Ministerul Educaţiei al Republicii Moldova

UNIVERSITATEA DE STAT DIN TIRASPOL

Catedra Chimie

Teză de licenţăDeterminarea conţinutului de acid ursolic şi

oleanolic în fructele de pădure prin metoda HPLC

Autor:

Guzun Mariana

studenta facultăţii:

Biologie şi Chimie

specialitatea:

Biologie şi Chimie

Coordonator ştiinţific:

Grigore Filip

Doctor, conf. univ.

Chişinău 2014

Cuprins:Lista abrevierilor 4

Introducere 5

Capitolul I. Revista literaturii: 7

1.1. Rolul şi importanţa plantelor medicinale şi a fructelor de pădure; 7

1.1.1. Compoziţia chimică a plantelor medicinale; 8

1.1.2. Compoziţia chimică a fructelor de pădure; 8

1.1.3. Valorea terapeutică a plantelor medicinale; 8

1.2. Caracteristica bio-chimică a fructelor de pădure; 9

1.2.1. Fructele de pădure din familia Cornaceae; 9

1.2.2. Fructele de pădure din familia Rosaceae; 10

1.2.3. Fructele de pădure din familia Elaeagnaceae; 20

1.3. Caracteristica generală a acizilor ursolic şi oleanolic: 21

1.3.1. Activitatea farmacodinamică a acidului ursolic; 22

1.3.2. Sinteza compuşilor derivaţi din acidul ursolic; 22

1.3.3. Acţiunea acidului ursolic asupra organismului omului; 23

1.3.4. Activitatea farmacodinamică a acidului oleanolic; 23

Capitolul II. Rezultate şi discuţii: 23

2

2.1 Esenţa metodei de analiză Cromatografia de lichide de înaltă performanţă

(HPLC); 23

2.2. Caracteristicile spectrale ale acidului ursolic. Utilizări sintetice . 25

2.3. Determinarea conținutului de acid ursolic și oleanolic. 28

Capitolul III. Partea experimentală:

3.1. Generalităţi

3.2. Extracţia fructelor de Corn;

3.3. Extracţia fructelor de Păducel;

3.4. Extracţia fructelor de Măceş;

3.5. Extracţia fructelor de Porumbar;

3.6. Extracţia fructelor de Mure;

3.7. Extracţia fructelor de Măslin sălbatic;

3.8.

Concluzii

Bibliografie

3

Lista abrevierilor

HIV-sindromul imunodificienței umane

IR-spectroscopie în infraroșu

RMN-rezonanța magnetică nucleară

1H RMN – spectrul protonic

13C RMN – spectrul carbonic

CSS-cromatografie în strat subțire

CPC-cromatografie pe coloană

AND - acid dezoxiribonucleic

ARN - acid ribonucleic

TPA - 12-O-tetradecanoiltorbol-13-acetat

HPLC-cromatografie cu lichide de presiune înaltă

PTLC - cromatografie preparativă în strat subțireTHF-tertahidrofuran

DMAP-N,N-dimetilaminopiridină

IUPAC-Uniunea Internațională pentru Chimie Pură și Aplicată

NAD-nicotinamidadimecleotid

PCC-clorocromat de piridiniu

4

Introducere

Încă din cele mai vechi timpuri și până acum aproximativ un secol, remediile

naturiste, bazate pe valorificarea plantelor medicinale şi a fructelor de pădure au

constituit principala formă de medicină.

În prezent plantele reprezintă o sursă de materii prime importante pentru

industria farmaceutică şi cosmetologică. Ele ne oferă o gamă largă de substanţe

biologic active ce posedă o serie de proprietăţi terapeutice importante pentru tratarea

unor boli sau deficienţe. Utilizarea plantelor, atât în farmaceutică, cât şi în

cosmetologie, necesită o cercetare profundă a compoziţiei lor chimice şi a

proprietăţilor lor. În botanică, dar și în farmacologie, plantele medicinale şi fructele

de pădure sunt recunoscute pentru că oferă un efect benefic, deseori terapeutic,

asupra organismului uman.

Evoluţia extrem de rapidă în dezvoltarea metodelor de valorificare a

substanţelor biologic active din ultimii ani a contribuit la extinderea şi aprofundarea

metodelor de cercetare şi analiză a acestora, valorificarea lor şi aplicarea lor în scopul

elaborării unor remedii atât în tratarea diferitor boli interne, cât şi în rezolvarea unor

probleme legate de aspectul exterior. De asemenea, se fac cercetări în direcţia lărgirii

fondului de materii prime vegetale şi valorificarea acestora. Regnul vegetal continuă

să prezinte principalul furnizor de compuşi fitochimici utilizaţi în diferite ramuri

industriale cum sunt cele ale produselor farmaceutice, alimentare, cosmetice,

agrochimice, cu valori comerciale.

Interesul pentru speciile de Corn, Păducel, Măceş, Porumbar, Mure și Măslin

sălbatic este sporit în Republica Moldova şi în România, datorită faptului că aceste

specii conţin ulei volatil, flavonoide și acizi terpenici în special acid ursolic şi acid

oleanolic. Aceste principii active imprimă importante efecte terapeutice: antiseptic,

antiinflamator, antispastic, antioxidant și altele.5

Scopul lucrării se referă la cunoaşterea compoziţiei chimice a speciilor mai

răspândite în flora spontană a Republicii Moldova, mai exact a fructelor de Corn,

Păducel, Măceş, Porumbar, Mure și Măslin sălbatic, care sunt frecvent utilizate de

către populația locală în alimentație sau pentru tratamente.

Acesta este un studiu de pionerat, care va oferi informații importante despre

calitatea materialului fitofarmacologic local și va justifica din punct de vedere științific necesitatea valorificării acestor specii în scopuri terapeutice, datorită

conținutului înalt de principiilor active pe care acestea le conţin.

Ne-am propus să determinăm conţinutul de acid ursolic şi acid oleanolic în

specile menţionate printr-o metodă de analiză modernă: cromatografia cu lichide de

înaltă performanță (HPLC). Această metodă permite cuantificarea exactă a

componentelor în extractele de origine vegetală, care reprezintă niște amestecuri

foarte complexe.

Pe durata efectuării lucrării au fost realizate obiectivele:

Studiul informativ al literaturii de specialitate;

Descrierea sistematică a fructelor de pădure din flora spontană a R. Moldova;

Colectarea şi cercetarea fitochimică a fructelor de pădure;

Extragerea fructelor și pregătirea probelor pentru analiză;

Izolarea acidului ursolic din surse locale, obținerea derivaților săi de sinteză și analiza confirmarea structurii lor prin metode spectrale IR, 1H RMN și 13C RMN.

Determinarea conţinutului de acid ursolic şi acid oleanolic în fructele de pădure prin metoda HPLC;

Sistematizarea rezultatelor obţinute şi compararea lor cu cele din literarura de specialitate.

6

Capitolul I. Revista literaturii

1.1. Rolul şi importanţa plantelor medicinale şi a fructelor de pădure.

Plantele medicinale şi fructele de pădure sunt produse horticole folosite de oameni

în alimentaţie sau în terapeutică. Aceste produse pot fi clasificate după caractere

generale comune, dar şi din punct de vedere botanic, comercial, tehnologic, horticol,

precum şi după modul de întrebuinţare al acestora. Delimitarea între plantele

medicinale şi fructele de pădure se poate face din punct de vedere tehnologic, după

posibilităţile lor de utilizare ca materie primă în industria alimentară sau

farmaceutică, sau după componentul chimic cu ponderea cea mai mare. Sub

denumirea de plante medicinale şi fructe de pădure se înţeleg, în această lucrare,

organele plantelor şi arbuştilor fructiferi care conţin substanţe active capabile să

exercite o influenţă pozitivă asupra organismului uman.

Plantele medicinale au reprezentat din toate timpurile materii prime pentru tratarea

diverselor afecţiuni, fiind remedii de bază sau, uneori, aproape singurul remediu în

vremurile de demult. La începuturile medicinei, tratarea bolilor se făcea, în principal,

cu ajutorul plantelor medicinale şi, alături de materialul vegetal, erau folosite materii

de origine animală sau altele de origine minerală. Folosirea plantelor medicinale

pentru vindecare sau prevenirea unor boli datează de circa 7000 de ani, cele mai

vechi date scrise referitoare la utilizarea plantelor medicinale fiind întâlnite la

popoarele din Egiptul antic şi China antică. Popoarele din Grecia antică au moştenit

bogate cunoştinţe medicale de la cele din India, Mesopotania, China şi Egipt.

