Tema lucrarii: Determinarea carotenoidelor din legume si fructe cu ajutorul metodei cromatograficeArgument:Am ales aceasta tema deoarece carotenoidele este una din cele mai importante clase de pigmenti vegetali care prezinta efecte protectoare atat la nivelul tesuturilor vegetale cat si a celor animale.

Pigmentii vegetali sunt substante naturale care determina culoarea florilor, fructelor,frunzelor, polenului, tuberculilor si altor organe si tesuturi ale plantelor. Ei au roluri biochimice si fiziologice foarte importante. Iau parte la numeroase procese metabolice si formeaza sisteme de oxido,reducere.

Carotenoidele fac parte din clasa pigmentilor neazotati si datorita dublei legaturi imprima tesuturilor in care apar o culoare rosie,galbena, portocalie sau chiar albastra, intensitatea culorii crescand cu gradul de nesaturare.

Au rol in fotosinteza, respiratie, fototropism, in transferul energiei absorbite la clorofile, fotoprotectie, s.a.

Pigmentii carotenoidici reprezinta sursa naturala din care omul si animalele pot sintetiza vitaminele A, care au un rol important in formarea pigmentilor fotosensibili implicati in procesul vederii, in cresterea si dezvoltarea organismelor, protectia si refacerea tesuturilor epiteliale.Clasificarea carotenoidelor:In functie de structura lor chimica, carotenoidele se clasifica astfel

hidrocarburi carotenoidice, alcatuite numai din carbon si hidrogen (ex alfa- , beta- caroten, licopina, neurosporen, fitoen, fitofluen etc);

derivati oxigenati ai carotenoidelor, numite si xantofile, ce cuprind esteri, eteri,glicozizi, epoxizi, ceto, si aldocarotenoide, acizi carotenoidici, carotenoide acetilenice, alenice, cu pentaciclu si cu cicluri aromatice.

In functie de numarul atomilor de carbon din molecula, se poate face o altaclasificare, si anume:

cu 20,40 atomi de carbon in molecula (apocarotenoide); cu 30 atomi de carbon in molecula (diapocarotenoide); cu 40 atomi de carbon (carotenoide C40); cu mai mult de 40 atomi de carbon (C45 si C50homocarotenoide sau

carotenoide superioare)

Structura chimicaPigmentii carotenoidici sunt o clasa aparte de pigmenti vegetali, de culoare galben-portocaliu cu structura generala de tip:

Carotenoidele cu 40 atomi de carbon in molecula reprezinta cea mai importanta clasa a acestor pigmenti. Fiind alcatuite din unitati izoprenice, pot avea 9, 10 sau 11 duble legaturi conjugateSe cunosc aproximativ 600 carotenoizi, dintre care cel mai raspândit este beta-carotenul,pigmentul de culoare portocalie al morcovilor (Daucus Carota). Foarte raspânditi sunt si alfa- si gama-carotenul, criptoxantina, licopenul, zeaxantina si mai ales luteina

Din totalul carotenoizilor morcovii contin 70 % beta-caroten, iar pepenii galbeni 85 % beta-caroten. El este în general raspândit în frunzele si algele verzi, fiind însotit întotdeauna de luteina, zeaxantina si cantitati mici de alfa-caroten. Licopenul se afla în cantitate mare în tomate (85 % din totalul carotenoizilor), în pepenii verzi (81 %), precum si în grapefruitele rosii, piersici si macese. carora le confera culoarea rosie, ultimele având si multa rubixantina. Verdeturile si toate legumele verzi sunt bogate în luteina, alaturi de alti carotenoizi. Foarte multa luteina se gaseste în varza de frunze, în spanac (10 mg %), ardei (7 mg %), cât si în frunzele de patrunjel (pâna l 10 mg %).

Alfa-carotenul si criptoxantina se gasesc de asemenea în fructele de culoare oranj sau galbena, cum sunt portocalele, mandarinele, porumbul, dovleacul si semintele de dovleac, ardeiul rosu, dar în special în uleiul de palmier (pâna la 40 %). Porumbul este bogat în special în zeaxantina, iar faina de lucerna este bogata în carotenali. De obicei, vegetalele verzi contin cu atât mai multi carotenoizi, cu cât sunt mai intens colorate în verde închis. Si intensitatea culorii fructelor si legumelor este corelata direct proportional cu proportia de carotenoizi

