Elemente structurale şi funcţionale ale peptidelor antimicrobiene

Între anii 1920 şi 1950, mulţi compuşi antimicrobieni au fost izolaţi, prezentând o anumită selectivitate pentru bacterii Gram-pozitive şi Gram-negative. În general aceste peptide antimicrobiene naturale sunt structuri bazice compuse din 12-50 de aminoacizi, existând astăzi peste 800 de asemenea compuşi descrişi în bazele de date privind peptidele antimicrobiene (Tossi, A. http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.htm). Doar pentru a exemplifica câteva dintre cele mai cunoscute peptide antimicrobiene, împreună cu sursa lor de provenienţă, pot fi menţionate următoarele: insect defensina A (fungi), cecropina A (insecte), melittina (veninul de albina), magainina 2 (amfibiene), tachyplesina 1 (crab), α-defensina HNP-1 (organismul uman). Structura primară, amfifaticitatea, încărcarea cationică şi dimensiunile lor le permit acestora să se ataşeze şi să se insere în membranele lipidice pentru a forma pori apoşi, ceea ce conduce la distrugerea acestora şi lizarea celulei microbiene [18,19,20,21,22,23].

Principalele caracteristici care stau la baza activităţii şi specificităţii peptidelor antimicrobiene sunt:

Secvenţa primară - majoritatea peptidelor antimicrobiene conţin în secvenţa primară aminoacizii bazici: lizina (Lys-K) şi arginina (Arg-R), aminoacizii hidrofobi: alanina (Ala-A), leucina (Leu-L), fenilalanina (Phe-F) sau triptofan (Trp-W) precum şi alţi aminoacizi cum ar fi isoleucina (Ile-I), tirozina (Tyr-Y) şi valina (Val-V); unele peptide antimicrobiene pot conţine secvenţe repetitive de astfel de aminoacizi; raportul cantitativ dintre aminoacizii hidrofobi şi aminoacizii care posedă sarcină electrică netă, poate varia de la 1:1 până la 2:1; numărul de aminoacizi care intră în structura peptidelor antimicrobine variaza de la 6 reziduuri aminoacidice pentru peptidele anionice până la 59 reziduuri aminoacidice pentru peptidele antimicrobiene cationice.

Sarcina electrică netă - peptidele antimicrobiene anionice, posedă o sarcină electrică netă negativă, la pH neutru, datorată în principal conţinutului de aminoacizi acidici, acidul aspartic (Asp-D) şi acidul glutamic (Glu-E) iar peptidele antimicrobine cationice posedă un exces de sarcină electrică netă pozitivă datorată conţinutului de aminoacizi bazici: arginina (Arg-R) şi lizina (Lys-K); peptidele anionice care sunt complexate cu zinc, precum şi peptidele puternic cationice sunt deseori mult mai active decât peptidele antimicrobiene neutre din punct de vedere electric sau cele care posedă o valoare mai mică a sarcinii electrice nete.

Structura secundară – majoritatea peptidelor antimicrobiene nu au o structură secundară bine definită în soluţii apoase dar, la nivelul membranelor celulare îşi pot asuma o varietate de structuri secundare cum ar fi structuri α-helix (cele mai răspândite în natură), β- sheet sau structuri ciclice; peptidele amfifatice cu structură secundară α - helix sunt mai active decât peptidele antimicrobiene care nu au o structură secundară bine definită; peptidele antimicrobiene care prezintă în structura lor secundară “ un miez” format din structuri β-sheet paralele cum este cazul moleculelor de defensină, sunt de cele mai multe ori foarte active.

Figura II.1. Clasificarea peptidelor antimicrobiene în funcţie de structura lor secundară şi exemplele reprezentative pentru care sunt indicate activitatea specifică a acestora şi mediul lor de provenienţă.

Hidrofobicitatea – reprezintă procentul de reziduuri aminoacidice hidrofobe existente în secvenţa primară a peptidei şi în general pentru peptidele antimicrobiene este de ~ 50%; această caracteristică are o importanţă deosebită în procesul de inserţie a peptidelor antimicrobiene în bistraturile lipidice membranare şi formarea de pori transmembranari capabili să lizeze membrana celulară [8]. Amfifaticitatea – reprezintă proprietatea peptidelor antimicrobiene de a prezenta o succesiune de aminoacizi hidrofili şi aminoacizi hidrofobi dispuşi de o parte şi de cealaltă a structurii de α-helix; pentru peptidele α-helix, amfifaticitatea este adesea exprimată prin intermediul momentului hidrofob care reprezintă vectorul sumă al indicilor hidrofobi, orientat normal la axa helixului şi indică orientarea aminoacizilor hidrofobi faţă de axa α-helixului; unele peptide antimicrobiene, rareori prezintă o buna delimitare a reziduurilor

Magainina 2Clasa: α-helixSpecia: Xenopus laevisActivitate: Gram+, Gram- fungi, tumori

Beta-defensina 3Clasa: β sheetSpecia: Homo sapiensActivitate: Gram+, Gram-

Lactofericina BClasa: β- hairipinSpecia: Bos taurusActivitate: Gram+, Gram- fungi, virusi, tumori

Nisina AClasa: structuri neregulateSpecia: LactococcusActivitate: Gram+

Polimixina EClasa: structuri cicliceSpecia: BacillusActivitate: Gram-

polare faţă de cele hidrofobe, ceea ce face ca hidrofobicitatea să fie mai greu de cuantificat [8, 9, 10].