Rezultatele cercetărilor efectuate de-a lungul timpului în acest domeniu au

demonstrat că valoarea terapeutică a plantelor medicinale se datorează relaţiei

stabilite între structura chimică a substanţelor active identificate şi extrase din

7

materialul vegetal şi acţiunea farmacodinamică pe care acestea o exercită asupra

elementelor reactive ale organismului.

1.1.1. Compoziţia chimică a plantelor medicinale.

Plantele medicinale îşi datorează acţiunea terapeutică uneia sau mai multor

substanţe chimice produse în celulele acestor şi denumite principii active.

Principalele clase de substanţe organice din organismele vii, respectiv glucidele,

lipidele şi protidele, formează aşa numitul metabolism principal, din care derivă apoi

toţi compuşii metabolismului secundar care, includ terpenele, steroizii, antocianii,

fenolii şi polifenolii între care se găsesc şi principiile active.

1.1.2. Compoziţia chimică a fructelor de pădure.

Printre produsele pădurii un loc important îl ocupă fructele de pădure. Recoltarea

lor i-a preocupat pe oameni încă din timpuri străvechi, ele constituind o însemnată

resursă de hrană. Multe din speciile de arbori şi arbuşti fructiferi au fost adaptate cu

timpul în culturi, făcând obiectul pomiculturii. Datorită conţinutului ridicat în

vitamine (A, B1, B2, B6, C, D, E, K, PP) şi substanţe nutritive (protide, lipide,

glucide, săruri minerale), fructele de pădure completează şi diversifică alimentaţia

omului. Astfel, necesarul zilnic de vitamine reclamat de buna funcţionare şi

dezvoltare a organismului poate fi satisfăcut în cea mai mare parte prin consumul de

fructe.

1.1.3. Valorea terapeutică a plantelor medicinale.

Are la bază relația dintre structura chimică a substanțelor active, numite și

principii active și acțiunea lor farmacodinamică pe care o exercită asupra

elementelor reactive ale organismului. Faptul că majoritatea plantelor medicinale au o

compoziție chimică complexă începând de la 2-3 compuși până la 30-40 substanțe

chimice identificate în unele plante, cum ar fi speciile genurilor: Rosa, Crataegus, 8

Rubus, Cornus etc., explică și proprietățile farmacodinamice multiple ale uneia și

aceeiași plante.

1.2. Caracteristica bio-

chimica a fructelor de

pădure.

1.2.1. Fructele de pădure din

familia Cornaceae.

Cornus mas - Cornul

Clasa: Mangnoliopsida

Ordin: Cornales

Familie: Cornaceae

Gen: Cornus

Aceasta este o plantă lemnoasă sub formă de arbust sau arbore de 4-8 m.

Frunzele sunt întregi peţiolate, ovat sau oval eliptice, acuminate şi rotungite la baza,

pe faţă verzi iar pe dos verde deschis la subţioară cu socuri de pieri albi cenuşii.

Florile sunt scurte pedicelate, galbene dispuse în umbelule câte 6-10. Floarea prezintă

un caliciul format din 4 dinţişori scurţi şi otuzi, corola din 4 petale ovate lanceolate,

acuminate şi răsfrânte, 4 stamine mai scurte decât petalele.

Fructul este o drupă elipsoidală roşie, lucioasă, acrişoară şi astrinigenă, cu 2

seminţe. Înfloreşte înainte de înfrunzire, creşte prin păduri, tufarişuri, fiind un

9

element constitutiv al tufarişurilor de la câmpi şi din regiunea deluroasă. Creşte mai

ales pe solurile calcaroase.

Compoziţia chimică: fructele conţin zaharuri 9%, acizi organici, substanţe tanante,

diverse substanţe minerale, vitamina C, scoarţa conţine tanoizi.

Proprietăţi: Toate parţile plantei de corn au proprietaţi astringente, pentru că toate

conţin tanin. Sunt din această cauză şi antidiareice, cicatrizante, dezinfectante.

Frunzele se pot folosi cu succes la tratarea ascarizilor.

Importanţa farmaceutică - prezintă scoarţa ce este în principiul amar şi bogată în

tanin. Fructele sunt comestibile din ele fabricându-se dulceaţă. Preparatele obţinute

din fructele de corn au proprietăţi febrifuge, astrigente, şi antidizenterice cu siropul

de coarne se tratează

dizenteria la copii. Cornul

este o buna plantă meliferă.

1.2.2. Fructele de pădure

din familia Rosaceae.

Crataegus monogyna -

Păducelul

Familia: Rosaceae

Subfamilia: Spiraeoideae

Gen: Crataegus

10

Este un arbust (2-6 m), spinos, cu tulpina neregulată şi cu o coroana rară.

Păducelul are florile albe și fructele roșii ce au un miros caracteristic și un gust

amărui. Din ele se obțin extracte care sunt folosite în primul rând, la ameliorarea

tulburărilor legate de problemele cardiace cu substrat nervos.

Compoziţia chimică:

Florile şi fructele de păducel conţin 13% procianidine oligomerice, 1.2-2.2%

flavonoide, incluzând în acestea flavonoli şi derivaţi ai flavonelor, ca de exemplu

hiperozidul, vitexinehamnozidul, rutina şi vitexina. Mai conţine amine, catechine,

fenoli, acizi carboxilici, purine, steroli, acizi triterpenici, în special acid oleanolic şi

acid ursolic, ulei esenţial, taninuri de natura catehica, pectine, săruri minerale şi multe

alte substanţe active. Fructele conţin taninuri de natură caltehică, vitaminele B1 şi C,

antociani, flavonoizi, acizii: tartric, citric, oxalic, nicotinic, clorogenic, sorbitol,

colină, acetilcolina, glucoză, fructoză, pectine, ceară, ulei gras, substanţe minerale. În

seminţe nu se găsesc substanţe active.

Prin compoziţia sa formată din flavonoide şi procianidine păducelul are o

acţiune inotropică care se manifestă prin efectul său pozitiv asupra contractibilităţii

musculare. Preparatele standardizate din flori şi frunze au rolul de a creşte

contractibilitatea celulelor miocardului cu aprox. 150% la o concentraţie de

120µg/ml. În extractele apoase păducelul are rolul de a dilata vasele coronariene.

11

Păducelul administrat sub formă de macerate sau extracte fluide din plantă, are

o acţiune cronotropică (regularitatea şi frecvenţa ritmului), inhibând astfel aritmiile

cardiace.

Mai multe studii de specialitate au demonstrat că extractele îmbogaţite în

flavonoide cresc fluxul sangvin. În

urma administrării preparatelor

pe bază de păducel, în cazurile

de insuficienţă cardiacă de

stadiul II s-a constatat că în

acelaşi timp creşte activitatea

cardiacă şi descreşte rata

presiunii cardiace. Fracţiunile

fenolice împreună cu flavonoizii

au acţiune antioxidantă

remarcabilă. De asemenea, au

fost demonstrate efectele sedative şi diuretice a acestora.

Interesant este că nici din fructele şi nici din florile păducelului, care au

proprietăţi aproape identice, nu s-a putut determina prin izolare un principiu activ

care sa-i poată explica acţiunea terapeutică. Substanţele sale sunt eficiente numai în

complexul natural reprezentat de planta ca atare.

Rosa canina – Măceșul

Clasa: Magnoliatae

Ordin: Rosales

Familie: Rosaceae

12

Subfamilie: Rosoideae

Gen: Rosa

Este o specie de plantă nativă în Europa, nord-vestul Africii și în vestul Asiei.

Este un arbust, cu o înălțime care variază între 1 și 5 metri. Tulpina este acoperită de țepi mici, ascuțiți, sub formă de cârlig. Frunzele sunt penate, cu 5-7 frunzulițe.

Florile sunt de obicei roz pal, dar există și plante cu flori albe sau roz închis. Au un

diametru de 4-6 cm și sunt formate din cinci petale. Fructul, numit măceașă, are o

formă elipsoidă și este roșu sau portocaliu închis.

Compoziţia chimică.

