SINTEZA REZULTATELOR

TESTAREA PROPRIETATILOR ANTIOXIDANTE,ANTIPROLIFERATIVE SI PROAPOPTOTICE ALE

EXTRACTULUI POLIFENOLIC DIN AFINE PE CULTURICELULARE TUMORALE

Proiect TE_168/2010Cod 109

10.12.2011

2ObiectiveleO1 - Caracterizarea extractelor din punct de vedere al compoziieiO2 - Dozarea compuilor bioactiviO3 - Evaluarea in vitro a activitii antioxidanteIntroducereInteresul n antioxidani naturali, n special cei provenii din fructe i vegetale, a crescut

n ultimii ani. Afinele conin concentraii mari de polifenoli, n special antociani, acizi fenolici,taninuri, carotenoide, vitamine A, C i E, acid folic i minerale ca i calciu, seleniu i zinc (Pinelii alii, 2011). Afinele sunt consumate datorit utilizrii lor n tratarea afeciunilor biliare, atusei, tuberculozei i diabetului (Martineau i alii, 2006). Afinele conin concentraii mari deantociani i compui fenolici cu activiti antioxidante in vitro mai mari comparativ cu alte fructe(Wang i Jiao, 2000). Coninutul n compui fenolici ai afinelor este influenat de diferenelegenetice, de tipul cultivarului dar i de gradul de maturare la recoltare (Zadernowski i alii,2005). Metodele folosite pentru determinarea activitii antioxidante pot fi clasificate n dougrupe mari: metode bazate pe transfeul unui singur electron (SET) i cele prin care se transferatomi de hidrogen (HAT). Dintre metodele SET cele mai folosite sunt ABTS/TEAC (Troloxequivalent antioxidant activity), FRAP (Ferric reducing ability), CUPRAC (Cooper reduction) iDPPH (2,2-diphenylpicrylhydrazil radical scavenging activity). Metodele ORAC (oxygen radicalabsorbance capacity) i TRAP (total radical-trapping antioxidant parameters) fac parte dingrupul metodelor HAT. Datorit diferenelor existente ntre mecanismele de aciune ale acestormetode, o singur metod aplicat nu va reflecta antioxidanii prezeni n sistem (Li i alii,2009).

Scopul acestui proiect este testarea efectului antioxidant al extractului de polifenoli totalisi respectiv de antociani i efectul proapoptotic al acestora asupra celulelor tumorale (ovariene ide sn).

Etapa corespunztoare acestui an urmrete caracterizarea extractele de afine obinute dinsoiuri de cultur i din flora spontan din punct de vedere al compoziiei n antociani,antocianidine i carotenoide. Separarea i caracterizarea compuilor s-a fcut folosindcromatografia lichid de nalt performan (HPLC-DAD). In paralel, s-a investigat polifenoliitotali, flavonoidele totale i antocianii totali folosind metode spectrofotometrice. S-a msuratactivitatea antioxidant pentru toate soiurile de afine luate in analiz folosind trei metode SET ianume ABTS, FRAP, DPPH i o metod HAT ORAC.

S-au luat n analiz trei soiuri de afine de cultur (Vaccinium corymbosum), Eliot,BlueCop i Duke i dou soiuri de afine culese din flora spontan ( Vaccinium myrtillus, Lot 1 iLot 2).

Material i metodea) Extracia compuilor fenolici. Extracia s-a fcut folosind metanol acidulat cu HCl. Dup centrifugare

la 3500 rpm, reziduul s-a reextras pan la decolorare complet [El-Sayed i Hucl, 2003].b) Separarea i dozarea antocianilor folosind HPLC-DAD. Separarea s-a facut pe o coloan Luna

Phenomenex C-18 (5m, 25 cm x 4.6 mm). Fazele mobile utilizate au fost: solventul A- acid formic (4.5%) n apbidistilat iar solventul B a fost acetonitril. Sistemul de eluare folosit a fost urmtorul : 10% B, 0-9 min; 12% B, 9-

317 min; 25% B 17-30 min; 90% B, 30-50 min; 10% B, 50-55 min.c) Separarea i dozarea antocianidinelor folosind HPLC-DAD. S-a fcut prin aceeai metod ca i pentru

separarea antocianilord) Extracia carotenoidelor. Carotenoidele s-au extras folosind un amestec de solveni metanol:eter de

petrol:acetat de etil (1:1:1), sub agitare continu, pn la decolorarea complet a materialului [Breithaupt iSchwack, 2000].

