Tema 5. TEHNICI DE IZOLARE I CONSERVARE A CULTURILOR PURE5.1 IZOLAREA CULTURILOR PURE DE MICROORGANISME

mbuntirea permanent a lotului de microorganisme din care s se selecioneze tulpini cu performane deosebite, utile n procesele microbiologice industriale, impune izolarea din medii naturale a mai multor culturi reprezentative, care trebuie meninute i studiate n laborator sub form de culturi pure.

Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare n medii de cultur specifice, i dup cultivare n condiii optime, izolarea i studiul coloniilor izolate, replicare pentru obinerea de culturi pure.

Mediile eterogene din microbiota crora se preleveaz de obicei probele biologice sunt reprezentate de diverse biotopuri naturale (produse alimentare, sol, aer, ape). Numrul de probe care se analizeaz variaz n general n funcie de obiectivul urmrit, densitatea posibil a microorganismelor de izolat n mediul analizat i variaia densitii celulelor n habitatul respectiv n funcie de condiiile de mediu.Prin cultur pur se nelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultura pur este format din celule aparinnd unei singure specii sau unei singure tulpini.n funcie de principiul realizrii lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate n dou grupe mari i anume:- metode bazate pe principiul separrii fizico-mecanic a celulelor;- metode biologiceLa rndul lor fiecare din aceste dou grupe cuprinde metode generale, care se preteaz a fi utilizate pentru izolarea majoritii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup, sau un microorganism individual.

Procedee fizice de izolare a culturilor pureI. Metode prin rspndire sunt larg folosite deoarece sunt uor de executat, avnd ca principiu rspndirea celulelor, aflate n populaii eterogene n medii naturale, prin diluare n medii lichide sau rspndire mecanic pe suprafaa mediilor sterile solidificate.1. Metoda Koch se bazeaz pe rspndirea microorganismelor recoltate din medii naturale ntr-un mediu nutritiv i fixarea distanat a celulelor n urma solidificrii mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate ntre ele.Metoda este folosit n special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de rspndire este mustul de mal cu gelatin, repartizat cte 20cm3 n 3 eprubete, fluidificat i meninut la 35-40C. Din proba aleas pentru izolare se recolteaz celulele cu o ans, care apoi este trecut succesiv n cele 3 eprubete. Dup inoculare i uniformizare, coninutul fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care rmn fixate n gel vor forma prin multiplicare colonii izolate.

n funcie de densitatea celulelor recoltate iniial, n placa a 2-a sau a 3-a pot exista colonii izolate (la o distan de cca. 2 cm), iar dup studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea n eprubete cu slant agar obinndu-se culturi pure (fig. 1).

Fig. 1. Tehnica de izolare a culturilor pure prin rspndire (metodaKoch)

Caractere colonialeBacteriile se cultiv pe mediul de cultur general bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar-agar.La cultivarea pe bulion de carne cu agar dintr-o celul de bacterie, prin reproducere prin sciziune ia natere o colonie care devine vizibil cu ochiul liber dup 24-48 h.Bacteriile formeaz colonii cu urmtoarele aspecte:tip S (smooth neted lucios)tip R (rough rugos, aspru, cutat)tip M (aspect mucoid).n seciune coloniile bacteriene prezint profil lenticular, crateriform, triunghiular iar perimetrul coloniilor poate fi circular, dantelat sau cu ramificaii rizoidale (fig. 2).Culoarea coloniilor bacteriene poate fi alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-rou, albastru.La cultivare pe medii nutritive lichide bacteriile pot da tulburare, sediment n cazul bacteriilor anaerobe sau facultativ anaerobe sau formeaz la suprafaa lichidelor voal caracteristic, fragil sau cutat, gelatinos n cazul bacteriilor aerobe.Aceste caractere macroscopice servesc la identificarea bacteriilor.

Fig. 2. Caracterile coloniale ale microorganismelor

2. Metode scarificate. n plci Petri sterile se repartizeaz mediul de cultur adecvat (Bulion de carne agarizat -BCA sau must de mal agarizat MMA). Cu ajutorul ansei se recolteaz celule din mediul natural, apoi cu ansa ncrcat cu celule se traseaz striuri diferite pe suprafaa mediului solidificat, astfel nct prin drumul ct mai sinuos parcurs de fir, ntr-o zon a plcii celulele s rmn ataate de mediu i prin termostatare 48-72 ore s se dezvolte i s formeze colonii izolate. Se realizeaz apoi studiul morfologic al coloniilor reprezentative i culturile care intereseaz sunt repicate n eprubete cu mediu steril obinndu-se astfel culturi pure (fig. 3, 4).