Conţinutul ridicat de acid ascorbic (vitamina C) imprimă măceşelor o puternică

acţiune antiinfecţioasă, motiv pentru care măceșele sunt recomandate în variate

afecțiuni. Măceşele conţin: apă 49%, zaharuri 21.0%, proteine 3.6%, acizi 3.5% (în

acid malic), celuloză 23.0%, substanţe minerale 2.8%, provitamina A, (500-5000 mg

la 100 g pulpă în funcţie de specie), vitaminele B1, B2, E, K şi P (sub formă de

flavonoglucozide), precum şi urme de vitamină PP. Uleiul seminţelor de măceşe

conţine vitamina F (acizi esenţiali: linolic, linoleic şi arahidonic). Acizii din măceşe

(îndeosebi, malic şi citric), contribuie la stabilizarea vitaminei C. În măceşe se mai

găsesc compuşi terpenici, ca betulina, precum licopen (izomer al carotenului),

pigment care le imprimă culoarea roşie-portocalie.

Tratamente cosmetice sau recomandări medicale.

În scopuri terapeutice, se folosesc fructele de măceş (din care se prepară

infuzie, decoct, vin medicinal, băuturi răcoritoare), seminţele şi florile. Măceşele

amestecate cu miere (două părţi pulpă de măceşe curăţate de perişoare şi o parte de 13

miere) se utilizează contra ascaridelor (ascaridoza), consumându-se zilnic câte 2-3

linguriţe din acest amestec. Măcieșul este un rezervor de vitamine pentru organismul

uman. Ceaiul de măceșe tratează intoxicațiile, diarea, afecțiunile hepatice, febra,

viermii intestinali şi palpitațiile. Afecțiunile rinichilor și ale vezicii urinare pot fi

tratate cu ajutorul ceaiului de semințe de măceș. Elixirul de măceș este recomandat

în tratarea bronșitei cronice și a tusei de bătrânețe. Măceșul face parte din categoria

plantelor-panaceu. Poate fi folosit cu succes și în combaterea alcoolismului și

tabacismului. Este un bun remediu în diferite boli – avitaminoze, enterocolite,

calculoză renală, viroze respiratorii, tulburări de circulație periferică. În anotimpul

friguros, ceaiul de măceșe calmează tusea și revigorează orice organism vlăguit de

febră.

Indicaţii terapeutice.

Stimularea proceselor metabolice. Datorită conţinutului ridicat de acid ascorbic

şi dehidroascorbic, de vitamina C, joaca un rol deosebit de important în procesele de

oxidoreducere şi în respiraţia celulară. Măceşele reuşesc astfel să stimuleze

funcţionarea tuturor celulelor organismului, jucând un rol important în procesele

metabolice fundamentale.

Alergii. O cura de 45 de zile, cu o jumatate de litru de infuzie combinata de măceşe

pe zi, face minuni în prevenirea alergiilor de primavară. Cel mai bun moment pentru

începerea unei astfel de cure este la sfârşitul iernii - începutul primaverii, aşa încât

efectul să fie maxim în luna aprilie, când începe polenizarea şi cei cu sensibilitate

alergică sunt cel mai greu încercaţi.

Vitaminizant. Nu numai ca au un conţinut extrem de ridicat din majoritatea

vitaminelor, dar, în plus, ajută şi la asimilarea vitaminelor şi mineralelor din alte

surse. Curele de vitaminizare cu produse pe bază de măceşe sunt importante în

14

special în sezonul rece, la efort fizic sau intelectual, în caz de anemii, răceli, febră, în

cazul gravidelor sau după naştere sau în cazul altor afecţiuni care slăbesc organismul.

Sistemul nervos. Studii realizate în Germania arată ca o cura cu măceşe ajută

organismul să se adapteze mai bine la condiţiile de stres, la suprasolicitare, să reziste

mai bine în faţa emoţiilor negative, să facă faţă furiei, frustrărilor, enervărilor. De

asemenea, măceşele combat insomniile, dar şi somnolenţa, migrenele, asteniile,

amneziile, nevrozele, anxietatea, oboseala, starea de confuzie mentala şi se pare că

sunt de folos chiar şi în cazul sclerozei multiple în placi (leuconevraxita).

Diabet. Datorită conţintului crescut de antociane, măceşele sunt recomandate şi în

diabetul de tip 2. Ele au un efect antidiabetic, hipoglicemiant, de stabilizare a

glicemiei.

Obezitate. Medicii japonezi de la Universitatea de Medicină din Osaka au evidenţiat

în urma mai multor studii că măceşele reprezintă o armă eficace împotriva obezitaţii.

Deja dupa o cură de două săptămâni s-a constatat o reducere a colesterolului şi a

zahărului din sânge, precum şi o inhibare a procesului de depunere a ţesutului adipos.

S-a observat, de asemenea, şi eliminarea unor substanţe toxice, precum acidul uric.

Pentru aceasta se recomanda o cură de 45 de zile cu un litru de infuzie combinată de

măceşe pe zi.

Boli cardiovasculare. Vitamina C, bioflavonoidele şi vitaminele din complexul B

previn ateroscleroza, ajută la adaptarea aparatului cardiovascular la condiţiile de

stres. Datorită conţinutului de acizi organici pectici reglează nivelul colesterolului, iar

datorită conţinutului de bioflavonoide şi de vitamina C şi P, măceşele sunt eficiente

în combaterea fragilitaţii capilare, întărind pereţii vaselor de sânge, îmbunătăţind

permeabilitatea, elasticitatea acestora şi circulaţia periferică deficitară. Astfel, dispar

şi efectele de mâini şi picioare reci.

15

Boli gastrointestinale. În cazul afecţiunilor gastrointestinale măceşele reprezintă, de

asemenea, un adjuvant de excepţie. În primul rând, stimulează pofta de mâncare şi

digestia. Apoi prezintă proprietăţi astringente, antidiaretice, diuretice, dar şi uşor

laxative, fiind un excelent regulator al digestiei. Atât florile şi frunzele, cât şi fructele

reprezintă inclusiv un adjuvant în caz de dizenterie.

Articulatii. Cele mai spectaculoase rezultate ale marilor centre de cercetare privesc

acţiunea măceşelor asupra articulaţiilor. Astfel, în tări precum Germania, Marea

Britanie, Danemarca, Franţa, măceşele devin treptat o opţiune de tratament,

ajungându-se chiar la înlocuirea antiinflamatoarelor de sinteză.

Bolile respiratorii. Măceşele sunt folosite cu succes şi în cazul bolilor respiratorii. În

primul rând, trebuie subliniat efectul pulberii de măceşe în cazul febrei, pe care nu o

scade, dar ajută sistemul cardiovascular şi pe cel nervos să reziste mai bine şi

accelereaza vindecarea, asigurând totodată şi eliminarea unor toxine din corp.

Infuziile, decocturile şi tincturile şi-au demonstrat eficacitatea în cazul gripelor,

al racelilor, faringitei, astmului bronşic, pneumoniei şi chiar a tuberculozei.

Este de remarcat creşterea rezistenţei la infecţiile pulmonare în general. Este

cunoscut de mult timp efectul ceaiului de măceşe, care calmează tusea şi revigorează

orice organism vlăguit de febră. Consumate sub forma de ceai, sirop sau dulceaţă,

măceşele cresc imunitatea şi ne păzesc de microbi şi de răceală. Cura de măceşe este

recomandată mai ales în sezonul rece când este binevenită şi asocierea măceşelor cu

catină, propolis, polen şi miere.

Precauţii şi contraindicaţii.

Pulpa de măceşe nu are nici un fel de contraindicaţie, fiind printre cele mai

bine tolerate remedii cunoscute. Seminţele de măceşe, în schimb, mai ales perişorii de

pe aceste seminţe, au un efect iritant foarte puternic asupra aparatului respirator şi

16

asupra celui digestiv. De asemenea, aceşti perişori pot declanşa reacţii alergice

severe, ca prurit sau disconfort gastro-intestinal. De aceeea, în cazul persoanelor

alergice se recomandă evitarea contactului cu aceşti perişori.

