sdadas

Lucrarea practica nr. 1

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ UTILIZATE ÎN PROCESELE

BIOTEHNOLOGICE

Mediul de cultură reprezintă un complex de substanţe organice şi anorganice ce

constituie suportul nutritiv sterilizat necesar cultivării microorganismelor în afara nişei lor

ecologice naturale.

Un mediu de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

- să fie nutritiv, să conţină toate substanţele necesare întreţinerii, dezvoltării şi

multiplicării microorganismelor

- să fie steril

- să aibă pH-ul optim microorganismului pe care dorim să-l cultivăm

- să satisfacă aerofilia microorganismului cultivat

Mediile de cultură prezintă o mare importanţă în procesele biotehnologice, ele

influenţând direct reproductibilitatea şi eficienţa tehnologiei aplicate.

Ele permit studierea la nivel de laborator a particularităţilor morfologice, fiziologice,

genetice şi de biosinteză a microorganismelor de cultivate.

Mediile de cultură utilizate în biotehnologie sunt diferite, având în compoziţie

elemente specifice fiecarui tip de microorganism.

1. Clasificarea mediilor de cultură

Mediile de cultură pot fi clasificate în funcţie de mai multe criterii.

a) După natura substanţelor nutritive care intră în compoziţia lor:

- naturale

- sintetice

b) După spectrul lor de activitate:

- uzuale, pentru izolare şi întreţinerea microorganismelor

- selective, pentru selecţia microorganismelor

c) După consistenţă:

- lichide, pentru îmbogăţirea culturilor microbiene, pentru studiul proprietăţilor

biochimice şi modificărilor asupra substratul lichid

- 1 -

- solide, pentru izolarea microorganismelor şi pentru studiul caracterelor coloniilor

- semisolide, favorizează migrarea microorganismelor în mediu pentru diferenţierea

între specii

d) După tipul respirator al microorganismelor cultivate:

- pentru microorganisme aerobe

- pentru microorganisme anaerobe

e) După scopul şi frecvenţa întrebuinţării:

- curente

- de îmbogăţire

- de conservare

- de identificare

- de bioprocess

f) După de numărul ingredientelor pe care le conţin şi în funcţie de scop:

- minimale

- complexe

g) În funcţie de scara la care sunt folosite:

- de laborator, sunt medii complete, relativ simple care permit obţinerea unei

biomase microbiene corespunzătoare

- industriale, sunt medii ieftine, ce asigură necesităţile nutriţionale ale

microorganismelor cultivate şi producerea de către acestea a compuşilor doriţi;

utilizarea lor permite obţinerea de produse finale la un preţ de cost convenabil

2. Compoziţia mediilor de cultură

Mediile de cultură utilizate în biotehnologie conţin în principal:

- sursă de carbon şi energie

- sursă de azot

- oligoelemente

- microelemente

- factori de creştere (hormini, steroizi)

- 2 -

Surse de carbon

În majoritatea proceselor biotehnologice, principala sursă de carbon o constituie

glucidele. În mediile de cultură naturale, sursele de carbon sunt reprezentate de monoglucide

(glucoză, fructoză) sau diglucide (maltoză, zaharoză, lactoză), fie sub formă de substanţe

pure, fie furnizate de produse agroalimentare ca melasa, siropul de glucoză, făina de porumb,

zerul de lapte, deşeuri celulozice.

Pentru obţinerea unui mediu de cultură, sursa de carbon se prepară sub forma unei

soluţii de concentraţie cunoscută, astfel încât după reunire cu celelalte componente ale

mediului de cultură, concentraţia sursei de carbon în mediu să corespundă valorii indicate în

tehnologie.

Surse de azot

Sursa de azot necesară preparării unui mediu de cultură este reprezentată fie de

substanţe organice sau anorganice simple ca amoniacul, ureea, sulfatul de amoniu, fosfatul de

amoniu, fie de produse naturale, ce conţin aminoacizi sau proteine cum sunt făina de soia,

peptona, extractul de carne, extractul de porumb, extractul de drojdie.

Substanţa reprezentând sursa de azot se cântăreşte la balanţa tehnică, se dizolvă în

cantitate minimă în apă, se sterilizează, iar după răcire se amestecă cu celelalte componente

ale mediului de cultură.

Oligoelemente şi microelemente

Fosforul, potasiul, sodiul, sulful şi magneziul sunt elemente de bază pentru

microorganisme, fără de care nu pot exista. Ele sunt furnizate din sărurile minerale care se

introduc în mediul de cultură.

Microelemente ca fier, cupru, cobalt, mangan, zinc şi molibden sunt de asemenea

esenţiale, fiind de regulă prezente în mediu sub formă de impurităţi existente în alte

ingrediente ale mediului.

Sărurile minerale componente ale mediului de cultură se cântăresc şi se dizolvă

separat în apă, apoi se reunesc şi se sterilizează conform protocolului indicat în reţeta de

lucru.

- 3 -

3. Reguli generale de preparare a mediilor de cultură

În general, există două variante de preparare a mediilor de cultură:

a) cântărirea şi dizolvarea pe rând a substanţelor indicate în reţetă, într-o cantitate

minimă de apă, completarea cu apă până la volumul dorit şi apoi sterilizarea mediului de

cultură

b) cântărirea, dizolvarea şi sterilizarea separată a ingredientelor indicate în reţeta de

lucru, urmată de reunirea lor în condiţii aseptice

Cea de-a doua variantă prezintă avantajul că elimină eventuale interacţiuni ce pot să

apară între diferite componente din mediu în timpul operaţiei de sterilizare termică. De

exemplu, în timpul sterilizării prin autoclavare a sursei de carbon, reprezentată de glucide şi a

sursei de azot, reprezentată de aminoacizi, au loc reacţii Maillard, cu formarea unor produşi

denumiţi “melanoide” care au efect inhibitor asupra microorganismelor.

Pentru prepararea mediilor de cultură utilizate în biotehnologie, se parcurg

următoarele operaţii:

- pregătirea şi cântărirea ingredientelor

- dizolvarea substanţelor, de obicei la rece, într-o cantitate de apă distilată mai mică

decât volumul total de mediu preparat

- verificarea şi ajustarea pH-ului cu ajutorul unor soluţii alcaline de NaOH sau NH3,

sau soluţii acide de HCl sau acid lactic, după caz. Măsurarea pH-ului se efectuează cu

ajutorul hârtiilor indicatoare pH sau cu pH-metru.