e) Separarea i dozarea carotenoidelor folosind HPLC-DAD. Identificarea i separarea carotenoidelor s-a fcut pe o coloan cromatografic Zorbax ODS (250 x 4.6 mm, 3.5 m). Faza mobil folosit a fost: amestec deacetonitril:ap (9:1) (solvntul A) i acetat de etil (solventul B). Gradientul ncepe cu 15 % B la 50 % B n 16 minute.Procentul solventului B continu izocratic pn la minutul 60. Cromatogramele s-au nregistrat la 450 nm.

f) Determinarea concentraiei n polifenoli totali. S-a realizat folosind metoda Folin-Cioclteu modificat[Singleton i alii, 1999]. Dup ce extractele au fost oxidate cu ajutorul reactivului Folin-Cioclteu, neutralizate cuNa2CO3 i inute la ntuneric 90 minute, absorbana a fost citit la 750 m.g). Determinarea coninutului n antociani totali. S-a realizat printr-o metod de pH-diferenial [Giusti iWrolstad, 2001]. Dup dizolvarea probelor n KCl i acetat de sodiu, dup diluia corespunztoare cu soluie tamponde pH=1, s-au msurat absorbantele la 520 i 700 nm.

h). Determinarea coninutului n flavonoide totale. S-a folosit metoda colorimetric descris de Kim ialii, 2003. Absorbana a fost citit la 510 nm dup adugare de NaNO2 5% i AlCl3 5%.i) Testarea activitii antioxidante folosind metoda DPPH. S-a realizat dup metoda descris de Brand-Williams i alii., 1995. S-a preparat o soluie proaspt de DPPH n methanol. Dup adugarea probelor de afine,absorbana a fost citit la 515 nm, timp de 30 minute.

j) Testarea activitii antioxidante folosind metoda FRAP. S-au amestecat TPTZ, tampon acetat i cloruraferic iar dup adugarea FRAP-ului amestecul s-a incubat timp de 3 minute. Apoi s-au adugat probele de afine iabsorbana a fost citit imediat la 593 nm folosind un cititor de microplci Biotech [Benzie i Strain, 1996].

k) Testarea activitii antioxidante folosind metoda ORAC. Fiecrei probe de afine i s-a adugat osoluie de fluorescein n tampon fosfat (pH=7.4) i au fost inute la 37 C timp de 30 de minute. Reacia s-a iniiatprin adugare de 2,2-azobis-2-amidinopropan (AAPH) iar fluoresecna a fost msurat cinetic la 485 nm i 535 nm[Huang i alii, 2002].

l) Testarea activitii antioxidante folosind metoda TEAC. Probele de afine si standardul de Trolox s-aucombinat cu o soluie de ABTS .+ (obinut prin reacia dintre ABTS i persulfat de potasiu la ntuneric timp de 12-16 ore). Dup 6 minute de incubare la 30 C s-a citit absorbana la 734 nm [Arnao i alii, 2001]. Rezultatele s-auexprimat ca micromoli echivaleni Trolox/ g prob.

Rezultate i discuiiDup extracia compuilor fenolici din afine, s-a folosit cromatografia lichid de nalt

performana pentru separarea, identificarea i dozarea antocianilor i ai antocianidinelorexistente. Cromatogramele aferente sunt prezentate n Figura 1. Concentraiile antocianiloridentificai sunt prezentate n Tabelul 1.

4Fig. 1. Profilul antocianilor i a antocianidinelor existente n soiul Bluecrop

Tabel 1. Concentraiile antocianilor individuali din afine (exprimai n mg/100 g fruct)Compus Timp de

