TEHNICI UTILIZATE PENTRU IZOLAREA GENELOR LA PLANTE

Izolarea genelor ale căror funcţii sunt cunoscute se face prin screening în bănci, cu sonde moleculare specifice. O sondă este o moleculă de ADN monocatenară, marcată radioactiv sau chimic. Metoda se bazează pe capacitatea de asociere a două molecule de ADN monocatenare complementare. Procedeul poartă numele de hibridarea coloniilor;

Hibridarea coloniilor presupune:

- construirea băncilor de gene (plăci cu colonii bacteriene dacă

vectorii de clonare sunt plasmide sau cu plaje de liză când donarea

se face cu fagi);

- realizarea unei replici de pe fiecare vas din banca de gene;

- denaturarea ADN;

- incubarea cu sonda;

- eliminarea excesului de sondă;

-autoradiografierea, pentru identificarea coloniei / plajei de liză în

care se află fragmentul de ADN complementar cu sonda.

Aplicaţii:

• izolarea genelor care codifică proteine total sau parţial secvenţializate;

• izolarea clonelor genomice;

• identificarea unei familii de multigene sau de gene înrudite de la alte

specii.

Exemple:

genele care codifică proteinele de rezervă de la cereale;

genele pentru enzimele chitinază şi glucanază de la cartof;

genele care codifică superoxid dismutaza la tomate etc.

SCREENING DIFERENŢIAT ( HIBRIDARE DIFERENŢIATĂ)

Izolarea genelor care se exprimă diferit în timp şi spaţiu, în diferitele celule, ţesuturi, organe.

Nu sunt necesare informaţii despre respectivele gene sau despre produşii lor.

Izolarea are la bază diferenţele existente între două sau mai multe probe în privinţa concentraţiilor produşilor de expresie.

Prin această tehnică (reprezentată schematic în figura) se izolează genele care au un mecanism comun de reglare.

Procedeul presupune:

- extracţia ARN din două probe;- izolarea ARNm din ambele probe (+ şi -);- realizarea de copii de ADNc din proba + (în care una sau mai multe gene de interes sunt transcrise);- construirea unei bănci de ADNc din proba +;- realizarea a două replici şi hibridarea acestora cu sonde reprezentate de ADNc din probele + şi -;- autoradiografierea;- izolarea clonelor cu intensităţi ale semnalului de hibridare diferite, care conţin genele transcrise diferenţiat;- caracterizarea clonelor selecţionate.

Principalul dezavantaj al acestei metode constă în faptul că nu permite identificarea moleculelor de ARNm, aflate în număr foarte mic (5-20 molecule/celulă).

ETALAREA DIFERENŢIATĂ A ARNm

Permite izolarea unor gene care se exprimă la un nivel foarte scăzut: - 30 de copii de ARNm / celulă - în două sisteme diferite

Această metodă se bazează pe sinteza PCR a ADNc, în prezenţa unor nucleotide marcate care reprezintă numai o parte dintr-o populaţie de ARNm, folosind un primer 3' oligo (T). Acest primer renaturează cu coada poli (A) şi o altă secvenţă scurtă, arbitrară, de nucleotide.

Dacă se utilizează primeri diferiţi, se pot face copii ADNc după toate moleculele de ARNm izolate dintr-o probă. Produşii PCR proveniţi din probe diferite se separă alăturat pe gel, obţinându-se un model de benzi ce poate fi studiat comparativ. Benzile unice reprezintă ARNm exprimat specific.

Clonele astfel izolate sunt caracterizate prin:

secvenţializare (este suficientă o regiune de 200-400 de perechi de

baze pentru a căuta în baza de date);

transfer de tip southern;

transfer de tip northern;

clonare în vector de expresie (rezultă, în cantitate mare, proteina

codificată şi pot fi astfel obţinuţi anticorpi specifici);

transformare genetică (se obţin plante transgenice cu construcţii

sens sau antisens, în care gena este pusă sub controlul unor

promotori constitutivi sau reglabili pentru studierea fenotipului

rezultat).