Extractia din tesuturile plantelor superioare Pentru tesuturile plantelor superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie, in continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei generale de extractie Metoda I Materialul vegetal este maruntit foarte fin (din considerentele aratate mai sus) siomogenizat cu acetona, timp de 1,2 minute, in atmosfera de azot. Omogenatul este filtrat,iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu acetona, pana cand omogenatul devineincolor. Extractele acetonice se reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare larotavapor. Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat distilat,omogenizand amestecul si spalandu,l apoi cu o solutie de NaCl (pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita emulsionarea amestecului), pana la indepartareacompleta a acetonei. Metoda II Aceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici de substanta. Tesutul este maruntit si triturat cu Na2SO4 anhidru, pana se obtine o pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu acetona, urmata de eter etilic Extractul se centrifugheaza,precipitatul obtinut extragandu,se in continuare pana la incolor, solutiile

supernatante reunindu,se si concentrandu,se, transferandu,se apoi intr,un volum egal de eter etilic, ca si in cazul metodei I. Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care permite indepartarea substantelor balast, mai ales a clorofilei, si hidroliza esterilor xantofilei. Saponificarea se realizeaza prin adaugarea de KOH 15% peste extract (1:10, v/v). Aceasta saponificare se poate realiza in doua moduri:, incalzirea amestecului alcalin timp de 10,15 minute pe baie de apa, in atmosfera de azot,la intuneric;, pastrarea la temperatura camerei sau la 50C, la intuneric, timp de 10,15 ore Extractia din alge:In cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda generalaprezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta, este necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea, extractia carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat acetona (etanol sau amestec acetona:etanol), datorita faptului ca au polaritate mare si permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata si racirea timp de 5,8 ore inaintea extractiei propriu,zise, apoi extractia cu metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de 2,3 minute, apoi racirea rapida cu gheata. Acest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor, dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor. Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de extractieMetode de separare:Metodele de separare se aleg in functie de proprietatile si fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Una dintre aceste metode ar fi:Cromatografia Cromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia componentelor dintr-un amestec intre doua faze: una fixa, denumita faza stationara, si alta mobila, cestrabate faza stationara. Faza stationara poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid depus pe suprafata unui suport solid (cromatografie de repartitie), un schimbator de ioni (cromatografie prin schimb ionic) sau un gel (cromatografie prin excluziune sterica).

a. Cromatografia de adsorbtie In cromatografia de adsorbtie un curent de lichid provoaca migrarea diferentiata pe coloana a constituientilor unui amestec, pornind de la o zona initiala, intr-un mediu poros care are proprietati de adsorbtie. b. Cromatografia de repartitie In cromatografia de repartitie, faza fixa poate fi:-apa sau solutie tampon-solvent organic mai putin polar decat apa-solvent mai putin polar decat solventul fazei mobile

c. Cromatografia de schimb ionic Schimbatorii de ioni sunt mase poroase fin divizate constituite din polimeri sintetici sau naturali insolubili care au grupari ionizabile acide ( -COOH, -SOзH ) sau bazice ( amoniu cuaternar, amine tertiare, secundare sau uneori chiar primare ). Separarea prin metode cromatograficePentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele cromatografice, atatcea in strat subtire, cat si cea pe coloana. Este cea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor, si a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie. Aceasta metoda este utilizata prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida de inalta performanta, metoda care prezinta avantajele utilizarii cantitatilor mici de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita scara, neputand fi utilizată in scopuri preparative In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si solventul de developare adecvat.Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru separareacarotenoidelor, pot fi amintiti:

celuloza, Ca(OH)2(utilizat mai ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice) zaharoza, Amidon Silicagel Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor), CaCO3 MgO (acestia fiind utilaizaţi la separarea carotenoidelor cu polaritate

intermediara, cum este cazul xantofilelor

Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt eluanti slabi.De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi:

acetona eter etilic etanol,eter etilic acetat de etil benzen

Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu,se cu portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul carotenoidic trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o singura data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se incepe developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.

In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru separareacarotenoidelor, si anume

a) cromatografia in zone; b) b) cromatografia elutiei in trepte si c) cromatografia elutiei in gradient.

Concluzii In perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un accent deosebit pe valorificarea superioara a plantelor de cultura si a celor din flora spontana, a surselornaturale in general, in functie de compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se impune ca o cerinta de prima marime. Numai prin cunoasterea compozitiei chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu continut ridicat in substante biologic active, care maresc valoarea biologica a plantelor in care se gasesc. Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a proprietatilorfizico,chimice a unui compus biologic activ, este necesara mai intai izolarea lui dinamestecul de compusi naturali. Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie de proprietatilecompusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari (eter etilic, cloroform), prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere, impunandu,se un grad de maruntire avansat, datorita faptului ca solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si in strat subtire, precum si separarile prin repartitia lichid,lichid si prin metoda distributiei contracurent. Pentru identificarea carotenoidelor se pot utiliza atat metodele chimice cat si metodele spectrale, care prezinta avantajele aplicabilitatii largi, sensibilitatii ridicate reproductibilitatii perfecte a rezultatelor, conservarii integritatii probei si rapiditatii determinarilor. Dintre metodele spectrale utilizate in detectarea carotenoidelor se pot aminti spectroscopia in vizibil, IR, RMN, spectrometria de masa.Pentru dozarea carotenoidelor, metoda generala utilizata este metoda spectrofotometrica, conditia esentiala fiind ca pigmentii sa fie de puritate analitica.