea multiplicării vegetative.

De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice, aflate într-un stadiu tânăr, nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini, sau în meristem generator de tulpini, fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematică incipientă, există şi un alt termen, întâlnit în literatura de specialitate – meristemoid (Torrey, 1966). Această noţiune se referă la formaţiuni meristematice, abia schiţate, cu direcţie de dezvoltare nedeterminată, aparent identice din punct de vedere morfologic.

Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate că axa caulinară şi cea radiculară, în evoluţia filogenetică, au o origine comună. Diferenţierea funcţională a meristemului se face, probabil, în stadiul de promeristem; în cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evoluează în: meristem proliferativ, meristem generator de rădăcini şi meristem de tip caulogen. Dar nu se cunoaşte dacă aceşti meristemoizi sunt identici sau prezintă deja amprenta determinismului lor funcţional, radicular şi caulinar.

Meristemele radiculare, funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii:

-meristem apical – situat în vârful rădăcinilor;-meristem lateral – format pe rădăcina principală;-meristem adventiv – provocat în a se forma la nivelul tulpinilor,

frunzelor sau al altor organe, care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. Inducerea formării acestor meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi, marcote sau organe de rezervă;

-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv.

Meristemele caulinare pot fi împărţite astfel:-meristeme apicale (terminale) – derivate din muguraşul embrionului;-meristeme axilare – aflate la axila frunzelor;-meristeme adventive – formate pe diverse organe;-meristeme neoformate – generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.Formarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec

treptat, sub control genetic şi hormonal. Factorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a proceselor de organogeneză. Hormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori cu rol hotărâtor în direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor, în meristeme radiculare sau caulinare. Auxinele intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar citochininele în neogeneza de muguraşi.

Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi de micropropagare a o serie de specii de interes economic.

211

Astfel, se poate concluziona faptul că, la plantele superioare există o diversitate de meristeme clasificate, după localizarea lor în plantă. Meristemele mai pot fi clasificate şi în alte două categorii:

-meristeme histogene – care produc obişnuit numai ţesuturi;-meristeme organogene – care dau naştere la ţesuturi ce formează

organe;Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca

structură şi funcţiune, meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural şi funcţional. Ele variază ca aspect şi potenţialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, în fapt, un microbutaş, întrucât vârful vegetativ al plantei, inoculat in vitro îşi formează un propriu sistem radicular, în partea sa bazală. În consecinţă, acest tip de meristem este frecvent folosit în tehnicile de multiplicare şi de propagare accelerată a plantelor, pe medii aseptice.

Potenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este, de regulă, extrem de mare. Ele se adaptează bine la condiţiile in vitro, suportă uşor traumatismul provocat de explantare, reluându-şi activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice, generând plante. Acest fapt presupune atât creşterea axei mugurelui şi a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzuliţelor, cât şi neogeneza de rădăcini. În final, meristemul terminal, apical sau axial generează una sau mai multe plante, în funcţie de balanţa hormonală prezentă în mediul de cultură. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridică probleme speciale, întrucât ele aparţin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce îngreunează o alimentare optimă a lor cu apă, cu nutrienţi şi hormoni. Acest lucru constituie impedimente fiziologice care, pe plan funcţional, se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative a celulelor lor, soldată cu o scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme.

Meristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în tot cursul vieţii plantei. Excepţie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical în decursul sezonului de iarnă se află în stare de latenţă.

Prin intermediul culturii de meristeme – apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o rapidă multiplicare clonală a plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice.

Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare, fapt deosebit de important în horticultură, asigurându-se astfel o multiplicare clonală.

Un alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor, este acela al obţinerii de material săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen. Plantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în condiţiile

212

înmulţirii vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura, într-o oarecare măsură, eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie de viroze. Dar nenumărate plante horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau, la unele soiuri, multiplicarea prin seminţe este dificilă (orhidee), ori seminţele nu sunt fertile, ceea ce a făcut ca înmulţirea acestora pe cale vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. Pe de altă parte, multiplicarea plantelor pe cale asexuată, prin metode de înmulţire vegetativă clasică, a condus la degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării, an de an, a infecţiilor virale. Astfel, o cultură sănătoasă de garoafe (Rudelle, 1977), înmulţite timp de cinci ani prin butăşire clasică, a prezentat o răspândire în masă a virozelor, multe din ele, cauzând degenerări. Totodată, multiplicarea vegetativă, prin metode tradiţionale, are drept consecinţă şi o perpetuare a unor mutaţii somatice.

Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, în floricultură şi în arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora, producţia realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a calităţii lor. Butaşii obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi realizează un procent scăzut de prindere. Pe de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a unor plante virozate se creează pericolul transmiterii virusurilor şi la alte plante, prin vectorii biologici prezenţi în cultură.

Primele încercări de cultivare a extremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca fiind realizate încă din 1922, de către Kotte şi de către Robbins, la mazăre şi porumb, dar fără mare succes. Ulterior, în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice la Lupinus albus şi la Trapaeolum majus. Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de meristeme nu era cunoscută, abia începând din anul 1949, prin lucrările lui Wetmore şi Morel s-au pus bazele cercetărilor sistematice privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice la condiţii de cultură, precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate în condiţii variate de mediu.

Dacă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, în schimb prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de rezultatele obţinute între anii 1949-1950 de către Limasset şi Cornuet, Morel a avut intuiţia de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 µm lăţime şi 150-200 µm înălţime, cu 1-2 primordii foliare.

Experienţele efectuate de Limasset şi Cornuet au constat în urmărirea, prin analize serologice, a gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distanţe de apex. Ei au constatat o distribuţie inegală a virusurilor în corpul plantelor şi au observat

213

un gradient mai scăzut de infecţie virală, pe măsura apropierii de vârful vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redusă infecţie virală a fost semnalată în sucul extras din frunzele aflate încă în mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset şi Cornuet au extirpat, aseptic o calotă de ţesut apical sau meristem şi câteva primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun, lezată printr-o scarificare superficială. După trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematică, au fost virozate în proporţie de 60%, în timp ce frunzele pe care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai îndepărtate de meristem) s-a infectat în procent de 100%. Aceste experienţe ia condus pe Limasset şi Cornuet la concluzia că în apexul caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este oprită.

Încă din 1952, Morel şi Martin au intuit faptul că, pornind de la plante virozate, prin explantarea şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obţine o plantă sănătoasă, conservând, în acelaşi timp, caracterele genetice ale plantei mamă. Această ipoteză a fost atestată de către Morel şi Martin prin experienţe efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat şi pus în practică de către Morel şi Martin. Tulpinile generate in vitro, neposedând rădăcini, au fost transformate în minibutaşi. Aceştia au dat naştere la plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii şi orhideele. În 1957, Quak a remarcat că metoda lui Morel şi Martin este posibil de aplicat, cu aceleaşi rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat cercetările în scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare şi producere a unui material săditor sănătos, cu randament economic asigurat, având ca obiectiv obţinerea de flori de calitate superioară.

În acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la atacul viral. Dacă prelevarea se face de la o plantă neinfectată, sau care prezintă o infecţie virală slabă, atunci cresc şi mai mult şansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecţii virale.

Din păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot îmbolnăvi tot atât de repede ca şi oricare altă plantă. De regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de butaşi, plantaţie executată în condiţii speciale de protecţie, încât plantele să fie ferite de atac zoopatogen.

Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. Astfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium şi Diffenbachia eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).

Cercetările recente au dovedit însă, că nu toate meristemele sunt libere de infecţii virale. Invazia meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul

214

meristemului, al virusului şi de specia plantei parazitate. Cu cât explantele meristematice sunt mai mici, cu atât şansa prelevării de celule lipsite de virusuri este mai mare, dar cu cât inoculul meristematic este mai mare, cu atât este mai ridicată capacitatea lor regenerativă.

Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică (Martin, 1977). De exemplu, la cartof, virusul X poate fi înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai în procent de 1%. Unele virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings, 1962).

Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de combatere a infecţiilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborată de către Kunkel, în 1936. Aceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între 35-39oC, timp de 2-4 săptămâni. În cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică; ele rămân la nivelul celulelor în care au fost surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic.

Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu şanse foarte mari de reuşită, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. În consecinţă, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil explantării, tratamentului termoterapeutic. Dar, în această situaţie, descreşte vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scăderea capacităţii de supravieţuire şi de regenerare a celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungeşte iar virusurile, nemultiplicându-se, rămân în celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce înlesneşte prelevarea unor explante apicale mai mari de până la 1 mm, micşorând pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului, infectate cu germeni fitopatogeni. În consecinţă, explantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată, ceea ce compensează epuizarea fiziologică, cauzată de termoterapie.

Kassanis (1950) a dovedit că unul din virusurile cartofului, localizat în frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat că la tomate există virusuri a căror activitate este suprimată abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe cercetători să prelungească durata termoterapiei, de la câteva zile la câteva luni şi să ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).

Hakkaart şi Quak (1964), experimentând cu meristeme excizate de la crizanteme, de până la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat că prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp (până la 50-60 zile)nu a condus la depăşirea procentului de plante devirozate.

În unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în decursul cultivării ţesuturilor in vitro. Astfel, Hollings şi Stone (1964), au reuşit această performanţă la garoafe, iar Walkey şi colab.

215

(1969) la cireş. Această eradicare endogenă a virozei, în interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecinţă a traumatizării celulelor excizate. Cu cât a fost mai mic fragmentul de ţesut excizat, cu atât traumatismul a fost mai puternic şi efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai mare (Walkey, 1980). De regulă însă, este imposibil să regenerăm anumite specii de plante din fragmente atât de mici de ţesuturi; ori în alte condiţii, nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare încât să se producă o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldată cu suprimarea atacului viral.

Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre justificări de ordin molecular. Una din ipoteze susţine că există o competitivitate între celula gazdă şi parazit, în ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie; altă ipoteză, susţine că celula meristematică utilizează ARN viral, sau că substanţele generate în urma traumatizării celulelor ar suprima virusurile prezente în celule.

În anul 1978, Walkey, a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro a ţesutului gametofitic femel, respectiv ovare sau ţesut nucelar, sau a meristemului floral.

Trebuie subliniat şi marele merit pe care Morel l-a avut în intuirea importanţei deosebite a descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave, precum şi a direcţiilor aplicative pe care le-a deschis această tehnică, efectuată în condiţii aseptice. Cele mai mari realizări le-a avut Morel în multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, în anul 1963, Morel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul că meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, generează un glomerul de 1-2 mm, de culoare verde, numit protocorm. Prin ruperea şi cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă globuloasă, un glomerul de cca 3-4 mm slab diferenţiat histologic, constituită dintr-un parechim, cu celule mari, sărace în citoplasmă şi cu vacuole întinse. În partea centrală a glomerulului se disting câteva fascicule vasculare. Fragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. În anul 1978, Murashige afirma că, dintr-un meristem de orhidee, în decursul unui an, prin fragmentări şi subcultivări repetate ale protocormilor, se pot obţine cca 4 milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemănător cu protocormul de germinaţie, rezultat din embrionii seminţelor.

În 1959, Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante, în care să fie conservat materialul biologic meristematic sănătos. Prin această tehnică, astăzi, materialul vegetal generat in vitro este uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor capacitate regenerativă.

Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în:-asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in vitro;

216

-eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni;-creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt

timp, a unui exemplar vegetal;-obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin

metode tradiţionale de înmulţire vegetativă;-conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici, pentru o

lungă perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce să asigure, oricând, necesarul de material săditor solicitat pe piaţă;

-conservarea germoplasmei în bănci de gene.În extinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a predominat

factorul economic rezultat, în primul rând, din aspectele fitosanitare, respectiv din obţinerea unor culturi viguroase, sănătoase. Astfel, cartoful, plată extrem de importantă atât în hrana omului şi pentru industrializare dar şi în hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozităţii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivând in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumărate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent în ţesuturi, ceea ce epuizează planta şi scade, considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu toate tipurile de virusuri pot fi în egală măsură combătute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des în cultură (A, Y, M, S, X) virusul A este mai uşor de îndepărtat, comparativ cu virusul X. Multiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. Astfel, în Franţa, cifra de afaceri realizată, în categoria florilor tăiate, prin vânzarea garoafelor, ocupă locul doi iar exportul horticol francez este reprezentat în proporţie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea provenind din mutaţii de culoare, practicate la tipul american de garoafă creat de William Sim, în 1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de exemplare. Conservarea calităţilor sale genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale. Infecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult şi capacitatea de înrădăcinare a butaşilor. În laboratoarele unei singure unităţi se produc anual, in vitro, cca 10 000 de garoafe. Înmulţirea meristematică a permis vindecarea garoafelor şi de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, şi a bacteriozelor Pseudomonas caryophylli şi Pectobacterium parthenii. De o mare importanţă este cultura orhideelor, obţinerea de material săditor devirozat la garoafe, căpşun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori şi arbuşti.

Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea, ca scop în sine, numai eradicarea bolilor ci pur şi simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. Această metodă este cu atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat.

217

Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar şi anume:

-unele procedee vizează cultivarea exclusivă a celulelor conului meristematic, fără primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, în dependenţă de dimensiunea redusă a explantelor şi de consecinţele traumatismelor provocate;

-altele privesc obţinerea de material săditor devirozat, explantele constând din meristeme recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor fiind de până la 500 μm, respectiv 0,25-0,7 mm;

-altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule, în timp scurt utilizând explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme axilare şi de muguri adventivi pe apexul iniţial.

În oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea, cu mare atenţie şi pricepere, a plantelor mamă, donatoare de explante. Este de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într-o perioadă de creştere activă. Latenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică aplicarea unor tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergenţa meristemelor. Alegerea explantelor, sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultură folosit, regimul din camerele de creştere influenţează supravieţuirea explantelor. Restabilirea proceselor biologice, de diviziune şi de regenerare precum şi sensul desfăşurării histo şi organogenezei, diferenţierea de plante, dezvoltarea lor şi apoi capacitatea adaptativă a acestora la mediul normal sunt influenţate atât de factori endogeni, cât mai ales de cei exogeni, în special de balanţa hormonală şi de regimul de lumină, respectiv de temperatură.

De regulă meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapidă creştere. Cu toate acestea şi meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite în culturile de meristeme. La crizanteme din 5000 de vârfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut, generând plante mature, în timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.

Mărimea explantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. Când se are în vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie să depăşească 0,5 mm dar nici să fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, în acest caz, este dificilă înrădăcinarea plantulelor generate din meristeme. În cazul în care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare, de până la 1 mm. În camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă să fie de 2400-2600 lucşi, în regim de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. În alte cazuri, lumina trebuie intensificată la 3500-4000 lucşi, iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 lucşi. Temperatura trebuie să fie stabilizată între 22-25oC. Uneori există indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de iluminare, cerute de un anumit tip de cultură, potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei anumite etape de dezvoltare a inoculilor.

218

În literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specifică că meristemele de garoafe supravieţuiesc, în proporţie mai mare, dacă sunt recoltate primăvara sau toamna devreme; meristemele recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate primăvara sau vara, de timpuriu, înrădăcinează mult mai repede în raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului.

În ceea ce priveşte substratul de cultură, de cele mai multe ori, se utilizează medii de cultură solide. La cartof, garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. PH-ul mediului de cultură poate constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului cultivat in vitro. Astfel, de regulă, pH-ul de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; după autoclavare, pH-ul scade, iar în decurs de o săptămână de la cultivarea ţesuturilor, pH-ul descreşte până aproape de 5,4. Un pH iniţial scăzut inhibă formarea rădăcinilor.

În compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente, FeEDTA, vitamine, aminoacizi şi o sursă de carbon organic, reprezentată, de regulă de zaharoză în concentraţie de 2-3%. Natura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta, în funcţie de scopul urmărit. Astfel, pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere ANA şi AIA, care însă folosite timp îndelungat pot duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. În acest caz, se recomandă subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. Citochininele stimulează creşterea meristemelor, mai ales în cazul în care ele se fală în latenţă, precum şi formarea de nenumăraţi muguraşi. Concentraţia fitohormonilor de creştere variază în diferitele faze de evoluţie ale meristemelor.

Plantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile in vitro, fiind trecute în condiţiile mediului septic. Ele vor fi transferate în ghivece mici, în amestec de perlit cu pământ. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic,chiar neînrădăcinaţi, această operaţiune putând determina înrădăcinarea lor. Buys (1969) recomandă transferarea timpurie în sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, întrucât rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură folositoare în sol, iar prelungirea duratei de menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură, ridică nejustificat costul materialului plantat rezultat. Atunci când plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic, eventuala prezenţă a virusurilor şi gradul de infecţie.

Metodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta. În 1977, Clark şi Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenţei virusurilor, iar în 1973, Derrick, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate în determinările de virusologie vegetală. Pentru a uşura exactitatea investigaţiilor este de dorit să se facă o analiză a infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum şi în cultura, sau culturile apropiate. După stabilirea unei culturi lipsite de

219

germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie menţinute în condiţii speciale fie că ele sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute, în recipientele lor de cultură, pe medii aseptice, fie că sunt cultivate în teren, într-un perimetru ferit de infecţii, metodele fiind menite să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor.

Metodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum şi a unei cantităţi limitate de material iniţial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi extrem de scăzute. În aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. Primele încercări de crioconservare au fost făcute de către Seiberg în anul 1976, la garoafe. Ulterior s-a reuşit şi conservarea altor tipuri de inoculi: calus, celule sau protoplaşti. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare, cu rol în prevenirea daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor, respectiv formarea cristalelor de gheaţă. Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) şi glicerolul (Kartha, 1981, citată de Cachiţă, 1984). Meristemul este ţesutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi scăzute, graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el îşi poate păstra întreaga capacitate regenerativă, întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime de mediu, celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. Meristemul se pretează cel mai bine conservării prin crioconservare, celulele lui fiind sărace în vacuole şi având o citoplasmă densă.

Pentru executarea operaţiunilor de congelare, îndeosebi pentru coborârea gradată a temperaturii, există dispozitive speciale. O metodă accesibilă preconizează introducerea flacoanelor cu inoculi într-o baie de alcool, mediu în care se produce descreşterea gradată a temperaturii.

În anul 1980, Dale şi colab. Au pus la punct o metodă de stocare la temperaturi scăzute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constând în conservarea îndelungată a plantelor, generate in vitro, prin menţinerea lor la temperaturi de 2-4oC, în regim de 8 ore lumină pe zi si o intensitate de 300 lucşi. Cultura poate fi menţinută astfel 10-11 luni, după care se recomandă ca aceasta să fie transferată pe mediu proaspăt.

O altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro. Plantele provenite atât din meristeme cât şi din explante de altă natură, prezintă un grad de juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui obţinut prin metodele tradiţionale: butăşire, marcotaj, altoire.

Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic, de exemplu la plantulele de căpşun, diferenţiate din meristeme. La căpşun, frunzele tinere sunt întregi, în timp ce frunzele plantelor bătrâne sunt trifoliate. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la inoculi în momentul în care se depăşeşte faza de

220

morfogeneză, constând în proliferarea a noi muguri axilari, prin repicări repetate şi cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină.

Un caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate meristeme apicale. Un exemplu îl constituie plantele lemnoase, multianuale. Explantele sau butaşii prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. La aceste plante se practică diferite metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri in vitro, altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule.

Sfecla constituie un alt exemplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte scăzută capacitate organogenetică. De aceea se recomandă inducerea formării de meristem prin repicări succesive.

O problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii aseptice, într-o stare primară, întrucât în cazul în care se inoculează un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpină floriferă, există pericolul ca anumiţi factori de mediu să inducă formarea florilor sau invers, să grăbim, prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de mediu, transformarea unui mugur vegetativ, în mugure florifer. Reglarea fotoperioadei şi sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par să determine transformarea apexului vegetativ în florifer.

La numeroase plante, detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă ţesuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, generând muguraşi. Adeseori, se formează muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui să se formeze boboci. Inocularea in vitro, pe medii, cu sau fără fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescenţe tinere conduce la formarea a numeroşi muguri. La conopidă, prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenţei şi cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxină (AIA), provoacă reveria ţesuturilor din florifere în vegetative. Astfel, poate fi înmulţită planta pe cale vegetativă (Crisp şi colab., 1974, citat de Cachiţă,1984).

Originea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea, în direcţia diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă, într-o anumită fază de dezvoltare a plantelor sau a organelor. Reuşita este dependentă de vârsta ţesutului, de specie şi de condiţiile de mediu.

Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante.

6.1.7.3 Cultura de calus

Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule deţinând o structură histologică uniformă. De regulă, când este tânăr, posedă celule nediferenţiate, care se divid activ. Un anumit tip de calus se produce şi în mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, având rol în cicatrizarea rănilor, fie se formează la baza butaşilor plantaţi pentru

221

înrădăcinare, constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive. În funcţie de obiectivul urmărit, obţinerea de calus poate constitui un scop în sine, alteori apariţia şi dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formării de calus cât mai friabil constituie scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei culturi de protoplaşti. Instabilitatea genetică a celulelor sale şi poliploidizarea facilă a lor, în anumite condiţii de cultură, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări, selectându-se linii cu calităţi speciale. Multiplicarea clonală, via calus nu este posibilă tocmai din cauza facilei poliploidizări a celulelor sale. Pe această cale se practică însă înmulţirea regenerativă, rapidă a unei specii, fără a avea siguranţa conservării genotipului. La unele specii: morcov, tutun, crizanteme din calus se pot obţine uşor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase (stejar), geneza de plante din calus este extrem de dificilă.

Atunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă, formarea de calus în porţiunea bazală a explantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un fenomen care perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză. Astfel, administrarea unei balanţe hormonale neechilibrate, face ca la baza explantului să se genereze calus, cauzând dezvoltarea preponderentă a rădăcinilor, în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers, se formează unul sau mai mulţi muguraşi, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat şi subcultivat pe un mediu cu sau fără auxină. Această metodă se practică cu succes, atunci când se procedează la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia şi Gerbera), constând în desprinderea de propaguli, de pe un ţesut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniţial, situat în porţiunea bazală a coloniei de propaguli.

Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi cultivat la nesfârşit, atunci când, periodic, se procedează la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. Fiecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. Calusul crescut la 25oC se recomandă a fi repicat la un interval de 4-6 săptămâni, în dependenţă de natura ţesuturilor din care a provenit şi de condiţiile în care a fost cultivat. Numai prin subcultivări repetate poate fi conservată vitalitatea celulelor sale. Dacă calusul nu este subcultivat în timp util, se produce o îmbătrânire a celulelor sale, masa tisulară îşi schimbă culoarea, din gălbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuşie sau galben-brună; uneori culoarea calusului devine roşiatică sau vişinie, datorită formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar. Provenienţa calusului şi natura inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. Street (1973) precizează că trecerea calusului în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a cantităţii de antociani. De altfel, s-a constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor (Gautheret, 1959, citat de Cachiţă, 1984). În general, prezenţa luminii şi natura acesteia intensifică acumularea în celule a antocianilor. Antocianii sunt sintetizaţi însă şi

222

la întuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultură de celule de Haplopappus cu raze UV, a izolat o linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de antociani. Fitohormonii de creştere şi natura acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. Astfel, auxina inhibă, iar citochininele stimulează formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981). Temperatura scăzută, carenţa de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide stimulează sinteza de antociani. Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o creează, întrucât şi un conţinut ridicat de NaCl stimulează formarea acestor pigmenţi.

La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă, decât la gimnosperme sau la monocotiledonate.

Pe măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură, în profunzime se diferenţiază centri vasculari, ori noduli organoformatori. În morfo şi organogeneza calusului un rol determinant îl au mediul de cultură şi condiţiile de cultură, natura ţesuturilor din care a provenit calusul şi vârsta acestora.

Formarea, creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia fitohormonilor de creştere, prezenţi în mediile de cultură. De regulă, concentraţiile ridicate de auxină conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine în inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite în concentraţii cuprinse între 1-10 mg/l.

În general, calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă diferită, chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. Astfel, prin inocularea de liber secundar, muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat în 2,4D, se ajunge uşor la formarea de calus.

Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte, legate între ele, sau pot fi mai laxe, formând un calus friabil, grunjos, separabil în fragmente granulate, de mărimi diferite, mai greu dezagregabile, sau spumos, ce se separă în formaţiuni tisulare fine, adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost detaşate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de creştere prezenţi în substratul de cultură şi uneori de condiţiile de cultură. Capacitatea organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal este dependentă atât de factorii endogeni şi exogeni, de numărul repicajelor făcute, de condiţiile de cultură şi de vârsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar şi după cinci ani, îşi menţin o potenţialitate ridicată de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativă scăzută, evaluată la câteva săptămâni (Conger, 1981).

Dintr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar, ce conţine un număr de aproximativ 50 000 celule. După cca şase săptămâni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspăt, se numeşte calus secundar.

223

Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un calus de tip neregenerativ ce prezintă, de regulă, o creştere luxuriantă, din el diferenţiindu-se rădăcini, şi uneori muguraşi, dar niciodată plante (Nabors, 1982). Aceste două tipuri de calus au mai fost denumite calusuri embriogene şi neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare albă-lăptoasă, spre galbenă, ori galbenă-verde. Citologic se remarcă zone compacte, cu celule nediferenţiate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă, de culoare albă, brunie sau verde. Acest tip de calus prezintă o consistenţă mai laxă, fiind mai friabil, desfăcându-se uşor în pachete de celule. Regiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. Aceste regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi dar niciodată plante. Nabors a fost primul care a dovedit că cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinută timp îndelungat o prezintă calusul embriogen, denumit de tip regenerativ. Tot Nabors a observat că acest calus regenerativ tinde să devină neregenerativ; după producerea acestei reversibilităţi procesul este definitiv, întrucât cele două forme sau tipuri de calusuri, diferite funcţional, nu sunt interconvertibile. De altfel, cele două tipuri de calusuri necesită fitohormoni diferiţi, în doze variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. De regulă, calusul neregenerativ creşte abundent, în timp ce calusul regenerativ are o creştere mult mai lentă, chiar şi pe medii potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a acestuia. Pentru a preîntâmpina dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus regenerativ omogen sau cel puţin predominant ca masă, într-o populaţie de celule calusale. Nabors a remarcat şi faptul că ceea ce la un anumit moment, într-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului, pare să fie ţesut de tip neregenerativ, poate genera, în continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate şi subcultivate (Cachiţă, 1984).

Frecvent, cele mai bune medii de cultură, adecvate creşterii optime a ţesutului calusal, nu constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. În general, mediul Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziţie similară, respectiv sărace în azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat. La cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, având efect pozitiv în susţinerea creşterii calusului. Acest mediu însă nu este cel mai potrivit pentru inducerea şi menţinerea proceselor regenerative.

În general, calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar şi la calusul bogat în zone regenerative acestea reprezintă numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dacă regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să impulsioneze şi să susţină procesele regenerative, celulele lui vor da în final naştere la plante.

224

Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar, prin menţinerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivări de întreţinere. Pe altă cale se pot identifica şi izola insulele de calus regenerativ, pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizându-se transferarea lor pe un mediu de creştere adecvat.

În decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric decât din cei crescuţi la lumină. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la întuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ creşte însă la calusul crescut în condiţii de întuneric. La grâu, calusul trebuie transferat la interval de cinci săptămâni, pe mediu potrivit inducţiei diferenţierii de plante. La calusul de grâu, regenerarea se realizează pe un mediu lipsit de fitohormoni de creştere; astfel din calusul de tip regenerativ, în cca 2-5 săptămâni după transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai creşte. Dacă calusul este mixt, componenta neregenerativă continuă să crească mult; concomitent, însă, din porţiunile de calus de tip regenerativ, în cultură se diferenţiază şi plante. După două subcultivări ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni de creştere, potrivit inducerii neoformării de plante, se recomandă transferarea calusului rămas, pe un mediu conţinând auxină, pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia.

Plantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise, conţinând perlit, care va fi udat cu apă de la robinet, urmând ca după 1-2 săptămâni, plantele bine înrădăcinate, să fie transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit.

Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule, cultivându-l pe medii lichide, obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri.

În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape:-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea

explantelor. Calusul poate fi obţinut din explante provenite din diverse surse: seminţe, embrioni, rădăcini, ţesut de rezervă, frunze, ramuri, antere, ovare;

-prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de scopul propus. Atunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultură oarecare, conţinând substanţe anorganice (macro şi microelemente) şi substanţe organice (sursă de carbon organic, vitamine, aminoacizi şi fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizează cu agar;

-sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură;

225

-pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării explantelor. Se realizează curăţirea organelor şi dezinfectarea lor, folosind diverse procedee în funcţie de tipul de explant utilizat;

-dimensionarea explantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de tipul de organ folosit ca sursă de explante;

-inocularea explantelor se realizează în condiţii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării culturii;

-incubarea inoculilor se face fie la întuneric, fie la lumină, de regulă la temperatura de 25oC;

-observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp;

-subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectuează la cca 4-6 săptămâni, fiind obligatorie pentru menţinerea viabilităţii calusului. Este importantă ţinerea unei evidenţe stricte a numărului de subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal;

-urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în care a fost cultivat calusul, de provenienţă şi de vârsta acestuia.

Ţesutul calusal are o utilizare variată. El constituie unul din materialele biologice asupra căruia se pot aplica diferiţi agenţi selectivi, în scopul obţinerii de linii rezistente, pentru selecţionarea de plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit factor de stres. Nabors (1982) a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii ridicate de NaCl, substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. Astfel, a raportat obţinerea de plante de Triticum, Orisa şi Pennisetum tolerante la concentraţii ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum şi la Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0,03%. La grâu, cel mai bun calus, care răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obţinut din rădăciniţa embrionară, dezvoltat în condiţiile germinării cariopselor pe medii aseptice.

Atunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de grâu se sterilizează, după care, la microscop, se detaşează embrionii, evitându-se lezarea acestora şi inoculându-i pe mediu de cultură.

Mediul de cultură recomandat pentru grâu (cariopse sau embrioni imaturi) este Linsmaier-Skoog, conţinând macro şi microelemente, vitamine, sursă de carbon (zaharoză), fitohormoni (2,4D sau 2,4,5 T) şi agar.

Agenţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de cultură, preparat pentru inducerea formării de calus, fie se adaugă în substratul de cultură destinat repicării calusului. În cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a culturii de calus, o varietate în mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului selectiv în cauză, se realizează o reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobândite

226

stabilizate, transmisibile descendenţilor. S-a constatat că stabilitatea caracterelor dobândite este dependentă de durata în care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp în care s-a operat selecţia. Pentru a fi atinsă o stabilă toleranţă, chiar şi în condiţiile absenţei îndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt necesare cel puţin şase luni de călire şi selecţie, prin subcultivări repetate. Menţionăm că şi în situaţia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenţierii capacităţii regenerative a calusului, în calus de tip regenerativ şi neregenerativ. Numai din calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este inutilizabil în acest gen de experimente.

Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite experimente de fiziologie, în studierea problemelor de morfogeneză, în urmărirea unor modificări ultrastructurale, în analize de ordin biochimic, sub acţiunea unor anumiţi factori, administraţi exogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul.

În concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reacţiei celulei vegetale la o serie de substanţe sau condiţii de cultură, permiţând efectuarea unor experimente de fiziologie privind: creşterea, reacţia la pesticide, noxe, ioni grei, respiraţia, morfo şi organogeneza, testarea viabilităţii celulare, a biogenezei unor produşi primari sau secundari de metabolism.

6.1.7.4 Cultura de embrioni şi endosperm

Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practică în diferite scopuri, atât pentru cercetări de fiziologie a seminţei cât şi în experienţe de hibridări intersoiuri, interspecii şi intergenuri.

Încă din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivării pe medii aseptice a embrionilor de Raphanus şi Cachlearia pe soluţii minerale cu adaos de zaharoză, obţinând plantule transferabile în sol.

Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecţionate continuu. Van Qverbeek şi colab. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) şi Morel (1956) să efectueze experienţe de multiplicare in vitro folosind ca material iniţial embrioni extraşi din seminţe coapte. Seminţele au fost sterilizate, după care au fost îmbibate în apă, 12-24 ore, şi apoi, în condiţii aseptice a fost izolat embrionul.

Embrionii pot fi cultivaţi in vitro, ca atare sau se operează detaşări de fragmente embrionare, sau sunt cultivaţi în scopul obţinerii de calus, care este utilizat ulterior în alte experimente. Există şi practici constând în grefarea de embrioni pe endospermul aparţinând altor specii sau genuri, operaţie denumită hibridare in vitro.

Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de explante, complexe. Un rol deosebit revine momentului în care se

227

execută explantarea embrionului, respectiv timpul scurs după fecundare, din clipa formării zigotului şi până la inocularea lui in vitro, perioadă care exprimă vârsta embrionului în zile. Ovulul fertilizat adăposteşte zigotul care, după formare, începe să se dividă şi se hrăneşte din rezervele endospermului. În această fază celulele embrionului sunt heterotrofe; pentru creşterea şi dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine şi hormoni. În această etapă explantarea embrionului şi inocularea lui pe medii aseptice creează probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continuării proceselor de creştere şi de dezvoltare.

De regulă, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice în momentul în care sunt formate cotiledoanele, respectiv când începe diferenţierea internă a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogenă a structurii embrionare variază de la specie la specie şi uneori este dependentă de condiţiile meteorologice. În unele cazuri, când este importantă izolarea timpurie a embrionului de sub acţiunea plantei mamă, poate fi realizată o creştere corespunzătoare a acestuia numai dacă embrionul este izolat împreună cu nucela sau cu ţesutul nutritiv, sau dacă se detaşează ovulul în întregime realizându-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunzătoare ca şi compoziţie.

Prin cultura in vitro de embrioni se poate preîntâmpina avortarea sau dezvoltarea anormală a embrionilor ca urmare a instalării unei incompatibilităţi între embrion şi ţesutul nutritiv, aşa cum este cazul hibrizilor sexuali intervarietăţi interspecii şi intergenuri, sau al formării de hibrizi sterili.

Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridică mari probleme, cultura de embrioni maturi este mult mai uşor de realizat.