La plante, au fost izolate prin această metodă foarte multe gene care se exprimă diferenţiat în cursul embriogenezei, germinării, dezvoltării polenului, florilor, fructului, meristemelor sau în condiţii de stres osmotic, termic, de poluare etc.

Inţelegerea modului de dezvoltare a florilor, fructului sau a biologiei reproducerii se află deja la baza unor aplicaţii biotehnologice. De exemplu, au fost obţinute plante androsterile cu un promotor specific pentru tapetum (stratul hrănitor al microsporilor, care căptuşeşte lojele anterelor) ataşat secvenţei care codifică o ribonuclează. Au fost obţinute, de asemenea, tomate cu procesul de coacere modificat prin izolarea genelor transcrise în fructul în curs de maturare.

SCREENING ÎN BIBLIOTECILE DE EXPRESIE

Această metodă permite izolarea genelor care codifică proteine faţă de care se pot obţine anticorpi, dar care nu sunt sintetizate în cantităţi mari pentru a fi analizate. Se pot identifica, de asemenea, clonele ce codifică proteine cu funcţii în reglarea expresiei genelor care recunosc secvenţe specifice de ADN. în primul caz, sondele utilizate sunt anticorpi, iar în al doilea caz - secvenţe de ADN dublu catenar.

Etapele parcurse:

construirea băncilor de expresie; transferul pe hârtie de nitroceluloză; incubarea cu sonda anticorp; detectarea complexului anticorp – antigen.

Prin această metodă, au fost izolate genele pentru fenilalaninamoniu liază (PAL) de la lucerna, pentru poligalacturonază de la tomate, pentru chitinază de la fasole etc.

COMPLEMENTAREA FUNCŢIONALĂ ÎN DROJDII SAU ÎN ESCHERICHIA COLI

Complementarea funcţională face posibilă restaurarea fenotipului normal al unei mutante prin transferul unei alele de tip sălbatic. Pentru aplicarea acestei metode este nevoie de:

mutante cu fenotipul uşor de detectat; un procedeu de transformare eficient; o bancă de clone ce pot fi exprimate în mutante.

Etapele parcurse:

construirea unei bănci de ADNc într-un vector de expresie;

introducerea vectorului în celule mutante, prin transformare;

selecţia pentru complementare pe un mediu adecvat;

caracterizarea clonelor identificate.

Exemple de gene de la plante izolate prin complementare:

gene care codifică transportori de membrană (K+, aminoacizi etc);

gene care codifică factori de transcripţie;

gene care codifică enzime implicate în sinteza nucleotidelor);

gene care codifică enzime implicate în sinteza aminoacizilor (A - 1 -

pirolidin - 5 - carboxilat reductaza, implicată în sinteza prolinei).

MUTAGENEZA DE INSERŢIEEste o metodă care presupune folosirea unor secvenţe de ADN -

transpozoni sau ADN-T - ca mutageni de inserţie, cu rol de "etichete" pentru genele mutante. Dacă nu există alte gene care să complementeze, parţial sau total, funcţia genei mutante, se obţine o descendenţă homozigotă cu fenotip anormal ce poate fi detectat morfologic, biochimic sau fiziologic.

Etapele parcurse: obţinerea unei populaţii numeroase de plante transgenice; identificarea fenotipurilor mutante în T

2;

determinarea consegregării fenotipului mutant cu secvenţa de inserţie (ADN-T); obţinerea secvenţelor care flanchează ADN-T; utilizarea secvenţelor care flanchează ADN-T pentru izolarea clonelor genomice de la tipul normal sau a ADNc; complementarea funcţională (transformarea mutantelor cu alele de tip sălbatic).

Prin mutageneza de inserţie, au fost clonate gene care reglează:dezvoltarea florii (agamous, apetala flower), numite şi homeotice;creşterea vegetativă (dwarf = piticism).