Fig. 3. Obinerea culturilor pure prin rspndire pe suprafaa mediului cu geloz

Fig. 4. Metoda scarificat de izolare a culturilor pure3. Metoda n strii. Se aplic n cazul contaminrii cu microorganisme strine a culturilor pure n timpul conservrii acestora. Este similar cu metoda scarificat, n schimb drept mediu de rspndire se folosete mediul nclinat din 2-3 eprubete, n care se realizeaz transferul succesiv de celule, prin trasarea de striuri la suprafaa mediului.4. Metoda Drigalski. n trei plci Petri sterile se toarn mediu nutritiv cu agar (stratul de mediu s fie de 0,5-1 cm grosime) i se las s se solidifice. Dup meninerea plcilor n termostat 1-2 ore pentru zvntarea suprafeei mediului, n prima plac cu o pipet se scurge o pictur din suspensia n care se afl microorganismele i cu spatula Drigalski aceasta se rspndete uniform pe suprafaa mediului. Celulele ataate de spatul sunt apoi rspndite prin aceeai tehnic n urmtoarele 2 plci Petri, realiznd astfel rspndirea celulelor pe suprafaa mediului. Prin termostatare are loc dezvoltarea de colonii izolate din care prin repicare n eprubet cu slant-agar se pot obine culturi pure.5. Metoda de rspndire n plci, se aplic n special pentru izolarea culturilor pure de mucegai. O cantitate redus din proba biologic cu microbiot eterogen, din care urmeaz s se realizeze izolarea, se introduce ntr-o eprubet cu mediu agarizat fluidificat i temperat la 42C. Dup omogenizare coninutul eprubetei se repartizeaz ntr-o plac Petri. Apoi, n aceeai eprubet se adaug mediu nutritiv steril, pentru antrenarea eventualilor spori sau fragmente hifale rmase ataate de pereii eprubetei, i coninutul se repartizeaz ntr-o alt plac Petri steril, operaia continund de 3-5 ori. n ultimele plci pot aprea colonii perfect izolate sau chiar o colonie unic, din care prin repicare pe slant-agar se obine cultura pur.

II. Metodele de diluare presupun diluarea probei n ser fiziologicsteril prin tehnica diluiilor decimale, astfel nct numrul de celule ntr-o micropictur din ultima diluie s fie redus.Metoda Lindner este folosit pentru izolarea culturilor pure de drojdii, este o metod precis deoarece se realizeaz sub control microscopic. Dup realizarea de diluii corespunztoare, nct ntr-o pictur s se afle o singur celul, cu ajutorul unei penie topografice se plaseaz 9 picturi pe suprafaa unei lamele sterile. Lamela se plaseaz, cu picturile n jos, pe o lam cu excavaie i se studiaz la microscop fiecare pictur. Se marcheaz apoi pictura care conine o singur celula aparinnd drojdiei ce intereseaz, apoi se desprinde lamela i cu ajutorul unei benzi sterile de hrtie se absoarbe pictura marcat. Banda se introduce apoi ntr-o eprubet cu must de mal lichid, iar prin termostatare se asigur condiii de multiplicare a celulei, care prin reproducere va da o cultur pur.Metoda Naumov este o metod specific pentru izolarea culturilor pure de mucegai. Din proba biologic se recolteaz cu ansa o cantitate redus de substrat, ce conine celule specifice ale mucegaiului de izolat (spori, filamente hifale), care apoi se dilueaz n ap steril. Dintr-o diluie convenabil se aplic distanat micropicturi pe capacul interior al unei plci Petri, peste care se adaug n picturi mediu agariz fluidificat (42-45C), i dup 2- 3 zile de termostatare la 25-28C, odat cu apariia vizibil a miceliului, se selecteaz, din pictura cu colonie unic, cultura pur dorit.O alt metod, care se preteaz cel mai bine pentru izolarea culturilor pure de mucegai, const n inundarea suprafeei mediului solidificat (MMA, n plci Petri) cu aproximativ 2 cm3 dintr-o suspensie diluat de spori, care se menine n contact cu mediul cteva minute, apoi se scurge din plac. Sporii fungici care au rmas n contact cu mediul vor forma colonii izolate, din care dup studiul caracterelor morfologice, prin repicare n eprubete cu slant-agar, se vor izola culturi pure.Izolarea culturilor pure cu ajutorul micromanipulatorului. Prin intermediul manipulatorului (aparat prevzut cu tuburi capilare) pot fi izolate celulele dorite aflate n preparate microscopice. Utilizarea micromanipulatorului este de asemenea util pentru recoltarea de ascospori din celule ascogene i n studii de inginerie genetic (conjugare, fusiune protoplati).