retenieMaximeleabsorbanei

Vaccinium myrtillus Vaccinium corymbosum

Lot 1 Lot 2 Bluecrop Elliot Duke

Delphinidin-3-galactozida 9.2 217; 277; 523 113.6711 73.438.1 53.297.2 ND NDDelphinidin-3-glucozida 10.6 217; 277; 523 119.8614 87.148.2 24.532 53.627 23.692.4Cianidin-3-galactozida 12.4 217; 279; 518 91.8510 37.954.3 9.961.8 ND NDDelphinidin-3-arabinozida 13.01 217; 277; 529 66.649.2 76.358.8 31.782.6 41.075.1 13.641.1Cianidin-3-glucozida 14.4 217; 279; 518 96.4811 43.346.1 2.080.4 3.090.6 0.11Petunidin-3-galactozida 15.09 217; 277; 524 38.365.2 17.530.9 28.542.5 ND NDPetunidin-3-glucozida 16.9 217; 278; 521 146.2718 85.197.8 25.142.5 21.351.9 8.180.9Peonidin-3-galactozida 19.4 217; 278; 520 8.711.3 ND ND 125.7912 37.114.3Petunidin-3-arabinozida 20.3 217; 277; 525 12.801.9 9.661.2 12.701.9 ND NDPeonidin-3-glucozida 22.4 217; 278; 521 108.8112 28.912.2 54.377.5 120.9 12.141.1Malvidin-3-galactozida 25.3 217; 278; 527 119.5312 39.004.3 37.972.6 67.459 27.552.4Malvidin-3-glucozida 27.4 217; 277; 528 17.513.2 6.041.1 34.752.5 ND NDMalvidin-3-arabinozida 29.5 217; 277; 528 urme urme ND ND ND

n Vaccinium myrtillus, petunidin-3-glucozida i delfinidin-3-glucozida au cea mai mareconcentraie din totalul antocianilor prezeni (15.6% i 16.9%; 17.3 i 12.7% respectiv). nVaccinium corymbosum, peonidin-3-galactozida reprezint antocianul major n Elliot i Duke(40.3% i 30.3 %) dar n varietatea BlueCrop peonidin-3-glucozida este absent, antocianulmajor fiind reprezentat de peonidin-3-glucozida (17.3 %).

Profilul carotenoidelor din Lotul 1 din flora spontan este prezentat n Figura 2.Carotenoidele s-au identificat n acord cu spectrele UV-VIS comparate cu datele de literatur ico-eluie cu standarde. Luteina, -cryptoxanthina i -carotenul au fost principalele carotenoideidentificate n afine. Compoziia cantitativ a carotenoidelor identificate este prezentat nTabelul 2.

5Tabel 2. Concentraia carotenoideloridentificate n probele de afine (g/100 g)

Fig. 2. Cromatograma HPLC corespunztoare carotenoidelor din afineVariaia n carotenoide totale n toate probele analizate a fost ntre 215 317 g/100

g. Cel mai mare coninut n carotenoide s-a gsit n Lotul 1 din flora spontan iar cel mai mic nvarietatea Duke. Dintre toate carotenoidele separate i identificate, luteina a avut cea mai mareconcentraie, urmat de -caroten i -cryptoxantina. S-au obinut diferene semnificative(p

6Lot 1Lot 2

819.12 36a672.59 30b

110.36 12.3a112.50 15a

300.02 27.9a252.23 18b

Pentru polifenolii totali acidul galic a fost utilizat ca i standard iar rezultatele (exprimateca i echivaleni de acid galic) au fost exprimate ca valori medii deviaia standard a trei probeparalele. Valorile pentru polifenolii totali n probele de afine analizate au fost ntre 424.84 -819.12 mg GAE/100 g. Lotul 1 corespunztor afinelor din flora spontan au artat cea mai mareconcentraie n polifenoli totali la 819.12 echivaleni acid galic /100 g urmat de Lotul 2 din floraspontan (672.59 mg GAE/100g). Dintre soiurile cultivate, soiul BlueCrop a avut cea mai mareconcentraie n polifenoli totali (652.27 mg GAE/100 g) iar cea mai mic s-a nregistrat pentrusoiul Duke (424.84 mg GAE/100g). Diferene semnificative s-au obinut pentru toate soiurile deafine luate n analiz (p