CLONAREA PE BAZA PCR

Această metodă se aplică atunci când:

• se cunoaşte secvenţa genei şi se pot construi primeri specifici;

• informaţiile despre secvenţa genei sunt limitate (invers PCR). Matriţa de ADN poate fi clona bacteriană, plasmida, ADN genomic, ADNc, ADN din bănci de gene, ca şi din coloniile bacteriene sau plajele fagice.

Indiferent de provenienţa ei, matriţa este denaturată rezultând două catene. Doi primeri oligonucleotidici hibridează cu matriţa (câte un primer pentru fiecare catenă). Apoi, o ADN-polimerază adaugă la primeri deoxiribonucleotide, sintetizând catenele complemetare. Urmează un nou ciclu de denaturare, renaturare, sinteză, dublându-se astfel fragmentul de ADN delimitat de primeri.

Înainte de a fi clonaţi, produşii PCR sunt secvenţializaţi şi caracterizaţi.

HIBRIDAREA PRIN DIFERENŢĂ (SUBTRACTIVE HIBRIDISATION)

Această tehnică permite izolarea unor clone genomice sau ADNc printr-o îmbogăţire selectivă cu secvenţa ce va fi izolată.

Etapele parcurse:• se izolează acizii nucleici (din organismul mutant, care nu posedă secvenţa "ţintă", şi din organismul normal, care o posedă) şi se biotinilează:• se denaturează;• se hibridează, pentru a se elimina secvenţele comune ambilor acizi nucleici şi a se obţine o populaţie îmbogăţită în secvenţe "ţintă".

Când se utilizează ADNc, secvenţele rămase după hibridare se folosesc ca sonde pentru screening în bănci de ADNc sau pentru a construi bănci mult mai mici decât cele convenţionale, în care pot fi mult mai uşor detectate clonele induse specific.Prin această metodă, a fost izolat ADNc exprimat în anumite ţesuturi sau ca răspuns la tratamente cu hormoni ori la acţiunea unor factori de stres biotici sau abiotici.

SECVENŢIALIZAREA GENOMURILOR ŞI A "ETICHETELOR PENTRU SECVENŢELE EXPRIMATE" (EXPRESSED SEQUENCE TAGS = EST)

Există proiecte care au drept scop secvenţializarea întregului genon: la Arabidopsis şi la Oryza sativa. Acumularea informaţiilor obţinute în cadrul acestor proiecte a determinat crearea unor noi bănci de date. Informaţiile dobândite prin secvenţializarea unei scurte porţiuni (250-400 de perechi de baze) de ADNc obţinute din diferite organe, în anumite stadii de dezvoltare etc, acumulate într-o bancă de date specială, pot fi folosite pentru izolarea unor noi gene la plante.

Etapele parcurse: se construiesc bănci de ADNc provenit din organe diferite, ca şi din celule cultivate în prezenţa unor hormoni sau sub acţiunea unor factori de stres; se secvenţializează o porţiune de 250-400 de perechi de baze, dintr-un ADNc ales la întâmplare, iar informaţiile obţinute sunt introduse în băncile de date EST; se analizează, prin diferite metode (care traduc secvenţa nucleotidelor în secvenţă de aminoacizi), secvenţele din băncile EST, comparativ cu cele din băncile internaţionale, pentru a se identifica funcţia genei de la care provin "etichetele".

Prin analiza EST, au fost identificaţi la Arabidopsis thaliana noi

membri ai unei familii de proteine care formează canale pentru K+

sau ai unei familii de transportori ai NO"3, ca şi al cincilea membru al

familiei de gene care codifică proteinele de rezervă din seminţe.

Numai o treime din EST de la Arabidopsis au fost etichete pentru

gene care codificau proteine cunoscute. Restul de două treimi din

EST secvenţializate corespundeau unor gene care codificau proteine

pentru care nu existau corespondenţi cunoscuţi la alte organisme

( gene exprimate care nu au fost încă identificate).