- filtrarea, pe hârtie de filtru

- completarea cu apă distilată la volumul final

- topirea agarului, pentru mediile solide, prin fiebere 30 min sau autoclavare (0,5

atm)

- repartizarea mediilor lichide, în recipiente de diverse capacităţi, în funcţie de

necesităţi (eprubete, flacoane Erlenmeyer, sticle)

- sterilizarea mediilor, de regulă 15-20 min, la 1210C pentru mediile care nu conţin

glucide, iar cele cu glucide 15-20 min, la 1150C, pentru a evita caramelizarea lor

- controlul sterilităţii mediilor, prin incubare timp de 24 ore, la temperatura la care

urmeză să se incubeze mediul de cultură

- 4 -

- adăugarea eventualelor substanţelor termosensibile sterilizate separat prin alte

metode

- stocarea mediilor, la 4-80C, nu mai mult de 4 săptămâni

Exemple de medii de cultură

Bulion nutritiv- Extract de carne - Peptonă- Clorură de sodiu- Apă distilatăpH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min

0,3%0,5%0,5%

1000 ml

Geloză nutritivă- Bulion nutritiv - Agar pH=6-7, sterilizare 1200C, 20 min

1000 ml1,5-2,0%

Mediu pentru fermentaţia alcoolică- Glucoză- Extract de drojdie- Peptonă- (NH4)2SO4

- KH2PO4

15%0,4%0,4%0,4%0,2%

- 5 -


FERMENTAŢIA LACTICĂ

Prin fermentaţie lactică se înţelege procesul biologic prin care în urma degradării unui

mediu de cultură rezultă ca produs principal acidul lactic.

Fermentaţia lactică are numeroase aplicaţii practice în domenii diferite cum sunt:

- industria alimentară, la conservarea cărnii, peştelui, legumelor, la prepararea

şerbetului şi dulceţurilor, ca acidifiant pentru sucuri şi siropuri, la prepararea laptelui acru,

a iaurtului şi a altor produse lactate, la obţinerea unor băuturi din cereale şi a unor specii

de bere

- zootehnie, la conservarea şi însilozarea nutreţurilor

- medicină, ca antiseptic

- industria chimică, ca mordant la colorarea şi imprimarea textilelor

- în industria pielăriei

Glucoza Fructoza-difosfat

Aldehida 3-fosfoglicerica (2 molecule)

Acid 3-fosfogliceric (2 molecule)

Piruvat Lactat

2 ATP 2 ADP

NAD+NADH22 ADP

2 ATP

Figura 3. Calea metabolică de formare a acidului lactic (glicoliza)

Principiul metodei

Materiile prime de natură amidonoasă sau zaharoasă din fermentatoare sunt

însămânţate cu culturi selecţionate de Lactobacillus delbrueckii, pentru amidon, glucoză,

melase, Lactobacillus bulgaricus, pentru zer sau Lactobacillus plantarum, pentru leşii

bisulfitice. După 8-10 zile de incubare la 45-500C, 90-98% din materia primă este - 6 -

transformată în acid lactic. Pe măsură ce se formează, acidul lactic este neutralizat cu

Ca(OH)2 astfel încât, produsul final obţinut este lactatul de calciu. Acidul lactic este separat

din lactatul de calciu prin tratare cu H2SO4 formându-se astfel CaSO4 care precipită şi poate fi

separat prin filtrare. Soluţia de acid lactic se concentrează prin evaporare în vid până la 50-

80% din volumul iniţial, după care se purifică.

C6H12O6 2 CH3 – CHOH – COOH glucoză acid lactic (-hidroxipropionic)

2 CH3 – CHOH – COOH + CaCO3 (CH3 – CHOH – COO)2Ca + CO2 + H2O acid lactic lactat de calciu

(CH3 – CHOH – COO)2Ca + H2SO4 2 CH3 – CHOH – COOH + CaSO4↓ lactat de calciu acid lactic

Prepararea inoculului

Bacteriile folosite pentru fermentaţia lactică diferă în funcţie de materia primă

utilizată şi de temperatura de incubare. Lactobacili folosiţi sunt rezistenţi la aciditate şi foarte

activi în producerea acidului lactic:

- Lactobacillus bulgaricus

- Lactobacillus casei

- Lactobacillus delbrueckii

- Lactobacillus leichamanni

- Streptococcus lactis

Materiale necesare:

- tulpini de bacterii lactice

- ansă, eprubete sterile, pipete sterile

- apă distilată sau ser fiziologic sterile

- bec de gaz

Mod de lucru:

Se introduc 5 ml de apă distilată sau ser fiziologic peste o cultură vegetativă de

bacterii lactice, se omogenizează bine. Suspensia obţinută va fi folosită ca inocul pentru

însămânţarea baloanelor cu mediu de fermentaţie

Înainte de însămânţare se verifică microscopic puritatea inoculului.

- 7 -

Fermentaţia la flacoane

Procesul de fermentaţie decurge cu rezultate bune într-un mediu cu materii

amidonoase zaharificate şi cu aciditate mică (pH = 5,5).

Materii prime şi materiale:

- glucoză, (NH4)2HPO4, peptonă, CaCO3

- flacoane Erlenmeyer de 100 ml

- pahare Berzelius de 500 ml

- pipete sterile

- cilindru gradat

- hârtie de pH

- termostat

Mod de lucru:

Se prepară 100 ml mediul de cultură cu următoarea compoziţie:

- glucoză 10%

- (NH4)2HPO4 0,1%

- peptonă 0,5%

- CaCO3 1%

pH = 5,5

După cântărire şi dizolvare mediul se repartizeză în flacoane Erlenmayer de 100 ml,

câte 50 ml/flacon şi se sterilizează la 1100C, 20 minute. După răcire, în fiecare flacon se

adaugă steril câte 2 ml inocul de bacterii lactice pregătite anterior. Flacoanele se incubează 72

de ore la 420C.

1. Variaţia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaţiei lactice

1.1. Variaţia pH-ului pe parcursul biosintezei de acid lactic

Pe parcursul procesului de fermentaţie pH-ul mediului variază, determinarea lui

făcându-se cu ajutorul hârtiei indicatoare de pH sau cu pH-metrul.

Pentru neutralizarea acidităţii şi pentru menţinerea pH-ului în intervalul 5-5,5 (optim

pentru dezvoltarea bacteriilor lactice), pe măsură ce se formează acid lactic, în mediul de

- 8 -

fermentaţie se adaugă CaCO3, Ca(OH)2 sau NH3. CaCO3 se poate adăuga în mediu fie la

începutul fermentaţiei, fie treptat, pe parcurs.

În timpul fermentaţiei se colectează probe la intervale regulate de timp. Dacă pH-ul

scade sub 4 (atât fermentaţiile cu bacterii, cât şi cu drojdii), se fac corecţii cu CaCO3, soluţii

amoniacale (12,5%) sau cu soluţii de NaOH 40%.

În final, se trasează curba de pH, înscriind pe abscisă timpul de fermentaţie, iar pe

ordonată valoarea pH-ului.