7ElliotBluecropDuke

50.74 1.9c60.39 1.6b33.03 2.54d

36.46 4.26c37.96 2.98bc24.33 3.76d

38.051.56a37.04 1.7a34.85 1.3b

43.48 1.9d46.64 1.65c29.96 1.38e

Vacciniummyrtillus

Wild 1Wild 2

73.71 3.2a64.87 2.9b

56.65 3.79a43.08 2.3b

38.49 1.01a37.78 0.89a

59.79 1.24a49.93 1.6b

Valorile obinute pentru activitatea antioxidant folosind metoda ORAC nu sunt diferitesemnificativ ntre probe (34.85-38.49 mol TE/g). Rezultatele obinute sunt similare cu celeobinute de Prior i alii, 1998 (17-37.1 mol TE/g) i mai mici decat valorile raportate de You ialii, 2011 (44-55 mol TE/g). Pentru varietatea Duke, valorile obinute de noi 34.85 mol TE/gsunt comparabile cu cele obinute de Wang i alii, 2009 (40.4 mol TE/g) and Moyer i alii.,2002 (32.6 mol TE/g).

Metoda ABTS se bazeaz pe abilitatea antioxidant a extractelor de a reaciona cucationul ABTS+ generat n sistem. n contrast, metoda FRAP msoar abilitatea extractelor de areduce complexul cu cationul feric la cationul feros. Valorile medii obinute pentru ABTS iFRAP sunt date n Tabelul 4. Afinele din Lotul 1 au avut cea mai mare activitate antioxidantbazat pe metodele FRAP i ABTS (73.71 M Fe2+/g i 56.65 mol TE/g). Cea mai micactivitate antioxidant folosind ambele meode s-a obinut pentru varietatea Duke. Ordineaobinut prin ambele metode, FRAP i ABTS, a fost urmtoarea: Lot 1>Lot 2>Bluecrop>Elliot>Duke. Valorile obinute prin metoda FRAP difer semnificativ ntre Lotul 1, Lotul 2, Bluecropi Duke (p

8Concluzii S-au identificat 13 antociani i 4 antocianidine n soiurile de afine luate n analiz n afinele din flora spontan petunidin-3-glucozida i delfinidin-3-glucozida

reprezint antocianii majoritari n timp de n afinele de cultur peonidin-3-galactozida reprezint antocianul major

Luteina, -cryptoxanthina i -carotenul au fost principalele carotenoideidentificate n afine. Cel mai mare coninut n carotenoide s-a gsit n Lotul 1 dinflora spontan iar cel mai mic n varietatea Duke.

Afinele din flora spontan au avut o concentraie mai mare de polifenoli,flavonoide i antociani totali comparativ cu afinele de cultur

S-au testat patru metode antioxidante referitor la activitatea antioxidant in vitroi toate aceste metode au evideniat cea mai mare activitate antioxidant pentruafinele culese din flora spontan

Publicaii realizate pe tematica proiectului1. Andrea BUNEA, Dumitria O. RUGIN, Adela M. PINTEA, Zoria SCONA,

Claudiu I. BUNEA, Carmen SOCACIU, Comparative Polyphenolic Content andAntioxidant Activities of Some Wild and Cultivated Blueberries from Romania, NotBot Horti Agrobo, 2011, 39(2):70-76 Print ISSN 0255-965X; Electronic 1842-4309 Factor de impact 0.483

2. Zoria SCONA, Dumitrita RUGIN, Floricua RANGA, Adela PINTEA, AndreaBUNEA, Preliminary Data Regarding Phenolic Acid Content in Some Wild andCultivated Blueberries, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 68(1-2)/2011- Revist indexat n baz de date internaional

Comunicari la simpozioane internaionale1. Andrea Bunea, Dumitria Rugin, Raluca Pop, Adela Pintea, Sanda Andrei, Claudiu

Bunea, Constantin Bele- Carotenoids and fatty acids profile and their quantification insome wild and cultivated blueberries from Romania, 4-P470, Abstract publicat nChemicke Listy, 2011- Factor de impact 0.236

