CAPITOLUL II

CAPITOLUL IIBIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importana transferului de embrioni

Importana transferului de embrioni poate fi zooeconomic i tiinific.

Importana zooeconomic. Lucrrile de selecie i ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numrul redus de produi care se obin de la o femel n cursul vieii sexuale i de intervalul dintre generaii. Transferul de embrioni d posibilitatea folosirii cu eficien crescut a rezervelor de ovocite de la animalele de nalt valoare zootehnic numite donatoare, prin provocarea maturrii i eliberrii mai multor gamei femeli (poliovulaie) cu obinerea unui numr mai mare de produi de la aceeai femel prin transferul embrionilor n uterul femelelor receptoare. Astfel, n decursul vieii sexuale este valorificat doar o infim parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual. De exemplu, vaca ncepe perioada genital cu o rezerv de circa 150000 de ovocite ( n ambele ovare), rezerv care diminu la circa 21000 la vrsta de 2-3 ani i la circa 2500 la 12-14 ani. Numrul de ovocite eliberate n ntreaga via sexual nu depete 50, din care n condiii normale rezult maxim 10-12 viei. Prin asigurarea numrului corespunztor de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obine, n medie 3-4 viei pe an, fiind cunoscute cazuri cnd n condiii de supraovulaie, de la o vac donatoare s-au obinut 30-35 viei.

Transferul de embrioni se practic i pentru scurtarea intervalului dintre generaii. Prin instalarea gestaiei, femela intr n repaus productiv (sub raportul procreerii) pe ntreaga durat a gestaiei. n cazul practicrii transferului de embrioni, produii de concepie sunt transferai n alte organisme, ceea ce d posibilitatea obinerii de noi produi de la aceeai femel n intervalul de timp n care n mod normal, ar fi trebuit s fie gestant.

Mai mult, n prezent se pot obine gamei i de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a maturrii i expulzrii ovocitelor, care vor fi apoi transferate n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul dintre generaii, se accelereaz ameliorarea efectivelor de animale.

Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantin i eventualele restricii sanitar-veterinare n comerul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodat, prin practicarea transferului de embrioni, se pot obine produi de la femelele valoroase dar cu diverse afeciuni genitale incompatibile cu meninerea gestaiei sau cu parturiia.

De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar crerii de noi rase de animale cu nsuiri morfo-productive performante care pot forma linii de femele consangvine n vederea folosirii lor la ncruciri industriale.

n sintez, n practica de producie, transferul de embrioni se aplic pentru rezolvarea urmtoarelor probleme:

- reproducerea accelerat a animalelor de prsil, de calitate superioar, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetic a purttoarelor unor nsuiri valoroase (producii ridicate, capacitate de utilizare intens a furajelor, prolificitate mare, longevitate productiv, rezisten la anumii factori nefavorabili etc.);

- obinerea unui numr mare de descendeni de la femelele cu producii ridicate i cu durat prelungit de exploatare, n vederea crerii de familii cu aceste nsuiri;

- raionalizarea importului i exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului embrionilor congelai, nlturndu-se astfel barierele sanitar-veterinare i nlesnirea aclimatizrii materialului importat, dezvoltarea lui embrionar avnd loc n organismul primitoarelor;

- obinerea de embrioni liberi de leucoz cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuco-negative;

- crearea unor bnci de embrioni n vederea pstrrii raionale a rezervelor genetice, ceea ce este mai economic dect ntreinerea unor efective numeroase din rezerva genetic.

Importana tiinific

Transferul de embrioni reprezint o biotehnologie prin intermediul creia se poate efectua, n condiii optime, un aprofundat studiu tiinific al proceselor intime legate de fecundaie i de influenele matern i patern asupra produsului de concepie. Totodat, poate fi studiat dezvoltarea embrionar la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normal, cauzele i factorii care genereaz mortalitatea embrionar.

Produii obinui prin transferul de embrioni permit studierea influenelor factorilor genetici i ai mediului extern asupra dezvoltrii embrionilor, ereditatea grupelor sanguine, obinerea de animale mozaic de gene, a concentrrii mai multor caractere pe acelai individ, a instituirii unei profilaxii i terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeai linie, transferul de embrioni reprezint baza unei noi generaii de biotehnici care deriv din aceasta sau i sunt asociate: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia in vitro clonarea, transferul de gene, iar ingineria genetic folosete ca verig important, n metodologie, aceast biotehnologie.

Micromanipularea i microchirurgia ovocitelor i a embrionilor permit desfurarea unei cercetri tiinifice interesante, i obinerea din punct de vedere practic a unor nalte performane n reuita transferului de embrioni, prin transferul jumtilor de embrioni.

Sexul embrionului poate fi precizat cu mult acuratee, baza investigaiei fiind dat de transferul embrionilor.

Reproducerea, fr contribuia genetic a partenerului, se poate realiza prin ginogenez, fiind deja obinui primii oareci homozigoi, (Groza I., 1996). Aspecte similare ridic androgeneza n care se poate induce bispermia, adic ptrunderea n ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioar a pronucleului femel i n consecin diviziunea va continua numai n zona masculin (Groza I., 1996).

2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vac

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducie larg rspndit n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stpnite, astfel nct aceast modern biotehnologie poate fi extins la aproape toate fermele de creterea vacilor din lume. Astfel, n Europa se obin anual circa 100000 de produi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produi, extinderea biotehnologiei fiind limitat de costurile destul de ridicate.

Transferul de embrioni constituie, totodat, baza unei noi generaii de biotehnici, care deriv din aceasta sau i sunt asociate, cum ar fi: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia ,,in vitro, clonarea, transferul de gene.

Transferul de embrioni presupune parcurgerea urmtoarelor etape (fig. 10):

selecia i pregtirea vacilor donatoare; selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare); sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare; inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.2.1. Selecia i pregtirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie s ntruneasc la cel mai nalt nivel caracterele zootehnice care intereseaz. De aceea, cnd se face selecia donatoarelor, se are n vedere evaluarea urmtoarelor criterii: performana reproductiv, superioritatea genetic i valoarea produsului obinut prin transfer embrionar.

Vaca donatoare va fi mai performant reproductiv atunci cnd vrsta se situeaz ntre 3 i 10 ani, a nscut anual cte un viel, a rmas gestant n maxim dou cicluri sexuale, ciclurile de clduri au o succesiune fiziologic i nu a avut antecedente ginecologice (distocii, retenii placentare, infecii genitale etc.). Practic, criteriile care se au n vedere sunt: o stare ginecologic perfect, intervalul dintre parturiie i primul estru s fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiie-nsmnarea fecund s fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaie s fie mai mic de 1,5.

Superioritatea genetic const ntr-un ritm superior de cretere, nainte i dup nrcare i un randament ridicat la sacrificare. n cazul vacilor de lapte, nsuirile cu heritabilitate ridicat se refer la producia de lapte, procentul de grsime din lapte i conformaia corporal.

Vacile donatoare trebuie s fie sntoase, ele suportnd mai multe intervenii de supraovulare i recoltare de embrioni. O atenie deosebit trebuie s se acorde alimentaiei raionale a acestei categorii de vaci.

2.2.2. Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare)

Vacile receptoare de embrioni trebuie s fie sntoase, fr afeciuni ginecologice, s aib aceeai talie cu donatoarele, s fie apte s nasc descendeni cu aceeai greutate la natere ca donatoarele, avndu-se n vedere c gestaia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern.

Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd transferul de embrioni se face la tineretul femel n vrst de 18-20 de luni.