Materiale necesare:

- pH-box sau pH-metru

- fiole cu 0,2 g CaCO3 steril

Mod de lucru:

Variaţia pH-ului pe parcursul fermentaţiei lactice se urmăreşte prin colectarea de

probe din 4 în 4 ore şi determinarea pH-ului acestora cu ajutorul hârtiei indicatoare pH sau cu

pH-metrul. Dacă pH-ul scade sub valoarea 4, se adaugă în flaconul cu mediul de fermentaţie

0,2 g CaCO3, sterilizat la 1800C, timp 2 ore.

Curba de pH se trasează înscriind pe abscisă timpul de fermentaţie, iar pe ordonată

valoarea pH-ului.

- 9 -


DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI TOTALE DE ACID LACTIC PE

PARCURSUL FERMENTAŢIEI

Pe parcursul fermentaţiei lactice există permanent un amestec de acid lactic liber şi

lactat de calciu. Pentru determinarea concentraţiei în acid lactic total existent în mediul de

cultură se determină concentraţia acidului lactic liber la care se adaugă concentraţia în acid

lactic existent sub formă de lactat de calciu.

1. Determinarea acidului lactic liber în mediul de fermentaţie

Principiul metodei

Acidul lactic formează în urma reacţiei cu hidroxidul de sodiu, lactat de sodiu.

Hidroxidul de sodiu rămas neconsumat se determină titrimetric cu o soluţie de acid clorhidric

0,1N, în prezenţă de fenolftaleină, ca indicator. Cantitatea de hidoxid de sodiu consumată în

reacţie este direct proporţională cu cantitatea de acid lactic din probă.

CH3 – CHOH – COOH + NaOH → CH3 – CHOH – COONa + H2O

HCl + NaOH → NaCl + H2O

Mod de lucru:

Proba de mediu se filtrează pe hârtie bandă albastră. Într-un flacon Erlenmeyer de 500

ml se introduc 0,5 ml probă, 20 ml apă distilată şi 50 ml NaOH 0,1N. Se astupă flaconul cu

dop rodat şi se lasă în repaus 30 de minute. Se titrează în prezenţă de fenolftaleină cu HCl

0,1N până la decolorare. În paralel, se face un martor, în aceleaşi condiţii dar fără probă de

acid lactic.

Calculul rezultatelor:

1ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g acid lactic

unde: Vm = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea martoruluiVp = volumul de HCl 0,1N folosit la titrarea probei

- 10 -

g = cantitatea de probă luată în lucruf = facturul soluţiei de HCl 0,1N

2. Determinarea lactatului de calciu în mediul de fermentaţie

Principiul metodei

Metoda se bazează pe dozarea ionilor de calciu prin complexarea lor cu sarea disodică

a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA-Na2) sau complexon III, în prezenţă de murexid, ca

indicator. Complexul iniţial, format între ionii de calciu şi indicator, este colorat în roz-violet.

+Na-OOC COO-Na+

+CH2O C

OH

NH2C

Ca2+

Ca

H2C

CH2 NCH2

CH2

OH

C O

OC

O

CH2

CH2

NCH2H2C

H2CN

O

COCH2

COO-Na++Na-OOC

Complexon 3

Complexonat de calciu

Ionii de calciu rămaşi în mediul de reacţie se titrează cu soluţie EDTA-Na2 formând

complexonatul de calciu. În momentul apariţiei în soluţie a unui exces de complexon III,

acesta va reacţiona cu complexul iniţial, format între ionii de calciu şi murexid, eliberând

murexidul care colorează soluţia în albastru.

Reactivi necesari:

- soluţie EDTA 0,05M (C10H14N2Na2O8 x 2H2O): 18,612 g EDTA disodic se dizolvă

în apă distilată şi se completează la 1000 ml

- soluţie tampon amoniacal pH = 10: 5,4 g clorură de amoniu se dizolvă în 50 ml apă

distilată, se adaugă 35 ml NH3 25% şi se completează cu apă distilată la 100 ml

- soluţie sulfat de magneziu 0,05M (MgSO4 x 7H2O): se cântăresc 1,23 g şi se dizolvă

în 100 ml apă distilată

- eriocrom negru T (C20H12N3O7SNa): 1 g eriocrom negru T se amestecă cu 100 g NaCl

- proba de mediu: 20 ml lichid de fermentaţie se tratează un vârf de spatulă de CaCO3

şi se lasă 30 de minute în repaus pentru neutralizare, apoi se filtrează pe hârtie de

filtru

- 11 -

Mod de lucru:

Din mediul filtrat se măsoară un volum de lichid astfel încât cantitatea de lactat de

calciu să fie 200 mg.

Pe parcursul fermentaţiei, numărul de ml probă luaţi în lucru variază astfel:

- 24 ore n = 3 ml

- 72 ore n = 2 ml

- 72-96 ore n = 1 ml

Într-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: n ml probă, 5 ml soluţie tampon

amoniacal şi 100 ml apă distilată.

Într-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu

0,05M, un vârf de spatulă de eriocrom negru T. Se titrează cu EDTA-Na2 0,05M până la

coloraţie albastră.

Soluţia obţinută (denumită edetat de Na şi Mg) din flaconul (2) se adaugă în flaconul

(1) ce conţine proba de titrat pentru observarea corectă a virajului culorii (magneziul adăugat

intensifică culoarea fără să modifice rezultatul deoarece este titrat).

Soluţia reunită se titrează cu EDTA-Na2 0,05M până la coloraţia albastră, notându-se

volumul total folosit.


Concentraţia în lactat de calciu din mediul de fermentaţie se calculează cu formula:

unde: A = volumul de EDTA cu care s-a titratf = factorul soluţiei de EDTA 0,05Mn = numărul de ml probă luaţi în lucru

Cantitatea de acid lactic existentă în mediul de cultură sub formă de lactat de calciu se

calculează conform următorului raţionament:

218 g lactat de calciu ………………… 2 x 90 g acid lactic b g lactat de calciu obţinut ………… Y g acid lactic

Y g acid lactic = 2 x 90 x b / 218

Concentraţia de acid lactic sub formă de lactat calculată pentru 1 ml probă luată în

lucru se calculează astfel:

C acid lactic sub formă de lactat (%) = Y x 100

- 12 -


DETERMINAREA GLUCIDELOR REDUCĂTOARE PRIN METODA SCHOORL

Principiul metodei

În mediul alcalin, la cald, glucidele reducătoare reduc complexul cuprotartric, format

prin amestecarea soluţiilor Fehling I şi Fehling II, până la oxid cupros (Cu2O), precipitat roşu

cărămiziu. Gruparea aldehidică se oxidează la carboxil.