Izolarea culturilor pure prin metode biologiceMetodele de izolare se bazeaz pe proprietile i particularitile fiziologice specifice ale microorganismelor ce urmeaz a fi izolate, prin care se difereniaz net de microorganismele nsoitoare aflate n microbiota eterogen din acelai biotop.Metoda Burri asigur separarea microorganismelor n funcie de necesarul de oxigen pentru desfurarea funciilor vitale (tipul respirator). Dup inoculare i omogenizare n mediu cu agar (fluidificat i temperat la 42-45C) mediul se transfer ntr-un tub de sticl (0,825 cm) i se solidific n poziie vertical formnd un tub de mediu drept. Drept medii de cultur se recomand utilizarea de medii speciale (carne-ficat-agar, tripticaz-glucoz-extract de drojdie), care conin glucoz. Pentru inoculare se poate utiliza i tehnica de rspndire a celulelor, n strii, n profunzimea tubului de gel (fig.5).

a bFig. 5 - Dezvoltarea microorganismelor n funcie de particularitile fiziologice (tipul respirator); b - Tehnica de inoculare a microorganismelor n masa de mediu cu gelozPrin termostatare, n funcie de accesul oxigenului din aer, separarea microorganismelor se realizeaz n mod natural (dup tipul respirator) (fig.5):- microorganismele aerobe - la suprafaa mediului drept;- microorganismele facultativ anaerobe - pe toat nlimea tubului de mediu;

- microorganismele microaerofile pe ultima 1/3 din nlimea mediului.- microorganismele strict anaerobe - pe mai mult de 2/3 din nlimea tubului.2. Folosirea mediilor selective, medii cu o compoziie care favorizeaz dezvoltarea unui grup restrns de microorganisme aparinnd aceluiai gen sau aceleiai specii. De cele mai multe ori, selectivitatea mediului este asigurat prin utilizarea unor substane chimice cu efect inhibitor asupra populaiei eterogene din care trebuie separat microorganismul dorit. De exemplu, pentru izolarea streptomicetelor (ageni utilizai pentru obinerea n condiii industriale a unor antibiotice i enzime), bacterii filamentoase, prezente n concentraie mare n sol n populaii microbiene abundente i extrem de diverse, selectivitatea mediilor se poate asigura prin una din urmtoarele metodele: utilizarea unor medii de cultur selective, care s conin surse de carbon i azot preferate, medii pe care streptomicetele s se dezvolte foarte bine comparativ cu eubacteriile i fungii. n acest caz, mediile recomandate sunt acelea care conin amidon i glicerol drept surse de carbon, arginin sau azotai ca surse de azot. Combinaia amidon-azotat este foarte favorabil pentru izolarea streptomicetelor, deoarece acestea asimileaz foarte bine azotatul comparativ cu alte bacterii; folosirea unor substane selective cu efect antifungic (actidion 50- 100 gcm-3; pimaricin + nistatin 10-15 mcm-3), sau antibacterian (polimixin 5gcm-3; penicilin 1gcm-3). Astfel, mediul cu amidon- cazein i rifamicin (50gcm-3) poate fi utilizat cu succes pentru izolarea unui numr mare de tulpini de Streptomyces diastaticus, cu efect inhibitor asupra altor microorganisme. De asemenea prin adugarea de roz bengal (35gcm-3), n mediul cu amidon-cazein-azotat, a fost inhibat creterea bacteriilor, ncetinit dezvoltarea fungilor, iar streptomicetele s-au dezvoltat normal.

3. Termorezistena diferit a principalelor forme sub care pot exista microorganismele poate reprezenta de asemenea un criteriu de separare a bacteriilor sporulate. Astfel, Bacillus subtilis agent utilizat n procese industriale de biosintez a enzimelor de tipul amilazelor i proteazelor, poate fi separat din microbiota eterogen a diverselor biotopuri naturale (sol,ap, fn, produse alimentare) prin pasteurizarea probelor la 80C/10 minute, cnd sunt distruse toate formele vegetative ale microorganismelor, precum i sporii, n timp ce endosporii bacteriilor rezisteni la pasteurizare, sunt izolai i n condiii favorabile de mediu dau natere la culturi pure.