2.2.3. Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare

Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare i receptoare de embrioni se poate realiza pe cale natural sau medicamentoas.

n cazul sincronizrii femelelor prin mijloace naturale se urmresc, n lotul receptoarelor femelele care n mod spontan manifest estrul n acelai timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const n fapul c sunt necesare multe animale receptoare n ateptare. Aceast modalitate de sincronizare s-a practicat n perioada de nceput a transferului de embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer embrionii proaspt recoltai. n aceast situaie, n aceeai unitate trebuia s fie i vaci donatoare i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s se realizeze ntr-un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).

Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz pe faptul c se urmresc succesiv dou-trei cicluri de clduri la vacile donatoare i se stabilete durata ciclului. n acest fel se poate calcula data apariiei ciclului care intereseaz n transferul de embrioni. n funcie de data previzibil, se acioneaz prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare n vederea inducerii cldurilor, sincronizate cu cldurile naturale ale donatoarei. n acest caz se acioneaz asupra donatoarei numai n ceea ce privete inducerea poliovulaiei.

Sincronizarea medicamentoas a ciclului estral al femelelor donatoare i receptoare de embrioni se realizeaz pe dou ci: blocarea eliberrii hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.

Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroaciune i exercit efectul negativ asupra hipotalamusului, diminund nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul Sincronizarea estrului).

2.2.4 Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial

a vacilor donatoare

Provocarea eliberrii concomitente la aceeai perioad de clduri a unui numr sporit de ovocite dect cel caracteristic speciei se numete poliovulaie (supraovulaie, superovulaie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament.

Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin pe cunoaterea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin ndeosebi n ultima faz a creterii i maturrii foliculare. Potenialul ovarian de foliculi teriari (cu antrum) rmne relativ constant (ns variabil cu individul) de la vrsta de dou luni pn la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la vac, un singur folicul ajunge la maturitate n preajma ovulaiei, n timp ce, n timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz. Injecia unui hormon cu activitate de FSH mpiedic atrezia unor foliculi i stimuleaz dezvoltarea i maturarea simultan a mai multor foliculi teriari, n cursul aceluiai ciclu estral.

n prezent, dou scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap gestant, liofilizat i standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit i Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare folicular (FSH) extras din hipofiza anterioar.

PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante i are o dubl activitate: de tip FSH i LH, raportul FSH/LH variaz de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de njumtire destul de lung - 120 ore - a acestui hormon determin o uurin n folosire, o singur injecie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient n provocarea poliovulaiei. La dou-trei zile de la injectarea PMSG se administreaz i.m. o doz de 500-750 (g prostaglandin F2(, cldurile aprnd la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz i unele efecte negative traduse prin creterea folicular i secreia ridicat de estradiol i dup descrcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua nsmnare artificial (de ex. Neutra -PMSG intervet).

Fecundarea ovocitelor se face, de regul, prin nsmnarea artificial a vacilor la un interval de 12 ore de la nceputul estrului cu repetare la 8-12 ore interval.

FSH se prepar din extractele purificate parial, provenite din hipofiza mamiferelor - n principal de suine - care conine FSH i LH. Coninutul n cei doi hormoni i raportul dintre acetia variaz cu lotul. Perioada de njumtire foarte scurt (circa 70 minute a acestui hormon necesit injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, n vederea meninerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcie de preparatul comercial, raportul dintre FSH i LH, de regul variaz de la 1 la 0,5. Dozele totale care se administreaz, n vederea producerii poliovulaiei, variaz de la 28 mg la vielele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injeciile fcndu-se n ritm descresctor, intramuscular sau subcutanat.

Preparatele care conin aceti hormoni au denumiri care difer cu unitatea productoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.

Ca i cealalt schem de tratament, injectarea prostaglandinei F2(, n doz de 500-750 (g se face la 48-72 de ore de la nceperea tratamentului, estrul aprnd la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin nsmnarea artificial a femelelor supraovulate de dou ori, la 12 i 24 ore de la apariia estrului.

Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei

Preparatele medicamentoase care conin hormoni gonadotropi sunt injectate n faza luteal a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent ntre ziua a 9-a i a 13-a. Dou zile dup injecia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecie de FSH, se injecteaz un analog de PGF2( (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permind ovulaiile (fig. 11 i 12).

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni (dup M. Thibier i M. Nibart, 1991)

O alt schem de tratament const n utilizarea progestinelor pe cale oral, parenteral, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blocheaz axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Ct timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se gsesc sub aciunea temporar a progestinelor, femela nu va manifesta estru i nici nu va ovula. Dup suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descrcare rapid, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, n decurs de 5-7 zile, intrarea n clduri ovulatorii a femelelor tratate. n cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, n ritm descresctor ncepnd cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecie intramuscular de PGF2(.

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

(dup I.C.P.C.B. Baloteti)

n cazul ntrebuinrii preparatelor hormonale pe baz de PMSG, acestea se injecteaz, mpreun cu o doz de prostaglandin F2(, n a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmat de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a nsmnare artificial (fig. 11 i fig. 12).

O schem mai simpl de provocare a poliovulaiei const n nceperea tratamentului cu hormoni gonadotropi n a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viele i n a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, ns numrul de embrioni obinui este mult mai redus.

Rezultate bune n provocarea poliovulaiei s-au obinut prin injectarea unei doze de Gn-RH la vacile poliovulate nainte de prima nsmnare artificial sau concomitent cu aceasta, n vederea gruprii ovulaiilor.

Prin provocarea poliovulaiei se pot obine de circa 8-10 ori mai muli embrioni, dect n cazul recuperrii unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 18).Exist o variaie mare n ceea ce privete rspunsul la tratamentul poliovulator, din partea vacilor. Aceast variaie pronunat se datoreaz hormonului utilizat, puritii acestuia i de specificul individual al femelelor. Cercetrile au relevat faptul c circa 10-20% dintre vaci nu rspund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% rspund slab la un astfelde Foto 18 Ovare superovulate

Tratament (1-3 embrioni transferabili pe vac tratat) i doar 30-40% dintre vaci au un rspuns ideal la tratamentul de superovulaie furniznd 7-12 embrioni/vac/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizeaz mai mult de 20 de embrioni. n prezent, stimularea ovarian pare a fi atins un anumit plafon ntruct, se colecteaz, n medie 9-10 embrioni (limite ntre 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite ntre 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988).

n ceea ce privete repetarea tratamentelor de superovulaie la aceeai donatoare, s-a constatat c tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani. Producia total de embrioni de la aceeai donatoare depinde de aceasta i de ritmul de colectare .

Este necesar un interval de cel puin 60 de zile dup ftare n vederea nceperii tratamentului poliovulator. Unii cercettori constat o reducere a numrului de embrioni transferabili o dat cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explic prin formarea n organismul femelei tratate a anticorpilor anti-PMSG i reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie s se fac la un interval de 54-60 de zile i s se intercaleze tratamentele pe baz de PMSG i FSH-p.

Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenate de vrsta femelelor, ras, mascul, sezon, nivelul produciei de lapte, starea general, etc. De regul, vielele produc un embrion viabil mai puin dect vacile adulte.

2.2.5. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate n urma nsmnrii naturale sau artificiale. De regul, se efectueaz dou nsmnri artificiale la interval de 12-24 de ore de la nceputul cldurilor observate clinic sau, sistematic, dup 56 i 72 de ore de la injecia cu PGF2(, sau dup 36 i 48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor.