Soluţia de sulfat de cupru şi sarea Seignette, în exces de hidroxid de sodiu, poartă

numele de soluţie Fehling. De obicei, aceasta se prepară în momentul întrebuinţării prin

amestecarea a două soluţii de bază, în cantităţi egale:

- soluţia Fehling I, soluţie cuprică: CuSO4 x 5H2O

- soluţia Fehling II, soluţie bazică: NaOH + tartrat dublu de Na şi K (sare Seignette)

NaOH Cu(OH)2 Na2SO4

HO CH COOKH2OCu

CuSO4 + +

Cu(OH)2 +COONaCHHO O CH COONa

COOKCHO+

Tartrat de sodiu si potasiu (Sare Seignette)

Complex cuprotartric (Albastru inchis)

Complexul cuprotartric format oxidează funcţiunea aldehidică a glucidului reducător

(glucoza), el reducându-se la oxid cupros. Cantitatea de oxid cupros este proporţională cu

cantitatea de glucoză din mediul de reacţie.

R O H2O Cu2OCHCOOK

COONa2 Cu+ 2

O

O CH

CH+ + +2 R COOH

CH

CHHO

HO

COONa

COOK2

AldozaComplex cuprotartric (albastru inchis)

Sare SeignetteAcid organic

În metoda Schoorl, restul de Cu(OH)2 care nu a fost redus se acidulează cu H2SO4,

transformându-se din nou în CuSO4 şi I2 care se titrează cu tiosulfat de sodiu.

- 13 -

Cu(OH)2 H2SO4 CuSO4 H2O

KI K2SO4 Cu2SO4 I2

Na2S2O3 Na2S4O6amidon

+ + 2

2 + 2 +CuSO4 +

I2 2 NaI ++

La titrare, se utilizează ca indicator o soluţie de amidon care formează cu iodul un

compus colorat în albastru închis. După titrare, soluţia devine albă.

Reactivi necesari:

- soluţie Fehling I: CuSO4x5H2O…….69,3 g H2SO4……………5 ml se aduce la 1.000 ml soluţie cu apă distilată

- soluţie Fehling II: tartrat dublu de Na şi K…….. 346 g NaOH………………………. 100 g după dizolvare şi răcire se aduce la 1.000 ml cu apă distilată

- soluţie H2SO4 25%: acid sulfuric concentrat………135 mlapă distilată………………….700 ml

- soluţie KI 20%: iodură de potasiu…………………200 g apă distilată………………………1.000 ml

- soluţie amidon 1%

Mod de lucru:

Se prelevează 10 ml din mediul de fermentaţie şi se filtrează pe hârtie de filtru. Din

proba filtrată se iau în lucru după cum urmează:

- în primele 48 de ore de fermentaţie (glucoza variază între 12-5%) – 0,5 ml

- între 48-96 ore de fermentaţie (glucoza variază între 5-0%) – 1 ml

Într-un flacon Erlenmeyer de 500 ml, se pipetează 10 ml soluţie Fehling I şi 10 ml

soluţie Fehling II, 20 ml apă distilată şi 0,5 ml / 1 ml probă. Se încălzeşte la flacără potrivită,

pe o sită de azbest, astfel încât soluţia să ajungă la fierbere în aproximativ 3 minute, după care

se menţine la fierbere 2 minute. Deasupra flaconului se aşează o pâlnie se sticlă pentru

condensarea vaporilor de apă. Se răceşte cu apă curentă, după care adaugă 10 ml soluţie

H2SO4 25% şi 10 ml KI 20%.

Soluţia obţinută se titrează sub agitare cu soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1N, până când

soluţia devine gălbuie. Se adaugă câteva picături soluţie amidon 1% şi se continuă titrarea

până ce culoarea soluţiei devine albă.

- 14 -

În paralel se realizează un martor folosind 20 ml apă distilată, 10 ml soluţie Fehling I

şi 10 ml soluţie Fehling II. La martor nu este necesară fierberea. În continuare se lucrează

identic ca la probă.

Tabelul 6. Corespondenţa între concentraţia glucidelor reducătoare şi volumul de tiosulfat

utilizat la titrare

ml Na2S2O3 0,1ml Na2S2O3 Glucoză [mg] Zahăr invertit [mg] Zaharoză [mg]1 0,31 3,2 3,2 3,12 0,31 6,3 6,4 6,23 0,32 9,4 9,7 9,34 0,32 12,6 13,0 12,45 0,32 15,9 16,4 15,66 0,32 19,2 19,8 18,87 0,32 22,4 23,2 22,08 0,32 25,6 26,5 25,09 0,34 28,9 29,9 28,410 0,34 32,3 33,4 31,711 0,33 35,7 36,8 35,012 0,34 39,0 40,3 38,513 0,34 42,4 43,8 41,614 0,35 45,8 47,3 44,915 0,35 49,3 50,8 48,216 0,35 52,8 54,3 51,617 0,35 56,3 58,0 55,118 0,35 58,9 61,8 58,719 0,36 63,3 65,5 62,320 0,36 66,9 69,4 65,921 0,38 70,7 73,3 69,622 0,38 74,5 77,2 73,323 0,40 78,5 81,2 77,124 0,41 82,5 85,2 80,925 0,40 86,6 89,2 84,7


(N - n)* F = X ml Na2S2O3

unde: N = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit pentru titrarea martorului n = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei F = factorul soluţiei de tiosulfat de sodiu 0,1N (0.9900)

Echivalenţa în susbstanţă reducătoare din proba luată în lucru se găseşte în tabelul 6.

1. Când se iau în lucru 0,5 ml:

Concentraţie în glucoză (%) = mg glucoză (tabel) x 0,2

2. Când se iau în lucru 1 ml probă:

- 15 -

Concentraţie în glucoză (%) = mg glucoză (tabel) x 0,1

În cazul în care sursa de carbon din mediu este reprezentată de un diglucid ca zaharoza,

pentru determinarea conţinutului în glucide reducătoare se aplică aceeaşi metodă, cu

deosebirea că se efectuaeză în prealabil o hidroliză a probei de analizat.

Pentru hidroliza diglucidelor se prelevează din proba respectivă 5 ml, se diluează cu

20 ml apă distilată, se adaugă 5 ml HCl 10%. Amestecul se menţine în apă fierbinte la 670C,

timp de 5 minut şi apoi se răceşte imediat în jet de apă rece. Se aduce amestecul la 50 ml cu

apă distilată într-un balon cotat. Din această soluţie se iau câte 5 ml pentru dozarea glucozei

în modul descris mai sus.