Prunus spinosa - Porumbarul

Subclasa: Rosidae

Ordin: Rosales

Familia: Rosaceae

Subfamilia: Amygdaloideae

Gen: Prunus

Este un arbust sălbatic, înalt de 1-3 m, cu ramuri spinoase, cu flori albe și cu

fructe sferice de culoare neagră-vineție şi mărimea unei vişine mici. Creşte de la

câmpie până sus, în zona

montană, la peste 1400 de

metri înalţime şi, ca mare

iubitoare de luminiş şi

căldură poate fi văzut la

marginea pădurilor, pe

marginea drumurilor şi a

terenurilor cultivate, în

zonele calcaroase, trăind la

un loc cu alunul şi măceşul. În scop medicinal, de la porumbar se folosesc florile,

frunzele şi fructele etc. Florile de porumbar conţin flavone, acizi organici, glicozide,

săruri de magneziu şi potasiu sunt recomandate ca sedativ şi diuretic în tratamentul 17

nefritelor, cistitelor şi enteritelor. Florile se culeg imediat după înflorire. Frunzele se

culeg prin luna iulie şi se recomandă în erupţii tegumentare, boli de rinichi, vezică,

pentru eliminarea toxinelor din corp. Fructele numite porumbe se culeg toamna

târziu, dupa ce cade toată frunza arbustului, şi se folosesc în alimentaţie dar şi ca

remedii în diferite afecţiuni. Fructele au acţiune astringentă şi diuretica şi efect

antidiareic şi antidizenteric se recomandă în dureri de stomac, diaree, dizenterie,

afecţiuni renale, tuse convulsive şi împotriva constipaţiei, ca sedativ şi diuretic.

Pentru tratamentul erupţiilor cutanate, în boli de rinichi şi vezica. Împotriva tusei,

pentru stimularea digestiei. Porumbarul este primul arbust pe care primăvara îl

îmbracă în flori albe. Se spune ca, dacă porumbarul are flori multe, anul va fi bogat.

În Oltenia, fetele prind mărtişoare din crengile porumbarului pentru ca tot anul să fie

albe la faţă cum sunt florile lui. În unele zone din ţară, porumbul se seamănă când

înfloreşte porumbarul.

Compoziţia chimică: Săruri de magneziu şi potasiu, flavone, acizi organic,

antociane, polifenoli, acizi triterpenici, quercetin, kemferol, glicozizi cianhidrogeni şi

glicocamferozide, flavonozizi, zaharuri, antocianini, prunicianina, săruri de calciu,

gumirezine. Calităţile porumbarului sunt: diuretic-depurativ, sedativ, laxativ slab,

tonic general, antidiabetic, antiasmatic, astringent şi antidiareic. În scopuri

fitoterapeutice sunt utilizate: radăcinile, florile şi fructele.

Rubus fruticosus – Murele

18

Clasa: Magnoliatae

Ordin: Rosales

Familia: Rosaceae

Subfamilie: Rosoideae

Gen: Rubus

Este un arbust, cu

tulpina spinoasă, cu frunze

palmat-compuse şi cu flori albe sau roz dispuse în umbele, ce apar la sfârşitul

primăverii sau începutul veri. Fructul este comestibil şi are un aspect negru-lucios.

Murul este un arbust viguros, înalt până la 3 metri, constituit din numeroase

tulpini drepte sau curbate, acoperite de ghimpi încovoiaţi în formă de gheară.

Frunzele sunt plisate, verzi pe faţa superioara şi mai palide pe cea inferioară şi

prevăzute cu ghimpi curbaţi pe nervuri şi peţiol. Florile au culoare albă, apar pe

tulpinile de cel puţin 2 ani şi sunt grupate în struguri. Fructele sunt la început roşii, iar

la deplină maturitate devin negre-brumate, cu miros şi gust dulce acrişor. Murul

creşte prin păduri şi tufişuri şi înfloreşte în lunile iunie şi iulie. Ca tratament naturist

se utilizează frunzele tinere recoltate înainte şi în timpul înfloririi şi uscate la umbră

în strat subţire. Produsul are miros plăcut şi gust astringent. De asemenea, ca remediu

se mai folosesc şi fructele.

Compoziţia chimică.

19

Frunzele uscate conțin o cantitate apreciabilă de materii tanate, derivați flavonici, vitamina C, acizi organici (malic, oxalic, tartric, lactic) şi inozitol. Fructele

sunt bogate în vitaminele A și C. Acestea mai conțin acid citric, salicilic, pectină,

mucilagii. Murele conţin84% apă. În plus în compoziţia murelor se mai întalnesc

vitaminele B1, B2, B5, B6 şi E. Murele sunt bogate în tanini, zahăr, proteine, flavone,

săruri minerale, calciu, magneziu, fosfor şi potasiu. Frunzele şi mugurii ramurilor

tinere conţin tanin, flavone, acizi organici, vitamina C şi multe substanţe minerale.

Acţiune farmaceutică.

Frunzele de mur au calitaţi dezinfectante, fac imposibilă înmulţirea microbilor,

moderează secreţiile, provoacă strângerea ţesuturilor şi ajută la vindecarea lor,

combat diareea, favorizează digestia la nivelul stomacului şi calmează spasmele. De

asemenea, frunzele de mur sunt utile la afecţiunile gâtului, gurii şi la vindecarea

leucoreei (scurgerea vaginală de lichid albicios).

Murele (fructele) sunt tonice, laxative, depurative şi nutritive pentru organism.

Murele reglează acţiunea melaninei (pigmentul care dă culoarea pielii), fiind utile

celor cu dereglări ale acestei substanţe (de exemplu în vitiligo). Murele au şi calităţi

de îmbunătaţire a acuităţii vizuale, refac integritatea cavitaţii bucale şi refac celulele

lezate ale tubului digestiv. Ele sunt de asemenea utile şi în diabet şi, în plus, sunt

indicate persoanelor astenice cărora le sângerează des gingiile. Murele ajuta la

combaterea obezitaţii, fiind foarte sănatoase pentru organismul nostru, având

numeroase beneficii precum: reducerea riscului hipertensiunii, vindecarea

inflamaţiilor intestinale, vindecarea problemelor de memorie, problemelor de inimă şi

a problemelor de stomac, combate hemoroizii, ajută la vedere şi reduc riscul de

diabet. Despre mure se spune că previne inclusiv cancerul de esofag, cervical sau de

sân.

20

1.2.3. Fructele de pădure din familia Elaeagnaceae.

Elaeagnus angustifolia - Măslin sălbatic (Sălcioara)

Clasă: Magnoliopsida

Subclasă: Rosidae

Ordin: Rhamnales

Familie: Elaeagnaceae

Gen: Elaeagnus

Elaeagnus angustifolia este un arbust peren cu frunze căzătoare, ce poate

ajunge până la cca.7 m înălțime, la maturitate. Frunzele sale sunt ovale, lanceolate,

de culoare verde şi sunt acoperite cu perișori mulți de culoare albă, ceea ce creează

aspectul argintiu al acestora. Elaeagnus angustifolia este un arbust spinos, care are

flori mici frumos mirositoare, de culoare galbenă, înflorirea producându-se la

sfarșitul primăverii. În urma florilor apar fructele verzi, de forma unor măsline, dar

de dimensiuni mai mici. Măslinul sălbatic este o plantă rezistentă atat la temperaturi

ridicate cât și la temperaturi scăzute și tolerează orice tip de sol bine drenat, chiar și

pe cele sărace în substanțe nutritive. Rezistă bine chiar și în soluri pietroase sau

sărate. Se plantează în general în locuri însorite dar se poate amplasa și in zone

semiumbrite. Este un arbust ce împiedică îmburuienarea terenurilor. Fructele sale au

proprietăți benefice în tratarea poliatritelor. Denumirea populară: Sălcioara, salcie

mirositoare. În scop terapeutic se utilizează ramurile tinere, mugurii, florile și

fructele.

21

Compoziţia chimică.

Ramurile tinere conţin: mucilagii, acid benzoic, acid cinamic, compuși polifenolici,

tanin, flavone. Florile conțin: mucilagii, rezine, acid benzoic, acid cinamic, acid

hidroxi-benzoic, compuși polifenolici, acid p-cumaric şi flavone.

Acțiune terapeutică. Sălcioara are acțiune antimicrobiana (Stapyiloccocus aureus,

Streptoccocus pyogenes, Klebsiella pneumoniae), antitumorală și cicatrizantă. Uleiul

din semințe este utilizat pentru tratarea afecțiunilor bronhiale.Sucul obținut din flori

este folosit pentru tratarea febrei. Fructele bogate în vitamine, flavone și substanțe

minerale, se apreciază că pot reduce apariția cancerului sau să stagneze evoluția

acestuia. Fructele pot fi utilizate pentru prepararea de gem și şerbet.

1.3. Caracteristica generală a acizilor ursolic şi oleanolic.

Acidul (3β)-hidroxi-urs-12-en-28-oic (1) sau acidul ursolic, (C30H48O3), (Fig.