4. Un alt procedeu de izolare pe baza proprietilor fiziologice specifice const n cultivarea n condiii restrictive de mediu, prin stabilirea unor regimuri de pH i temperatur optime pentru dezvoltarea unui singur microorganism sau a unui grup restrns de microorganisme i defavorabile pentru celelalte microorganisme nsoitoare prezente n acelai biotop.VERIFICAREA PURITII CULTURILOR PURE IZOLATE

Verificarea puritii culturilor izolate prin una din tehnicile descrise se face analiznd caracterele morfologice prin studiul urmtoarelor caractere: macroscopice (culturale) - prin inoculri pe mediu nutritiv solidificat n plci Petri, cnd prin controlul vizual al culturii se urmrete uniformitatea creterii i prezena indicatorilor morfologici caracteristici speciei izolate; microscopice - n preparate microscopice se apreciaz puritatea culturii pe baza cunotinelor referitoare la morfologia celulelor i unele particulariti specifice privind structuri de reproducere.Tulpinile izolate n numr mare din medii naturale sunt iniial pstrate n laborator sub denumirea de izolate i dup ce sunt studiate din punct de vedere morfologic i fiziologic capt identitate i sunt definite ca tulpini ce aparin unor specii i genuri distincte.Cea mai simpl i sigur metod de verificare a puritii culturii izolate const n recoltarea celulelor, realizarea unei suspensii n ser fiziologic steril, diluarea suspensiei i inoculare n mediu nutritiv cu agar, n plci Petri. Dup termostatare corespunztoare se studiaz coloniile dezvoltate n plac i se verific dac indicatorii morfologici coincid cu cei ai culturii iniiale. n cazul confirmrii puritii cultura se repic n cel puin 2 exemplare i se conserv n condiii corespunztoare care s asigure meninerea viabilitii, puritii i stabilitii.CONSERVAREA CULTURILOR PUREStabilitatea microorganismelor utilizate n scopuri tiinifice i practice se poate realiza prin conservarea n timp a strii de viabilitate (a caracteristicilor morfologice i biochimice ale microorganismelor n culturi pure), utiliznd metode diverse de conservare bazate pe ncetinirea proceselor metabolice ale celulelor vii.Microorganismele i conserv caracterele fiziologice, n perioade de timp variabile, n funcie de: specie; calitatea mediului; metoda de conservare; gradul de deshidratare a mediului; perioada dup care este necesar repicarea culturii pe mediu proaspt i obinerea de subculturi n condiii care s evite contaminarea.Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure de microorganisme menionm:- repicarea periodic la intervale scurte de timp;- privarea culturilor de accesul oxigenului;- meninerea culturilor la temperaturi sczute;- pstrarea celulelor n medii cu umiditate redus.Metodele de conservare aplicate, specifice fiecrui microorganism, trebuie s permit meninerea viabilitii i a potenialului productiv pe o perioad ndelungat. Indiferent de metoda aplicat cultura supus conservrii trebuie s fie pur din punct de vedere genetic.Alegerea metodei cea mai adecvat de conservare se face n funcie de tulpinile ce urmeaz a fi conservate, mijloacele tehnice disponibile i investiiile necesare. Literatura de specialitate ofer date privind cele mai adecvate metode de conservare a principalelor grupe de microorganisme i n particular pentru genurile i speciile cu importan industrial.Aprecierea viabilitii celulelor conservate prin diverse metode se realizeaz dup reactivarea acestora prin cultivare pe medii de cultur bogate din punct de vedere nutritiv i aprecierea cantitativ sau uneori calitativ a prezenei celulelor viabile.Controlul presupune stabilirea procentului de celule care i-au meninut viabilitatea dup o perioad de conservare prin metoda aleas, n raport cu numrul total de celule supuse conservrii.Procentul de celule afectate prin conservare, care nu i-au pierdut viabilitatea dar suferit modificri ale proprietilor biochimice se calculeaz prin diferena dintre numrul de celule care s-au dezvoltat n mediu nutritiv bogat i numrul de celule care au crescut pe mediu sintetic (minimal).