- 16 -


PRELUCRAREA MEDIULUI DE FERMENTAŢIE

La sfârşitul procesului de fermentaţie mediul se tratează cu hidroxid de calciu, astfel

încât, produsul final să se găsească în întregime sub formă de lactat de calciu. Suspensia

obţinută se filtrează, iar lichidul se tratează cu acid sulfuric până la reacţie acidă pentru

descompunerea lactatului de calciu în acid lactic şi precipitat de sulfat de calciu. După

filtrarea sulfatului de calciu, soluţia diluată de acid lactic se concentrează.

Concentrarea se face prin evaporare în vid, la presiune scăzută, până la 1/5 din

volumul iniţial, când concentraţia de acid lactic este 50-80%. Produsul obţinut, acidul lactic

brut, denumit şi “acid lactic uz tehnic”, poate fi folosit fie ca atare în industrie, fie purificat.

Pentru purificarea acidului lactic se folosesc mai multe metode:

- recristalizarea lactatului de calciu şi tratarea ulterioară a acestuia cu acid sulfuric

pentru obţinerea acidului lactic liber;

- transformarea lactatului de calciu în lactat de Zn care cristalizează mai uşor decât

celelate săruri ale acidului lactic. Lactatul de zinc se purifică prin cristalizări repetate, apoi

se tratează cu hidrogen sulfurat pentru precipitarea sulfurii de zinc. Soluţia de acidul lactic

se decolorează cu cărbune activ, se filtrează şi se concentrează în vid;

- esterificarea acidului lactic cu alcool metilic. Mediul se tratează cu acid sulfuric şi

se menţine 4-5 ore la cald. Precipitatul se îndepărtează prin filtrare, iar excesul de alcool

metilic prin distilare;

- oxidarea acidului lactic cu diferiţi agenţi oxidanţi (hipoclorit de sodiu, hipoclorit de

calciu, permanganat de potasiu, acid azotic, apă oxigenată, clor, ozon);

- extragerea cu solvenţi (eter izopropilic);

- trecerea unui curent de vapori de alcool metilic prin soluţiile apoase de acid lactic;

lactatul de metil dă naştere prin hidroliză şi distilare la acid lactic pur.

Mod de lucru:

Mediul de fermentaţie obţinut în laborator (100 ml), se tratează cu 5 ml H2SO4

concentrat, se lasă timp de 30 minute pentru descompunere, după care se filtrează pe hârtie

bandă albastră pentru îndepărtarea sulfatul de calciu. Lichidul perfect limpede, conţinând

aproximativ 10% acid lactic, se concentrează sub vid până la 1/5 din volumul iniţial. În final,

se determină concentraţia acidului lactic obţinut.

- 17 -

CALCULUL RANDAMENTULUI DE OBŢINERE A ACIDULUI LACTIC

Caracterizarea bioprocesului de obţinere a acidului lactic prin fermentaţie se realizează

prin calcularea mai multor randamente.

Pentru evidenţierea gradului de utilizare a glucozei la sfârşitul fermentaţiei, atât pentru

dezvoltarea microorganismelor cât şi pentru biosinteză, se calculează randamentul de consum

al glucozei şi randamentul de transformare a glucozei în acid lactic.

Pentru evaluarea bioprocesului la sfârşitul biosintezei se calculează randamentul de

obţinere a acidului lactic.

a) Randamentul de consum al glucozei

Prin calculul acestui randament se obţin informaţii referitoare la proporţia totală în

care a fost consumat substratul pentru dezvoltarea microorganismelor şi pentru producerea de

acid lactic. Acesta nu oferă însă informaţii referitoare la gradul de transformare a glucozei în

acid lactic.

cantitatea de glucoză consumată η = x 100

cantitatea de glucoză iniţială

b) Randamentul de transformare a glucozei în acid lactic

Acest calcul oferă informaţii cu privire la specificitatea microorganismului producător

şi capacitatea acestuia de a produce acid lactic şi nu alţi produşi.

cantitatea de glucoză transformată în acid lactic η = x 100

cantitatea de glucoză consumată

c) Randamentul de obţinere a acidului lactic

Acesta interesează din punct de vedere tehnologic, întrucât oferă informaţii globale

referitoare la desfăşurarea bioprocesului.

cantitatea de acid lactic obţinut practicη = x 100

cantitatea de acid lactic teoretic

Cantitatea de acid lactic obţinut practic, se calculează în funcţie de volumul final al

mediului de fermentaţie.

- 18 -

Cantitatea teoretică de acid lactic se deduce din stoechiometria reacţiei chimice de

transformare a glucozei, ţinând cont de cantitatea introdusă la începutul procesului de

fermentaţie.

Pentru o mai bună înţelegere a randamentelor prezentate mai sus, se consideră

următorul exemplu:

Exemplu:

Se consideră următoarele concentraţii şi volume iniţiale şi finale:

- volum iniţial de fermentaţie = 95 ml

- volum final de fermentaţie = 80 ml

- concentraţie iniţială de glucoză = 9,0% (g/v)

- concentraţie de acid lactic = 3,5% (g/v)

- concentraţie de lactat de calciu = 4% (g/v)

- concentraţie finală de glucoză = 0,3% (g/v)

Să se calculeze randamentele de consum al glucozei, de transformare a glucozei în

acid lactic şi cel de obţinere a acidului lactic.

a) Randamentul de consum al glucozei

Cantitatea de glucoză iniţială introdusă în mediul de fermentaţie se calculează astfel:

9 x 95 / 100 = 8,55 g glucoză iniţială

cantitatea de glucoză consumată = cantitatea iniţială de glucoză – cantitatea finală de glucoză

Cantitatea de glucoză rămasă în mediu la sfârşitul fermentaţie se calculează astfel:

0,3 x 80 / 100 = 0,24 g glucoză finală

Cantitatea de glucoză consumată = 8,55 – 0,24 = 8,31 g glucoză comsumată

c = 8,31 / 8,55 x 100 = 97%

b) Randamentul de transformare a glucozei în acid lactic

Cantitatea de glucoză transformată în acid lactic se obţine din calculul stoechiometric

al reacţiei globale:

C6H12O6 → 2 CH3 – CHOH – COOH glucoză acid lactic 180 90

cantitatea totală de acid lactic

=cantitatea de acid

lactic liber+

cantitatea de acid lactic din lactatul de calciu

- 19 -

Cantitatea de acid lactic aflat sub formă de lactat de calciu se calculează din reacţia:

2 CH3 – CHOH – COOH + CaCO3 (CH3 – CHOH – COO)2Ca + CO2 + H2Oacid lactic lactat de calciu

90 218

Cantitatea de acid lactic aflat ca lactat de calciu se calculează astfel:

4 x 80 / 100 = 3,2 g lactat de calciu

218 g lactat de calciu ………………… 180 g acid lactic3,2 g lactat de calciu ………….............. x g acid lactic

x = 3,2 x 180 / 218 = 2,64 g acid lactic din lactat de calciu

Cantitatea de acid lactic liber se calculează astfel:

3,5 x 80 / 100 = 2,8 g acid lactic liber

Cantitatea totală de acid lactic = 2,8 + 2,64 = 5,44 g

Cantitatea de glucoză din care provine acidul lactic se calculează astfel:

180 g glucoză ...………………….. 2 x 90 g acid lacticy g glucoză ……………………..... 5,44 g acid lactic

y = 180 x 5,44 / 180 = 5,44 g glucoză

tr = 5,44 / 8,3 x 100 = 65,5%

c) Randamentului de obţinere a acidului lactic

Cantitatea de acid lactic teoretic ce ar fi trebuit obţinută:

180 g glucoză ....…………………….. 2 x 90 g acid lactic8,55 g glucoză ……………………..... z g acid lactic

y = 180 x 8,55 / 180 = 8,55 g acid lactic teoretic

= 5,44 / 8,55 x 100 = 63%

- 20 -


FERMENTAŢIA ALCOOLICĂ

Fermentaţia alcoolică are numeroase aplicaţii practice în industrie:

- fabricarea spirtului, a băuturilor spirtoase;

- fabricarea vinului, a berii;

- fabricarea sucurilor de fructe;

- în panificaţie.

Etanolul se poate obţine prin metode chimice sau prin fermentaţia completă de către

unele drojdii a diferitelor substanţe hidrocarbonate, umată de distilarea şi purificarea alcoolică.

Drojdiile au un echipament enzimatic foarte bogat, graţie căruia, prin procese

anaerobe de fermentaţie işi pot procura energia necesară reacţiior metabolice vitale.

C6H12O6 2 CH3 – CH2OH + 2 CO2

În realitate, mersul reacţiei este mult mai complicat, formându-se şi numeroşi compuşi

secundari de fermentaţie.

Începutul fermentaţiei corespunde perioadei de multiplicare a drojdiei în care

consumul sursei de carbon este de 2%, iar degajarea de dioxid de carbon este slabă

(fermentaţie redusă). După 20 de ore, fermentaţia este însoţită de degajare intensă de dioxid

de carbon, concentraţia sursei de carbon scăzând de la 85%, la 15% (fermentaţia principală).

Urmează o perioadă liniştită, cu degajare slabă de dioxid de carbon, concentraţia sursei de

carbon ajungând la 2% (fermentaţia secundară). Formarea etanolului se observă după mai

multe zile, în funcţie de temperatură de incubare.

Prin procesul de fermentaţie alcoolică, rezultă o cantitate redusă de energie, fapt

confirmat şi de randamentul energetic scăzut, realizat într-o unitate de timp. Pentru a obţine

aceeaşi cantitate de energie rezultată prin respiraţia unei molecule de glucoză, în fermentaţia

alcoolică sunt necesare 12 molecule de glucoză. Într-un proces mixt de descompunere a

glucidelor pe cale anaerobă şi aerobă, 98% din această cantitate se foloseşte pentru

fermentaţie şi numai 2% pentru respiraţie.

Bilanţul energetico-chimic al procesului de fermentaţie alcoolică este:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 – 18 kcal

- 21 -

În biotehnologie se realizează o fermentaţie dirijată cu tulpini selecţionate, care

durează 20-24 de ore, aşa cum se exemplifică în continuare.

Materii prime şi materiale necesare:

- cultura stoc de Saccharomyces cerevisiae

- eprubete sterile

- bec de gaz

- ansă

- mediu lichid de dezvoltare


Fermentaţia alcolică poate fi produsă de o serie de microorganisme:

- Saccharomyces cerevisiae

- Bacillus macerans

- Sarcina ventriculi

- Zymomonas mobilis

- Erwinia amylovora

- Thermoanaerobacter ethanolicus

În comparaţie cu fermentaţia alcoolică produsă de drojdii, obţinerea etanolului pe cale

bacteriană este un proces mai avantajos deoarece bacteriile cresc mai rapid şi au o rată de

productivitate mult mai mare.

Mod de lucru:

Se prelevează cu ansa o cultură stoc de Saccharomyces cerevisiae şi se colectează într-

o eprubetă sterilă cu mediu lichid. Se incubează static, 24 ore, la 280C. Se obţine astfel o

suspensie omogenă de drojdii ce va constitui inoculul pentru fermentaţia la nivel de laborator

(flacoane).

Fermentaţia la baloane

Se prepară 1.000 ml de mediu pentru multiplicarea drojdiilor cu următoarea

compoziţie:

- Glucoză 15%

- Extract de drojdie 0,4%

- Peptonă 0,4%

- 22 -

- (NH4)2SO4 0,4%

- KH2PO4 0,2%

Materii prime şi materiale necesare:

- flacoane Erlenmayer de 500 ml sterile

- balanţă tehnică

- spatule, pahare Berzelius (mensură)

- cilindru gradat

- baghetă de sticlă

- pH-box

- bec de gaz

- autoclav

Mod de lucru:

Se cântăresc şi se dizolvă pe rând substanţele componente ale mediului de cultură, se

corectează pH-ul la valoarea 4-5, se repartizează câte 250 ml în fiecare flacon Erlenmayer şi

se sterilizează prin autoclavare la 1150C, 15 minute.

Fiecare flacon este însămânţat cu 10% inocul şi se termostatează la 280C, static, timp

de 24-48 de ore.

Produsul rezultat conţine în principal alcool etilic, în concentraţie de 5-7% dar şi

cantităţi mici de produşi secundari, ca acetaldehida, glicerina, acizi organici volatili şi alcooli

superiori.

1. Variaţia parametrilor biochimici pe parcursul fermentaţiei alcoolice

1.1. Determinarea variaţiei sursei de carbon pe parcursul fermentaţiei

Când se foloseşeşte glucoza în mediul de fermentaţie, determinarea consumului

acesteia se face prin metoda Schoorl, fără hidroliză prealabilă. În general, în mediile de

cultură pentru drojdii se utilizează glucide fermentescibile ale căror concentraţii variază între

2 şi 20%. Gradul de asimilare al glucidelor depinde de concentraţia lor în mediu, de cantitatea

de biomasă, de temperatură şi pH.

Cantitatea de glucoză consumată se determină recoltând probe din 4 în 4 ore.