Embrionii maturi necesită un mediu de cultură simplu, care are în compoziţia sa săruri minerale şi o componentă glucidică. Adăugarea la mediul de bază a vitaminelor (acidul nicotinic, acidul ascorbic, piridoxină) impulsionează creşterea ţesuturilor, iar adăugarea fitohormonilor de creştere are drept scop urmărirea evoluţiei embrionilor în prezenţa acestora, pentru a asigura stimularea creşterii unui anumit organ sau pentru inducerea formării de calus. În mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomandă adiţionarea unor extracte naturale: hidrolizat de caseină, lapte din nucă de cocos, suc din fructe de tomate sau extract de endosperm.

În general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiţia ca ei să fie explantaţi în acea fază de formare care să le permită, în continuare parcurgerea evoluţiei fireşti a proceselor de ontogeneză şi să se respecte integritatea lor morfoanatomică; cu cât stadiul în care au fost prelevaţi a fost mai timpuriu cu atât şi factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai complecşi şi greu de reprodus. În timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similară cu cei dezvoltaţi în condiţii naturale, sau prezintă chiar un uşor avans în creştere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt

228

plăpânde, iar în sol dovedesc o creştere mai lentă şi sunt mai firave. Cultura de embrioni imaturi, recoltaţi foarte tineri, uneori conduce la obţinerea de plantule malformate, chiar dacă mediile de cultură au o compoziţie adecvată dezvoltării acestora.

În unele cazuri, după polenizarea interspecifică sau intergenerică, dezvoltarea embrionilor a fost extrem de lentă, ceea ce a făcut ca explantarea embrionilor şi cultivarea lor in vitro, să fie imposibilă. Taira şi Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-n-caproic, facilitând astfel, creşterea embrionilor hibrizi, realizaţi între grâu şi secară, depăşind barierele fiziologice care împiedicau creşterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu anumiţi regulatori de creştere, după polenizare, impulsionează creşterea embrionilor până la faza în care ei pot fi extraşi şi cultivaţi, cu succes, pe medii aseptice.

Prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n, îmbinându-se caracterul de perenitate cu cel al calităţii furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune s-au obţinut şi în regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere, obţinându-se hibrizi interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, şi Medicago.

Tot prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante la specii ale căror seminţe nu germinează (banane) sau a celor care se înmulţesc greu prin seminţe (specii forestiere). În unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de latenţă, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metodă eficientă în scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.

De asemenea, embrionii pot să servească şi ca ţesuturi de plecare în multiplicarea şi propagarea rapidă a unor plante (la specii ornamentale) atunci când acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de explante.

O atenţie deosebită trebuie acordată aspectelor teoretice şi practice pe care le ridică problemele de embriologie experimentală la gimnosperme. Cea mai veche cultură de embrioni la gimnosperme este citată ca fiind efectuată de către Schmidt în anul 1924, când a cultivat pe un mediu organic embrioni de Pinus sylvestris. Mai târziu, în 1936 Rue a reuşit cultivarea in vitro a embrionilor proveniţi de la câteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis, Tsuga canadensis şi Pseudotsuga menziensii şi a demonstrat, totodată, că embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi cultivat pe medii aseptice, până la stadiul de plantulă. Experimentele ulterioare au reliefat faptul că embrionii de gimnosperme pot fi crescuţi in vitro, în lipsa megagametofitului (Cachiţă, 1984).

La cultura de embrioni, presiunea osmotică, sau sursa de carbon organic, joacă un rol important în evoluţia acestora, atunci când embrionii sunt excizaţi şi sunt cultivaţi in vitro. De exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un conţinut de 3-6% zaharoză şi hormoni, vor genera

229

plantule, în timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoză, se constată o serioasă limitare a dezvoltării primordiilor radiculare.

Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuşit scoaterea acestora din starea de latenţă, odată cu detaşarea şi desprinderea lor de sub acţiunea megagametofitului.

Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de morfogeneză şi se referă la cultura endospermului de tip secundar, derivând din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar, având celule triploide, gimnospermele având un endosperm de tip primar. Ambele tipuri de endosperm deţin un rol important în alimentarea şi susţinerea creşterii embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regulă endospermul este consumat în primele faze ale dezvoltării embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.

Primele experimente constând în proliferarea endospermului imatur de porumb au fost efectuate încă din anul 1933 de către Lampe şi Mills. La Rue, în anul 1947, a realizat creşterea nelimitată a endospermului de porumb. Cercetările menţionate au deschis calea unor experimente prin care s-a dovedit că acest ţesut iniţial are o capacitate ridicată de proliferare, formează uşor rădăciniţe, muguraşi şi chiar plantule. În această direcţie, Straus şi La Rue în 1954, au obţinut rezultate excelente cultivând endosperm de porumb, la 12 zile de la polenizare. Cele mai bune varietăţi, potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile după polenizare, nu creşte pe medii aseptice. Deci, pentru reuşita iniţierii culturii este important stadiul în care se află diferenţierea celulelor embrionului.

Endospermul matur, doar la câteva specii sau varietăţi, corespunde scopului inducerii formării de calus şi anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifestă procese de organogeneză. Endospermul de porumb, de ricin, precum şi la alte specii, generează o masă de calus în continuă creştere, fără organogeneză, în timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observă embriogeneza.

Cultura de embrioni oferă un important instrument în cercetările de embriologie şi în embriogeneza experimentală, constituind un sistem de tip monitorial în redarea fazelor de creştere ale diferitelor părţi componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate în dependenţă de natura substratului de cultură, de vârsta embrionului, în funcţie de condiţiile de mediu, oferind importante informaţii privind interferenţa diferitelor etape metabolice cu regulatorii de creştere, procesele de depozitare ale substanţelor de rezervă în ţesuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, în formarea şi creşterea embrionilor.

230

6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule şi de ţesut nucelar

În hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate între partenerii sexuali. De aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de către ovule a autopolenizării ori a polenizării încrucişate, învingându-se astfel barierele de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la încrucişări, operaţiunile fiind făcute în scopul obţinerii de seminţe viabile.

Incompatibilitatea dintre ovule şi polen este provocată de către diferite cauze, de ordin endogen şi anume: o primă selecţie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate prezenta o conformaţie morfologică necorespunzătoare, împiedicând angrenarea ornamentaţiilor exinei polenului pe vilozităţile stigmatului; pe de altă parte, natura umedă sau uscată a suprafeţei stigmatului poate constitui un impediment în reţinerea polenului pe stigmat şi în crearea mediului optim; substanţele secretate de către celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum şi creşterea tubului polinic.

În unele cazuri există o autoincompatibilitate naturală, generată de faptul că plantele care trebuie încrucişate prezintă diferenţe morfologice constând în mărimea polenului, amplasarea anterelor în floare etc. Alteori, maturitatea organelor sexuale se face în momente diferite, caz în care se impune ca, în prealabil, polenul să fie recoltat şi să fie conservat, pentru o anumită perioadă de timp.

Experimentele de polenizare şi fecundare artificială in vitro trebuie precedate de o cunoaştere a bilogiei florilor cu care se doreşte efectuarea experienţelor, atât în ceea ce priveşte morfologia, etapele de morfogeneză cât şi a compatibilităţii şi a incompatibilităţii, a antezei şi a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. Pe de altă parte trebuie făcute testări prealabile cu privire la mediile de cultură adecvate menţinerii microsporilor la un potenţial biologic şi într-o stare optimă de viabilitate, pentru asigurarea creşterii tubului polinic, pentru menţinerea viabilităţii părţilor componente ale pistilului.

Polenizarea şi fecundarea artificială in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea în contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele excizate.

Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practică în cazul speciilor compatibile sexual, când nu există impedimente morfofiziologice, privind fixarea şi germinarea polenului la nivelul stigmatului. Prin această metodă s-a reuşit autopolenizarea la Antirrhinum majus (Usha, 1965), în schimb la Petunia violacea, specie autocincompatibilă s-a constatat că autopolenizarea in vitro a fost urmată de o creştere a pistilului dar după un timp acesta s-a brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachiţă, 1984).

231

Deseori, însă, polenizarea şi fecundarea in vitro a ovulelor au eşuat, în condiţiile utilizării tehnicilor constând în folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la reproducerea aceloraşi încrucişări, dar operând cu ovare sau ovule.

Meritul primei culturi de ovare îi revine lui La Rue (1942), care a reuşit cultivarea in vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobţinând, însă în final seminţe viabile. În această perioadă, Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum, Cucumis angeria, Phaseolus vulgaris şi Nicotiana tabacum. Mediile de cultură au fost complexe şi au conţinut ca fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic. Ovarele au fost recoltate fie înainte de polenizare fie după ce polenizarea s-a petrecut în mod natural. In vitro ele au crescut, dar în final nu au format seminţe.

Prin tehnicile de cultură in vitro a ovarelor au fost obţinuţi hibrizi din încrucişarea hibrizilor diploizi de Brassica chinensis şi autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata, 1968). Hibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare între cei doi părinţi.

La Oryza sativa şi la Haworthia turgida, Majumdar a obţinut, în anul 1970, plantule din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice.

Mitra (1972) a reuşit obţinerea de embrioizi din pereţii ovarelor nepolenizate de Citrus aurantifolia şi Citrus sinensis, cultivate in vitro. În general cultura de ovare serveşte la inducerea artificială a poliembrioniei, la seminţele care, normal, sunt monoembrionare.

Există numeroase cercetări care atestă rolul deosebit pe care îl joacă părţile florale în dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari şi Lal (1961, citaţi de Cachiţă, 1984) experimentând cu flori excizate, cultivate in vitro, au constatat la Iberis amara formarea unor fructe normale, numai dacă, în condiţiile inoculării lor la o zi după polenizare, acestea prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi suplinită prin adăugarea în mediul de cultură a unui surplus de zahăr. În cazul în care florile au fost excizate şi inocularea s-a făcut la opt zile după polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimţită.

Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct între polen şi ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic până la sacul embrionar. În acest mod, s-a realizat actul de fecundare între indivizii îndepărtaţi filogenetic, înlăturându-se barierele incompatibilităţilor genetice şi obţinerea, în final, de seminţe viabile.

Încă din anul 1932, White a încercat să cultive ovule de Antirrihinum, dar a obţinut calus, generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivând in vitro ovule de Erythronium americanum, observat o creştere a acestora fără ca să obţină maturizarea lor.

În anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, în condiţiile cultivării in vitro a acestora, s-a observat apariţia fenomenelor de poliembrionie.

232

Embrionii izolaţi au continuat să prolifereze numeroşi alţi embrioni (Zatyko, 1975).

S-a constatat că ţesutul placentar exercită un efect pozitiv asupra creşterii ovulelor cultivate in vitro, favorizând formarea şi maturarea seminţelor. Se presupune că ţesutul placentar cedează ovulelor anumite substanţe stimulatoare. Substanţele respective nu prezintă o specificitate, întrucât ovule fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe placentă de Capsicum. În condiţiile cultivării acestora in vitro, ovulele s-au maturizat şi au format seminţe viabile.

Pot fi cultivate in vitro atât ovule fertilizate cât şi ovule nefertilizate. Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate în condiţiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic.

Există perspective mari în ceea ce priveşte realizarea prin culturi in vitro a unor polenizări încrucişate, interspecifice şi intergenerice care în condiţiile obişnuite, în natură duc fie la incapacitatea embrionului format în a-şi menţine viabilitatea, fie sămânţa rezultată se dovedeşte inaptă în a suporta dezvoltarea embrionului.

În literatură se citează hibridul realizat între Lolium perene şi Festuca rubra, utilizându-se ovule detaşate din floare, la cinci zile de la polenizare. Plantele rezultate au fost asemănătoare cu Festuca rubra.

Învingerea barierelor morfo-fiziologice creează posibilitatea realizării de hibrizi interspecifici care, în viitor, pot prezenta un interes economic major şi care în mod natural nu pot fi obţinuţi prin hibridare sexuată.

S-au reuşit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. Pornind de la acest tip de ţesut, in vitro se poate induce poliembrionia. Astfel, în 1976, Mullins şi Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera – Cabernet Sauvignon, specie în mod normal monoembrionară. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele căruia s-au diferenţiat embrioizi, ceva mai mari decât embrionii zigotici. Plantulele rezultate au fost viabile.

La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspăt, recoltat în perioada iniţierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales în cazul urmăririi realizării de polenizări interspecifice sau intergenerice. În ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculării, polenul să fie testat în ceea ce priveşte capacitatea germinativă, creşterea tubului polinic şi să se studieze comparativ eficienţa câtorva reţete de medii de cultură, în vederea asigurării unei creşteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea şi susţinerea întregului potenţial biologic al celulei generative şi a celei vegetative.

În cazul în care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar să se aproximeze dacă tubul polinic are o lungime corespunzătoare pentru a fi asigurată accesibilitatea lui la ovule; în caz contrar se renunţă la cultura de pistile şi ovulele vor fi excizate şi cultivate ca atare. În acest mod, va fi facilitată

233

fecundarea şi se preîntâmpină epuizarea celulei generative, în decursul parcurgerii traseului de la stigmat, până la sacul embrionar (Cachiţă, 1984).

Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor şi a altor părţi florale, precum şi a ansamblelor de componente florale a permis completarea cunoştinţelor actuale privind funcţionarea organelor respective şi privind biologia fecundării, a formării embrionului, a seminţei şi a fructului. Aceste cunoştinţe servesc la obţinerea de noi succese în învingerea barierelor incompatibilităţilor existente în hibridarea sexuată, fapt deosebit de important, întrucât prin înmulţirea sexuată se poate reînnoi continuu, potenţialul biologic al plantelor, îmbogăţindu-se zestrea ereditară, cu caracterele moştenite de la doi părinţi, posedând acumulări genetice diferite.

6.1.7.6 Cultura de celule

Poate fi definită ca o creştere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu de cultură lichid. În funcţie de momentul în care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus în momentul iniţierii culturii şi mult mai accentuat în perioada optimă de creştere. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente dezmembrări a celulelor inoculate, a separării şi individualizării parţiale a acestora. De asemenea ele pot fi şi rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fără separarea celulelor, iar în astfel de cazuri frecvenţa agregatelor creşte pe măsura atingerii perioadei maxime de diviziune celulară. Ulterior deşi frecvenţa diviziunilor scade, mărirea agregatelor celulare se datorează creşterii în volum a celulelor.

Cea mai perfectă cultură de celule nu este alcătuită numai din celule libere. Pentru a reduce numărul de agregate se practica filtrarea culturii. Agregatele care persistă şi după filtrare vor deţine maximum 4-10 celule, uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976).

Gradul de dispersare a celulelor, într-o suspensie celulară, depinde de durata creşterii celulelor în cultură, originea acestora, compoziţia mediului şi condiţiile de cultură (Street, 1977). Mediul de cultură optim, de cultivare la celulele de gimnosperme diferă de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate, dar şi faţă de mediul folosite la dicotiledonate. Unul din constituenţii mediului de cultură de care depinde menţinerea celulelor în suspensie sunt fitohormonii de creştere care pot influenţa cultura celulelor in vitro prin natura lor şi concentraţia folosită. Astfel un conţinut ridicat de auxină determină creşterea numărului de celule în suspensie, iar reducerea conţinutului în acest fitohormon, descreşte capacitatea celulelor de a se separa (Torrey şi Reinert, 1962). De asemenea s-a constatat că procesele de agregare celulară sunt influenţate şi de prezenţa în mediul de cultură a etilenei dar şi de creşterea concentraţiei în glucide.

234

O cultură celulară ideală trebuie să fie omogenă din punct de vedere morfologic şi biochimic. Numai o cultură de celule individualizate, obţinute prin clonarea unei singure celule, menţinută în condiţii care să păstreze stabilitatea nucleară, constituie un material biologic valoros pentru operaţiunile de mutageneză, în izolarea de linii celulare, în selectarea de mutanţi, de un anumit tip. Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate genetică în cadrul populaţiei de celule (Cachiţă, 1984).

Pentru menţinerea celulelor într-o stare activă de diviziune şi astfel creşterea gradului de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp.

Din momentul iniţierii unei culturi celulare şi până în momentul practicării unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numeşte ciclu de creştere a culturii. În decursul acestui ciclu se produc schimbări în ceea ce priveşte viteza de diviziune şi de creştere a celulelor. Se distinge o fază incipientă de creştere a vitezei de multiplicare celulară, urmată de o perioadă de plafonare a frecvenţei diviziunilor, după care, fără o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate într-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse în acelaşi flacon de cultură. În aceste condiţii creşterea încetează atunci când nutrienţii de bază din mediu s-au redus sau au fost epuizaţi. Există şi sisteme închise de cultură care asigură reîmprospătarea continuă a mediului consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de cultură acţiune care asigură funcţionarea sistemului şi recoltarea biomasei produse. În acest sistem se realizează un echilibru între cantitatea de mediu introdusă în sistem şi mediul evacuat.

Durata menţinerii în condiţii de viabilitate a unei culturi, fără a se produce modificări, depinde de specie, de condiţiile de cultură, de epuizarea din mediu a constituenţilor, care pot limita diviziunea şi creşterea, de pH.