2.2.6. Recoltarea embrionilor

Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup ieirea lor din oviduct (ntre zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se prefer colectarea embrionilor nc inclui n zona lor pelucid (ies n a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz ntre zilele 6-8 dup fecundaie, de regul n ziua a 7-a.

Recoltarea embrionilor se face chirurgical i nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgical a fost singura utilizat. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital n plag i recoltarea propriu-zis a embrionilor prin splarea cu un lichid cu o compoziie special, a oviductelor (dup un interval de timp mai mic de 3 zile dup nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un interval de timp mai mare de 4 zile de la nsmnare). n prezent, metoda chirurgical de recuperare a embrionilor la vac este abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint. Astzi, este generalizat metoda nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei principiu const n splarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, splare care se realizeaz n condiii de asepsie n a 7-a zi de la nsmnare. Tehnica nechirurgical de colectare a embrionilor s-a perfecionat continuu, firme specializate produc pe scar industrial mediul de recoltare, congelare, decongelare i ntreaga aparatur necesar recoltrii i transferului embrionilor.

Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe operaii: contenia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a regiunii perivulvare, identificarea prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de splare n lumenul coarnelor uterine, splarea acestora, recuperarea lichidului mpreun cu embrionii, identificarea i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat i supus decantrii i aprecierea morfologic a acestora.

n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul unde se gsete femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practic anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care blocheaz nervii coccidieni i ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se introduce ntre prima i a doua vertebr coccigian sau ntre ultima vertebr sacral i prima vertebr coccigian, anestezia instalndu-se dup circa 10-15 minute i dureaz n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul i uterul.

Se introduce, cu precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de coninut, apoi se apreciaz rspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu atenie ambele ovare i numrdu-se corpii galbeni (foto 19). n cazul n care rspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedeaz cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei ci, prin conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se ajunge n lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n scopul fixrii cateterului i pentru a mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare. Vasul din sticl, ce conine lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin cdere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de splare).Recuperarea lichidului de splare se face prin calea de admisie (n cazul cateterului cu dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y) prevzut cu canal de admisie i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectat la un filtru de colectare a crui orificii au un diametru de 75 (m, care are rolul de reinere a embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul fiind colectat ntr-un recipient situat sub filtru.Mediul folosit la splarea unui corn uterin se folosete la splarea, n acelai mod, a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se folosete pentru splarea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectundu-se irigri repetate i un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat. Exist diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diveri cercettori, care se bazeaz pe acelai principiu constructiv .ntre momentul recuperrii embrionilor i cel al inoculri lor n uterul receptoarelor, zigoii trebuie s fie meninui n via n condiii speciale i s fie manipulai n cele mai bune condiii tehnice i igienice. n ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluii tampon fosfat - PBS (Fosfat bufferet salin) pentru splarea coarnelor uterine i pentru pstrarea embrionilor recuperai.Foto 19 Recoltarea embrionilor prin metoda nechirurgical

Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic de 290 miliosmoli i conine multe sruri minerale, glucoz i protein (albumin bovin seric, 2-4 g/l, sau ser de viel fetal decomplementat 10%.Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele crioprotectoare care vin n contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se arunc (sonde colectoare, filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care necesit a fi sterilizate, se spal cu o soluie de detergent netoxic, se cltete n ap distilat, se usuc i se nvelete n hrtie n vederea sterilizrii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (cldur uscat, cldur umed, substane antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperrii embrionilor depind n cea mai mare msur de abilitatea i antrenamentul operatorului. Proporia embrionilor recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu numrul de corpi galbeni identificai pe ambele ovare. Dup colectarea embrionilor se injecteaz donatoarei o doz de PGF2(, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitndu-se astfel gestaia multipl.

2.2.7. Cutarea i aprecierea calitii embrionilor

Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se ndeprteaz supernatantul iar stratul inferior n care se regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agit n mediu din filtrul colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori.

Examenul embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai bune condiii de asepsie, curenie i la o temperatur constant a laboratorului (20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucid avnd o grosime de 12-15 m. Pentru identificarea embrionilor, se examineaz la o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare ptrat de la nivelul plcii Petri. (foto 21).Foto 20 Placa PETRI cadrilat folosit la cutarea embrionilorFoto 21 Cutarea embrionilor n lichidul de splare cu ajutorul stereolupelor

O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n plci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm n care se gsete mediul de splare la care s-a adugat 20% albumin seric bovin (BSA). Operaiunea se repet de 3-5 ori, embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta, schimbndu-se de fiecare dat pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai exportului, acetia sunt trecui prin zece astfel de bi de splare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS (40% BSA sau 10-20% ser de viel fetal) provoac o cretere a presiunii osmotice. Pentru a reduce ocul osmotic, embrionii sunt trecui succesiv i pe cte o durat de 5 - 10 minute n dou-trei bi cu mediu de conservare cu o concentraie crescnd n crioprotector: glicerol 0,7 M i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast trecere a embrionilor n mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatur cuprins ntre+20oC i +30oC.

Dup ultima baie, adic n momentul n care este atins concentraia final n crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiionai pentru congelare, fie n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Exist bancuri de identificare ce permit pe de o parte nchiderea ermetic a paietei i care poart (sunt inscripionate) toate informaiile necesare.

Pentru fiecare paiet trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colectrii, numrul de embrioni, centrul de producie.

Procedura de umplere a paietelor comport trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limiteaz orice risc de pierdere a embrionilor n momentul manipulrilor efectuate cu umplerea sau evacuarea coninutului paietelor.

Embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat.

n cursul examenului sub stereolup la un grosisment mai mic de 80, embrionul este ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei n anumite poziii ale embrionului.

Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s fie perfect integr, fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare embrionar n raport cu ziua colectrii este principalul factor luat n considerare. Embrionii care prezint o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai. Embrionii colectai n a aptea zi de la debutul estrului trebuie s se gseasc n stadiul de morul compact/blastocist. Embrionii care conin 16 celule sau mai puin, nu se rein pentru transfer sau congelare, fiind ntr-o ntrziere mare a dezvoltrii.

n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin distincte ntruct blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure. Prezena ctorva celule detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare ntruct majoritatea blastomerelor formeaz o mas sferic fr opacitate marcant.

n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie s fie vizibile i s prezinte contururi bine delimitate.

Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor granulaii la suprafaa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n dezvoltare, absenei contururilor celulare sau unei opaciti marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a cror aspect este ndoielnic sunt conservai una-dou ore apoi vor fi examinai din nou.

Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morfologic i corespunztor vrstei (foto 22). Embrionul bun calitativ prezint unele imperfeciuni: zona pelucid oval, dimensiuni mai mici ale embrionului, ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine celule extrudate, mici. Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, ns prezint unele anormaliti: un numr moderat de celule excluse, dimensiuni Foto 22 Embrioni buni pentru congelare

mai mici, unele degenerri i ntrzierea cu o zi. Embrionul inferior prezint diverse degradri considerabile: celule veziculate, variabilitate mare n ceea ce privete dimensiunile celulelor, ntrzierea n dezvoltare cu dou zile, absena compactrii. Embrionul degenerat prezint degenerri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezint structur simpl a gametului femel, fr celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. i colab.,1991).

2.2.8. Conservarea i deconservarea embrionilor

Embrionii pot fi conservai cteva ore in vitro la 20oC ntr-un mediu de conservare: PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel fetal decomplementat. n acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt transferai la receptoare. n cazul n care transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la recoltare, se recomand congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatur de 0o-4oC ntr-un mediu de conservare identic. n acest fel embrionii pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat.

