‚

Determinarea activităţii antioxidante a

extractului de ceai verde

Ceaiul verde reprezintă frunzele de Camelia sinensis. Acestea nu sunt lăsate să

fermenteze şi sunt imediat uscate, fiind numit şi ceai nefermentat şi ceai virgin.

Recent a fost dezvoltat un unguent pe baza extractului de ceai verde, care

acţionează împotriva leziunilor HPV genitale şi anale. Acestea sunt datorate acţiunii

HPV (human papilomavirus), un agent rezistent la majoritatea tratamentelor, cu excepţia

unor tehnici chirurgicale complicate.

Figura 1. Structura catechinei

Efectul inhibitor este datorat catechinelor din compoziţia extractului vegetal care

au un puternic efect antioxidant şi antioxidant.

În general este cunoscut ca a avea efecte antioxidante puternice împotriva

radicalilor liberi. Este cel mai vechi şi mai utilizat în tratamentele naturiste de prevenire a

apariţiei tumorilor canceroase. De asmenea extractul de ceai verde se utilizează pentru a

preveni atacurile cardiovasculare şi la scăderea colesterolului.

Se găseşte sub formă de pliculeţe – cel mai frecvent. În farmaciile de specialitate

se găseşte şi sub formă de pastile sau încoporat în diferite creme şi unguente.

Materiale necesare: balanţă analitică, tăviţe de cântărire, spatulă, pahar

Berzelius, eprubete, stativ, pipete de sticlă, spectrofotometru, rotavapor, ceai verde uscat,

etanol., 2,2 – Difenil – 1 – picrilhidrazil (DPPH).

Mod de lucru:

1. Obţinerea extractului vegetal

100 g produs vegetal (ceai verde) uscat se pun într-o sticlă cu dop. Se toarnă peste

200 de ml de metanol. Se lasă două zile, după care se îndepărtează materialul vegetal prin

centrifugare la 10.000 rpm timp de 10 minute, într-o centrifugă EBA 32R cu răcire.

Lichidul rezultat se concentrează într-un rotavapor Buchi până la 50%, la 400C, 150 rpm

şi 150 mbar. Produsului concentrat i se determină activitatea antioxidantă totală şi

conţinutul în fenoli.

2. Determinarea activităţii antioxidante totale

Activitatea antioxidantă totală a fost evaluată prin metoda spectrofotometrică

indirectă care utilizează 2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazil (DPPH) ca sistem de generare a

radicalului liber stabil DPPH

•. Amestecul de reacţie conţine următoarele:

Soluţii Probă Martor Standard

Probă 50 μl - -

Etanol 80% - 50 μl -

Vitamina

E/Trolox

- - 50 μl

DPPH 0,04%

în etanol

5 ml 5 ml 5 ml

Amestecurile se lasă timp de 30 de minute şi se va măsura absorbanţa la 517 nm,

faţă de etanol. Astfel, concentraţia radicalilor DPPH a fost calculat prin utilizarea

următoarei formule de calcul:

Activitate antioxidantă totală (%) =

A0−A1

A0 ×100, unde:

A0 – absorbanţa martorului

A1 – absorbanţa probei

2. Determinarea conţinutului fenolic total

Determinarea s-a reaclizat cu reactiv Folin – Ciocalteau utilizând acidul galic ca

standard. Amestecul de reacţie este format din 1 ml extract vegetal diluat în 46 ml apă

distilată. Se mai adaugă 1 ml reactiv Folin – Ciocalteau, iar după 3 minute aproximativ 3

ml carbonat de Na 2%. Amestecul se lasă 2 ore, agitând periodic Se citeşte absorbanţa la

760 nm. Concentraţia totală de fenoli se exprimă în mg/g de extract uscat. Concentraţia

componenţilor fenolici totali din extract se determină ca μg de acid galic utilizând ecuaţia

obţinută de la curba standard de acid galic:

Absorbanţa = 0,0008 × acid galic (μg).

În funcţie de materialul vegetal supus extracţiei şi de rezultatele ce se urmăresc a

se obţine, se mai pot efectua următoarele analize:

a. Determinarea puterii de reducere. Se fac diluţii ale extractului în eprubete diferite cu

apă ultrapură şi se analizează fiecare diluţie în parte. Amestecul va conţine:

- 1 ml diluţie;

- 2,5 ml tampon fosfat 0,2M, pH 6,6;

- 2,5 ml fericianură de potasiu 1%.

Amestecul se introduce la 500C, timp de 20 de minute. Peste amestec se adaugă

2,5 ml acid tricloracetic 10% şi se centrifughează la 1000 rpm 10 minute.

Într-o eprubetă curată se pun 2,5 ml supernatant, 2,5 ml apă distilată şi 1 ml FeCl3

1%. Se măsoară absorbanţa la 700 nm. Creşterea absorbanţei odată cu creşterea

concentraţiei extractului este direct proporţională cu creşterea puterii reducătoare.