- 23 -

Tabelul 7. Variaţia concentraţiei de glucoză pe parcursul unei fermentaţii cu Saccharomyces cerevisiae

Timp (ore) Glucoza (%)022284652

11,48,72,800

6.3.1.2. Determinarea conţinutului în alcool etilic în mediul de fermentaţie

Mod de lucru:

Se măsoară într-un cilindru gradat un litru de mediu de fermentaţie, se introduce într-

un balon de 2 litri, după care se distilă la 2/3 din cantitatea introdusă, urmărindu-se ca

temperatura în corpul coloanei să crească spre 1000C. Se măsoară volumul distilat şi se

determină conţinutul în alcool cu un alcoolmetrul. Cantitatea de alcool se exprimă procentual,

cu ajutorul următoarei formule:

% alcool = (V x C) / 100 ( v/v)

unde: V = volumul de alcool distilat C = concentraţia de alcool determinată cu alcoolmetrul

Pentru o mai mare precizie, fracţiunea distilată care conţine acizi distilaţi se

neutralizează cu NaOH în prezenţă de fenolftaleină şi se redistilă. Raportarea cantităţii de

alcool se face ca în primul caz.

2. Prelucrarea mediului de fermentaţie alcoolică

În urma fermentaţiei alcoolice se obţine un produs ce conţine alcool etilic şi diferiţi

produşi secundari. Alcoolul etilic se recuperează din mediul de fermentaţie prin distilare. În

urma distilării simple se obţine o soluţie alcoolică având un conţinut în alcool de 27-32%.

3. Calculul randamentului în alcool etilic

Randamentul de obţinere a alcoolului etilic obţinut la sfârşitul procesului de

fermentaţie, se calculează astfel:

cantitatea de alcool etilic obţinută practic alcool = x 100

- 24 -

cantitatea de alcool etilic obţinută teoretic

Cantitatea de alcool etilic teoretic se deduce din stoechiometria reacţiei chimice,

ţinând seama de cantitatea de glucoză pură iniţială supusă procesului de fermentaţie:

C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 (1)180 46

Exemplu:

Se consideră următoarele concentraţii şi volume iniţiale şi finale:

- concentraţie iniţială de glucoză = 9,7% (g/v)

- volum iniţial mediu de fermentaţie = 500 ml

- concentraţie finală de alcool etilic = 5,2% (v/v)

- volum final mediu de fermentaţie = 495 ml

Cantitatea iniţială de glucoză:

9,7 x 500 / 100 = 48,5 g glucoză iniţială

Cantitatea de alcool etilic teoretic se calculează din ecuaţia (1) astfel:

180 g glucoză …………………. 92 g alcool etilic

48,5 g glucoză …………………. X g alcool etilic

X = 92 x 48,5 / 180 = 24,7 g alcool etilic teoretic

Volumul de alcool etilic obţinut practic:

5,2 x 495 / 100 = 25,74 ml alcool etilic practic

Masa alcoolului etilic din mediul de fermentaţie se calculează cu formula:

m = x v

unde: m = masa (g) = densitatea (g/ml); pentru alcoolul etilic 100% = 0,79 g/ml v = volumul (ml)

Cantitatea de alcool etilic practic:

m alcool = 0,79 x 25,74 = 20,33 g alcool etilic practic

= 20,33 / 24,7 x 100 = 82,32%

- 25 -


OBŢINEREA ACIDULUI GLUCONIC

Acidul gluconic este un acid slab, biodegradabil (98% în 48 ore), nu este coroziv,

volatil sau toxic.

În natură, acidul gluconic se găseşte în fructe, miere, ceai de kombucha si vin.

Se poate obţine prin oxidarea glucozei sub acţiunea glucoz-oxidazei, produsă de fungi

(Aspergillus niger) sau a glucoz-dehidrogenazei, produsă de bacterii (Gluconobacter).

Fermentaţia cu Aspergillus niger datează de câteva decenii şi este cea mai rentabilă metodă de

obţinerea acidului gluconic.

Acidul gluconic şi derivaţii lui îşi găsesc aplicaţii în numeroase industrii: alimentară,

farmaceutică, textilă, a detergenţilor şi cea a produselor de igienă.

În principal, este folosit ca aditiv alimentar (E574) pentru reglarea aciditatăţii

produselor. El imprimă un gust proaspăt, acidulat multor produse alimentare ca vinul, sucurile

de fructe, etc.

Gluconatul de sodiu, datorită proprietăţii de chelatare a metalelor grele, superioară

EDTA-ului, îşi găseşte aplicaţii în domenii din cele mai variate: în metalugie, pentru

prevenirea formării şi curăţarea ruginii, în industria textilă, pentru prevenirea formării

depunerilor de fier, în industria detergenţilor, pentru îndepărtarea depozitelor calcaroase de pe

metale şi alte suprafeţe. De asemenea, mai poate fi folosit ca aditiv la cimentului reglând

procesul de maturare, crescându-i duritatea, rezistenţa la apă, la îngheţ şi la crăpare.

Gluconatul de calciu este folosit în terapia deficienţelor de calciu, în nutriţia

animalelor, iar pe cale injectabilă, pentru tratarea malariei.

Gluconolactona se foloseşte ca acidifiant slab în panificaţie, în procesarea cărnii, în

coagularea proteinelor din soia, în industria produselor lactate, pentru creşterea stabilităţii la

fierbere a laptelui şi pentru obţinerea unor tipuri de brânzeturi

Microorganismele utilizate frecvent pentru obţinerea acidului gluconic sunt:

Fungi:

- Aspergillus niger

- Penicillium chrysogenum

Bacterii:- 26 -

- Acetobacter aceti

- Acetobacter gluconicum

- Pseudomonas fluorescens

- Pseudomonas ovalis

Pentru obţinerea acidului gluconic prin fermentaţie se foloseşte ca materie primă

glucoza. Ea este oxidată incomplet sub acţiunea glucozo-oxidazei elaborată de

microorganismele din cultură. Metabolizarea glucozei se realizează în culturi submerse aerate,

sub presiune, randamente mari de producţie (90-95%) putând fi obţinute cu condiţia

neutralizării acidului gluconic din mediu cu carbonat de calciu sau hidroxid de sodiu. În

aceste condiţii, produsul final se obţine sub formă de gluconat de Ca sau de Na, în funcţie de

natura substanţei folosită pentru neutralizare.

Reacţia globală devine:

CH2OH (CHOH)4 CHO O

H2O

COOH

FADFADH2

H2O2

1/2 O2

+

+

+

glucozoxidaza

(CHOH)3CH2OH CH C

Oδ -D-gluconolactona

glucoza

O2

FAD

catalaza

H2O

acid D-gluconic(CHOH)4CH2OH

+++

+

H2O

glucozaCHO(CHOH)4CH2OH 1/2 O2 CH2OH (CHOH)4

acid gluconicCOOH

COOHacid gluconic

(CHOH)4CH2OH2 CaCO3 CO2[CH2OH (CHOH)4 COO]2Cagluconat de calciu

Prepararea inoculului de Aspergillus niger

Pentru însămânţarea mediului de fermentaţie la nivel de laborator se foloseşte o

suspensie de microorganisme, dezvoltată pe mediu solid.