Conservarea de lung durat a embrionilor congelarea - rmne cea mai avantajoas metod de meninere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilitii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie s fie meninui n stare solid, n azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai sczute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problem mai dificil constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor embrionii. n timpul congelrii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii intracelulare i concentraia salin ridicat. Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de rcire const n deshidratarea parial a celulelor i evitarea ocului produs de concentraiile ridicate n sruri prin utilizarea unui

Crioprotector, n general glicerol cu o concentraie de 1,5 M (sau 10% n volum) n mediul de congelare. Ca ageni criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale de rcire (foto 23). Substanele crioprotectoare (n general polialcooli) sunt capabile s ptrund uor n celule printr-o simpl difuziune (osmoz), ntrziind formarea Foto 23 Model de freezer

cristalelor de ghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele crioprotectoare limiteaz efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din apa intracelular atras prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea un rol protector fa de membranele celulare (hidrai de carbon, polivinilpirolidon), (Baril i colab., 1993).

Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea viabilitii embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai bogat n ap dect mediul celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de ghea se produc mai nti n mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate. Aceast concentraie salin ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular, reducnd n acest fel formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa intracelular nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate mare n interiorul celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n timpul congelrii i decongelrii distrugnd structurile celulare. n cazul n care ritmul de rcire este lent, deshidratarea progresiv a celulelor antreneaz o cretere important a concentraiei n electrolii, n mediul celular, modificnd proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecina fiind totdeauna pierderea viabilitii celulelor.

Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de dinamica apei intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul embrionilor, ritmul de rcire trebuie s corespund pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercetrilor ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirm faptul c acesta trebuie s se desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n dou trepte: la nceput 4oC/min pn la 6 7oC i 0,3-0,6oC/min ntre 7oC i 30 35oC, apoi o congelare rapid (brusc) de la -35oC pn la temperatura de pstrare -196oC.

Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la nceperea congelrii, nu trebuie s depeasc dou-trei ore.

Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede urmtoarele:

alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun;

timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;

introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperatura laboratorului (20oC);

introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer, embrioni +mediu, bul de aer, mediu);

rcirea pn la -6oC sau -7oC cu o vitez de 4oC/minut;

inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute);

rcirea pn la 30oC sau 35oC cu o vitez de 0,3 - 0,6oC/minut;

introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i stocarea lor (-196oC).

Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul transferului la femelele receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu influeneaz supravieuirea ulterioar a acestora.

Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului

Embrionii congelai la -35oC nu sunt dect parial deshidratai, o anumit cantitate de ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare s se produc o cretere a acestor mici cristale de ghea care s distrug celulele, decongelarea trebuie s se fac n timp, ct mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid i se introduc direct ntr-o baie de ap la 37oC, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup decongelare, nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii embrionilor. Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu trebuie s fie introduse direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de presiune osmotic va provoca ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va risca s explodeze. De aceea, este necesar o ndeprtare progresiv a crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i ptrunderea apei n celul s fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.

Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz o rehidratare lent a celulelor embrionare.

Diluia crioprotectorului pe etape const n trecerea succesiv a embrionilor prin bi cu concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i 0 M). Meninerea embrionilor n fiecare baie este de 5-10 minute. n acest caz concentraia mediului n crioprotector este invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea lichidului de rcire, calitatea embrionilor poate fi apreciat printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de regul sunt eliminai ca necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelai.

Diluia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conine sucroz are la baz accelerarea ieirii acestuia din celule. Molecula de sucroz avnd o greutate molecular mare (344) nu ptrunde n celule prin simpl difuziune; prezena sa n mediu creaz o mrire a presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerat a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o soluie de PBS care conine 0,25-0,5 M sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS nainte de examinare i transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct n interiorul paietei. Pentru aceasta, n momentul introducerii embrionilor n paiete pentru congelare, alternana diverselor medii din paiet este: la mijloc embrionul n mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, nconjurat de bule de aer i apoi la exterior PBS+sucroz 0,25 M. Dup decongelare paieta se scutur n vederea amestecrii mediilor pe baz de etilen glicol i cele pe baz de manoz, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului n afara celulei n cteva minute. Embrionii sunt transferai fr selecie prealabil, mpreun cu coninutul paietei direct n uterul femelelor receptoare. Aceast metod mai necesit unele verificri.

Nivelul supravieuirii embrionilor dup decongelare este condiionat de mai muli factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte de congelare, femela donatoare etc.

Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de supravieuire in vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul de blastocist (81%), (Martinez i colab., 1985).

Congelarea nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun calitate, caz n care procentul de supravieuire dup transfer fiind uor inferior (10%) fa de nivelul supravieuirii obinut dup transfer direct, fr congelare.

Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelai efect denumit i efectul donatoarei a fost demonstrat prin faptul c procentul de supravieuire a embrionilor congelai n aceleai condiii poate varia de la 0 la 78% n raport cu donatoarea.

2.2.9. Transferul embrionilor

O atenie deosebit va fi acordat seleciei femelelor receptoare, ntruct condiioneaz n mare parte rezultatele dup transfer. Aa cum s-a menionat n capitolul anterior, receptoarele trebuie s aib o activitate sexual ciclic, s fie bine dezvoltate corporal, fr afeciuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viele n vrst de 18 luni cu condiia atingerii a cel puin 2/3 din greutatea corporal a adultului. Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate i la vaci adulte n vrst de 3-6 ani dac funcia de reproducie s-a desfurat normal.

Examenul femelelor receptoare se completeaz cu aprecierea ultimului estru, care trebuie s aib loc ntre parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de sntate a conductului vestibulo-vaginal i al orificiului vaginal al cervixului).

Pregtirea receptoarelor const ntr-o sincronizare ct mai perfect a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie n clduri naturale fie n clduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menionate anterior). O atenie special se va acorda depistrii ciclurilor (dimineaa, prnz, seara) apoi se determin momentul exact al nceputului estrului. naintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se va face n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaa cruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obinut i prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurcaia coarnelor uterine n lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. nainte i imediat dup transfer se va evita orice stres: vaccinri, tratamente antiparazitare, ecornri, lotizri, tuberculinri, recoltri de snge etc. Se va evita schimbarea brusc a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primvara 4 sptmni dup transfer. Variaiile climatice determin o cretere a mortalitii embrionilor dup transfer. n cazul folosirii embrionilor proaspei, receptoarele se in ntr-un grajd curat i ct mai aproape de donatoare.

Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizeaz prin dou metode: chirurgical i nechirurgical.

Transferul chirurgical s-a aplicat n perioada de nceput i a constat n deschiderea cavitii abdominale (pe linia alb sau n flanc), exteriorizarea cornului uterin i depunerea embrionului pe cornul uterin corespunztor ovarului cu corp galben prin puncionarea peretelui acestuia. Este o metod laborioas, costisitoare, traumatizant pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei.

Metoda actual care d cele mai concludente rezultate este cea nechirurgical. Aceast metod folosete calea vagin-cervix, asemntor nsmnrii artificiale. Pentru transfer se folosete un pistolet tip Cassou n care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspt recoltat. Pentru a se evita contaminarea nveliului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul traversrii conductului vestibulo-vaginal, se fixeaz un al doilea nveli din material plastic care este secionat pe toat lungimea sa. Dup ce pistoletul ajunge n lumenul cervical, acest nveli protector se retrage. Pentru a nvinge rezisteana cervixului (n aceast faz cervixul fiind nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurcaie, pe cornul uterin corespunztor ovarului ce conine corpul galben, se depune embrionul, asemntor nsmnrii artificiale. Aceast metod este exclusiv folosit n present. Traversarea cervixului trebuie s se realizeze cu mare precauie n vederea evitrii lezionrii mucoasei acestuia. n vederea relaxrii cervixului, a evitrii contraciilor organelor genitale se efectueaz anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2%, sau alte preparate medicamentoase cu efect similar.