Articol descifrat formulas

b. Determinarea activităţii de legare a radicalului hidroxil. Se realizează o serie de

eprubete ce vor conţine extract vegetal de diferite concentraţii. Amestecul de reacţie are

următorul conţinut:

- 0,1 ml EDTA 1mM;

- 0,01 ml FeCl3 10 mM;

- 0,1 ml H2O2 10 mM;

- 0,36 ml deoxiriboză 10 mM;

- 1 ml extract vegetal dizolvat în apă ultrapură;

- 0,33 ml tampon fosfat 50 mM, pH 7,4;

- 0,1 ml acid ascorbic 1 mM.

Figura 2. Structura chimică a acidului galic

Amestecul a fost introdus într-un termostat la 370C, timp de 1 oră. În alte eprubete

notate la fel se adaugă:

- 1 ml amestec iniţial;

- 1 ml TCA 10%;

- 1 ml acid tiobarbituric (TBA) 0,5%.

În paralel se face şi o probă martor în care se utilizează un compus ca martor (acid

galic). Se măsoară absorbanţa amestecului la λ = 532 nm. Capacitatea de legare a

radicalului hidroxil (% OH-) se calculează după formula:

% OH- =

A Martor−APr obă

AMartor × 100, unde:

AMartor – absorbanţa reacţiei martor

AProbă – absorbanţa probei ce conţine extractul vegetal

c. Determinarea activităţii de legare a radicalului oxid nitric. Metoda se bazează pe

generarea oxidului nitric din nitroprusidul de Na în soluţie şi care au fost măsuraţi prin

utilizarea reacţiei Griess.

Figura 3. Structura chimică a nitroprusidului de Na

Se pregătesc o serie de eprubete cu diferite concentraţii ale extractului vegetal. În

paralel se face şi o probă martor în care se utilizează un compus ca probă martor (butilat

hidroxi-toluenul). Amestecul de reacţie este format din:

- 3 ml mitroprisid de Na 10 nM în tampon fosfat

- 2 ml probă extract vegetal.

Se prepară un martor, care are în locul extractului vegetal, metanolul sau etanolul,

în funcţie de solventul cu care se efectuează extracţia. Amestecul rezultat se incubează

timp de oră, în baie de apă la temperatura de 250C. Între timp se pregăteşte reactivul

Greiss, care conţine:

- 1% sulfanilamidă

- 0,1% N-l-naftiletilen-diamin-dihidroclorid de sodiu în 2% H3PO4.

Într-un alt set de eprubete notate identic se adaugă următoarele:

- 5 ml soluţie ce conţine extract vegetal

- 5 ml reactiv Griess.

Se măsoară absorbanţa fiecărei eprubete la 546 nm, faţă de metanol. Calcularea

activităţii de legare a radicalului oxid nitric se face după următoarea formulă:

% NO =

A Martor−APr obă

AMartor × 100, unde:

AMartor – absorbanţa reacţiei martor

AProbă – absorbanţa probei ce conţine extractul vegetal.

d. Determinarea activităţii de legare a anionului superoxid. Radicalii super oxid sunt

generaţi prin oxidarea NADH şi determinaţi prin reducerea nitro blue tetrazoliu (NBT).

Pentru determinarea se procedează conform tabelului următor:

Soluţie Probă Martor

Tampon Tris – HCl

(16 mM, pH 8)

3 ml 3 ml

NBT 50 μM 1 ml 1 ml

NADH 78 μM 1 ml 1 ml

Extract vegetal

(50 – 300 μg/ml)

3 ml -

Acid ascorbic

(50 – 300 μg/ml)

- 3 ml

Fenazin metosulfat

10 μM

1 ml 1 ml

Amestecurile se realizează în 2 eprubete care se vor introduce în etuvă timp de 5

minute la 2500C. Se va citi absorbanţa martorului şi a probei faţă de blanc

(realizat .........). Inhibarea generării anionului superoxid se calculează conform formulei:

% SOD =

A Martor−APr obă

AMartor × 100, unde:

AMartor – absorbanţa reacţiei martor

AProbă – absorbanţa probei ce conţine extractul vegetal.

e. Determinarea activităţii de legare a radicalului H2O2.

Metoda se bazează pe capacitatea extractului vegetal de a lega radicalii H2O2. Se prepară

în eprubete diferite probe de extract vegetal în apă distilată şi cu o concentraţie diferită.

Se adaugă 0,6 ml H2O2 40 mM. Se prepară un martor în tampon fosfat pH7,4, la care se

adaugă 0,6 ml H2O2 40 mM. Amestecurile se fac în eprubete care se păstrează 10 minute

la temperatura camerei.

Se citeşte absorbanţa la 230 nm faţă de tampon fosfat pH 7,4. Capacitatea de

legare a H2O2 se calculează conform formulei:

% H2O2 =

A Martor−APr obă

AMartor × 100, unde:

AMartor – absorbanţa reacţiei martor

AProbă – absorbanţa probei ce conţine extractul vegetal.

Powered by http://www.referat.ro/cel mai tare site cu referate