Izolarea culturilor pure de microorganisme

Procedee de izolare a culturilor pure- metode bazate pe principiul separrii fizico-mecanic a celulelor;- metode biologiceProcedee fizice de izolare a culturilor pureI. Metode prin rspndire sunt larg folosite deoarece sunt uor de executat, avnd ca principiu rspndirea celulelor, aflate n populaii eterogene n medii naturale, prin diluare n medii lichide sau rspndire mecanic pe suprafaa mediilor sterile solidificate.II. Metodele de diluare presupun diluarea probei n ser fiziologicsteril prin tehnica diluiilor decimale, astfel nct numrul de celule ntr-o micropictur din ultima diluie s fie redus.

Metode prin rspndireMetoda Koch Metoda de striiMetoda DrigalskiMetoda de rspndire n plci

Tehnica de izolare a culturilor pure prin rspndire (metodaKoch)

Bacteriile formeaz colonii cu urmtoarele aspecte:tip S (smooth neted lucios)tip R (rough rugos, aspru, cutat)tip M (aspect mucoid).

Caracterele coloniale

Metode scarificate de izolareObinerea culturilor pure prin rspndire pe suprafaa mediului cu geloz

Metode scarificate de izolareObinerea culturilor pure prin rspndire pe suprafaa mediului cu geloz

Tehnica striurilor

Metode de diluareMetoda Lindner (micropicturi pe lamele)2. Metoda Naumov (micropicturi fixate n agar)Inundarea suprafeei mediului solidificatIzolare cu ajutorul micromanipulatorului

Metode biologice de izolareMetoda Burri asigur separarea microorganismelor n funcie de necesarul de oxigen pentru desfurarea funciilor vitale (tipul respirator). Folosirea mediilor selective, medii cu o compoziie care favorizeaz dezvoltarea unui grup restrns de microorganisme aparinnd aceluiai gen sau aceleiai specii.Izolare n baz de termorezisten

Izolarea culturilor pure prin metode biologice

Metodele de conservare a bacteriilor n CNMN.

Colecia Naional de Microorganisme NepatogeneTema: Valorificarea i conservarea resurselor microbieneprin biotehnologii competitive clasice i moderne

Etapa 2006: Standardizarea procedurii de conservarea tulpinilor de fungi pstrate n CNMNExecutant responsabil: dr.Srbu Tamara

Scopul cercetrilor: Crearea condiiilor corespunztoare standardelor internaionale de conservare i valorificare a fondului genetic microbian, n special al micromicetelor din Colecie

Sarcini specifice:-Selectarea metodelor optime de conservare a fungilor microscopici.-Selectarea mediilor de protecie necesare pentru liofilizarea tulpinilor de fungi depozitate n CNMN.- Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a micromicetelor-Selectarea mediilor de regenerare a culturilor supuse liofilizrii.- Studiul influenei pstrrii de lung durat asupra viabilitii i stabilitii proprietilor tulpinilor de fungi de interes biotehnologic.

Selectarea mediilor de protecie optime pentru liofilizarea micromicetelor

Mediul optim pentru liofilizarea micromicetelor din genurile Aspergillus i Penicillium

lapte degresat + 7% glucoz

Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a fungilor microscopici Temperatura de congelare:majoritatea culturilor studiate manifest un procent mai mare al viabilitii n cazul aplicrii temperaturii de congelare de 400C. Exemplele cele mai elocvente sunt rezultatele experienelor cu Penicillum corylophilum, Penicillium vermiculatum i Aspergillus flavus.

Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a fungilor microscopiciDiferena dintre viabilitatea sporilor n cazul concentraiei iniiale de 1012 i 1013 este foarte elocvent. Ex: mrirea concentraiei sporilor de Aspergillus flavus de la 2,44 x 1012 la 1,4 x 1013 scade viabilitatea sporilor de la 83,6% la 10,7%.Se recomand concentraia sporilor de 1010- 1012 cel/ml.