Dea asemenea oxigenul şi glucidele din mediu pot influenţa creşterea, astfel că o reducere a celor două componente determină reducerea sau chiar stoparea creşterii celulelor. Subcultivarea celulelor înainte de finalizarea perioadei exponenţiale de creştere a celulelor permite obţinerea unor populaţii de celule mai stabile.

Prin încorporarea în mediul de cultură a unor concentraţii reduse de enzime se poate realiza separarea celulelor, întrucât enzimele, în diluţii adecvate, nu influenţează negativ rata de creştere, permiţând obţinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic şi metabolic.

Rata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de creştere a culturii se modifică din momentul iniţierii culturii, până la oprirea diviziunilor. O primă fază, imediat după inoculare, constă într-o întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere, dar în următoarele 10 zile numărul de

235

celule per unitatea de volum creşte exponenţial, urmând apoi faza de staţionare şi apoi faza de declin. Faza exponenţială de creştere se caracterizează ca o perioadă finită de timp, în care rata de creştere a biomasei, raportată la unitatea concentraţiei de biomasă este constantă. Faza de creştere exponenţială este extinsă în condiţiile în care cultura este iniţiată cu o densitate redusă a celulelor per unitatea de volum (Cachiţă, 1984).

Pentru a menţine culturile într-o fază de creştere exponenţială trebuie prevenită situaţia limitării nutrienţilor din mediu ca o consecinţă a epuizării acestora. În acest sens se impune subcultivarea frecventă a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus gracilis şi la un interval de 48 ore. La o cultură de Acer pseudoplatanus, Dorre şi colab. (1971) au realizat subculturile la un interval de 7 zile, obţinând o densitate iniţială de 2 x 105 celule/ml.

Pentru culturile de celule se pot folosi următoarele tipuri de dispozitive:-fermentatoare – de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate şi în cultura cu

volum de mediu limitat, stabilit iniţial;-chemostate – pentru cultura continuă, deschisă;-fitostate – chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate în

care rata de creştere şi densitatea celulară sunt menţinute constante, prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi şi hormonali;

-turbiostate – sistem deschis de cultură continuă, în care mediul proaspăt se adaugă în momentul creşterii turbidităţii culturii şi a eliberării, prin spălare şi eliminare a excedentului de celule.

O cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi. Cea mai folosită metodă constă în realizarea în mediul de cultură lichid a unei suspensii utilizând ca material iniţial calus, pentru ca să se realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de calus, condiţie ce poate fi îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balanţă hormonală adecvată scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4 diclorfenoxiacetic, în diferite concentraţii. În cazul în care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar şi în condiţiile agitării mediilor de cultură lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului şi diluarea agregatelor celulare mici în mediu de cultură proaspăt.

De asemenea, în acelaşi scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul lichid şi recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel că, coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci când se reiniţiază suspensia celulară (Street, 1976).

O altă metodă constă în omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderată, în omogenizator de sticlă şi apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate.

În acelaşi scop se pot utiliza protoplaşti obţinuţi prin digestie enzimatică.Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei cantităţi de

mediu, dintr-o cultură deja existentă, având o densitate cunoscută de celule,

236

diluând-o cu mediu proaspăt. Densitatea celulelor în subcultură nu trebuie să depăşească iniţial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. În decurs de 15-25 zile densitatea va creşte până la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachiţă, 1984).

Cultura de celule prezintă foarte multe avantaje. Există specii care constituie modele în ceea ce priveşte reacţia la condiţiile create şi la care procesele de citodiferenţiere, de organogeneză şi embriogeneză pot fi controlate şi dirijate în sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule prezintă avantaje deosebite în efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creşterii, citodiferenţierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de celule, fiind constituită într-o populaţie omogenă de celule se poate folosi în vederea inducerii variabilităţii genetice şi selecţiei de mutanţi, prin expunerea culturii la acţiunea unor anumiţi agenţi fizici sau chimici.

Unul din marile obiective urmărite prin culturile de celule îl constituie acela al selectării de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, săruri, etc. Prin astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar modificările genetice operate la nivel celular pot fi regăsite în plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaţie. Selectarea liniei celulare se poate face uşor prin etalarea suspensiei pe medii de cultură solide, recoltarea efectuându-se în perioada creşterii exponenţiale (Cachiţă, 1984).

Capacitatea regenerativă depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora, vârsta culturii, compoziţia substratului şi de condiţiile de cultură.

Întrucât experienţele de ameliorare şi genetică din câmp sunt costisitoare, necesitând multă forţă de muncă şi suprafaţă mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se simplifică, reducându-se activitatea, în prima fază, doar în laborator, astfel că se reduc atât suprafeţele de lucru cât şi timpul necesar obţinerii rezultatelor dorite. În plus materialul biologic valoros obţinut, prin cultura de celule se poate păstra timp îndelungat prin crioconservare, în azot lichid.

O problemă deosebită este aceea a obţinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele cultivate pe medii aseptice deşi au clorofilă nu pot supravieţui în lipsa zahărului din mediul de cultură. În încercările făcute pe medii aseptice s-a constatat că succesul cultivării ţesuturilor şi celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim, înregistrându-se o rată scăzută a creşterii acestora. Vigurozitatea slabă a celulelor crescute în astfel de condiţii a fost explicată printr-o activitate fotosintetică scăzută, datorată unor deficienţe de cultură, care împiedică dezvoltarea cloroplastelor şi a fotosintezei. Yamada şi colab.(1978) s-au ocupat de această problemă şi au ajuns la concluzia că în realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie să se aibă în vedere selectarea de celule care produc multă clorofilă. Lumina puternică stimulează sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraţie scăzută de zaharoză. Prezenţa

237

în mediul de cultură a unor concentraţii ridicate de zaharoză inhibă sinteza clorofilei.

Culturile de celule au implicaţii practice deosebite în industria aşa zisă de tip fermentativ, după modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele în scopuri industriale. Şi în culturile de celule s-a asimilat şi adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele în care se cultivă celule. La plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produşii secundari de metabolism sunt depozitaţi în vacuole, nefiind excretaţi în mediul de cultură. La suspensiile celulare, derivând din plantele superioare, durata de fermentaţie este de cca 10 ori mai mare decât la culturile de tip microbian.

Un aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de cultură. Biotransformarea poate fi utilizată pentru diferite tipuri de reacţii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiţia de carbon, ruperea lanţului de carbon.

Culturile în mediu lichid prezintă avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienţii, se asigură un schimb de gaze optimizat, se evită neajunsurile provocate de o eventuală orientare polară neadecvată, precum şi depozitarea şi concentrarea în jurul celulelor a produşilor de metabolism, eliminaţi în mediu.

6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante

Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosită ca explant pentru iniţierea culturilor in vitro. Inducerea neoformării de ţesuturi este dependentă de specie, de natura organului, de mărimea explantului, natura ţesuturilor prezente în explant, sezonul în care s-a recoltat organul, modul de sterilizare, compoziţia mediului de cultură, orientarea lor pe mediu precum şi balanţa hormonală folosită în mediul de cultură.

De regulă, în afară de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al inflorescenţelor, cotiledoanelor şi mai rar, în porţiunea internodală a tulpinilor se constată existenţa unei capacităţi regenerative, a cărei intensitate depinde de specie, de vârsta organului din acre se prelevează ţesuturile, mărimea explantului, orientarea lui pe mediu de cultură, de compoziţia mediului sau de condiţiile din camera de creştere.

Într-un experiment efectuat de Lazăr şi Cachiţă (1980-1982), cu explante de crizantemă de natură diferită, cultivate pe mediu de bază cu adaos de AIA (2 mg/l) şi BA (2mg/l) s-a constatat că, în afară de meristeme, alte tipuri de explante folosite – de la peduncul floral, peţiol, inflorescenţa, minibutaşi – frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de organogeneză, pe suprafaţa superioară, formare de muguraşi iar pe cea inferioară, generarea de rădăciniţe. Din meristemele apicale, după două luni de

238

cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. Din meristemele axilare, diferenţierea plantelor s-a făcut mai lent. Plantele formate din meristeme au avut o conformaţie proporţionată şi s-au adaptat bine la viaţa mediului septic. Explantele nodale şi cele constând din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un număr variabil de muguraşi. Dintre aceştia unul până la trei s-au dezvoltat, ceilalţi rămânând în diferite faze de creştere. separaţi şi subcultivaţi pe medii proaspete au format rădăciniţe şi s-au dezvoltat normal. Inoculii constând din explante de formă cilindrică (ex. internod), au prezentat o pregnantă polaritate morfogenetică, chiar dacă explantul a fost acoperit de calus.

Procesul de organogeneză a fost şi mai scăzut la fragmentul desprins din mijlocul peţiolului frunzelor. În general, inoculii constând din internod şi mai ales cei dimensionaţi din peţiol au generat mult mai mult calus decât cei de formă şi mărime similară, obţinuţi din peduncul floral.

Explantele dimensionate din porţiunea limbului foliar, în care nervura principală a frunzei era bine reprezentată, au generat o cantitate mai redusă de calus, în schimb au dat naştere la muguraşi, din care s-au format plante (Lazăr şi Cachiţă, 1982). În general, lăstăraşii formaţi la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpiniţelor formate din meristeme, ceea ce atestă că din celulele calusului se pot diferenţia plantule cu o conformaţie particulară, diferită de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurată, pe această cale înmulţirea clonală.

Concluzia finală a constat în aceea că regenerarea şi diferenţierea rapidă a noi plante s-a realizat din inoculii meristematici. Lăstarii pot fi transformaţi în minibutaşi şi prin aceasta se ridică coeficientul de multiplicare a clonei respective. Se poate deci concluziona că, în funcţie de specia la care se doreşte experimentare, dar ţinând cont şi de scopul urmărit, natura explantului este diferită, iar rezultatul preconizat a se obţine este influenţat de o serie de factori, de la compoziţia mediului de cultură, natura fitohormonilor de creştere şi concentraţia acestora, până la vârsta organului donor sau condiţiile din camerele de creştere. Există, aşadar, o „gamă” variată de posibilităţi de inducere a unei culturi in vitro, astfel că se pot depista pentru fiecare specie de cultură, ornamentală sau forestieră, sursele de explante cele mai potrivite în vederea realizării unor astfel de experienţe. Iar acolo unde literatura nu oferă posibilităţi de inducere a culturilor de celule, experienţa cercetătorului poate permite depistarea prin tatonări a celor mai bune metode în vederea realizării obiectivelor în acest domeniu.

239

CAPITOLUL VIII

8.1 TEHNOLOGII DE CULTURĂ IN VITRO

Tehnicile de cultură in vitro a explantelor reprezintă o cale optimă de cercetare a fiziologiei plantelor. Aplicaţiile practice ale acestor tehnici au fost repede apreciate de vreme ce plantulele obţinute în vase de cultură pot fi aclimatizate pe un substrat normal în condiţii naturale de viaţă.

Cronologic, cultura de meristeme a stat la originea primelor aplicaţii, deoarece scopul acestor culturi a fost, în principal, obţinerea de plante libere de virusuri. După primele succese ce au confirmat semnificaţia metodei, s-au dezvoltat rapid tehnicile de micropropagare pentru a asigura o producţie rapidă de plante libere de virusuri.

Acestor două tehnici, care sunt acum utilizate frecvent în horticultură, le mai pot fi adăugate altele trei, ce încă aparţin domeniului cercetare, obţinerea plantelor haploide, izolarea şi cultura de protoplaşti şi cultura de calus şi suspensii celulare cu scopul producerii de compuşi medicinali aromatici. Ultima tehnică vizează obţinerea de substanţe farmaceutice direct din culturi de celule vegetale, fără o cultivare în câmp.

8.1.1 Cultura de meristeme

Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ cu celule tinere ce-şi menţin pe tot parcursul vieţii plantelor capacitatea de se divide, formând mereu noi celule. Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor – tulpini sau rădăcini – fiind meristeme apicale cu rol în creşterea în lungime a acestora. Importanţa culturii de meristeme constă în principal în utilizarea lor în vederea obţinerii de plante libere de viroze, aceasta fiind şi principala aplicaţie practică a acestui tip de culturi.

Pentru cultura de meristeme cu scopul devirozării plantelor se folosesc îndeosebi meristemele din vârful de creştere al tulpinilor, şi anume din mugurii floriferi sau foliari, iar la cartof din ochii de pe tubercul tocmai porniţi în vegetaţie.

Mugurele este constituit dintr-un ax principal în apexul căruia se află meristemul, iar prin diviziunea continuă a meristemului se formează primordiile foliare (Fig.17). Formarea meristemelor şi mai apoi organogeneza, adică formarea organelor plantei, sunt procese ce au loc sub influenţa fitohormonilor, de aceea meristemele excizate sunt plasate pe medii cu o balanţă hormonală adecvată.

240

Observaţiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost făcute de White, care a notat că rădăcini de tomate infectate cu virus, generează în unele cazuri rădăcini fără virus. Studii mai amănunţite au fost făcute de Limaset şi Cornuet (1949), care au observat că din plante de tutun infectate cu virus, explantele prelevate prezentau o infecţie de intensitate scăzută, sau explantele de dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.

Aceste cercetări au demonstrat că intensitatea infecţiei creşte dinspre părţile juvenile ale plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate în apropierea mugurilor apicali conţin cu până la 150 de ori mai puţin virus decât cele aflate la mijlocul plantei).

a – zona apicală axială; b – zona laterală;c – primordii foliare; d – meristeme axilare; e – meristem medular; f - procambiu

Fig. 17 Reprezentarea schematică a unui meristem caulinar (după Badea şi colab., 2001)

Aceste cercetări au permis emiterea teoriei conform căreia multiplicarea virusurilor a fost limitată la nivelul sub-meristematic, meristemul fiind liber de virusuri. Morel şi Martin au fost primii care au reuşit să regenereze noi plantule din meristeme inoculate pe medii artificiale. Plantele regenerate au făcut parte din genul Dahlia şi erau infectate cu virusul pătării inelare şi virusul mozaicului. Meristemele cultivate au generat lăstari tineri dintre care unii s-au dovedit a fi liberi de virusuri. Acest prim succes a fost urmat de altele şi a deschis calea utilizării acestei tehnici de cultură in vitro în horticultură.

Motivul pentru care meristemele sunt libere de virusuri nu este elucidat în întregime presupunându-se că datorită ritmului alert de multiplicare a celulelor la acest nivel generează o anumită imunitate sau poate că în lupta pentru metaboliţi dată între celule şi virusuri primele au mai mult succes. A doua presupunere este verificată prin rezultatele obţinute în urma aplicării termoterapiei, deoarece temperaturile ridicate avantajează multiplicarea celulelor vegetale şi reduce viteza de multiplicare a virusurilor. De fapt, studiile au arătat că în unele cazuri de infecţie cu anumite virusuri rezultate notabile s-au

241

obţinut doar după combinarea celor două metode: cultura de meristeme cu termoterapia.

Această tehnică este aplicată doar la speciile ce permit înmulţirea vegetativă şi favorizează diseminarea virusurilor. La speciile ce se înmulţesc generativ, riscul transmiterii prin intermediul seminţei este foarte limitat, de aceea regenerarea prin cultura de meristem este puţin interesantă.

După alegerea plantei donor se trece la prelevarea vârfurilor de creştere din care, în condiţii sterile, va fi izolat meristemul. În funcţie de vârful de creştere se va proceda la sterilizarea materialului vegetal înainte de izolarea meristemelor. De exemplu, colţii tuberculilor sau vârfurile de creştere ale Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate înainte de prelevarea meristemelor, pe când mugurii de viţă de vie, vârfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor sau anghinării nu necesită sterilizare, doar schimbarea instrumentarului, cu unul sterilizat, după fiecare operaţiune. Explantele se sterilizează conform metodologiei prezentate anterior şi păstrate până la fasonare şi inoculare în ultima apă distilată sterilă destinată clătirii. Excizia poate fi făcută la hota cu flux de aer steril sau mai simplu pe o masă dezinfectată în prealabil. Un binocular este indispensabil efectuării acestor operaţiuni, magnitudinea optimă putând fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt înlăturate de pe explant prin tăiere, urmând ca foliolele rudimentare să fie înlăturate prin smulgere, iar meristemul izolat cu ajutorul unui vârf de ac de seringă sau cu un bisturiu cu vârf foarte fin. Instrumentarul se schimbă foarte des, după fiecare operaţiune, şi se înlocuieşte cu unul sterilizat prin flambare. Când meristemul este vizibil (domul meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie în general meristemul primar şi are o culoare galben-verzuie transparentă) se înlătură cu foarte mare grijă şi ultimele foliole şi prin patru secţiuni perpendiculare se izolează meristemul. Ultima secţiune transversală izolează meristemul, tăierea trebuie făcută imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o lamă, ac de seringă sau bisturiu cu lamela foarte fină şi inoculat la suprafaţa mediului de cultură solid.

Toate operaţiunile prezentate anterior trebuie făcute într-un timp cât mai scurt pentru a evita deshidratarea şi pentru a limita riscurile contaminării.

În ce priveşte substratul nutritiv utilizat, în general, acesta trebuie să fie suficient de bogat în elemente minerale, în special în potasiu, concentraţia căruia trebuie să fie mare într-un mediu destinat micropropagării. Din acest punct de vedere mediul Murashige-Skoog este optim.