Figura II.2. a) Reprezentarea distribuţiei aminoacizilor polari şi nepolari de-a lungul axei unui α-helix; b)Diagrama proiecţiei în plan transversal a structurii secundare de α-helix a

unui monomer peptidic, în care sunt indicate unghiul polar, Φ, şi momentul hidrofob, [10].

Unghiul polar – reprezintă o măsură a proporţiei relative a părtii polare a unei structuri α- helix, faţă de partea hidrofobă; de exemplu într-o situaţie ipotetică în care o structura α - helix a unei peptide este ordonată în aşa fel încât o jumătate a helixului în lungimea axei sale este alcătuită din aminoacizi polari iar cealaltă jumătate este alcătuită din aminoacizi hidrofobi, unghiul polar este de 180 de grade; o creştere a numărului de aminoacizi hidrofobi va reduce valoarea unghiului polar; studii au arătat că unghiul polar este corelat cu stabilitatea şi timpul de viaţă al porilor transmembranari induşi de peptidele antimicrobiene; peptide caracterizate de un unghi hidrofilic mic şi o valoare medie mare a hidrofobicităţii au tendinţa de a forma pori transmembranari, în timp ce o peptidă care are un număr egal de aminoacizi hidrofobi şi hidrofili, preferă adoptarea unei orientari paralele la suprafaţa biomembranelor [8,10].

Diversitatea peptidelor antimicrobiene face ca o clasificare a lor să fie dificil de realizat; dar având la bază proprietăţile enumerate anterior, peptidele antimicrobiene pot fi grupate în câteva clase principale, în funcţie de gradul lor de acţiune preferenţială şi anume:I. peptide antimicrobiene nespecifice, care nu prezintă specificitate în ceea ce priveşte acţiunea lor asupra unor membrane microbiene (Melitina – Apis mellifera)II. peptide antimicrobiene care destabilizează membrana celulelor eucariote:

a) celule tumorale ( Magainin 2 - Xenopus laevis )b) fungi (Lactofericin B - Bos taurus); fungii sunt susceptibili la acţiunea unor

peptide antimicrobiene datorită conţinutului lor de ergosterol (care nu se întâlneşte în celulele umane) c) viruşi (Lactofericin B - Bos taurus) III. peptide antimicrobiene care afectează membrana celulelor procariote, bacteriilor (β defensin 3 Homo sapiens):

a) bacterii Gram - pozitive (Nisin A - Lactococcus lactis)b) bacterii Gram - negative (Polymyxin E - Bacillus colistinus)

θ

a) b)

Figura II.3. Clasificarea reprezentativă a peptidelor antimicrobiene în funcţie de activitatea specifică a acestora, punându-se în evidenţă câteva exemple, împreună cu structura lor secundară şi mediul lor de provenienţă.

Partea practica – modelarea in programul de simulare HyperChem a unor peptide

cu urmatoarele structuri primare:

pep 1: Phe-Lys-Arg-Trp-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Thr-Asn-Lys-TrpFKRWQKLLSKITNKW

pep 2: Leu-Lys-Arg-Leu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Asn-Lys-TrpLKRLQKLLSKIWNKW

pep 3: Phe-Lys-Arg-Trp-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Trp-Lys-AsnFKRWQKLLSKIWWKN

pep 4: Leu-Lys-Arg-Leu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Lys-Ile-Trp-Trp-Lys-AsnLKRLQKLLSKIWWKN

MelitinaH2N-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-CONH2

HPA3Ala-Lys-Lys-Val-Phe-Lys-Arg-Leu-Glu-Lys-Leu-Phe-Ser-Ile-Trp-Asn-Trp-Lys-NH2

Magainina II

NH2-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser -CONH2

Cecropin A KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2 H - Lys - Trp - Lys - Leu - Phe - Lys - Lys - Ile - Glu - Lys - Val - Gly - Gln - Asn - Ile - Arg - Asp - Gly - Ile - Ile - Lys - Ala - Gly - Pro - Ala - Val - Ala - Val - Val - Gly - Gln - Ala - Thr - Gln - Ile - Ala - Lys - NH2

Cecropin B KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL-NH2 H - Lys - Trp - Lys - Val - Phe - Lys - Lys - Ile - Glu - Lys - Met - Gly - Arg - Asn - Ile - Arg - Asn - Gly - Ile - Val - Lys - Ala - Gly - Pro - Ala - Ile - Ala - Val - Leu - Gly - Glu - Ala - Lys - Ala - Leu - NH2

CA-MA KWKLFKKIGIGKFLHSAKKFLys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe

CA-MA-P5 KWKKLLKKPLLKKLLKKLLys-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Pro-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu- Leu-Lys-Lys-Leu