Selectarea mediilor optime de regenerare a culturilor liofilizate de fungi. Regenerarea culturii Penicillium expansum 1-cultur pe mal-agar regenerat n mediul Czapec, 2- cultur pe mal-agar regenerat n mal 3- cultur pe mediul solid Czapec regenerat n mediul Czapec4- cultur pe mal-agar regenerat n ap distilat

4123

Evaluarea viabilitii i stabilitii proprietilor tulpinilor de micromicete n procesul pstrrii

La tulpinile din genul Penicillium se observ pstrarea peste 1 an al nivelului de viabilitate nregistrat ndat dup liofilizare, pe cnd tulpinile din genul Aspergillus manifest o scdere lent a viabilitii.Studiul particularitilor morfologice ale culturilor liofilizate comparativ cu cele pstrate pe medii solidificate nclinate indic asupra pstrrii particularitilor morfo-culturale ale tulpinilor. Culturile liofilizate, dup un an de pstrare, formeaz colonii identice cu cele iniiale: de aceeai mrime, form, grad de sporulare. Aceast afirmaie este valabil pentru tulpinile din diferite genuri: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trihoderma, Alternaria.

Evaluarea viabilitii i stabilitii proprietilor tulpinilor de micromicete n procesul pstrriiActivitatea antimicrobian a tulpinilor Aspergillus alliaceus i Aspergillus flavus Bacillus subtilisXantomonas campestris

Schema procesului de conservare prin liofilizare i regenerare a culturilor de micromicete

Pregtirea culturii i acumularea biomasei la cultivare pe mediu mal-agar solidificat nclinat timp de 14 zile

Pregtirea mediului protector: lapte degresat+7%glucoz Suspendarea sporilor de micromicete n mediul protector n concentraie de 1010- 1012 spori/ml i distribuirea a cte 2 ml suspensie n fiole

Congelarea la to= - 400C,

Uscarea masei congelate n instalaia de sublimare Sudarea fiolelor Pstrarea fiolelor la to= -4oC

Regenerarea culturii prin adugarea a 2 ml de mediu lichid Czapecmbogirea culturii prin trecerea coninutului fiolelor pe mediul mal-agar

Fig. 10. Activitatea antimicrobian a tulpinii Ps. aureofaciens B1249 fa de cultura-test Corynebacterium michiganense pn i dup liofilizare.

Fig. 11. Activitatea antimicrobian a tulpinii Ps. aureofaciens B-1249 fa de cultura-test Fusarium solani pn i dup liofilizare.

Fig.12. Meninerea tulpinilor de microorganisme din cadrul CNMN sub un strat de ulei mineral.

Studiul antagonismului microbian

Antagonismul bacterian

FACTORII CARE DETERMIN ACTIVITATEA MICROBIAN

-Compoziia chimic a mediului;-Structura anatomic ;-Valoarea pH-ului-Indicele de activitate al apei (aw)

Valori limit de pH pentru creterea microbian

Grupe deMicroorganismeValori minimeValori optimeValori maximeDrojdii1,5 3,54 6,58 8,5Mucegaiuri1,5 3,54,5 6,88 11Bacterii4,56,5 7,511Staphhylococcus aureus4,27 7,59,3Escherichia coli4,46 79,0Pseudomonas aeruginosa5,66,6 78,0Bacillus sp.5 - 66,8 7,59,4 10Clostridium botulinum4,88,2Clostridium perfingens5,56 7,68,5Clostridium sporogenes5 5,86,8 7,59,4 10Acetobacter sp.45,4 6,39,2Bacterii lactice3,23,5 6,58Lactobacillus acidophilus4 4,65,8 6,66,8Lactobacillus plantarum3,55,5 6,58Leuconostoc cremoris55,5 - 66,5

Valori minime pentru aw

Limite de awMicroorganismeProduse alimentare1 0,95Bacterii gram negative, bacterii sporulate, unele drojdiiProduse cu 20% zahr sau7% sare (salamuri, produse de panificaie)0,95 0,91Micrococi, bacterii lactice, bacterii sporulate, forme vegetative, sareProduse cu 55% zahr sau12% sare (brnzeturi, salamuri afumate)0,91 0,87Majoritatea drojdiilorProduse cu 65% zahr sau 15% sare0,87 0,80Majoritatea mucegaiurilorFina, orez cu 15 17 % ap0,80 0,70Majoritatea bacteriilor halofileAlimente cu 26% sare0,75 0,65Mucegaiuri xerofiteProduse cu 10% ap0,65 0,60Dojdii osmofileFructe uscate, cu 15 -20% ap.0,50Nu se dezvoltmicroorganismeCaramele cu 8% ap0,40Nu se dezvoltmicroorganismeProduse cu 3 5 % ap0,20 0,30Nu se dezvoltmicroorganismeProduse cu umiditate < 5%