Conţinutul în zaharuri trebuie să fie între 2 şi 6%, în funcţie de specie. Mai sunt necesare şi alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor şi cheaţilor de fier, în concentraţii variabile.

Mediul de cultură artificial este solidificat, în general, cu agar (6 până la 10mg/l), dar poate fi şi lichid, caz în care schimburile dintre mediu şi explant

242

sunt mai bune cu condiţia asigurării unei aerări optime (pentru a se evita asfixierea explantelor), deci a unei agitaţii corespunzătoare.

Regulatorii de creştere sunt determinanţi în realizarea cu succes a unei culturi de meristeme. În general, auxinele sunt indispensabile multiplicării celulare. Uneori se adaugă şi citochinine în concentraţii foarte mici, în special sub formă de urme. Deseori sunt necesare şi giberelinele pentru determinarea alungirii axului principal, meristemele aparţinând grupului de explante de tip organizat. Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece volumul de aer de deasupra meristemelor trebuie să fie mic pentru a evita deshidratarea acestora.

După inocularea meristemelor, vasele de cultură sunt plasate în camerele de creştere la o intensitate luminoasă de 1000 până la 3000 de lucşi, la un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric şi la temperaturi de 22-25oC.

În aceste condiţii, dacă mediul este favorabil, se va observa formarea unor lăstari care vor înrădăcina sau nu, în funcţie de specie. Dacă plăntuţele sunt complet formate, cum e cazul crizantemelor, garoafelor, violetelor de Parma sau anghinării, se poate trece la aclimatizarea lor sau pe mediu de multiplicare, în cazul în care se doreşte obţinerea unui număr mare de plante. Dacă plăntuţele nu înrădăcinează, cum e cazul speciilor Actinia, Gerbera şi trandafir, lăstarii regeneraţi se subcultivă pe mediu pentru înrădăcinare, ce va conţine doar elementele minerale necesare fără fitohormoni sau cu adiţie de auxine.

Din numărul total de meristeme inoculate se pierd mai multe sau mai puţine din mai multe cauze.

Prima cauză ar fi de ordin tehnic, procedeul de izolare al meristemelor este dificil şi delicat, rezultând contaminări cu bacterii sau fungi (în medie de aproximativ 5%). Mai mult, un număr însemnat de meristeme se deshidratează, iar la cele de dimensiuni foarte mici s-ar putea la secţiunea finală să se treacă prin inelul central al domului meristematic şi astfel să se determine decesul acestuia.

A doua cauză poate fi de natură fiziologică, condiţiile în care au crescut plantele donor prezentând o importanţă deosebită. La speciile ierboase, se întâlnesc deseori următoarele fenomene: când meristemul este prelevat de pe axa principală de creştere, rata de regenerare este de 80-90%. În contrast, această rată poate descreşte până la 5-10% atunci când meristemele sunt prelevate din axele secundare cu creşteri lente.

La speciile lemnoase această metodă este dificil de aplicat deoarece meristemele prelevate de pe ramuri aflate în faza de vegetaţie se brunifică în contact cu mediul şi mor. În acest caz, prelevarea meristemelor se face din muguri dorminzi.

A treia cauză ar putea fi de ordin biologic, pe de o parte, după cum se ştie, unele virusuri ajung şi în domul meristematic, pe când unele sunt uşor de înlăturat prin cultura de meristeme, iar pe de altă parte, la unele specii se poate

243

întâlni prezenţa bacteriilor până în cele mai profunde straturi celulare (marea majoritate nepatogene) ce se vor dezvolta ulterior în mediu infectând cultura. De exemplu, Hydrangea şi Pelargonium găzduiesc multe bacterii ceea ce duce la creşterea ratei infecţiilor in vitro (aproape de 99% uneori la Hydrangea). Această caracteristică este observată şi la speciile acaule (fără tulpină aparentă., vine din franţuzescul acaule, în greacă a – fără, kaulos – tulpină), la care meristemele sunt situate la nivelul solului.

Cauzele enumerate mai sus determină eliminarea a numeroase vase cu infecţii sau cu meristeme deshidratate, sau dacă nu au apărut nici infecţii şi s-au dezvoltat lăstari trebuie verificată prezenţa virusurilor la nivelul ţesuturilor.

În cazul acestei tehnici, nu este atât de important procentul de plante regenerate cât numărul de plante libere de virusuri obţinute, ce vor constitui materialul biologic donor pentru regenerarea unui lot liber de virusuri.

Cultura de meristeme permite obţinerea de plante sănătoase şi viguroase, la care trebuie însă verificat cu rigurozitate dacă s-au eliminat virusurile din ţesuturi. Aceste controale se fac prin indexarea plantelor susceptibile de infecţii cu virusuri, la care se calculează în general trei indici. Dacă aceşti indici sunt negativi, planta se consideră liberă de virusuri şi poate trece pe mediile pentru micropropagare. Aceste tehnici nu ne permit să afirmăm că plantele sunt în totalitate libere de virusuri, existând întotdeauna un oarecare risc. În afara indexării se pot efectua teste imunologice sau serologice, ce permit testarea plantelor pentru virusurile cunoscute.

Controalele sanitare oferă informaţii asupra prezenţei sau absenţei virusurilor, dar nu indică calitatea genetică a plantelor. Oricând pot apărea mutaţii, chiar dacă din acest tip de explante modificările genetice sunt foarte rare. De aceea, înainte de a distribui plantele obţinute prin cultura de meristeme, la beneficiari, este recomandabil a se verifica dacă sunt identice din punct de vedere genetic cu planta donor.

Punerea la punct a acestei tehnici a indus o dezvoltare considerabilă culturilor in vitro şi a permis descoperirea unei bariere pentru răspândirea virusurilor printre speciile de importanţă propagate vegetativ. De asemenea, această metodă permite rejuvenilizarea unei specii, ducând la obţinerea de descendenţi viguroşi.

Se presupune că fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de explant (câţiva milimetri de ţesut) care în urma exciziei pierde o parte din memoria citoplasmatică construită de-a lungul existenţei ţesuturilor parentale. Trebuie subliniat faptul că deşi această tehnică permite eliminarea virusurilor din ţesuturi şi obţinerea de plante sănătoase, plantele obţinute nu sunt imune, rămânând susceptibile la atacul bolilor şi dăunătorilor ca şi părinţii donor. De aceea, este recomandabil să se evite recontaminarea materialului vegetal obţinut, şi dacă nu este posibil să se reînnoiască cu regularitate materialul semincer.

244

CAPITOLUL XI

11.1 MICROPROPAGAREA PLANTELOR

11.1.1 Consideraţii generale

Spre deosebire de metodele de înmulţire clasică, generativă şi vegetativă, micropropagarea plantelor prezintă o serie de avantaje, care au impus-o în faţa primelor. Aceste avantaje ar putea fi următoarele:

-înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât cea in vivo, astfel că într-un an dintr-un explant se pot obţine peste un milion de exemplare;

-multe specii care nu pot fi înmulţite in vivo sau care se înmulţesc greu, pot fi înmulţite in vitro în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;

-creşterea plantelor înmulţite in vitro este mai puternică, fapt datorat juvenilizării şi devirozării. Astfel, Cameron şi colab. (1986) au observat la căpşun, că creşterea mai puternică a explantelor obţinute in vitro se datorează modificărilor survenite în schimburile gazoase ale acestora;

-este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele care decurg de aici;

-plantele cultivate in vitro pot fi transportate în condiţii de siguranţă fitosanitară desăvârşite, putând fi schimbate, exportate sau importate;

-pentru iniţierea unei culturi in vitro este nevoie de o cantitate redusă de material biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se poate realiza o selecţie drastică a materialului biologic şi în plus se pot înmulţii indivizi deosebiţi obţinuţi prin hibridări sau mutante apărute;

-se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil;

-oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creşterea productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii producţiei determinată de efectul sezonier. Se poate, de asemenea, planifica producţia de plante obţinute in vitro în funcţie de necesităţile concrete ale pieţei;

-înmulţirea in vitro permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea cu toate dezavantajele pe care le presupune;

-materialul produs in vitro poate să fie conservat prin diferite metode şi folosit în momentul în care este cerut;

Pentru ameliorarea plantelor, micropropagarea oferă avantaje suplimentare:

-se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi;-se pot obţine şi înmulţii clone homozigote care să fie folosite pentru

obţinerea hibrizilor F1;

245

-prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi in vitro se pot obţine şi selecţiona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la regenerarea de lăstari adventivi din mezofil;

-prin cultura explantelor in vitro în condiţii extreme se poate realiza selecţia la factorii de stres a genotipurilor noi (ex. selecţia la aluminiu);

-manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără folosirea culturilor de celule şi protoplaşti in vitro;

-anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă; haploizi, mutante sterile, liniile mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizi, sau heterozigoţi deosebiţi;

-materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de explante in vitro.

Folosirea micropropagării este limitată, în unele cazuri, de anumite dezavantaje pe care aceasta le prezintă:

-în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit in vitro este redusă;

-plantele înmulţite in vitro prezintă, uneori, „defecte” caracteristice şi după ce sunt trecute in vivo: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze necaracteristice, prezenţa spinilor, lăstărire adventivă, fructificare întârziată, vigoare exagerată, pierderea caracterului dominant;

-uneori, înrădăcinarea explantelor înmulţite in vitro este greoaie sau imposibilă. De regulă, rădăcinile formate in vitro au o funcţionalitate redusă ele fiind înlocuite de alte rădăcini în faza de aclimatizare;

-aclimatizarea plantelor obţinute in vitro este, la unele specii, foarte dificilă datorită unor modificări morfo-anatomice şi fiziologice care apar pe durata cultivării in vitro. Pentru realizarea aclimatizării trebuie construite structuri speciale – sere, solarii, dotate cu dispozitive de control al factorilor de mediu;

-clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a unor clone de către rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior. Pentru evitarea acestor situaţii se va recurge la varianta înmulţirii şi plantării multiclonale;

-capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă prin subculturi repetate;

-în anumite situaţii, sterilizarea totală a materialului iniţial este dificilă sau imposibil de realizat;

-microînmulţirea in vitro presupune existenţa unor structuri specializate şi a unei forţe de muncă specializate.

246

11.1.2 Fazele multiplicării in vitro

11.1.2.1 Pregătirea materialului biologic

Prima fază a micropropagării este o etapă importantă mai ales pentru speciile lemnoase care trebuie să treacă printr-o fază de juvenilizare. Aceasta se poate realiza prin:

-tăieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creşterile noi;-prin butăşire;-prin altoiri repetate sau microaltoire.Materialul biologic juvenil se poate obţine prin germinarea seminţelor

sau sâmburilor atunci când este posibil.În acelaşi timp, faza de pregătire presupune cultivarea plantelor destinate

prelevării de explante, în spaţii închise pentru prevenirea sau reducerea contaminărilor sau pentru efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente.

11.1.2.2 Iniţierea şi stabilizarea

Faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului biologic, izolarea explantelor şi inocularea acestora pe un mediu de iniţiere. Mediile de iniţiere sunt, în general, variante ale mediilor obişnuite, recomandate pentru specia respectivă, având însă concentraţia de săruri redusă la jumătate. Frecvent se folosesc reţete de medii lipsite de fitohormoni.

În această fază este importantă realizarea culturii aseptice şi începerea creşterii explantelor. Pentru depistarea infecţiilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii bogate în zaharuri, peptone, etc.

11.1.2.3 Multiplicarea

Faza de multiplicare se întinde pe mai multe subculturi cu o durată de 3-4 săptămâni. În această fază scopul principal este creşterea ratei de multiplicare în condiţiile menţinerii stabilităţii genetice a materialului biologic.

Aceasta se poate realiza, în general, prin creşterea cantităţii de citochinine din mediu sau prin realizarea unei balanţe hormonale favorabile citochininelor.

Numărul de subculturi trebuie să fie limitat, în funcţie de specie, şi orice prelungire a fazei respective necesită verificări suplimentare a stabilităţii genetice a materialului.

247

11.1.2.4 Înrădăcinarea

Faza de înrădăcinare sau de pregătire a materialului pentru trecerea in vivo este o fază importantă care constă în reducerea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor, inducerea formării rădăcinilor sau chiar formarea rădăcinilor.

Frecvent, în această fază se folosesc medii de cultură adiţionate cu cărbune vegetal, lipsite de hormoni sau cu concentraţii ridicate de auxine. O altă variantă constă în cultivarea pe un mediu cu o concentraţie ridicată de auxine, o anumită perioadă, urmată de cultivarea pe un mediu fără hormoni. Foarte multe laboratoare optează însă pentru realizarea înrădăcinării concomitent cu aclimatizarea pentru a evita astfel pierderile de timp şi reactivi.

11.1.2.5 Aclimatizarea

Este etapa cea mai dificilă dintr-un protocol de micropropagare. Lăstarii înrădăcinaţi sau cu primordii de rădăcini sunt trecuţi în amestecuri de pământ şi apoi menţinuţi într-un spaţiu caracterizat prin umiditate relativ ridicată şi temperatură controlată.

Înainte de a fi folosit pentru plantare materialul săditor, atât cel de pomi fructiferi şi viţă-de-vie, cât şi cel de arbori trebuie să petreacă câteva luni în câmp (pepiniere) pentru creştere şi fortificare.

11.1.3 Cultura de meristeme şi apexuri

Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in vitro.

Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile să genereze în final plante întregi.

În general, se folosesc pentru iniţierea de culturi meristematice, meristemele terminale şi cele axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in vitro plăntuţe care sunt folosite apoi pentru înmulţirea rapidă.

Primele încercări de cultivare a meristemelor caulinare şi radiculare in vitro au fost făcute în 1922 de către Kotte la mazăre şi de către Robbins la porumb. Abia în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice de Lupinus albus şi Tropaeollum majus. Ulterior, Wetmore şi Morel, citaţi de Cachiţa-Cosma (1984), au studiat comportarea meristemelor provenite de la diferite specii, în diferite condiţii de cultură.

Epoca optimă pentru prelevarea meristemelor variază de la caz la caz. De regulă se evită perioadele de latenţă a organelor, când activitatea meristematică este redusă.

La garoafe, cel mai mare procent de supravieţuire l-au avut meristemele recoltate primăvara sau toamna devreme, pe când cele recoltate iarna au

248

înrădăcinat mai uşor, iar cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.

La cartof, meristemele recoltate primăvara şi vara formează plante care înrădăcinează mai bine decât cele recoltate în a doua parte a anului.

Prelevarea meristemelor se face după sterilizarea prealabilă a materialului vegetal.

La speciile lemnoase care prezintă meristeme protejate de catafilele mugurilor, sterilizarea poate să se facă la concentraţii mai ridicate ale agenţilor sterilizanţi.

Ulterior, prelevarea meristemelor se face la hotă sub o lupă binocular. Se înlătură treptat catafilele şi primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului şi a unor ace spatulate până se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau două tăieturi urmărind detaşarea unei cantităţi cât mai reduse din ţesutul aflat dedesubt.

Pentru uşurarea lucrului, la mugurii vegetativi proveniţi de la speciile lemnoase înainte de „dezvelirea” domului meristematic, sub lupă, se poate recurge la eliminarea prin patru tăieturi paralele cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora. Tăierea se va face antrenând şi scoarţa adiacentă de pe ramură şi înlăturând astfel şi eventualele riscuri de infecţie.

După detaşare, meristemul este aşezat uşor de pe lama bisturiului pe mediul de cultură. Se poate practica, cu ajutorul vârfului bisturiului, o uşoară incizie în masa mediului în care se va aşeza meristemul.

Mediul de cultură folosit este, de regulă, mediul solid, putându-se însă folosi şi medii lichide, meristemele aşezându-se în acest caz, pe punţi de hârtie de filtru.

Frecvent se recomandă reducerea conţinutului de macroelemente la jumătate (Standardi, 1982), iar pH-ul mediului variază între 5,5 – 5,8.

Concentraţiile de hormoni sunt reduse 0,1-0,5 µm/l, auxinele şi citochininele fiind indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele pentru stimularea alungirii lăstarilor.

Intensitatea luminoasă variază de la caz la caz, în general recomandându-se 2400-2600 lucşi, cu o fotoperioadă de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. La unele specii incubarea meristemelor la întuneric timp de câteva zile (2-6) are ca efect reducerea brunificărilor (Stănică şi colab., 1992).

Există situaţii când intensitatea luminoasă trebuie să atingă valori cuprinse între 3000-4000 lucşi sau chiar de 10000 lucşi la conifere. Uneori, se recomandă suplimentarea luminii fluorescente , cu lumină roşie.

Temperatura optimă este de 22-25oC, dar la unele specii (viţa-de vie) incubarea meristemelor la temperaturi mai ridicate poate avea un efect mai drastic în eradicarea virusurilor.

După începerea formării lăstarilor din meristeme se trece la înmulţirea acestora, folosind cel mai adecvat procedeu în funcţie de specie.

249

Astfel, se poate realiza minibutăşirea lăstarului prin secţionarea lui în fragmente uninodale sau stimularea lăstăririi axilare şi izolarea lăstarilor formaţi.

Avantajele folosirii meristemelor sunt multiple:-posibilitatea înmulţirii clonale a materialului biologic valoros;-eliminarea bolilor şi dăunătorilor periculoşi;-obţinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de multiplicare;-conservarea la temperaturi scăzute a inoculior valoroşi până în

momentul folosirii;-posibilitatea realizării băncilor de gene.