1.), este o triterpenă hidroxi-pentaciclică care manifestă o bună activitate

chemoprotectivă pentru organismul uman, este larg răspândit în natură şi se izolează

din diferite extracte din plante, singur sau împreuna cu zăharuri. Alături de izomerul

său, acidul (3β)-hidroxi-olean-12-en-28-oic (2) sau acidul oleanolic, (Fig. 1.), acesta

se găseşte în numeroase plante, inclusiv cele care au fost folosite timp îndelungat în

medicina tradiţională[1].

22

Figura.1. Acidul ursolic (1) și acidul oleanolic (2).

1.3.1. Activitatea farmacodinamică a acidului ursolic.

Acidul ursolic (1) prezintă proprietăţi farmacologice remarcabile, cele mai

importante constând în efecte antihiperlipidemice, [2], antiinflamatoare, [3],

hepatoprotective, [4], inhibitorii ale proceselor de iniţiere şi proliferare a tumorilor,

[5], analgezice, [6], cardiotonice, [7], sedative şi anxiolitice, [8], antiulceroase, [9],

antimicrobiene, [10], hipoglicemiante, [11], antiaterosclerotice, [12], protective

împotriva toxicităţii induse de ciclofosfamide, [13] şi anticariogenice, [14], dar şi

efecte tonice şi modulatoare a sintezei de colagen, [15]. Ca agent natural

antiinflamator şi antitumoral, acidul acţionează prin inhibarea promotorilor tumorali

şi a proceselor inflamatoare datorate prezenţelor tumorilor.

1.3.2. Sinteza compuşilor derivaţi din acidul ursolic.

La fel ca şi acidului betulinic (3) şi acidul ursolic (1) prezintă cele trei poziţii:

C3, C20 şi C28 care în urma unor modificări chimice au furnizat o serie de derivaţi noi

cu proprietăţi biologice semnificative (Fig. 2). În urma investigării unui număr de

peste 70 de compuşi şi derivaţi sintetici ai acidului ursolic (1)s-a remarcat frecvenţa

acţiunii lor biologice, de inhibare a proliferării şi dezvoltării celulelor tumorale, fiind

consideraţi potenţiali agenţi chemo-preventivi în diverse tipuri de cancer [16].

Figura. 2. Acidul betulinic (3).

23

1.3.3. Acţiunea acidului ursolic asupra organismului omului.

Acidul ursolic (1), aşa cum se găseşte în organele vegetale al unor plante

medicinale, exercită efecte asupra organismului uman. Această substanţă naturală,

ajută la regenerarea şi restructurarea fibrelor de colagen, prezentând pe lângă acţiunea

antireumatică şi antigutoasă, şi efecte diuretice, coleretice şi sudorifice. Prin faptul că

acţionează trofic asupra fibrelor de colagen, acidul ursolic (1) prezintă şi efect

regenerativ asupra pieli. Cercetările din ultimii ani, au demonstrat proprietăţile

antitumorale exercitate de către acest compus. Cel mai probabil, în cazul acidului

ursolic (1), mecanismul de acţiune se datorează capacităţii de blocare a receptorilor

sensibili la hormonii corticosuprarenali, de la nivelul ţesuturilor conjunctive.

1.3.4. Activitatea farmacodinamică a acidului oleanolic.

În literatra de specialitate se menţionează că acidul oleanolic(2) este un compus

cu activitate anti-bacteriană [17-18], antifungală [19-20], insecticidă [21], anti-HIV

[22-24], diuretică [25], antidiabetogenic [26], gastro-intestinal [27]. În plus acidul

oleanolic are acţiuni de protecţie a ficatului [28], efecte anti-inflamatorii [29],

activitate antitumorală [30-32], şi acţiuni imunomodulare [33].

24

Capitolul II. Rezultate şi discuţii

2.1 Esenţa metodei de analiză Cromatografia de lichide de înaltă performanţă

(HPLC).

Această metoda acoperă azi, în proporţie aproximativ 80%, analiza

substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii

foarte polari sau labili termic precum şi compuşii cu masă moleculară ridicată

(naturali sau sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un

punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor

nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul că se poate modifica, pe lângă faza

staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi

analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de

masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiză a

compuşilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se

sprijină chimia sintetică actuală şi pe care s-a dezvoltat biochimia şi biotehnologia

modernă.

Metoda constituie o evoluţie a unei metode mai vechi, cromatografia pe

coloană clasică, care servea în primul rând la izolarea preparativă a compuşilor

naturali.Prin introducerea pompelor şi în consecinţă, lucrându-se la presiuni tot mai

ridicate (200 atm), dezvoltarea unor faze staţionare performante, de dimensiuni tot

mai mici (recent constituite din granule de faze staţionare sferice, cu diametre 2-5

µm), în coloane tot mai scurte (3-10 cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la

configuraţia actuală (Fig.3).

25

Figura 3. Prezentarea schematică a unui chromatograf de lichide (HPLC) modern.

Se poate observa că din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi

pompa (sau pompele), alimentează coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi

sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate a coloanei se introduce proba,

automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. În coloana aflată într-o etuvă

termostat, are loc separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră într-un detector de

unde componentul, dacă este separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul

unui colector de fracţiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct

în memoria unui calculator. În esenţă, un cromatograf analitic HPLC are structura din

(Fig.4), unde nu s-a mai prezentat colectorul de fracţiuni, interesant doar din punct de

vedere preparativ. Se poate observa asemănarea cu GC singura deosebire majoră

constituind-o sursa de eluent - pompa. În cele ce urmează se vor prezenta cele mai

importante aspecte deoarece volumul de informaţii publicate este deosebit de amplu,

un mare număr de date existând chiar pe reţeaua Internet.26

Solven

t

Pomp

ă

Injector Coloană Dedector Înregistrator

Figura 4. Schema bloc a unui cromatograf HPLC.

2.2. Caracteristicile spectrale ale acidului ursolic. Utilizări sintetice.

În laboratorul ”Chimia terpenoidelor ” al Institutului de Chimie a Academiei de Științe a Republicii Moldova au fost efectuate tentative de izolare a acidului ursolic

(1) din materii prime locale. Dintre acestea se evidențiază deșeurile de levănțică

(Lavandula angustifolia) provenite din hidrodistilarea uleiului volatil și tescovina de

măr ramasă de la producerea sucului, ambele la moment nu sunt utilizate, fiind

aruncate. Conținutul de acid ursolic (1) în aceste surse poate ajunge până la 1%.

Sursele menționate au fost extrase cu alcool, extractele obținute au fost

degresate cu eter de petrol, apoi supuse unei purificări cromatografice pe coloană cu

silicagel. S-a reușit izolarea acidului ursolic (1) în formă destul de pură. Structura lui

a fost confirmată prin metode de analiză moderne, spectroscopia în infraroșu (IR), și

rezonanță magnetică nucleară (RMN).

Spectrul IR al acidului ursolic (1) confirmă structura acestui compus prin

prezența benzilor de absorbție caracteristice pentru grupa hidroxil (-OH la 3675 și

1045 cm-1), gruparea carboxil (CO2H- la 3441 și 1722 cm-1) și legătură dublă

trisubstituită (la 1513și 873 cm-1) (Fig. 5).

27

Figura 5. Spectrul în infraroșu al acidului ursolic (1).

Spectrul 1H RMN al acidului ursolic (1) conţine 7 semnale singlet ale grupelor

metil de la 0.66, 0.70, 0.78, 0.79, 0.82, 1.05 şi 1.10 ppm (C23, C24, C25, C26,C27, C29 şi

C30), semnalul triplet al protonului de la atomul de carbon terțiar C3la 3.03 ppm,

semnalul singlet larg al protonului din grupa hidroxil (OH) atașată la atomul de

carbon C3 la 3.92 ppm şi singletul provenit de la protonul de la legătura dublă din

poziția C12 la 5.08 ppm (Fig.6).

Figura 6. Spectrul 1H RMN al acidului ursolic (1).

28

Datele spectrului 13C RMN al acidului ursolic (1) confirmă prezenţa a 7 grupe

metil din poziţiile C23, C24, C25, C26, C27, C29 şi C30 de la 15.13, 15.34, 16.63, 18.13,

23.07, 24.03 şi 30.48 ppm, unui atom de carbon terțiar hidroxilat din poziția C3 la

78.57 ppm şi a celui terțiar din poziţia C12 localizat la dubla legătură la 125.34 ppm șia atomului de carbon carbonilic din poziţia C28cărui îi aparţine semnalul de la

180.51 ppm(Fig. 7).