2.3. Biotehnologia transferului de embrioni

la rumegtoarele mici

Ca i la rumegtoarele mari, folosirea transferului de embrioni la rumegtoarele mici se practic cu scopul multiplicrii descendenei femelelor cu nalt potenial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni congelai i asigurrii bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetri fundamentale n reproducia animalelor i biologia celular.

Reglarea i controlul funciei de reproducie la rumegtoarele mici sunt influenate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o, rumegtoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care ncepe ctre sfritul verii i se ncheie ctre finele sezonului de toamn. n decursul unui an, funcia sexual la oaie se caracterizeaz prin alternarea a dou perioade:o perioad de anestru fiziologic, cuprins ntre sfritul iernii i nceputul verii;o perioad de activitate sexual, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprins ntre sfritul verii i nceputul iernii (10-14 sptmni dup cea mai lung zi).

Anestrul fiziologic se datoreaz att factorilor materni (anestru de lactaie), ct i factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunndu-se.

Periodicitatea sexual sezonier este atribuit influenei modulatoare a fotoperiodismului, temperaturii, umiditii i alimentaiei asupra unui ritm ciclic anual de baz, condiionat genetic.

Factorul principal n stimularea funciei sexuale la oi este reprezentat de reducerea progresiv a numrului de ore lumin, iar cel subordonat este scderea temperaturii i schimbarea alimentaiei.

Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca animalele zilelor scurte. Fotoperiodismul regleaz funcia de reproducie la oi prin intermediul melatoninei, hormon secretat de glanda epifiz. Epifiza controleaz momentul apariiei maturitii sexuale i sezonul de reproducie. Melatonina regleaz funcia de reproducie prin schimbarea secreiei hormonilor gonadotropi. O dat cu micorarea zilei lumin, secreia melatoninei crete i activeaz funcia sexual.

Factorii de mediu trebuie s aib un anumit nivel pentru a influena pozitiv funcia de reproducie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativ 65-85%, durata zilei lumin - 4-7 ore. Ali factori ai mediului ambiant (relaiile dintre indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator n blocarea sau declanarea activitii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex. efectul mascul) permite s se controleze mai bine perioadele de reproducie.

Gradul de ovulaie variaz n timpul sezonului de reproducie. Nivelul acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile inute la temperaturi sczute, n timpul verii, ncep sezonul de reproducie mai devreme dect cele care n sezonul estival, au fost inute la temperaturi obinuite acestui anotimp.

Oile expuse stresului termic n orele de dinainte sau de dup estru, prezint tulburri de fecunditate. Variaiile raiei de hran (date de variaiile disponibilitilor alimentare) determin oscilaii ale nivelului de fertilitate.

La latitudini medii, variaiile fotoperioadei rmn factorul principal care declaneaz activitatea reproduciei la oi (Thimonier J. i colab., 1986).

2.3.1. Alegerea donatoarelor i receptoarelor

Femelele care intr ntr-un protocol al transferului de embrioni trebuie s fie selecionate naintea nceperii operaiilor propriu-zise.

Prima selecie a donatoarelor se face dup valoarea lor genetic pa baza unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectiv. n general, n alegerea donatoarelor se are n vedere ca acestea s se fi nscut n sezonul de reproducie precedent, fr tulburri ginecologice, s nu fie gestante, cu ovare normale, capabile s rspund la tratamentul superovulator (examen fcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie).

n cazul repetrii tratamentelor de superovulare, se investigheaz, prin probe de laborator, prezena sau absena anticorpilor contra hormonilor folosii la tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza contra gonadotropinelor heterospecifice i nu mai rspund la administrarea preparatelor hormonale de acest tip.

n cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie s aib o greutate corporal de cel puin 60% din greutatea femelei adulte i s fie n vrst de cel puin 8-10 luni.

naintea lotizrii, donatoarele (ca i receptoarele) se supun mai multor teste serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta (bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus i de legislaia sanitar-veterinar din mai multe ri, care prevede pentru femelele donatoare s fie indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare i receptoare se va face cu cel puin dou luni naintea tratamentului, pentru a se evita efectele negative ale stresului de adaptare la un nou mediu i pentru a se instala o nou ierarhie n interiorul lotului reconstituit.

Donatoarele i receptoarele trebuie s fie supuse unui tratament antiparazitar cu spectru larg cu cel puin o lun naintea nceperii tratamentului. n cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi n special dirijat contra infestaiei constatate.

Alimentaia donatoarelor i receptoarelor se va face dup norme tiinifice.

Creterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei sptmni care precede folosirea la reproducie (flushing) provoac, la ovine, o cretere a nivelului ovulaiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaiei i o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulrii. Practica flushing-ului este recomandabil att pentru donatoare ct i pentru receptoare i n special cnd alimentaia nu acoper n totalitate nevoile energetice.

La receptoare, nevoile nutriionale suplimentare datorate gestaiei, nu sunt diferite de cele legate de o gestaie natural, dar ele trebuie luate n consideraie pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaiei.

n preajma ftrii, o supraveghere atent a femelelor previne mortalitatea perinatal i erorile de descenden (filiaie).

Alegerea donatoarelor se face pe baza performanelor genetice, starea fiziologic i sanitar. Donatoarele, n general, trebuie s fie de vrst medie, s aib o carier de reproducie fr tulburri notabile, s fie sntoase n urma examenului clinic general i ginecologic, fcut la trei luni naintea transferului de embrioni. Se respect un interval de cel puin 5 luni ntre ultima ftare i nceputul tratamentului.

Alegerea receptoarelor se face, n general, dup aceleai criterii ca donatoarele, valoarea genetic nefiind luat n consideraie. Nuliparele sunt cele mai recomandate. n momentul transferului, receptoarele trebuie s fie n vrst de 8-10 luni i cu o greutate de cel puin 60% din greutatea medie a femelei adulte din rasa respectiv (30-35 Kg). n cazul n care receptoarele sunt achiziionate, acestea se integreaz cresctoriei cu cel puin trei luni naintea nceperii tratamentului, pentru a se adapta la noile condiii, dup ce au fost alese pe baza unor criterii stricte, ntruct femelele destinate reformei prezint adeseori probleme de reproducie i sanitare.

Cu trei luni naintea transferului embrionar i pn la ftare se evit orice tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc.

2.3.2. Sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele donatoare

i receptoare

Tratamentele hormonale specifice donatoarelor i receptoarelor se fac pentru a induce estrul i superovularea (donatoarelor) sau ovulaia (receptoarelor) la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmresc de fapt un control temporar al activitii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puin, a mecanismelor endocrine care controleaz ciclul sexual.

Donatoarele i receptoarele sunt supuse unei serii de intervenii, cronologic precise. nainte de provocarea hormonal a superovulaiei se impune stabilirea cu exactitate a momentului apariiei ciclului estral. Depistarea manifestrii cldurilor se face de dou ori pe zi (dimineaa i seara) prin folosirea berbecilor ncerctori de calitate. Pentru provocarea superovulaiei, se folosesc oi cu ciclu natural sau sincronizat.