11.1.4 Cultura de apexuri

Pe lângă folosirea meristemelor , iniţierea culturilor in vitro se poate realiza prin folosirea unor apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în formare, este detaşat după o prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai bun moment pentru inoculare este perioada de creştere intensă a lăstarilor.

Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În aceste cazuri însă gradul de infectare a materialului este ridicat.

O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la forţare a unor ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se parafinează la vârf şi eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se pun apoi în vase cu apă la temperatură ridicată, în camera de creştere, urmând ca în 10-14 zile mugurii să se deschidă şi să formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea apexurilor.

În tabelele 11.1 şi 11.2 sunt prezentate câteva din realizările obţinute prin cultura de meristeme şi apexuri la plantele horticole lemnoase, pomi şi arbuşti fructiferi, arbori şi arbuşti ornamentali. Sunt indicate atât mediile de cultură folosite, cât şi rezultatul cercetărilor.

11.1.5 Cultura de fragmente uninodale

Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură.

Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp vor fi secţionaţi din nou.

Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi înrădăcinarea acestora au fost efectuate de Galston (1947, 1948) şi Gorter (1965) la asparagus.

250

Tabelul 11.1Culturi de meristeme şi apexuri la pomii şi arbuştii fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Ananas comosus

Lăstari axilari MS (1962) 30 - 1,8 ANA; 2 AIB; 2 KIN

Matheus şi Rangan (1979)

Lăstar unic MS (1962) 30 - 25% CM Zepeda şi Sagawa (1981)

Castanea sativa

Lăstar unic Rodriquez (1982 b) K(h)

5,5 30 6 1 AIB Rodriquez (1982 c)

lăstari Rodriquez (1982 b) K(h)

5,5 30 6 0,06 AIB; 1 BAP

Rodriquez (1982 c)

Proliferare lăstari

Vieitez şi Vieitez (1980 b)

5,5 30 7 0,1 BAP Vieitez şi Vieitez (1980 b)

Citrus sp. Lăstari axilari şi adventivi

Bouzid (1975) A 5,8 30 8 1 ANA; 1 KIN

Bouzid (1975)

Cocos nucifera

Rizogeneză D’Souza (1982) BM 68,4 6,5 1-2 ANA;12% CM

D’Souza (1982)

Fragaria

Lăstari devirozaţi

Mullin şi colab. (1974) B

5,7-5,8

30 glucoză - 2,5 AIA;0,1 KIN

Mullin şi colab. (1974)

White (1954) - săruri 20 7 10% CM Miller şi Belkengren (1963)

Adams (1972) 5,2 30 - 1 AIB; 0,1 BAP Adams (1972)Proliferare

lăstariBoxus (1974 a) 5,6 22 glucoză 7 1 BAP Boxus (1974)

Lăstari Mullin şi colab. (1974)

4,5 30 glucoză - 1 AIA Mullin şi Schlegel (1976)

251

Tabelul 11.1 (continuare)Culturi de meristeme şi apexuri la pomii şi arbuştii fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Malus x domestica

Proliferare lăstari

MS (1962) 5,3 20 7 1,1 BAP Lane (1979)

Proliferare lăstari

Jones şi colab. (1977)

5,2 30 7 1 AIB; 1 BAP; 0,1 GA3

Snir şi Erez (1980)

Musa cavendishii

Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA; 1 KIN; Ma şi colb. (1978)

Musa textilisLăstari axilari şi adventivi

Mante şi Tapper (1983)

5,7 30 5-8 2 BAP Mante şi Tapper (1983)

Prunus cerasifera

Proliferare lăstari axilari

LS (1965) 5,8 30 7 0,5 BAP Norton şi Norton (1986)

Rubus idaeusCreştere lăstari Donnelly (1982) 5,7 30 - Donnelly şi colab.

(1982)

Rubus sp.Lăstari axilari Skirvin şi Chu

(1978)5,8 30 10 0,1 ANA; 2 BAP Skirvin şi Chu (1978)

Vaccinium sp.Proliferare

lăstariGoldy şi Lyrene

(1984)5,7 30 4 10 2IP; Goldy şi Lyrene (1984)

Lăstari axilari Smagula şi Lyrene (1984)

5,7 30 - 5 2IP Smagula şi Lyrene (1984)

252

Tabelul 11.2Culturi de meristeme şi apexuri la arbori şi arbuşti ornamentali

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Hedera helix

Înrădăcinare (sub lumină puternică)

Hackett (1970) 5,8 20 - 5-10 ANA sau 10 AIA + 5,5

catechol

Hackett (1970)

Înrădăcinare (sub lumină

slabă)

Hackett (1970) 5,8 20 - 10 AIA + 5,5 catecho

Hackett (1970)

Lăstari Polito şi Alliata (1981)

5,6 20 8 0,5 ANA; 2 BAP Polito şi Alliata (1981)

Lavandula augustifolia

Calus Kharta (1974) 5,5 20 7 1 ANA; 4 BAP; 10% CM

Quazi (1980)

Pinus sylvestris

Înmugurire Bornman şi Janson (1980)

5,6-5,8

50,5 6-7 2,2 BAP; 1-2 2IP Bornman şi Janson (1980)

Syringa vulgaris

Dezvoltare lăstari

Wetmore (1954) 20 10 15% CM Wetmore (1954)

Weigela florida

4 lăstari/expl. MS (1962) 30 6,5 2,25 BAP Calvert şi Stephens (1986)

253

Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de lăstari (apexuri), muguri aflaţi la subsioara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum şi alte organe capabile să genereze lăstari in vitro.

De regulă, în mediul de cultură, nu se adaugă citochinine care să anuleze efectul dominanţei apicale. Se urmăreşte de fapt, alungirea lăstarilor pentru a obţine un număr cât mai mare de noduri.

Iniţierea culturii este foarte importantă. În vederea stabilizării trebuie realizată juvenilizarea materialului iniţial.

La speciile lemnoase un alt aspect important îl reprezintă necesitatea întreruperii dormansului mugurilor după inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi scăzute (0-5 oC), mărirea duratei perioadei de iluminare (16 h), asociată cu temperaturi scăzute, urmată apoi de creşterea temperaturii.

Uneori se recomandă creşterea concentraţiei de citochinine şi gibereline.La speciile erbacee, dormansul se poate întrerupe prin etiolarea

materialului.Rata multiplicării este direct proporţională cu viteza de creştere a

lăstarilor, respectiv cu numărul de frunze care se formează.De regulă, lăstarii formaţi din apexuri cresc şi se alungesc mai rapid

decât cei formaţi din muguri axilari. De aceea, ei sunt trecuţi în vase de cultură separate.

Folosirea mediului de cultură în dublu strat (solid şi lichid) a avut ca efect accentuarea vitezei de creştere a lăstarilor de gutui BA-29 (Stănică F. şi colab., 1996).

De asemenea, folosirea apei structurate, şi a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a stimulat creşterea lăstarilor de măr (Săvulescu Anca şi Stănică F., 1996).

La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creşterii lăstarilor este posibilă prin folosirea zeatinei sau a 2IP (Pierik şi colab., 1986).

La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerării, pot fi folosiţi numai lăstari ortotropi. La cafea, în schimb are loc o transformare a lăstarilor plagiotropi în ortotropi (Pierik, 1987).

Metoda de faţă se foloseşte cu succes la foarte multe specii (viţă-de-vie, păr, trandafir, iederă, salcie pletoasă), (tabelele 11.3 şi 11.4).

După mai multe cicluri de multiplicare este necesară inducerea înrădăcinării lăstarilor obţinuţi. Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la întuneric.

În faza de alungire a rădăcinilor, concentraţia de auxine trebuie redusă.

254

11.1.6 Cultura de lăstari axilari

Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără stimularea alungirii lăstarului mamă.

Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale a mugurelui. Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial.

Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru prima dată de către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus (1973, 1974) la căpşun şi de Pierik (1973, 1974, 1975) şi Murashige (1974) la gerbera. După descoperirea chinetinei, eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea acesteia, iar ulterior prin utilizarea altor citochinine.

Frecvent, această metodă de micropropagare este folosită în tandem cu cultura de fragmente uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar, apoi acest lăstar este trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este stimulată formarea lăstarilor axilari.

Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje:-este simplă;-rata de multiplicare este relativ ridicată;-stabilitatea genetică este asigurată;-este unica metodă de multiplicare in vitro eficientă la plantele care cresc

în rozetă (ex: căpşun).Necesarul de citochinine este diferit în funcţie de specie. La multe specii

s-a observat scăderea necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită acumulării acestora dar, mai ales datorită juvenilizării lăstarilor.

Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de citochinine în mediul de cultură decât cel provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).

Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi concentraţii ridicate de citochinine. Raportul citochinine:auxine cel mai recomandat este de 10:1.

Felul citochininelor folosite este şi el important. Cele mai multe specii reacţionează bine la utilizarea BAP (benzil aminopurină) şi mai puţin bine la chinetină sau 2-iP.

Tidiazuronul şi compuşii de substituţie ai piridil-fenil-ureei stimulează, uneori, mai mult lăstărirea axilară decât citochininele (Read şi colab., 1986).

255

În multe situaţii se recomandă distrugerea mugurelui apical şi asocierea acestei măsuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creşterea eficienţei metodei, citochininele trebuie aplicate după ce lăstarul s-a alungit.

Creşterea concentraţiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului, ceea ce trebuie evitat pentru a reduce probabilitatea apariţiei variabilităţii somaclonale.

La unele specii (Ananas), formarea lăstarilor este uneori stimulată de folosirea mediului de cultură lichid.

De regulă, capacitatea de proliferare scade odată cu creşterea numărului de subculturi, acest fenomen fiind frecvent însoţit şi de formarea calusului.

Astfel, la căpşun, de exemplu, depăşirea unui număr de 12 subculturi a avut ca efect apariţia unor modificări fiziologice majore.

Metoda lăstăririi axilare poate fi folosită atât pentru plantele care cresc în rozetă cât şi pentru plantele care formează lăstari normali.

Mărirea concentraţiei de citochinine din mediul de cultură, în vederea stimulării lăstăririi axilare, poate avea ca efect apariţia fenomenului de „tufă”, fenomen care poate continua şi după subcultivarea explantelor pe medii lipsite de citochinine în vederea alungirii sau înrădăcinării.

În prezent, metoda este mult folosită la micropropagarea materialului săditor pomicol, în multe ţări fiind generalizată (Italia, Franţa, Anglia).

În tabelele 11.5 şi 11.6 sunt prezentate câteva din cercetările efectuate în micropropagarea prin lăstărire axilară la plantele horticole lemnoase.

11.1.7 Organogeneza adventivă

Organele şi ţesuturile cultivate in vitro în anumite condiţii au capacitatea de a diferenţia centri meristematici care ulterior dau naştere la lăstari sau rădăcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.

Formarea adventivă a lăstarilor şi rădăcinilor poartă denumirea de organogeneză. Aceasta poate fi de două feluri: directă sau indirectă, după cum organele respective se formează direct din explantele inoculate sau se trece printr-o fază intermediară de calus.

În general, factorii care influenţează pozitiv organogeneza şi formarea lăstarilor adventivi sunt numeroşi:

-plantele juvenile au o capacitate organogenetică ridicată; la gimnosperme regenerarea de lăstari adventivi este posibilă doar folosind embrioni, puieţi tineri sau părţi ale acestora (David, 1982);

-zaharurile stimulează organogeneza directă cu formarea de lăstari;-giberelinele şi acidul abscisic inhibă organogeneza;-lumina stimulează, în general, procesul de organogeneză.Există şi o serie de specii care necesită o perioadă de întuneric.

256

Tabelul 11.3Cultura de fragmente uninodale la arbori şi arbuşti ornamentali

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Acer negundoCalus MS

(1962)20 6 3 ANA;

15%CMRadojevic şi colab.

(1980)Betula

verrucosaCalus Chalupa

(1981)30 6 0,05 AIB;

0,6 BAPChalupa(1981)

Paulownia tomentosa

Muguri axilari Ben-Jaacov şi Dax(1981)

5,6 30 6,5 0,1 ANA;1 BAP

Burger şi colab.(1985)

Quercus robur

Lăstari Chalupa (1984) BTM sau WPM

20 6 0,2-1 BAP Chalupa(1981)

Salix babylonica

Lăstari Morel şi Martin(1955)

15Glucoză

8 Daguin şi Letouze(1986)

Lăstari Daguin şi Letouze(1986)

15Glucoză

8 Daguin şi Letouze(1986)

Salix madsudana

Lăstari adventivi şi

axilari

Whitehed şi Giles 5,8 20 6,5 0,01 ANA;0,05 BAP

Bhojwani(1980)

Tilia cordataLăstari axilari Chalupa

(1984) WPM20 6 0,2-1 BAP;

0,1 ANA sau AIB

Chalupa(1981)

Vinca minorProliferare

lăstariStapfer şi Heuser

(1985)5,6-5,8

30 7 0,018-0,18 ANA14,4 BAP

Stapfer şi Heuser(1985)

257

Tabelul 11.4Cultura de fragmente uninodale la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Actinidia deliciosa

Lăstari înrădăcinaţi

Harada (1975)

5,5 20 7 0,1 ANA;40 Ad;

Harada (1975)

Armeniaca vulgaris

70% lăstari Lloyd şi McCown(1981) WPM

5,2 20 6 2 2IP Snir(1984)

Castanea mollissima

Proliferare lăstari axilari

Yang (1986)

5,5 20 6,5 0,1 BAP Yang şi colab.(1986)

Castanea sativa

Proliferare lăstari axilari

San Jose (1984)

30 6 0,1 BAP San Jose şi colab.(1984)

Proliferare lăstari

Heinz şi Mee(1969)

5,5 30 6 1 BAP Vieitez şi Vieitez (1980 b)

Citrus sp.Proliferare

lăstari LS

(1965)5,7 30 10 1 BAP;

100 AdS;Navarro şi colab.

(1975)Corylus avellana

Embriogeneză directă

Cheng (1975) Basal

5,5 30 8 0,1-1 AIB Perez şi colab.(1986)

Juglans hindisii x J.

regia

Multiplicare lăstari

Driver şi Kuniykuhi(1984) DKW

5,5 30 2 gelrite

0,001 AIB;1 BAP;

Driver şi Kuniykuhi(1984)

Juglans regiaLăstari Chalupa

(1981)30 6 0,15 ANA;

0,1 BAP;Chalupa(1981)

Olea europeaProliferare

lăstariRugini şi Fontanazza

(1981)5,8 30 6 0,5 AIB;

0,5 GA3;Rugini şi Fontanazza

(1981)

258

Tabelul 11.4 (continuare) Cultura de fragmente uninodale la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Pyrus communis

Lăstar unic MS(1962)

5,8 30 8 0,45 BAP Shen şi Mullins(1984)

Rubus idaeusLăstar unic Snir

(1981)5,0 20 6,5 0,22 2,4 D

1 BAP;0,1 GA3

Snir(1981)

Theobroma cacao

Proliferare lăstari axilari

Passey şi Jones(1983)

5,2 30 7 0,2 BAP Passey şi Jones(1983)

Vaccinium corymbosum

Lăstari axilari Cohen şi Elliot(1979)

5,7 30 6 5 2IP Cohen şi Elliot(1979)

1-2 lăstari/expl. Lloyd şi McCown(1981) WPM

5,2 30 6 5 2IP Wolfe şi colab.(1983, 1986)

Vaccinium sp.Lăstari axilari Smagula şi Lyrene

(1984) WPM5,7 30 4 5 2IP Smagula şi Lyrene

(1984)

259

Tabelul 11.5Cultura de lăstari axilari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Ananas comosus

Plantule Lakshni Sita (1974)

5,8-6 20 9 1 ANA Lakshni Sita (1974)

Plantule MS (1962) 30 6,5 Mapes (1973)Lăstari multipli MS (1962) 30 - 1,8 ANA, 2 AIB,

2 KINMatheus şi Rangan

(1979)Creştere lăstari 0,5 x MS (1962) 30 - 25%CM Zepeda şi Sagawa (1981)

Castanea sativa

Proliferare lăstari

Vieitez şi Vieitez(1980)

5,5 30 6 1-2 BAP Vieitez şi Vieitez(1980)

Ficus carica

Lăstar unic MS (1962) 5,8 30 8 0,18 ANA, 0,1 BAP, 0,03 GA3

Muriithi(1982)

Proliferare lăstari

LS (1965) 5,2 30 7 0,5 BAP, 0,1 AIB, 0,1 GA3

Pontikis şi Melas(1986)

Glossularia redinata

Creştere lăstari şi rădăcini

Jones şi Vine (1968)

5,6-5,8

40Glucoză

- Jones şi Vine (1968)

Dezvoltare lăstari

Jones şi Vine (1968)

5,6-5,8

40Glucoză

- 1 AIB, 0,2 BAP, 1 GA3

Jones şi Vine (1968)

Malus x domestica

8 lăstari/ explant

LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,99 BAP, 0,48 GA3

Van Nieuwkirk şi colab.(1986)

Mussa sp.Lăstar unic Heinz şi Mee

(1979)5,8 40 7 5 BAP Cronauer şi Krikorian

(1984)

Rubus idaeusProliferare

lăstariAnderson

(1978, 1980)5,7 30 6 0,1 AIB, 4 BAP Anderson

(1979)

260

Tabelul 11.6Cultura de lăstari axilari la arbori şi arbuşti ornamentali

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiRezultat Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Clematis sp. Lăstari multipli LS (1965) 30 6 10 BAP Kratz şi Langhans (1978)Cotoneaster

dammeriLăstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton şi Boe

(1982)Crataegus

rachzacanthaLăstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton şi Boe

(1982)Fraxinus

americanaLăstari multipli Lloyd şi McCown

(1981)5,2 20 Lichid 5-10 BAP Heiman şi Preece

(1983)Hydrangea

macrophylla6 lăstari/explant Gamborg

(1968)5,5 20 2

gelrite1,8 BAP Bailey şi colab.