Figura 7. Spectrul 13C RMN al acidului ursolic (1).

2.4. Determinarea conținutului de acid ursolic și acid oleanolic.

Extractele obținute din fructele de pădure cercetate au fost analizate la Institutul

Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii Criogenice şi Izotopice or.

Râmnicul Vâlcea, România, pe un cromatograf de lichide de înaltă performanță,

HPLC de tip Surveyor Plus, echipat cu pompa cuaternară, cu doua pistoane tandem în

serie și spalare continuă a pistoanelor; sistem automat de injecție a probelor, bucla de

injecție de 25 µL; detector PDA, tip diode array; cuptor pentru controlul

temperaturii; sistem de degazare pentru solvenți; coloana cromatograficăBDS

Hypersil C18, lungime 250x4,0 mm, dimensiunea porilor de 3 µm;software pentru

controlul sistemului HPLC și achizitia/prelucrarea datelor.

Pentru construirea curbei de calibrare s-au folosit etaloane de puritate HPLC: acid

ursolic și acid oleanolic, procurate de la Sigma-Aldrich.

29

Probele pentru analiză au fost pregătite prin dizolvarea extractelor în metanol,

filtrarea lorînainte de introducerea directăîn sistemul cromatografic, folosind filtre de

membrană de 0.45 µm.

Analiza HPLC a fost efectuată în următoarecondiții cromatografice: debitul fazei

mobile: 0,7 mL/min; eluția izocratică a fazei mobile formată din MeOH:H3PO4:H2O

luați în raport de 88:0,05:11,95 (v/v/v); detective la lungimea de undă 210 nm;

volumulprobelor injectate: 10 µL; temperatura pe coloana: 20ºC; domeniul de

linearitate al metodei: 0 – 400 mg/L, iar coeficientul de corelare: 0,9775 pentru AO și

0, 9757 pentru AU.

Timpii de retenție pentru compușii analizați auvariant de la 14 la 15 minute în

cazul acidului oleanolic (2) și de la 15 la 16 minute în cazul acidului ursolic (1).

În rezultat au fost analizate toate cele 6 probe, cromatogramele lor fiind

reprezentate în Fig. ?-?,iar conținutul de acid oleanolic și ursolic determinat (în

mg/L) pentru fiicare probă este indicat în Tabel.

Figura 8. Cromatograma extractului de corn.

30

Figura 9. Cromatograma extractului de păducel.

Figura 10. Cromatograma extractului de măcese.

Figura 11. Cromatograma extractului de porumbar.

31

Figura 12. Cromatograma extractului de mure.

Figura 13. Cromatograma extractului de măslin.

Print-un conţinut înalt de acid ursolic şi acid oleanolic se evedenţiază specile

de Corn (189/460 mg/L) după care urmează Măceşul, Murul, Păducelul și Porumbar.

În toate specile s-a determinat un conţinut mai mare de acid ursolic, cel oleanolic find

în cantităţi mai reduse, excepţie se observă la specia de Măslin sălbatic unde acidul

oleanolic este intr-o cantitate mai mare faţă de acidul ursolic.

32

Tabelul 1

Proba Concentratie solutie (mg/L)

Acid oleanolic Acid ursolic

Corn331,7 1045,6

Păducel48,50 305,6

Măceş321,5 1035,4

Porumbar30,1 176,6

Mure278,9 464,5

Măslin sălbatic32,1 10,6

33

Capitolul III. Partea experimentală:

3.1. GeneralitățiSpectrele în infraroşu (IR) au fost determinate cu ajutorul spectrofotometrului

“Perkin-Elmer IR 397 spectrometer” în soluţie de tetraclorură de carbon. Spectrele de

rezonanţă magnetică nucleară (RMN) au fost înregistrate cu ajutorul spectrometrelor

“Bruker AC-400”.

Punctul de topire (p.t) al substanţelor a fost determinat cu ajutorul aparatului

“Boetius”. Unghiul de rotaţie a fost măsurat la polarimetrele “Polamat S” şi “Perkin-

Elmer 141” în soluţie de CHCl3. Pentru cromatografia de eluare pe coloane

cromatografice s-a utilizat, silicagel L 40/100µ, L 100/60µ sau "Across". Eluarea

coloanelor s-a efectuat cu eter de petrol sau amestec de eter de petrol – acetat de etil

în gradient crescând al acetatului de etil. Cromatogramele în strat subţire (CSS) au

fost efectuate pe plăci de silicagel ”Fluka”.Solvenţii pentru cromatografie au fost

distilaţi şi uscaţi cu CaCl2şi Na2SO4 anhidru.

3.2. Date spectrale ale acidului ursolic (1).

Spectrul IR (, cm-1,ulei de vazelină): 874, 1046, 1199, 1379, 1456, 1723, 2850, 2918,

3441, 3676, Spectrul1H RMN (200.13 MHz, , ppm, J/Hz): 0.66 (s, 3H,C(5)H), 0.68

(s, 3H, C(24)H3), 0.69 (s, 3H, (C(26)H), 0.82 (d, 3H, C(29)H3), 0.87 (s, 3H, C(25)H),

0.90 (s, 3H, C(23)H3), 0.92 (s, 3H, C(30)H3), 1.01 (m, 2H, C(15)H3), 1.05 (s, 3H,

C(27)H3), 1.27 (m, 2H, C(7)H2), 1.29 (m, 2H, C(21)H2), 1.29 (m, 1H, C(6)H), 1.31

(m, 1H, C(19)H3), 1.43 (m, 2H, C(2)H2), 1.47 (m, 1H, C(6)H2), 1.52 (m, 1H,

C(20)H), 1.54 (m, 2H, (C(22)H2), 1.56 (m, 2H, C(1)H2), 1.58 (s, 1H, C(9)H), 1.53

(m, 2H, C(16)H2), 1.92 (d, 2H, C(11)H2), 2.12 (d, 1H, C(18)H), 3.01 (d, 1H, C(3)H3),

5.14 (d,1H, C(12)H). Spectrul 13C RMN (100.61 MHz, δ, ppm): 15.13 (C(26)), 15.34

(C(25)), 16.63 (C(24), 17.57 (C(6)), 18.13 (C(29)), 22.86 (C(16)), 23.07 (C(30)),

34

23.80 (C(11)), 24.03 (C(27)), 26.79 (C(2)), 27.52 (C(21)), 30.48 (C(23)), 30.77

(C(7)), 32.69 (C(15)), 36.29 (C(22)), 36.51 (C(10)), 38.22 (C(1)), 38.35 (C(4)), 38.42

(C(19)), 38.48 (C(20)), 39.09 (C(8)), 41.62 (C(14)), 46.81 (C(17)), 47.00 (C(9)),

52.38 (C(18)), 54.77 (C(5)), 78.57 (C(3)), 125.54 (C(12)), 138.18 (C(13)), 180.51

(C(28)).

3.3. Extracţia fructelor de Corn:

Probele de fructe de corn cu m=10g fiecare, colectate în împrejurimile oraşului Orhei

în luna septembrie 2013 au fost extrase iniţial cu eter de petrol (EP, 3x5 ml), timp de

5 minute, extractele eterice au fost unite, filtrate şi concentrate în vid pînă la uscat sa

obţinut fracţii (1-3) ce conţin ceruri vegetale şi grăsimi cu masele: m1 =?, m2 =? , m3

=?.

În continuarie probele (1-3) au fost extrase cu cloroform (CHCl3 ), fierbinte 2x15ml

timp de 5 minute, extractele cloroformice au fost unite, filtrare şi concentrate pînă la

uscat. Sa obţinut extractele (1-3), cu m1 = ?, m2 = ?, m3 =?, cu nuanţă albă-roşiatică ce

conţine acizii oleanolic (AO) şi ursolic (AU). Aceste probe în continuare au fost

supuse analizei HPLC la Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii

Criogenice şi Izotopice (Râmnicul Vâlcea, România). Rezultatele sunt reprezentate în

Tabelul 1.