2. Simpozionul International USAMV Cluj, oct 2011 1 prezentare oral

9BibliografiePineli, L.L.O., Moretti, C.L., Santos, M.S., Campos, A.B., Brasileiro, A.V., Cordova, A.C., Chiarello, M.D. (2011).Antioxidants and other chemical and physical characteristics of two strawberry cultivar at different ripeness stages.J Food Compos Anal, 24,11-16.Martineau, L.C., Couture, A., Spoor, D., Benhaddou-Andaloussi, A., Harris, C., Meddah, B., Leduc, C., Burt, A.,Vuong, T., Le, P.M., Prentki, M., Bennett, S.A., Arnason, J.T., Haddad, P.S. (2006). Anti-diabetic properties of theCanadian lowbush blueberry Vaccinium angustifolium Ait. Phytomedicine, 13, 612-623.Wang, S.Y., Jiao, H. (2000). Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry and strawberry varieswith cultivar and developmental stage. J Agric Food Chem, 48, 140-146.Zadernowski, R., Naczk, M., Nesterowicz, J. (2005). Phenolic acid profiles in some small berries. J Agric FoodChem, 53, 2118-2124.Li, W., Hydamaka, A.W., Lowry, L., Beta, T. (2009). Comparison of antioxidant capacity and phenolic compoundsof berries, chokecherry and seabuckthorn. Cent Eur J Biol, 4, 499-506.El-Sayed, M.A.A., Hucl, P. (2003). Composition and stability of anthocyanins in blue-grained wheat. J Agric FoodChem, 51, 2174-2180.Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Ravents, R.M., Lester, P. (1999). Analysis of total phenols and otheroxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Meth Enzymol, 299, 152-178.Giusti, M.M., Wrolstad, R.E. (2001). Characterization and measurement of anthocyanins by UV-Visiblespectroscopy. John Wiley & Sons, Inc., New York.Kim, D.O., Jeong, S.W., Lee, C.Y. (2003). Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivarsof plums. Food Chem, 81, 321-326.Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., Berset, C. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity.Food Sci Technol, 28, 25-30.Benzie, I.F.F., Strain, J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidantpower: the FRAP assay. Anal Biochem, 239, 70-76.Arnao, M.B., Cano, A., Alcolea, J.F., Acosta, M. (2001). Estimation of free radical-quenching activity of leafpigment extracts. Phytochem Anal, 12, 138-143.Huang, D., Ou, B., Hampsch-Woodill, M., Flanagan, J.A., Prior, R.L. (2002). Highthroughput assay of oxygenradical absorbance capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system coupled with a microplatefluorescence reader in 96-well format. J Agric Food Chem, 50, 4437-4444.Giovanelli, G., Buratti, S. (2009). Comparison of polyphenolic composition and antioxidant activity of wild Italianblueberries and some cultivated varieties. Food Chem, 112, 903-908.You, Q., Wang, B., Chen, F., Huang, Z., Wang, X., Luo, P.G. (2011). Comparison of anthocyanins and phenolics inorganically and conventionally grown blueberries in selected cultivars. Food Chem, 125, 201-208.Prior, R.L., Cao, G., Martin, A., Sofic, E., McEwan, J., OBrien, C., Lischner, N., Ehlenfeldt, M., Kalt, W., Krever,G., Mainland, C.M. (1998). Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturityand variety of Vaccinium species. J Agric Food Chem, 46, 2686-2693.Wang, C.Y., Chen, C.T., Wang, S.Y. (2009). Changes of flavonoid content and antioxidant capacity in blueberriesafter illumination with UV-C. Food Chem , 117, 426-431.Moyer, R.A., Hummer, K.E., Finn, C.E., Frei, B., Wrolstad, R.E. (2002). Anthocyanins, phenolics and antioxidantcapacity in diverse small fruits: Vaccinium, Rubus and Ribes. J Agric Food Chem, 50, 519-525.Koca, I., Karadeniz, B. (2009). Antioxidant properties of blackberry and blueberry fruits grown in the Black SeaRegion of Turkey. Sci Hortic, 121, 447-450Ogawa, K., Sakakibara, H., Iwata, R., Ishii, T., Sato, T., Goda, T., Shimoi, K., Kumazawa, S. (2008). Anthocyanincomposition and antioxidant activity of the crowberry (Empetrum nigrum) and other berries. J Agric Food Chem,56, 4457-4462Marinova, D., Ribarova, F. (2007). HPLC determination of carotenoids in Bulgarian berries. Journal of FoodComposition and Analysis, 20, 370-374.Breithaupt, D.E. , Schwack, W., 2000. Determination of free and bound carotenoids in paprika (Capsicum annuumL.) by LC/MS. Eur Food Res Technol 211, 52-55Cluj-Napoca, 10.12.2011 Director de Proiect,

Sef.lucr. dr. Andrea Bunea