Pentru standardizarea strii fiziologice a donatoarelor la nceputul stimulrii i mai ales sincronizarea intrrii n estru la terminarea tratamentului stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfritul tratamentului progestativ, stimularea creterii foliculare se face prin administrarea hormonilor gonadotropi cu scopul creterii numrului de ovulaii/femel (superovulaie). Att pentru sincronizare (tratamente progestative) ct i pentru stimularea ovarin (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare

Difer prin substanele progestagene folosite i prin calea de administrare:

a) injecii zilnice a cte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21 de zile la capr sau 12-14 zile la oaie;

b) implante vaginale, reprezentate de burei de poliuretan impregnai cu 60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston (FGA) sunt n prezent cele mai folosite;

c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub pielea de la nivelul suprafeei externe a urechii. Eficacitatea acestei ci de administrare a progesteronului este asemntoare celei a pesariilor vaginale.

Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apeleaz la pesariile vaginale impregnate cu FGA.

Durata tratamentului difer n raport cu specia i cu sezonul.

La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandat a tratamentului variaz n funcie de perioada anului: 14 zile n timpul sezonului sexual i 12 zile nafara sezonului sexual.

La caprine, durata tratamentului trebuie s fie de 17-21 zile (tratament lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) n asociere cu prostaglandinele.

n cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai scurt dect cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecie de PGF2( (50 g Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore naintea tratamentului progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi nc activi n momentul retragerii suportului de progestagen.

d) sincronizarea estrului poate fi fcut fr a se realiza impregnarea printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincron prin dou injecii, la interval de 10-14 zile, de prostaglandin F2(, (50-100 g de Cloprostenol etc). Aceast metod nu d rezultate la femelele neciclice (n afara sezonului sexual), iar pe de alt parte, procentul oulor divizate este mai slab la femelele donatoare dect n cazul unui tratament progestativ.

2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovarian

Stimularea creterii foliculare pentru inducerea superovulaiei donatoarelor sau ovulaiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfritul tratamentului progestativ, i este realizat prin injecii intramusculare de gonadotropine hipofizare sau extrahipofizare.

Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaiei poate fi efectuat n cursul unui ciclu natural, prin nceperea stimulrii cu 48 de ore naintea momentului prezumat al luteolizei spontane, ns aceast metod este ineficace n perioada anovulatorie i dificil de aplicat n cazul tratamentului mai multor femele nesincronizate n prealabil.

Administrarea gonadotropinelor are loc, n general, la finele tratamentului progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va determina o cretere a numrului de foliculi preovulatori i la ovulaia mai multor foliculi.

Stimularea cu ajutorul PMSG const ntr-o injecie de 750-1500 U.I. PMSG efectuat 48 de ore naintea terminrii tratamentului progestativ. Durata relativ lung a activitii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG nc n circulaie n preajma estrului provoac o activitate folicular anormal n acest stadiu care perturb mediul hormonal n timpul fecundaiei i a primelor faze ale dezvoltrii oulor. Aceste efecte au drept consecin general o slab producie de embrioni de bun calitate i ca urmare, acest hormon este din ce n ce mai puin folosit pentru inducerea poliovulaiei. Repetarea tratamentului superovulator cu PMSG determin o reducere accentuat a rspunsului ovulator.

Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecvent metod folosit pentru provocarea superovulaiei la rumegtoarele mici.

Cantitile de FSH care se administreaz pentru a obine superovularea sunt adesea exprimate n mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activitii unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 g de hormon FSH pur).

Administrarea FSH-p se face n zilele 2, 3 sau 4 dup tratamentul progestativ, n doz de 12-24 mg/femel. Perioada scurt de njumtire (3-4 ore), face ca doza s fie repartizat n mai multe injecii pentru a determina superovularea. n intervalul de dou-patru zile de la ncheierea tratamentului progestativ se injecteaz FSH-p, 4-8 injecii, de dou ori/zi, la interval de 10-12 ore, n doze descrescnde (trei zile de tratament).

Tratamentul de superovulare se poate face i cu extracte hipofizare de cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal gonadotropin) care determin un rspuns ovulator i o producie de embrioni similare celor observate dup tratamentul cu FSH-p la caprine i ovine, ns aceste preparate sunt puin disponibile.

Pentru provocarea superovulaiei se poate asocia tratamentul pe baz de PMSG cu cel pe baz de FSH-p. Pentru aceasta, se asociaz 48 de ore naintea retragerii spongiilor vaginale cu o injecie de 12-18 mg de FSH-p ce se administreaz n 6 injecii sau ntr-o singur injecie concomitent cu administrarea de PMSG.

Rspunsul superovulator este condiionat de mai muli fatori, ntre care menionm: rasa, individul, apariia anticorpilor n cazul repetrii tratamentului, tipul de hormon folosit etc.

2.3.2.3. Inducerea estrului i ovulaiei la receptoare

Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci cnd transferul se face fr interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor i receptoarelor ncepe n acelai moment, astfel nct s se gseasc n acelai stadiu fiziologic n momentul transferului embrionar.

O injecie de PMSG se face ctre sfritul tratamentului progestativ: injecia cu PMSG se face cu 48 ore naintea retragerii spongiilor vaginale la capr i n momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecia se face cu 48 ore naintea retragerii bureilor vaginali impregnai cu progestagene, iar ovulaia se produce cu circa 12 ore mai trziu dect la donatoarele supuse aceluiai tratament asociat cu FSH-p. n acest caz, pentru receptoare se ntrzie terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore n raport cu donatoarele care au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p.

La oile receptoare, injecia de PMSG se face n momentul retragerii spongiilor vaginale. Oile intr n clduri dup circa 36 de ore, cu o ntrziere de 12 ore, n raport cu donatoarele tratate cu FSH-p.

Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff.

Dozele de PMSG variaz cu sezonul, vrsta i nivelul produciei de lapte (caprine).

La donatoare, variabilitatea momentului ovulaiei este un factor limitant al nivelului de fecunditate, mai ales critic n cazul folosirii spermei congelate.

Principalul criteriu folosit pentru depistarea nceputului estrului este manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina practic debutul estrului, se folosete un mascul vasectomizat sau prevzut cu or, care este pus n prezena femelei la interval de 4-6 ore, ntre 20 i 60 de ore dup terminarea tratamentului progestativ. Insuficiena libidoului la mascul poate fi un factor limitant al eficacitii deteciei estrului.

2.3.3. nsmnarea femelelor donatoare

Fecundarea donatoarelor poate fi fcut fie pe cale natural, practicndu-se monta liber sau dirijat, fie prin nsmnare artificial, cnd se poate ntrebuina sperma proaspt sau congelat care poate fi depus fie pe cale cervical sau direct n uter sub controlul endoscopic.

n toate cazurile este important s folosim masculii cu o fertilitate ridicat.

Monta a fost cea mai ntrebuinat metod de nsmnare a femelelor donatoare n cursul sezonului sexual att la ovine ct i la caprine, ns nu permite folosirea raional a masculilor valoroi, repartiia geografic a acestora fiind neuniform, acetia fiind concentrai n centrele n care se practic nsmnarea artificial (depozite ORSA), cnd se practic monta liber, masculii i femelele sunt lsai mpreun pe perioada estimat a cldurilor, pentru fiecare mascul repartizndu-se 3-4 femele. n cazul practicrii montei dirijate, fiecare femel descoperit n clduri trebuie s fie dat la mont de cel puin dou ori la interval de 10-12 ore. Momentul nsmnrii artificiale cea mai eficace este ntre 12 i 24 de ore de la nceputul estrului.