3.4. Extracţia fructelor de Păducel:

Probele de fructe de păducel cu m=10g fiecare, colectate în împrejurimile raionului

Ialoveni satul Sociteni în luna octombrie 2013 au fost extrase iniţial cu eter de petrol

(EP, 1x10ml), timp de 24h, la temperatura cameri extractele eterice au fost unite,

filtrate şi concentrate în vid pînă la uscat sa obţinut fracţii (1-3) ce conţin ceruri

vegetale şi grăsimi cu masele: m1 =11 mg, m2 =8 mg, m3 =7 mg.

35

În continuarie probele (1-3) au fost extrase cu alcool, fierbinte 1x10 ml timp de 24h,

extractele alcoolice au fost unite, filtrare şi concentrate pînă la uscat.Sa obţinut

extractele (1-3), cu m1 =627mg, m2 =717mg, m3 =652mg, cu nuanţă albă-roşiatică ce

conţine acizii oleanolic (AO) şi ursolic (AU). Aceste probe în continuare au fost

supuse analizei HPLC la Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii

Criogenice şi Izotopice (Râmnicul Vâlcea, România). Rezultatele sunt reprezentate în

Tabelul 1.

3.5. Extracţia fructelor de Măceş:

Probele de fructe de măceş cu m=10 g fiecare, colectate în împrejurimile raionului

Briceni satul Teţcani în luna octombrie 2013 au fost extrase iniţial cu cloroform

fierbinte (CHCl3, 2x15 ml), timp de 5 minute, extractele cloroformice au fost unite,

filtrate şi concentrate în vid pînă la uscat sa obţinut fracţia ce conţine ceruri vegetale

şi grăsimi cu masele: m1 =22 mg.

În continuarie proba a fost extrase cu eter de petrol fierbinte (EP, 2x15 ml) timp de 5

minute, extractele eterice au fost unite, filtrare şi concentrate pînă la uscat. Sa obţinut

extractul cu m1 =5 mg, cu nuanţă albă-roşiatică ce conţine acizii oleanolic (AO) şi

ursolic (AU). Aceste probe în continuare au fost supuse analizei HPLC la Institutul

Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii Criogenice şi Izotopice (Râmnicul

Vâlcea, România). Rezultatele sunt reprezentate în Tabelul 1.

3.6. Extracţia fructelor de Porumbar:

Probele de fructe de porumbar cu m=10g fiecare, colectate în împrejurimile raionul

Ştefan-Vodă în luna noiembrie 2013 au fost extrase iniţial cu eter de petrol (EP, 3x10

ml), timp de 5 minute, extractele eterice au fost unite, filtrate şi concentrate în vid

pînă la uscat sa obţinut fracţii (1-3) ce conţin ceruri vegetale şi grăsimi cu masele: m1

= ? , m2 =? , m3 =?.

36

În continuarie probele (1-3) au fost extrase cu cloroform fierbinte (CHCl3 ,2x15 ml),

timp de 5 minute, extractele cloroformice au fost unite, filtrare şi concentrate pînă la

uscat. Sa obţinut extractele (1-3), cu m1 = ?, m2 = ?, m3 =?, cu nuanţă albă-roşiatică ce

conţine acizii oleanolic (AO) şi ursolic (AU). Aceste probe în continuare au fost

supuse analizei HPLC la Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii

Criogenice şi Izotopice (Râmnicul Vâlcea, România). Rezultatele sunt reprezentate în

Tabelul 1.

3.7. Extracţia fructelor de Mure:

Probele de fructe de mure cu m=10 g fiecare, colectate în împrejurimile oraşului

Orhei în luna septembrie 2013 au fost extrase iniţial cu cloroform (CHCl3, 2x20 ml),

timp de 5 minute, extractele cloroformice au fost unite, filtrate şi concentrate în vid

pînă la uscat sa obţinut fracţia ce conţin ceruri vegetale şi grăsimi cu masa: m1 =131

mg.

În continuarie proba a fost extrase cu eter de petrol fierbinte (EP, 3x5 ml), timp de 5

minute, extracţia eterică a fost unită, filtrară şi concentrată pînă la uscat. Sa obţinut

extracţia, cu m1 =3 mg, cu nuanţă albă-roşiatică ce conţine acizii oleanolic (AO) şi

ursolic (AU). Acestă probă în continuare au fost supusă analizei HPLC la Institutul

Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii Criogenice şi Izotopice (Râmnicul

Vâlcea, România).Rezultatele sunt reprezentate în Tabelul 1.

3.7. Extracţia fructelor de Măslin:

Probele de fructe de măslin cu m=10 g fiecare, colectate în împrejurimile raionului

Ialoveni satul Sociteni în luna octombrie 2013 au fost extrase iniţial cu eter de petrol

(EP, 1x10 ml), timp de 24h, la temperatura camerei extractele eterice au fost unite,

filtrate şi concentrate în vid pînă la uscat sa obţinut fracţii (1-3), ce conţin ceruri

vegetale şi grăsimi cu masele: m1 =5 mg, m2 =6 mg, m3 =8 mg.

37

În continuarie probele (1-3) au fost extrase cu alcool, fierbinte 1x10 ml timp de 24h,

extractele alcoolice au fost unite, filtrare şi concentrate pînă la uscat.Sa obţinut

extractele (1-3), cu m1 =195 mg, m2=194 mg, m3 =198 mg, cu nuanţă albă-roşiatică ce

conţine acizii oleanolic (AO) şi ursolic (AU). Aceste probe în continuare au fost

supuse analizei HPLC la Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare prin Tehnologii

Criogenice şi Izotopice (Râmnicul Vâlcea, România). Rezultatele sunt reprezentate în

Tabelul 1.

3.8. Analiza HPLC a extractelor din fructe de pădure.

Materiale și metoda

Echipament - Cromatograful de lichide de înaltă performanță, HPLC Surveyor Plus

echipat cu:

Pompa cuaternară, cu doua pistoane tandem în serie și spalare continuă a

pistoanelor;

Sistem automat de injecție a probelor, bucla de injecție de 25 µL;

Detector PDA, tip diode array;

Cuptor pentru controlul temperaturii;

Sistem de degazare pentru solvenți; Coloana cromatografică BDS Hypersil C18, lungime 250x4,0 mm,

dimensiunea porilor de 3 µm;

Software pentru controlul sistemului HPLC și achizitia/prelucrarea datelor.

Materiale și reactivi

Etaloane de puritate HPLC: acid ursolic și acid oleanolic, Sigma Aldrich;

Acid fosforic, metanol de puritate analitică, apă ultrapura MiliQ

38

Prepararea probelor – extractele se dizolvăîn metanol și se filtreazăînainte de

introducerea directăîn sistemul cromatografic, folosind filtre de membrană de 0.45

µm.

Analiza HPLC–condiții cromatografice:

Debitul fazei mobile: 0,7 mL/min;

Eluția izocratică a fazei mobile MeOH:acid fosforic:apa = 88:0,05:11,95

(v/v/v)

Detecție: 210 nm

Volum injectat: 10 µL;

Temperatura pe coloana: 20ºC

Domeniul de linearitate al metodei:

Compus Timpul de retenție

(min)

Domeniu de linearitate

(mg/L)

Coeficientul de corelare

(r2)Acid oleanolic

14.33 0 - 400 0,9775

Acid ursolic 15.20 0- 400 0,9757

39

Concluzii:

Rolul plantelor medicinale și a fructelor de pădure în viața noastră ramâne

incontestabil. Ele sunt capabile să trateze atât afecțiuni simple, cât și boli

severe, sunt folosite în alimentație, pot fii valorificate în terapeutică pentru

efectele antiseptic, antiinflamator datorită conținutului flavonidelor,

compușilor volativi, compușilor terpenici în special acizii ursolic și oleanolic

sau altor principii activii.

Au fost colectate 6 specii de fructe de pădure autohtone: Corn, Păducel,

Porumbar, Măslin Sălbatic, Mure, Măcieş;

În condiții de laborator au fost extrase probele colectate după mai multe

metode care constau din mai multe etape: una prin extracția cu cloroform

fierbinte timp de 5 minute (Corn, Porumbar, Mure, Macies), a doua metodă

prin extracția cu alcool timp de 24 ore (Maslin si Paducel), a treia cu eter de

petrol care sa efectuat pentru toate probele;

Extractele obținute au fost analizate prin metoda cromatografică HPLC

(Cromatografie de lichide de înaltă performanţă);

40

BIBLIOGRAFIE:

1. Novotny, L.; Abdel-Hamid, M.E.; Hamza, H.; Masterova, I.; Grancai, D.

Development of LC-MS method for determination of ursolic acid. Application

to the analysis of ursolic acid in Staphylea holocarpa hemsl. J. Pharm.