(1986)Proliferare

lăstariMiller şi Murashige

(1976)5,7-5,8

20 7 1 BAP Stoltz (1984)

Lavandula augustifolia

Plantule Kartha (1974) 5,5 20 7 2 2,4D, 4 BAP, 10%CM

Quazi (1980)

Picea glaucaProliferare

lăstariRumary şi Thrope

(1974)5,9 30 8 Rumary şi Thrope

(1984)

261

Rezultatele obţinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stănică F. (1996), au dovedit importanţa întunericului în faza de inducţie pentru stimularea organogenezei adventive din limb foliar la portaltoiul de măr M-27:

-poziţia explantului este de asemenea foarte importantă; în cazul limbului foliar, la majoritatea speciilor, acesta trebuie aşezat cu partea inferioară pe mediu. Uneori se recomandă crestarea nervurilor frunzei înainte de inoculare;

-fitohormonii influenţează organogeneza în mod diferit; există specii care nu necesită aport suplimentar de auxine sau citochinine în mediu pentru declanşarea organogenezei chiar dacă aceste substanţe stimulează apoi acest proces;

-marea majoritate a speciilor formează lăstari adventivi în prezenţa citochininelor în timp ce auxinele inhibă procesul. Uneori acest lucru este posibil şi atunci când este vorba de explante de tipul peţiolului, rădăcinilor sau internodurilor (Stănică F., 1995);

-cea mai folosită citochinină este BAP, iar pentru gimnosperme este singura recomandată. Celelalte citochinine sunt mai puţin utilizate;

-concentraţii ridicate de citochinine (în special BAP) poate determina dereglarea procesului de organogeneză. Se recomandă în această situaţie alternarea culturii pe două medii cu concentraţii diferite;

-zeatina a avut un rol important în procesele de organogeneză la kiwi pornind de la diferite tipuri de explante (Stănică F. şi colab., 1995, 1998). De asemenea TDZ (tidiazuronul) şi 2 –iP (2 izopenteniladenina) au determinat efecte spectaculoase de stimulare a lăstăririi adventive;

-adenina sulfat poate stimula organogeneza adventivă la ulm (Jacquiot, 1951). În combinaţie cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea lăstarilor adventivi (Skoog şi Miller, 1975; Nitsch şi colab., 1969);

-acidul abscisic inhibă formarea lăstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor;

-substanţele antiauxinice, cele care inhibă transportul auxinelor au ca efect stimularea organogenezei adventive;

-vitaminele stimulează formarea lăstarilor adventivi la ulm (Jacquiot, 1951);

-infectarea materialului iniţial cu Agrobacterium tumefaciens rasa C58, a stimulat organogeneza adventivă la plop (Steffen şi colab., 1986). Efectul s-a datorat şi juvenilizării materialului iniţial datorită acţiunii bacteriei.

În tabelele 11.7 şi 11.8 sunt prezentate câteva din rezultatele obţinute în organogeneza adventivă la pomi, arbuşti fructiferi, arbori şi arbuşti ornamentali.

262

Tabelul 11.7Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Actinidia deliciosa

Fragmente rădăcini

Harada (1975) 5,5 20 7 1 Z, 40 Ad Harada (1975)

Fragmente lăstari

MS (1962) 30 6,5 1Z Kwei şi colab. (1980)

Fragmente lăstari

Monette (1986) 5,7 22,5 7 0,023 AIB, 2 BAP, 60 AdS

Monette (1986)

Amygdalus communis

Lăstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP Hisajima (1982)Lăstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP,

0,005 AIBHisajima (1982)

Lăstari MS (1962) 5,8 30 9 0,1 ANA, 0,7 BAP

Ruginii şi Verma (1982,1983)

Calus Matheus şi Rangan (1981)

30 6,5 5%CM Matheus şi Rangan (1981)

Ananas comosus

Lăstari 0,5 x MS (1962) 30 - 0,5-1 AIB Zepeda şi Sagawa (1981)

Armeniaca vulgaris

Fragmente lăstari

Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Skirvin (1980)

Castanea sativa

Epicotil San Jose (1984) 30 6 0,1 AIB, 2 BAP San Jose (1984)

Cerasus avium

Fragmente lăstari

Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, 0,1 GA3

Seirlis şi colab.(1979)

263

Tabelul 11.7 (continuare)Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Cerasus vulgaris

Fragmente lăstari

Skirvin (1980)

5,7 20 6,5 Skirvin şi colab.(1980)

Lăstari Skirvin şi Chu (1978)

5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin şi colab.(1981)

Citrus sp.

Fragmente rădăcini

Hoagland şi Snyder(1933)

- - Murashige şi colab.(1972)

Fragmente lăstari (5 cm)

Kitto şi Young(1981)

5,6-5,8

30 -40 10 5 BAP, 80 AdS Kitto şi Young(1981)

Corylus avellana

Calus Radojevic (1975)

20 8-10 1 KIN, 2 Ad Radojevic (1975)

Calus Radojevic (1975)

20 8-10 1 KIN, 2 Ad, 1GA3

Radojevic (1975)

Diospyros kaki

Calus Yokoyama şi Takeuchi (1976)

5,6-5,8

30 7 1 ANA, 0,1-1 KIN

Yokoyama şi Takeuchi (1976)

FragariaFragmente

lăstariMS (1962) 5,6 30 7 0,2-1 AIB, 1,1

BAP, 1 GA3

Anderson şi colab.(1982)

Glossularia redinata

Fragmente lăstari

MS (1962) 5,5 30 6 0,1 AIB, 0,49 BAP

Walender (1985)

Juglans regia

Lăstari Chalupa (1981) 30 6 0,1-0,3 ANA, 0,1-0,6 BAP

Chalupa (1981)

Seminţe 0,5 x Rodriguez(1982)

5,5 30 6 9 BAP Rodriguez(1982)

264

Tabelul 11.7 (continuare)Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Malus x domestica

Fragmente lăstari

Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP,0,1 GA3

Jones (1977)

Cotiledon Kartha (1974) 5,8 30 8 1 ANA, 0,3 BAP Liu şi colab. (1983)Calus Kartha (1974) 5,8 30 8 1 BAP Liu şi colab. (1983)

Calus din cotiledon

White (1943) 20 6,5 4 ANA, 2 KIN, 1 GA3, 15%CM

Mehra şi Sachdeva (1979)

Calus din embrion

White (1943) 20 6,5 2 ANA, 2 BAP, 15%CM

Mehra şi Sachdeva (1979)

Lăstari Jones (1977) 5,2 30 7 1 AIB, 1 BAP, 0,1 GA3

Snir şi Erez(1980)

Lăstari LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,48 GA3 Van Nieuwkirk şi colab.(1986)

Muguri dorminzi/lăstar

Zimmerman(1984)

20 7 0,01 AIB, 0,09 BAP Zimmerman(1984)

Morus alba

Fragmente lăstari

Lakshmi-Sita(1976)

5,6 30 8 1 BAP Oka şi Ohyama(1981)

Fragmente lăstari

Lakshmi-Sita(1976)

5,6 30 8 10 BAP Oka şi Ohyama(1981)

Muguri MS (1962) 5,6 30 8 10 BAP Oka şi Ohyama (1981)Musa

acuminataLăstari Krikorian şi Cronauer

(1984)5,8 40 - 4,95 BAP, 10%CM Krikorian şi Cronauer

(1985)

265

Tabelul 11.7 (continuare)Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Musa cavendishii

Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA, 1 KIN Ma şi colab. (1978)

Musa spp.Lăstari Heinz şi Mee (1979) 5,8 40 7 5 BAP Cronauer şi Krikorian

(1984)

Musa textilisLăstari Mante şi Tepper

(1983)5,7 30 5-8 0,1 AIB, 3-5 BAP,

160 AdSMante şi Tepper

(1983)Persica vulgaris

Lăstari Miller (1982) 20 8 0,1 ANA, 2 BAP Miller (1982)Lăstari Skirvin şi Chu (1978) 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin şi Chu (1978)

Phoenix dactylifera

Fragmente lăstari

LS (1965) 5,7 30 8 0,1 2,4D sau ANA, 3 2-Ip, 40 AdS

Tisserat şi colab.(1979)

Calus Thompson şi Gordon(1977)

5,6-5,8

30 8 Tisserat şi colab.(1982)

Fragmente lăstari

Tisserat (1984) 5,6-5,8

30 8 10 2,4D Tisserat şi colab.(1984)

Pistacia vera

Seminţe 0,5 x MS (1962) 5,8 - - Barghchi şi Alderson(1983)

Lăstari MS (1962) 5,8 - 7 4 BAP Barghchi şi Alderson(1983)

5-8 mm lăstari MS (1962) 30 7 4 BAP Barghchi şi Alderson(1985)

266

Tabelul 11.7 (continuare)Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Prunus domestica

Fragmente lăstari

Pietropaolo şi Reisch(1984)

5,8 30 7 1,1 BAP Pietropaolo şi Reisch(1984)

Fragmente lăstari

Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Nu sunt menţionaţi Skirvin (1980)

Prunus insititia

Fragmente lăstari

Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, 0,1 GA3

Jones şi Hopgood (1979)

Pyrus communis

Fragmente lăstari

Lane (1979) 5,2 30 7 1,13 BAP Lane (1979)

Fragmente lăstari

MS (1962) 5,8 30 8 1,36-2,25 BAP, 1,1 Z; 1,02 2-iP

Shen şi Mullins(1984)

Fragmente lăstari

LS (1965) 5,7-5,8

30 6 2 BAP Singha (1982)

Ribes nigrum

Fragmente lăstari

MS (1962) 5,7 20 6 1,35 BAP Flegmann şi Wainwright (1981)

Fragmente lăstari

Jones şi Vine (1968) 5,6-5,8

40Glucoză

- Jones şi Vine (1968)

Rubus idaeus

Lăstari Donnely (1980) 5,7 30 6,5 0,1 AIB; 1 BAP Donnely (1980)Lăstari Snir (1981) 5 20 Gelrite 0,22 2,4D; 1 BAP; 0,1

GA3

Snir (1981)

Lăstari cu noduri

Welander(1985)

5,2 30 6 1 BAP Welander(1985)

267

Tabelul 11.8Organogeneza adventivă de lăstari la arbori şi arbuşti ornamentali

(după Stănică, 1999)Denumirea

specieiExplant Mediu de cultură pH Zaharoză

(g/l)Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Acer rubrum x Acer saccharum

Fragmente lăstari

MS (1962) 5,7 30 10 0,1-0,5 Thidiazuron Kerns şi Meyer (1985)

Betula pendula

Calus Simola (1985) 5,6 20 6 5-10 Z; 0,1-0,2 ANA Simola (1985)Calus Srivastava şi

Steinhauer (1981)5,8 40 6 2 AIA; 6 KIN; 40 Ad Srivastava şi

Steinhauer (1981)Frunze Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 2 AIA; 5 Z; 2 GA3 Srivastava (1985)

Fragmente lăstari

Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 0,5 ANA; 5 2 iP; 30 Ad

Srivastava (1985)

Betula verucosaCalus Chalupa (1981) 30 6 0,05 AIB; 0,2 BAP;

20 AdSChalupa (1981)

Biota orientalis (thuja)

Hipocotil Thomas şi Tranvan(1982)

5,4 30 8 0,1 AIB; 1,1 BAP Thomas şi Tranvan(1982)

Chaenomeles japonica

Fragmente lăstari

LS (1965) 5,8 30 7 2,5 BAP Norton şi Boe (1982)

Crataegus rachyacantha

Fragmente lăstari

LS (1965) 5,8 30 7 0,1-1 BAP Norton şi Norton (1986)

Fraxinus americana

Fragmente lăstari

Lloyd şi McCown(1981)

5,2 20 6 0,5 – 1 BAP Heiman şi Preece(1983)

268

11.1.8 Embriogeneza somatică

Embriogeneza somatică a fost realizată pentru prima dată, în anul 1958, de Reinert şi Steward, la morcov, din calus şi suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralelă între formarea embrionilor zigotici şi a celor somatici, fapt uşurat de folosirea laptelui de cocos în mediul de cultură.

Thomas şi colab. (1979) au reuşit inducerea de embrioni somatici la ţelină, o altă reprezentantă a familiei Umbeliferae.

În formarea embrionilor somatici se disting mai multe etape:-dediferenţierea celulelor diferenţiate şi începerea diviziunii;-formarea celulelor parenchimatice, începerea diviziunii şi creşterea

conţinutului de citoplasmă sub influenţa auxinelor. Astfel are loc transformarea celulelor parenchimatice în celule embriogene. Acestea sunt mici, cu conţinut dens de citoplasmă, vacuolă mică, nuclei mari cu nucleoli mari şi un conţinut ridicat de grăunciori de amidon. Au activitate metabolică intensă şi de asemenea o sinteză a ARN-ului;

-formarea embrionilor din celule embriogene în absenţa auxinelor în mediu.

Formarea embrionilor somatici se poate face în interiorul calusului, sau la exteriorul acestuia. Embrionii somatici se mai pot forma în ţesutul nucelar şi hipocotil, sau pe organe florale, antere, grăunciori de polen, endosperm, embrioni zigotici. Embrionii somatici se formează dintr-o singură celulă care se divide şi formează o structură embrioidă.

S-a reuşit inducerea embriogenezei somatice la 132 specii din 81 de genuri, aparţinând familiilor: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae, Gramineae (Tisserat şi colab., 1979, citaţi de Pierik, 1987).

11.1.8.1 Embriogeneza somatică directă

Embriogeneza somatică directă constă în formarea embrionilor somatici sau a ţesuturilor embrionare direct din explantul inoculat iniţial. Embrionii somatici se pot forma din celule somatice, din celule nucelare la specii aparţinând genului Citrus, din celule epidermice şi hipocotil de morcov sau Brassica napus.

În vederea inducerii şi studierii embriogenezei somatice cel mai frecvent se recurge la culturi de embrioni zigotici imaturi. Ţesutul acestora are un pronunţat caracter embriogenic. Momentul optim pentru izolarea şi inocularea embrionilor zigotici in vitro este la aproximativ 14 zile de la polenizare.

Ca substrat nutritiv se folosesc medii de cultură care conţin cantităţi variabile de auxine, în special ANA şi 2,4D.

După sterilizare se face excizarea embrionului imatur şi inocularea lui pe mediu. După aproximativ o săptămână, la o parte dintre explante încep să se

269

diferenţieze embrioni somatici în diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluţie ale embrionilor somatici sunt: globulară, cordiformă, de torpilă şi cotiledonară. Se poate observa dezvoltarea asincronă a embrionilor, ceea ce poate determina suprapunerea diferitelor faze ale evoluţiei.

11.1.8.2 Embriogeneza somatică indirectă

Tehnica de micropropagare care constă în formarea embrionilor somatici din calus se numeşte embriogeneză somatică indirectă. După obţinerea şi multiplicarea calusului acesta este trecut pe un mediu de inducere şi formare a embrionilor somatici.

Capacitatea de regenerare din calus depinde de specie, tipul de explant utilizat iniţial, vârsta explantului sau numărul de subculturi.

Inducerea embriogenezei somatice este condiţionată de un număr însemnat de factori:

-concentraţia ridicată de auxine (mai ales 2,4 D), determină inducerea embrionilor somatici;

-acidul abscisic stimulează formarea embrionilor somatici în culturile de calus sau în suspensiile celulare;

-giberelinele şi etilena inhibă inducerea formării embrionilor somatici;-probabilitatea formării embrionilor somatici creşte la ţesuturile juvenile.

La speciile genului Citrus embrionii se formează numai în nucelă;-azotul redus sub formă de ioni de amoniu, potasiul şi concentraţia

ridicată de săruri stimulează formarea celulelor embriogene în masa calusului; în acelaşi timp, ionii de calciu influenţează negativ acest proces;

-lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice, existând însă şi specii care reacţionează mai bine la întuneric;

-temperatura ridicată, este un alt factor care stimulează formarea embrionilor somatici; la cultura de antere, în vederea inducerii embrionilor somatici, este necesar, la început, un şoc cu temperaturi scăzute;

-prezenţa în mediul de cultură a zaharozei (2-3%) şi a laptelui de cocos are un efect pozitiv asupra inducerii embrionilor somatici.

Ca urmare a capacităţii mai reduse de a forma embrioni somatici, la speciile horticole lemnoase, această tehnică de micropropagare este folosită mai puţin (tabelele 11.9 şi 11.10).

La speciile de conifere se studiază posibilitatea extinderii acestei metode pentru înmulţirea rapidă, pornind de la embrioni zigotici şi trecând prin faza de calus embriogen. Rata de multiplicare este ridicată şi rezultatele obţinute până în prezent sunt încurajatoare (Palada – Nicolau Magdalena, 1994).