Cnd se practic monta n contrasezon, absena sau slaba manifestare a libidoului masculilor sunt cauzele nerealizrii procentului de fecunditate normal la femelele donatoare, la care se adaug i puterea fecundant foarte sczut a spermei n aceast perioad.

nsmnarea artificial permite valorificarea spermei masculilor a cror valoare genetic este cunoscut. Cercetrile au demonstrat faptul c transportul i supravieuirea spermatozoizilor n cile genitale femele sunt perturbate dup tratamentul progestativ i/sau cu prostaglandine asociate i a induciei ovulaiei (Evans i colab., 1984).

Eficacitatea nsmnrii artificiale endo- sau exocervicale la rumegtoarele mici superovulate este sensibil redus comparativ cu animalele martor nesuperovulate. Nivelul oulor divizate obinute prin aceast metod este adeseori insuficient i inferior celui obinut dup mont.

Mai mult, nivelul fecundaiilor este strns dependent de nivelul rspunsului ovulator la tratamentul de stimulare.

La ovine, se folosete pentru nsmnare numai sperma proaspt. Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor nsmnate pe cale cervical. Doza de sperm este de 2x400x106 spermatozoizi total n sperma proaspt, sperma depunndu-se la intrarea n cervix. Anatomia cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de nsmnare.

La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practic curent. Sperma se depune pe canalul cervical la 48 i 54 de ore (dou nsmnri artificiale) sau la 30, 48 i 54 de ore (trei nsmnri artificiale) dup sfritul tratamentului progestativ. Totui, procentul oulor fertilizate este sczut, datorit faptului c nivelul ridicat de estrogeni dup un rspuns bun la tratamentul progestativ, inhib transportul spermatozoizilor pe cile genitale femele.

nsmnarea artificial intrauterin, sub controlul endoscopic, este destul de rspndit la rumegtoarele mici. Aceast tehnic permite folosirea spermei congelate i obinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numrul de spermatozoizi mobili/doz prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la circa 80-100 milioane i se face o singur nsmnare artificial.

nsmnarea artificial intrauterin se face la 48-60 de ore dup sfritul tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore dup nceputul estrului la capre sau la 32 de ore dup nceputul cldurilor la oi (87% embrioni viabili).

2.3.4. Recoltarea embrionilor

Operaiile de colectare i transfer a embrionilor sunt eficiente sub anestezie general, femelele fiind supuse, n prealabil, unei diete alimentare i hidrice n cursul a 24 de ore care premerg intervenia chirurgical.

Embrionii sunt recoltai prin splri succesive a celor dou coarne uterine n a 6-a sau a 7-a zi dup nceputul estrului.

Acest interval de timp relativ scurt n care embrionii pot fi recoltai, este condiionat de mai muli factori:

trecerea embrionilor din lumenul oviductului n cel al coarnelor uterine se produce ncepnd cu a 4-a zi;

pentru raiuni sanitare, legislaia prevede ca embrionul s fie transferat nainte de a iei din zona pelucid, care poate surveni ncepnd cu a 8-a zi;

congelarea embrionilor se poate face cel mai bine cnd acetia se gsesc n stadiile de morul compact i blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la nceputul estrului).

Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2% albumin seric bovin sau de 10% ser de viel fetal meninut la 37oC.

Embrionii sunt recoltai aproape n exclusivitate, fie prin laparotomie abdominal (metoda chirurgical), fie sub control endoscopic (colectare prin endoscopie sau laparoscopie).

S-a ncercat colectarea embrionilor i prin mijloace nechirurgicale, pe cale cervical, asemntor ca la rumegtoarele mari sau la cabaline, ns rezultatele sunt foarte slabe, datorit traversrii dificile a conductului cervical i a imposibilitii manipulrii coarnelor uterine prin palpare rectal.

Recoltarea prin metoda chirurgical se face pe femela sub anestezie general, contenionat pe o mas n decubit dorsal, cu o nclinare antero posterioar de 35-45o.

Se face o incizie lung de 8-10 cm pe linia alb naintea atarii mamelei. Se exteriorizeaz coarnele uterine, se numr corpii galbeni de pe ambele ovare, pentru a se aprecia rspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). n cazul n care recoltarea se face dup dou-patru zile de la debutul estrului, majoritatea embrionilor se regsesc n lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1 mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de PBS sunt injectai cu scopul de a-i antrena n coarnele uterine. Apoi se spal coarnele uterine sau se recupereaz la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul injectat la baza coarnelor uterine .

n cazul n care recoltarea embrionilor se face n zilele 6-7, se spal fiecare corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncie la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul punciei se introduce o sond Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este obturat, prin umflarea balonaului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter introdus la nivelul jonciunii utero-tubare se injecteaz 40-50 ml de PBS, recuperarea lichidului care antreneaz i embrionii fcndu-se prin sonda Folley. Mediul de splare poate fi injectat la nivelul sondei Folley i recuperat prin cateterul introdus anterior (perfuzie anterograd ) legat cu un tub steril plasat ntr-o baie marin la 37oC. Se procedeaz la splarea succesiv i separat a celor dou coarne uterine apoi se introduce un antibiotic n cavitatea abdominal i se nchide plaga de la nivelul coarnelor uterine i al peretelui abdominal.

Aceast metod este cea mai rspndit la rumegtoarele mici. Nivelul de recuperare a embrionilor oscileaz ntre 70 i 90%, ns diminu mult atunci cnd se fac recoltri repetate de la acelai animal (52-24%) la ovine i 65-42% la caprine n cazul colectrilor 2 i 3.

Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziat se contenioneaz pe o mas de operaie, n decubit dorsal, cu o nclinare antero-posterioar de 30-45oC. O prim puncie se face la 4-5 cm naintea glandei mamare i la 10-15 cm la stnga liniei albe. Se introduce o canul cu un diametru de 7 mm, care poart endoscopul. Se insufl aer filtrat n cavitatea abdominal pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canul, cu un diametru de 5 mm, se introduce n partea opus primei, n raport cu linia alb i prin care se introduce o pens atraumatic pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi numrai. Un corn uterin se prinde la nivelul ligamentului intercornual i se puncioneaz cu un ac avnd diametru de 2,5 mm.

A treia canul, cu diametru de 5 mm, se plaseaz pe linia alb, la 15 cm de prinderea glandei mamare. Prin aceast canul se introduce o sond cu trei ci pn n lumenul uterului. Balonaul fixat la sond este umflat cu aer prin intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor uterine. Extremitatea cateterului este deplasat ct mai aproape posibil de jonciunea utero-tubar. Pensa se fixeaz la nivelul istmului pentru a se evita refularea mediului de colectare n oviduct.

Mediul de colectare se injecteaz prin corpul sondei (40-50 ml pentru fiecare corn). Presiunea creat de lichidul introdus permite returul acestuia prin cateter. Se poate folosi i o sond cu dou ci. n acest caz, a doua puncie se face la vrful cornului uterin pe unde se inser un cateter de injecie, fixat la pensa atraumatic. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda plasat la baza coarnelor uterine. Proporia de embrioni recuperai prin endoscopie este inferioar cu 10-15% celei obinute prin chirurgie, ns repetarea colectrilor de la aceeai femel prin endoscopie nu provoac reducerea proporiei de embrioni colectai.