Biomed. Anal. 31, 2003, 961-968.

2. Li, Y.; Kang, Z.; Li, S.; Kong, T.; Liu, X.; Sun, C. Ursolic acid stimulates

lipolysis in primary-cultured rat adipocytes. Mol. Nutr. Food Res. 54, 2010,

1609–1617.

3. Miceli, N.; Taviano, M.F,; Giuffrida, D.; Trovato, D.; Tzakou, O.; Galati, E.M.

Anti-inflamatory activity of extract and fractions from Nepeta sibthorpii

Bentham, J. of Ethnopharmacol. 97, 2005, 261-266.

4. Saravanan, R.; Viswanathan, P.; Viswanathan, K.; Pugalendi, K. Protective

effect of ursolic acid on ethanol-mediated experimental liver damage in rats,

Life Sciences.78,2006, 713-718.

5. De Angel, R.; Smith, S.; Glickman, R.; Perkins, S.; Hursting, S. Antitumor

effects of ursolic acid in a mouse model of postmenopausal breast cancer, Nutr.

Cancer. 62,2010,1074–1086.

6. Munoz ,O.; Christen, P., Cretton ,S.; Backhouse, N.; Torres, V.; Correa, O.;

Costa, E.; Miranda, H.; Delporte, C. Chemical study and anti-inflammatory,

analgesic and antioxidant activities of the leaves of Aristotelia chilensis (Mol.)

Stuntz, Elaeocarpaceae, J. of Pharma. and Pharmacol.63 (6),2011, 849–859.

7. Somova, L.; Shode, F.; Mipando, M. Cardiotonic and antidysrhythmic effects

of oleanolic and ursolic acids, methyl maslinate and uvaol, Phytomedicine.

11,2004,121-129.

41

8. Pemminati, S.; Gopalakrishna, H.; Venkatesh,V.; Rai, A.; Shetty, S.; Vinod,

A.; Pai, P.; Shenoy, A. Anxiolytic effect of chronic administration of ursolic

acid in rats, J. Appl. Pharm. Sci.1 (03),2011, 68-71.

9. Ramos, A.; Lima C.; Pereira, M.; Fernandes, F.; Pereira, W. Antigenotoxic

effects of quercetin, rutin and ursolic acid on HepG2 cells. Evaluation by the

comet assay, Toxicology Lett. 177 (1),2008, 66-73.

10.Azevedo, M.; Camsari, C.; Sá1, C.; Lima, C.; Ferreira, M.; Wilson, C. Ursolic

acid and luteolin-7-glucoside improve lipid profiles and increase liver

glycogen content through glycogen synthase kinase-3, Phytother. Res. 24

(S2),2010, 220–S.224.

11. Aragon, M.; Heras, B.; Reus, M.; Benedi, J. Pharmacological modification of

endogenous antioxidant enzymes by ursolic acid on tetrachloride-induced liver

damage in rats and primary cultures of rat hepatocytes, Exp. Toxic Pathol.

53,2001,199-206.

12. Somova, L.; Nadar, A.; Rammanan, P.; Shode, F. Cardiovascular

antihyperlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic acids in

experimental hypertension, Phytomedicine. 10,2003, 115-121.

13. Assimopoulou, A.; Zlatanos ,S.; Papageorgiou, V. Antioxidant activity of

resins and bioactive triterpenes in oil substrates, Food Chemistr. 92,2005, 721-

727.

14. Ramos, A.; Pereira, C.W.; Collins, A.R. Protective effects of ursolic acid and

luteolin against oxidative DNA damage include enhancement of DNA repair in

Caco-2 cells, Mutat. Res. 692 (1–2),2010, 6–11.

15. Kanjoormana, M.; Kuttan, G. Antiangiogenic activity of ursolic acid, Integr.

Cancer Ther. 9 (2), 2010, 224–235.

16. Simon, A.; Delage, C.; Saux, A.; Chulia, A.J.; Najid, A.; Rigaud, M. Anti-

herpes virus activities of bioactive fraction and isolated pure constituent of

42

Mallotus peltatus. An ethnomedicine from Andaman Islands, Virol J. 9, 2012,

98-102.

17. Kowalewski, Z.; Kortus, M.; Ediza, W.; Koniar, H. Antibioticaction of beta-

ursolic acid. Arch. Immunol. Ther. Exp.24, 1976, 115-119.

18. Sattar, A.; Bankova, V.; Kujumgiev, A.; Galabov, A.; Ignatova,A.; Todorova,

C.; Popov, S. Chemical composition and biologicalactivity of leaf exudates

from some Lamiaceae plants. Pharmazie. 50,1995, 62-65.

19.Jeong, T. S.; Hwang, E. I.; Lee, H. B.; Le, E. S.; Kim, Y. K.;Min, B. S.; Bae,

K. H.; Bok, S. H.; Kim, S. U. ChitinsynthaseIIinhibitoryactivityofursolicacid,

isolatedfromCrataeguspinnatifida. Planta Med. 65, 1999, 261-263.

20.Tang, H. Q.; Hu, J.; Yang, L.; Tan, R. X. Terpenoids and flavonoids from

Artemisia species. Planta Med., 66, 2000, 391-393.

21.Marquina, S.; Maldonado, N.; Garduno-Ramirez, M. L.; Aranda,E.; Villarreal,

M. L.; Navarro, V.; Bye, R.; Delgado, G.; Alvarez,L.

Bioactiveoleanolicacidsaponinsandotherconstituentsfromtherootso

fViguieradecurrens. Phytochemistry. 56, 2001, 93-97.

22.Kashiwada, Y.; Nagao, T.; Hashimoto, A.; Ikeshiro, Y.; Okabe, H.; Cosentino,

L. M.; Lee, K. H. Anti-AIDSagents 38. Anti-HIV activity of 3-O-acyl ursolic

acid derivatives. J. Nat. 63, Prod.2000, 1619-1622.

23. Ma, C.; Nakamura, N.; Hattori, M.; Kakuda, H.; Qiao, J.; Yu,H. Inhibitory

effects on HIV-1 protease of constituents from the wood of Xanthoceras

sorbifolia. J. Nat. Prod., 63,2000, 238-242.

24. Assefa, H.; Nimrod, A.; Walker, L.; Sindelar, R. Enantioselectivesynthesis

and complement inhibitory assay of A/B-ring partialanalogues of oleanolic

acid. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2001, 1619-1623.

25. Alvares, M. E.; Maria, A. O.; Saad, J. R. Diuretic activity ofFabiana

patagonica in rats. Phytother. Res. 16,2002, 71-73

43

26.Yoshikawa, M.; Matsuda, H.

Antidiabetogenicactivityofoleanolicacidglycosidesfrommedicinalfoodstuffs.

Biofactors. 13,2000, 231-234.

27. Li, Y.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M. Effects of oleanolic acidglycosides on

gastrointestinal transit and ileus in mice. Bioorg. Med. Chem. 7,1999, 1201-

1205.

28. Liu, J. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid. J.Ethnopharmacol.

49, 1995, 57-68.

29.Najid, A.; Simon, A.; Cook, J.; Chable-Rabinovitch, H.; Delage,C.; Chulia, A.;

Riguad, M.

Characterizationofursolicacidasalipoxygenaseandcyclooxygenaseinhibitorusing

macrophages, plteletsanddifferentiatedHL60 leukemiccells. FEBS. 229,1992,

213-217.

30. Hsu, H. Y.; Tsai, L. H. The investigation of oleanolic acid andursolic acid

combined with high dose ionizing radiation on theapoptosis of HL-60 cells.

Cancer Detect. PreV. 24 (Suppl.1),2000, 89-92

31. Liu, J. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectives. J.

Ethnopharmacol. 100, 2005, 92-94.

32. Li, J.; Guo, W. J.; Yang, Q. Y. Effects of ursolic acid and oleanolic acid on

human colon carcinoma cell line HCT15. World J. Gastroenterol. 8,2002, 493-

495.

33.Raphael, T. J.; Kuttan, G.

Effectofnaturallyoccuringtriterpenoidsglycyrrhizicacid, ursolicacid,

oleanolicacidandnomilinontheimmunesystem. Phytomedicine. 10,2003, 483-

489.

44