270

Tabelul 11.9Embriogeneza somatică la pomi şi arbuşti fructiferi (după Stănică, 1999)

Denumirea speciei

Explant Mediu de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Actinidia deliciosa

Fragmente de rădăcini

Harada (1975) 5,5 20 7 0,1-1 2,4D; 40Ad Harada (1975)

Mangifera indica

Seminţe imature

Litz (1984) 5,7 30 - Litz (1984)

Fructe imature

Litz (1984) 5,7 60 8 1 2,4D Litz (1984)

Pheonix dactylifera

Fragmente de lăstari

LS (1965) 5,7 30 8 10 2,4D; 3 2iP; 40 AdS

Tisserat (1979)

Muguri laterali

Thompson şi Gordon(1977)

5,6-5,8

30 8 10 2,4D; 3 2iP Tisserat (1982)

Calus Tisserat (1984) 5,6-5,8

30 8 Tisserat (1984)

Tabelul 11.10Embriogeneza somatică la arbori şi arbuşti ornamentali (după Stănică, 1999)

Denumirea speciei

Explant Mediu de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Fitohormoni (mg/l)

Autori

Hedera helix Calus Banks (1979) 5,7 30 5 1 ANA; 0,5 BAP Banks (1979)Ilex aquifolium Embrioni LS (1965) 5,6 40 10 Hu şi Sussex (1972)

Larix deciduaCalus Nagmani şi Bogna

(1985)5,8 20 8 2 BAP Nagmani şi Bogna (1985)

Picea abies

Calus Von Arnold şi Erikson (1981)

5,8 34,2 5 2,2 2,4D; 1,1 BAP Hakman şi colab., (1985)

Embrioni maturi

Von Arnold şi Erikson (1981)

10 3 gelrite

2,21 2,4D; 1,13 BAP

Von Arnold şi Hakman (1986)

Quercus rubra Internod MS (1962) 30 6,5 5 ANA; 0,1 BAP Seckinger şi colab. (1979)

271

11.1.9 Poliembrionia nucelară

O serie de specii din genul Citrus formează în mod natural, în aceeaşi sămânţă, pe lângă embrionul zigotic şi unul sau mai mulşi embrioni somatici. Aceşti embrioni iau naştere din celule somatice diploide ale ţesutului nucelar. Ţesutul nucelar este un ţesut juvenil caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea ţesutului nucelar in vitro şi inducerea formării calusului s-au obţinut un număr mare de embrioni9 somatici la genul Citrus (Rangaswamy, 1981).

Formarea embrionilor somatici prin embriogeneză directă sau indirectă a fost posibilă prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz şi colab., 1985).

Embriogeneza somatică din ţesut nucelar este prezentă la mango (Mangifera indica) şi la alte specii pomicole tropicale. La fel ca în cazul citricelor, speciile cu tendinţe de poliembrionie in vivo au o capacitate ridicată de regenerare a embrionilor somatici in vitro.

Utilizarea poliembrioniei nucelare prezintă o serie de avantaje: permite înmulţirea „în masă” a speciilor monoembrionare; procesele de embriogeneză somatică sunt însoţite şi de devirozarea materialului vegetal obţinut; în paralel, se pot induce mutaţii şi se pot selecţiona mutantele utile; se realizează juvenilizarea materialului obţinut. În toate cazurile, folosirea pentru înmulţire a embrionilor somatici care conservă caracteristicile genetice ale plantelor mamă, deschide mari perspective în domeniul seminţelor artificiale (Standardi, 1998).

11.1.10 Embriocultura

Cultura embrionilor zigotici a apărut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme apărute în procesul ameliorării plantelor horticole.

În pomicultură, apare posibilă cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi care provin prin încrucişări de la soiuri extratimpurii şi timpurii de sâmburoase. În mod natural, aceşti embrioni nu ajung la maturitate datorită unor dereglări fiziologice care apar în procesul de creştere a seminţei şi fructului. În mod similar, în cazul unor hibridări interspecifice are loc avortarea embrionilor înaintea ajungerii lor la maturitate (Stănică F., Dumitraşcu Monica, Ion Ligia, 1977).

La viţa-de-vie nu este posibilă obţinerea unor descendenţi hibrizi atunci când se foloseşte ca genitor matern un soi apiren şi în acest caz, embrionul avortând timpuriu. Situaţii oarecum similare se întâlnesc şi la realizarea unor combinaţii hibride sau încrucişări între soiuri, specii sau genuri incompatibile.

Prin extragerea embrionului abia format cu o porţiune de ţesut nucelar, sau prin cultivarea ovulului fecundat se reuşeşte să se depăşească barierele incompatibilităţii.

Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se foloseşte pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus relativ al seminţelor.

De asemenea, în cazul unor combinaţii hibride valoroase se face înmulţirea materialului genetic înainte de realizarea selecţiei in vitro, sau materialul hibrid este supus unor procese de stres, înainte de a fi aclimatizat şi trecut în câmp.

Momentul începerii culturii variază de la specie la specie în funcţie de scopul urmărit. Astfel, la cireş, la 28-35 zile de la înflorire, la vişin, la 29-41 zile şi la piersic la 81-97 zile.

Un alt indiciu folosit este reprezentat de mărimea cotiledoanelor la piersic, momentul optim fiind când acestea ating 4-5 mm în diametru.

La cireş se mai recomandă iniţierea culturii în momentul întăririi sâmburelui, după aceea viabilitatea embrionilor scăzând până la momentul intrării în pârgă. Stabilizarea

272

culturilor de embrioni este relativ uşoară datorită faptului că sâmburii sau seminţele protejate de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraţii ridicate.

Compoziţia mediului de cultură este cu atât mai complexă cu cât embrionii se află într-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.

După inoculare, embrionii se lasă la întuneric timp de 30-60 zile la temperatura camerei pentru germinare, după care sunt trecuţi la lumină.

11.1.11 Microaltoirea in vitro

Constă în altoirea în condiţii aseptice a unui apex meristematic pe un portaltoi obţinut din seminţe sau din minibutaşi.

Portaltoii folosiţi trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:-să posede seminţe cu o bună capacitate germinativă pe mediile de cultură;-minibutaşul să aibă ţesuturi elastice şi turgescente;-minipuietul să posede cambiu activ, uşor depistabil;-ţesuturile să fie rezistente la oxidare;-să posede un aparat radicular bine format, capabil să crească în mediul de cultură.Portaltoiul poate fi obţinut din seminţe. În acest sens seminţele sunt scoase din starea

de latenţă fie prin tratamente cu fitohormoni (citochinine şi gibereline), sau prin tratamente cu temperaturi scăzute. Se înlătură apoi endocarpul, iar apoi se determină viabilitatea seminţelor prin imersie timp de câteva ore, a unor probe de seminţe într-o soluţie de clorură de 2,3,5 trifenil-tetrazoliu, 1%. Viabilitatea seminţelor este evidenţiată prin culoarea ţesuturilor seminţelor în culoare roşu intens.

Materialul este apoi sterilizat prin imersie în alcool 70% cca 1 min., urmat de imersia în hipoclorit de sodiu 7% timp de 20 minute, iar în final se clătesc seminţele în cinci reprize cu apă distilată sterilă.

Germinarea seminţelor se face pe mediu Murashige-Skoog solidificat cu 7 g/l agar. Incubarea se face la 22-24oC, la întuneric.

Portaltoii se pot obţine şi din minibutaşi, care, sub formă de fragmente uninodale se prelevează de pe plante libere de viroze.

Pregătirea altoiului. Altoiul constă dintr-un apex meristematic provenit fie din lăstari crescuţi in vitro, fie de la lăstari sau ramuri in vivo.

Altoirea propriu-zisă se face prin înlăturarea cotiledoanelor de la portaltoii obţinuţi din seminţe care apoi sunt secţionaţi transversal. Se secţionează de asemenea, transversal portaltoii vegetativi. Apexul meristematic, de dimensiuni foarte reduse se detaşează şi se aşează pe zona cambială a portaltoiului secţionat.Planta altoită se trece apoi într-un vas steril, pe mediu lichid pentru a asigura o atmosferă saturată în umiditate. Aclimatizarea se realizează când minialtoiul atinge 1,5-2,5 cm lungime, prin transplantarea plantei altoite în condiţii normale (Stănică, 1999).

273

CAPITOLUL XIV

14.1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTURĂ ÎN SOL – ACLIMATIZAREA

O plantă provenită din cultura in vitro diferă din multe puncte de vedere de una provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982; Sutter, 1985) prin următoarele aspecte:

1. La plantele crescute în condiţii in vitro stratul de ceară (cuticular) de la suprafaţa frunzelor şi tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativă într-un vas de cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie să se protejeze împotriva deshidratării. Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi pierderea unei cantităţi mari de apa din ţesuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult scăzută comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subţiri şi prezintă o activitate fotosintetică mult redusă, deoarece îşi pot procura carbonul necesar din mediul de cultură şi anume din zaharurile din mediul de cultură, astfel că, atunci când o plantulă regenerată in vitro va fi trecută in vivo va trebui să se readapteze la o activitate fotosintetică intensă. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezintă, pe lângă un număr scăzut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficientă a luminii, şi multe spaţii aerifere în mezofil. Stomatele lor nu funcţionează normal, iar trecerea plantelor de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai importantă de stres hidric. În culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lăstari şi rădăcinuţe, sunt slab dezvoltate, ceea ce duce de asemenea la o slabă circulaţie a apei dintr-o parte a plantei în alta. Plantele in vitro au o hrănire heterotrofă, pe când cele in vivo au o hrănire autotrofă, acest fapt constituind un alt factor de stres pentru plăntuţele transferate în sol. Ele trebuie să-şi dezvolte activitatea fotosintetică pentru a-şi putea procura carbonul necesar.

Din cele de mai sus se poate concluziona că aclimatizarea plantulelor trebuie să fie un proces lent, care să permită trecerea treptată a plantelor de la condiţiile in vitro la cele in vivo, ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ scăzută, la dezvoltarea mecanismelor de închidere şi deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle şi colab. (1983) au demonstrat că scăderea umidităţii aerului in vitro la Brassica oleracea „Botrytis” a dus la formarea unei pelicule de ceară mai groasă pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o evaporare cuticulară mult scăzută şi la creşterea procentului de plante aclimatizate.

Aclimatizarea poate fi făcută prin generarea unei umidităţi crescute în mediul in vivo unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate speciale, generatoare de ceaţă, şi prin menţinerea unei luminozităţi şi temperaturi relativ constante şi scăzute. O altă metodă de aclimatizare prevede lăsarea vaselor de cultură deschise, într-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptată a plantulelor la condiţiile exterioare. De asemenea, mai este posibilă folosirea unor substanţe antiperspirante, care sunt pulverizate pe frunzele plantulelor transferate în sol, reducând astfel procesul de evaporare al apei din ţesuturi (Sutter şi Hutzel, 1985), deşi această metodă poate avea şi efecte adverse.

2. Rădăcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile şi nu funcţionează foarte bine in vivo, prezentând foarte puţini sau deloc perişori absorbanţi. Aceste rădăcini vor muri în scurt timp fiind înlocuite de altele generate direct în sol. Dezvoltarea perişorilor absorbanţi in vitro poate fi determinată prin menţinerea culturilor, pentru o perioadă de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determină o supravieţuire slabă a unei plante în condiţiile de mediu natural, in vivo, mai ales în condiţiile unei transpiraţii intense. Pentru o plantă provenită din cultura in vitro este vitală pierderea unei cantităţi cât mai mici de apă din ţesuturi.

274

3. Plantele care în condiţiile mediului lor natural de viaţă trăiesc în simbioză cu fungi (micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci când sunt transferate în condiţii in vitro, dar mai ales dacă sunt din nou transferate in vivo. Mai multe studii au arătat că inocularea unor plante in vitro împreună cu microorganismul simbiont a determinat o creştere şi dezvoltare mai bună a explantelor şi o supravieţuire crescută atunci când s-a procedat la aclimatizarea acestora.

Dhawan şi colab. (1986) au demonstrat că adiţia de Rhizobium în timpul aclimatizării plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au supravieţuit transplantării în sol, iar supravieţuirea acestora a avut o rată cu 90% mai mare faţă de cele care nu au nodulat. Morandi şi colab. (1979) au raportat că plantele produse in vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dacă au fost inoculate cu câteva microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller şi colab. (1984) au raportat că micorizele joacă un rol important în micropropagarea plantulelor de plop; inocularea explantelor împreună cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o creştere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fără micorize.

Atunci când se iau în considerare problemele asociate cu sistemele radiculare ne-funcţionale trebuie avut în vedere următoarele măsuri speciale:-permiterea formării rădăcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie să se dezvolte în rădăcini subterane proprii, fie măcar să asigure supravieţuirea plantulei până la formarea unor rădăcini subterane proprii;-permiterea dezvoltării in vitro a rădăcinilor, atunci când e posibil, prin menţinerea culturilor, o perioadă de timp, cu rădăcinile în mediul lichid, acestea fiind apoi capabile să preia toate funcţiile unei rădăcini normale, atunci când va fi transferată în sol;-transferarea întregii faze de înrădăcinare în mediu in vivo. Înrădăcinarea în sol nu este realizabilă la toate speciile de cultură, dar poate fi stimulată prin înmuierea bazei lăstarilor în soluţie de auxină. Totuşi pentru multe specii faza de înrădăcinare este bine să aibă loc in vitro mai ales pentru speciile care nu înrădăcinează uşor nici în condiţii normale de cultură, cu ar fi speciile ierboase.

Atunci când se recurge la aclimatizarea unor plăntuţe obţinute prin tehnicile de regenerare in vitro, trebuie să se ţină seama de următoarele:

1.Pentru a evita infecţiile cu fungi sau bacterii:-agarul de pe rădăcinuţele explantelor (ce conţine zaharuri) trebuie îndepărtat prin spălarea acestora cu apă călduţă;-solul sau substratul solid, în care vor fi trecute plăntuţele regenerate in vitro, trebuie să fie sterilizat prin menţinerea la temperaturi ridicate (în etuvă la 180oC pentru 3 ore) sau prin iradiere cu radiaţii gama.

2.Asigurarea unor condiţii cât mai sigure de viaţă, prin executarea tratamentelor de combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determină o rată mai mare de supravieţuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.

3.Pentru a se evita rănirea rădăcinuţelor se recomandă folosirea, pentru început, a unui sol uşor.

4.Pentru a îmbunătăţi aclimatizarea plantulelor la condiţiile in vivo, înrădăcinarea este bine a avea loc pe medii de cultură sărace în săruri minerale (MS – concentrat la jumătate sau KNOP).

5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi scăzute (4-8 săptămâni la 5oC) in vitro sau imediat după transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de latenţă. Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbuştilor şi plantelor lemnoase, dar şi cerealelor care necesită o perioadă de vernalizare pentru a putea produce seminţe.

275

6.Plantele care formează protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate în sol în această formă (protocorm, bulbi), ceea ce va creşte şansele de aclimatizare şi supravieţuire ale acestora.

7.Transferarea lăstarilor generaţi in vitro pe un mediu fără zaharuri şi îmbogăţirea mediului înconjurător cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uşoară a plantelor (Langford şi Wainwright, 1986).

Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri în domeniu:1.În unităţile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct în

straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajută la menţinerea umidităţii (uneori se folosesc şi pulverizatoare de apă în acest scop), iar luminozitatea şi temperatura trebuie să fie relativ scăzute.

2.Lăstarii obţinuţi in vitro la unele specii (Gerbera şi Rhododendron) sunt transferaţi direct pe un substrat artificial, care va permite înrădăcinarea acestora. Laboratoarele Twyford au confecţionat un tip de lădiţe de plastic prevăzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu substrat pentru înrădăcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa şi susţinerea optimă a lăstarilor. Înrădăcinarea lăstarilor în lădiţele perforate va avea loc într-o încăpere semisterilă, climatizată, în care umiditatea aerului este menţinută ridicată. Imediat ce înrădăcinarea este suficientă şi lăstarii încep să crească, butaşii sunt transferaţi din lădiţele perforate direct în seră.

Speciile lemnoase sunt în prezent înrădăcinate mai mult in vivo decât in vitro, deoarece astfel se economiseşte mai mult timp şi bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia, Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) şi în general la toate speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplică acest tip de înrădăcinare.

3.Compania Milcop din Franţa a produs un substrat artificial pentru înrădăcinare, pe bază de polypropilenă, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permiţând o aerare bună. Acest substrat este disponibil sub formă de fulgi, fiind potrivit pentru înrădăcinarea in vitro. Pentru o înrădăcinare directă, in vivo, există blocuri (cuburi) mici, din acelaşi material, în care lăstarii pot fi plasaţi cu uşurinţă.

Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune că, în viitorul apropiat, vor apărea pe piaţă tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea plantulelor mult mai eficientă şi mai uşoară, decât a fost în trecut. Trecerea directă a butaşilor in vivo este importantă, pentru că va duce la eliminarea fazei de înrădăcinare in vitro, care este relativ costisitoare şi necesită o perioada de timp suplimentară, ceea ce creşte perioada dintre doua generaţii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale producătoare de material semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnică uzuală şi mai la îndemână, necesitând doar camere de creştere special amenajate pentru aclimatizarea şi înrădăcinarea butaşilor direct pe substraturile artificiale.

276