2.3.5. Examenul i aprecierea embrionilor

Mediul de colectare recuperat dup cltirea coarnelor uterine este turnat ntr-o plac Petri cu fundul cadrilat care s uureze cercetarea embrionilor la o lup binocular. Embrionii depistai sunt aspirai cu ajutorul unei pipete fine sau a unei seringi racordat la un tub transparent din plastic i introdui ntr-o cutie Petri mai mic ce conine PBS filtrat i suplimentat cu 4% albumin seric bovin sau 10% ser de oaie sau de capr. Se apreciaz calitatea embrionilor recuperai.

Mediul de colectare i examen a embrionilor este meninut la o temperatur de +25+27oC, clasificarea embrionilor fcndu-se n urmtoarele categorii: nefecundai, degenerai, retardai sau morul compact, blastociti tineri, blastociti extini sau blastociti ieii din zona pelucid. Viabili se consider embrionii care au o form regulat, sferic, cu citoplasma omogen, nveli transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte important este i stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind c ncetinirea ritmului de diviziune constituie, n majoritatea cazurilor, dovada unui nceput de degenerare a embrionilor.

Embrionii sunt clasai n exceleni, buni, de calitate medie sau necorespunztori. Numrul de embrioni degenerai crete considerabil cu vrsta acestora, ncepnd cu a 5-a zi de la nsmnarea artificial. Abaterile de la morfologia normal survin la animalele donatoare sub aciunea nefavorabil a unor concentraii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor degenereaz n stadiul de morul pn n ziua a 8-a. n practic se poate asigura un procent ridicat de ftri alegndu-se embrioni dup atingerea stadiului de blastocist.

n momentul colectrii - n ziua a 7-a - unii embrioni de oaie i capr pot prezenta o uoar ntrziere n dezvoltare (morul compact) pe cnd alii sunt ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieit din zona pelucid). La capre, dezvoltarea embrionar precoce apare cu o ntrziere de 12-24 de ore n raport cu cea observat la oi. n ziua a 7-a dup debutul estrului, proporia embrionilor n stadiul de blastocist ieit din zona pelucid este mai ridicat la oi dect la capre (oaie: 95%; capr: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril i colab., 1993).

Embrionii care au o ntrziere n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai.

n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton embrionar) trebuie s fie vizibile i s prezinte un contur bine delimitat. Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin, a granulaiilor la suprafaa celulelor, absena contururilor celulare vizibile sau prezena unei opaciti evidente a blastomerelor, constituie criterii de eliminare a embrionilor.

Dup aprecierea calitii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecui prin 10 bi succesive de PBS n vederea nlturrii eventualelor bacterii sau virui. Aceast practic este recomandat de Societatea Internaional de Transfer Embrionar i confer o siguran sanitar pentru stocarea sau folosirea unui embrion sntos.

2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor

ntr-un interval de timp care nu depete dou ore de la colectare, dup cltire, embrionii sunt trecui prin mai multe bi succesive de PBS adiionat cu glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5 minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemntor celor precizate la bovine. Embrionii sunt condiionai n paiete mici (0,25 ml) i congelai treptat, scderea temperaturii mediului fcndu-se cu circa 1oC/minut pn la -7oC. n acest stadiu, cristalizarea este indus (vezi cele menionate la congelarea embrionilor bovini), apoi scderea temperaturii se face cu cte 0,3oC/minut pn la -35oC, dup care paietele sunt introduse direct n azot lichid.

Decongelarea se face, ca i la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu embrioni, timp de 30 secunde, ntr-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt trecui succesiv prin 3-4 bi de PBS, la care s-a adugat crioprotector n concentraie descrescnd (invers dect la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3 M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare progresiv a celulelor embrionare.

Se apreciaz iari calitatea embrionilor, cei care au suferit n timpul acestor operaii fiind eliminai.

2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare

Transferul embrionilor trebuie s se fac ntr-un interval ct mai scurt de timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se realizeaz aproape n exclusivitate chirurgical, laparoscopic.

2.3.7.1. Transferul chirurgical

Dup anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm n lungul liniei albe, 3-4 cm naintea atarii glandei mamare. Se exteriorizeaz coarnele uterine, se examineaz ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmeaz s se fac transferul. Embrionii sunt aspirai ntr-un volum mic de PBS (30-50 l), aplicnd principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la bovine), de regul ntr-un cateter adaptat la o sering de 1 ml. Diametrul extern al capilarului-cateter trebuie s fie de circa 1 mm. Se puncioneaz cornul cu un ac cu vrful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fr a leza mucoasa i se expulzeaz uor embrionii ctre treimea superioar a cornului uterin ipsilateral ovarului care prezint un corp galben funcional.

De regul, se transfer doi embrioni n acelai corn uterin. Dup transfer se instil n cavitatea abdominal 1000000 U.I. penicilin, peritoneul i pielea fiind apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare (I.C.P.C.O.C. Palas-Constana)

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic

Receptoarea anesteziat este fixat n decubit dorsal pe o mas de contenie nclinat la 30-35oC. Se pregtete i dezinfecteaz cmpul operator, naintea glandei mamare. Se face o puncie n abdomen pe unde se introduce canula endoscopului. Se insufl puin aer prin canul pentru a se uura vizualizarea tractusului genital.

O a doua canul este inserat n partea opus primei, n apropierea liniei albe, prin care se introduce o pens de manipulare atraumatic. Cu ajutorul acestei pense se controleaz rspunsul ovulator pe fiecare ovar i se alege cornul uterin pe care urmeaz s fie transferai embrionii, corespunztor ovarului care are corpul galben funcional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins n apropierea jonciunii utero-tubare i puncionat cu un ac lung de 30 cm i cu un diametru de 1,5 mm, n prealabil inserat sub linia alb. Embrionii sunt cundiionai ntr-un volum de 30-50 l (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer, lichid+embrion) ntr-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la o sering de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul i furtunul sunt introduse ntr-un tub metalic care asigur rigiditatea i maniabilitatea ansamblului. Printr-o a 3-a canul plasat pe linia alb la 15 cm de la ataarea glandei mamare, capilarul de transfer este introdus n cavitatea abdominal, apoi, prin punctul de jonciune n lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depui cu atenie. Dup retragerea instrumentelor, se pulverizeaz un antibiotic la nivelul celor trei locuri de puncie a peretelui abdominal. Dup cptarea dexteritii necesare, transferul prin endoscopie se poate face n 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult mai redus dect n cazul transferului pe cale chirurgical.

Procentajul de reuit a transferului de embrioni prin cele dou metode variaz ntre 70,5% i 75,6% la caprine i ntre 69% i 74% la ovine.

Pentru reuita transferului de embrioni la rumegtoarele mici, o condiie important const n sincronizarea ct mai bun a ciclurilor estrale la donatoare i receptoare, astfel nct, s existe concordan ntre particularitile dezvoltrii embrionului i modificrile mediului uterin.

SELECIA RECEPTOARELOR

SELECIA DONATOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE

PMSG

tipul

FSH-p

doza

schema de administrare

SINCRONIZAREA CICLULUI SEXUAL CU AL DONATOARELOR

I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR

TRANSFERUL EMBRIONILOR

POLIOVULA}IE

FSH p

1

2

3

4

ANTILUTEOTROP

IMPLANT NORGESTOMET

9 zile

POLIOVULA}IE

PMSG

ANTI-PMSG

ANTILUTEOTROP

IMPLANT NORGESTOMET

9 zile

PMSG

PGF2(

1

2

3

4

PMSG

PGF2(

Gn-RH

PMSG

PGF2(

HCG

FSH

PGF2(

PAGE 92