Mediul solid pentru obţinerea conservului vegetativ are următoarea compoziţie: must

de malţ 2%, agar 2%, pH=6,4. Mediul astfel preparat se repartizează în eprubete, se

sterilizează la 1100C, timp de 30 de minute, se răceşte pe o suprafaţă înclinată şi se

însămânţează cu o suspensie de spori provenită dintr-o cultură pură de Aspergillus niger.

Incubarea se face la termostat, la 28-300C, timp de 7 zile, pentru sporulare.

- 27 -

Fermentaţia la baloane agitate

În scopul efectuării unei fermentaţii gluconice în laborator, se pregătesc 300 ml mediu

de cultură cu următoarea compoziţie:

- glucoză (dextroză) 20%

- carbonat de calciu 1%

- azotat de sodiu 0,05%

- sulfat de magneziu 0,0125%

- fosfat monopotasic 0,01%

Soluţia de glucoză împreună cu sărurile (fără carbonatul de calciu) se repartizează în 6

baloane Erlenmayer de 100 ml, câte 50 ml/balon şi apoi se sterilizează la 1200C, timp de 30

de minute. După sterilizarea şi răcirea mediului, se adaugă câte 0,5 g carbonat de calciu/balon,

sterilizat separat în etuvă la 1800C, 2 ore.

Fiecare balon se însămânţează cu 0,5% suspensie de spori preparată astfel: 5 ml apă

distilată sterilă se adaugă peste cultura de Aspergillus niger dezvoltată pe solid.

Cultura se dezvoltă la 28-300C sub agitare continua la 220 rpm, timp de 48 de ore.

După această perioadă cultura trebuie să să fie pură, să prezinte un miceliu crenelar, cu hife

distincte la microscop, împâslite, dar nu aglomerate, iar pH-ul mediului trebuie să fie de

aproximativ 6,0.

1. Determinarea conţinutului de acid gluconic în mediul de fermentaţie

Acidului gluconic se determină de fapt ca gluconat de calciu, aceasta fiind forma

regăsită la sfârşitul procesului de fermentaţie, după care se calculează concentraţia

corespunzătoare în acid gluconic.

Principiul metodei

Metoda se bazează pe dozarea ionilor de calciu prin complexare cu sarea disodică a

acidului etilendiaminotetraacetic (conform punctului 6.2.1.3.2.).

Mod de lucru:

Se filtrează 5 ml mediu de fermentaţie pe hârtie de filtru (bandă albastră).

Din filtrat se măsoară un volum de lichid astfel încât cantitatea de lactat de calciu să

fie 300 mg.

- 28 -

Într-un flacon Erlenmeyer de 500 ml (1) se introduc: 1 ml probă, 5 ml soluţie tampon

amoniacal şi 100 ml apă distilată.

Într-un alt flacon Erlenmeyer de 500 ml (2) se introduc: 1 ml sulfat de magneziu

0,05M, un vârf de spatulă de eriocrom negru T. Se titrează cu EDTA-Na2 0,05M până la

coloraţie albastră.

Soluţia obţinută (denumită edetat de Na şi Mg) din flaconul (2) se adaugă în flaconul

(1) ce conţine proba de titrat pentru observarea corectă a virajului culorii (magneziul adăugat

intensifică culoarea fără să modifice rezultatul deoarece este titrat).

Soluţia reunită se titrează cu EDTA-Na2 0,05M până la coloraţia albastră, notându-se

volumul total folosit.


Concentraţia în gluconat de calciu din mediul de fermentaţie se calculează cu formula:

unde: A = volumul de EDTA cu care s-a titratf = factorul soluţiei de EDTA 0,05Mn = numărul de ml probă luaţi în lucru

Cantitatea de acid gluconic existentă în mediul de cultură sub formă de gluconat de

calciu se calculează conform următorului raţionament:

430 g gluconat de calciu ………………… 2 x 196 g acid gluconic Y g gluconat de calciu obţinut ………… Z g acid gluconic

Z g acid gluconic = 2 x 196 x Y / 430

Concentraţia de acid gluconic sub formă de gluconat (%) = Z x 100

2. Prelucrarea mediului de fermentaţie

Mediul de biosinteză obţinut în finalul fermentaţiei gluconice se prelucrează pentru

izolarea acidului gluconic format pe parcursul bioprocesului şi calculul randamentului.

În scopul neutralizării complete a acidului gluconic rezultat în urma oxidării glucozei,

se procedează la tratarea mediului de fermentaţie cu hidroxid de calciu (carbonat de calciu

carbonat de calciu sau carbonat de calciu.). Acesta se adaugă cu o spatulă, în proporţie de

10% (10 g carbonat de calciu sau hidroxid de calciu la 100 ml mediu). Pentru definitivarea

reacţiei de neutralizare se încălzeşte amestecul la 60-700C, timp de 30 de minute, sub agitare

- 29 -

continuă. După neutralizare, amestecul de reacţie se filtrează fierbinte, pe filtru rămânând

biomasa şi excesul de carbonat de calciu rămas nereacţionat.

Soluţia perfect limpede obţinută după filtrare se răceşte pe baie de gheaţă, sub agitare

continuă, timp de 1-2 ore pentru cristalizarea gluconatul de calciu din soluţie. Suspensia

obţinută se filtrează în vederea separării precipitatului. Turta de gluconat de calciu se esorează

corespunzător, se usucă în etuvă, în curent de aer cald la 40-500C, timp de 4-5 ore, se

cântăreşte şi se calculează randamentul de obţinere.

3. Controlul analitic al bioprocesului de obţinere a proteinelor monocelulare

3.1. Determinarea biomasei umede (WCW= Wet Cell Weight)

Mod de lucru:

Proba se agită bine pentru omogenizare. Într-o eprubetă (cuvă) de centrifugă tarată în

prealabil, se introduce un volum exact măsurat din probă (10 ml) şi se centrifughează la 4000

rpm, 20 minute. După înlăturarea supernatantului se cântăreşte eprubeta cu biomasă.

Formula de calcul:

WCW % = a x 10

unde: a = cantitatea de biomasă umedă centrifugată (greutatea eprubetei cu biomasă - greutatea eprubetei goală)

10 = pentru a raporta la 100 ml mediu

3.2. Determinarea biomasei uscate (DCW= Dry Cell Weight)

Greutatea uscată reprezintă ~ 20-25% din cea umedă şi este un indicator mai exact,

deoarece celulele pot absorbi sau pierde apă în cantităţi necorelate cu masa protoplasmatică.

Mod de lucru:

Proba se agită bine pentru omogenizare. Într-o eprubetă (cuvă) de centrifugă tarată în

prealabil, se introduce un volum exact măsurat din probă (10 ml) şi se centrifughează la 4000

rpm, 20 minute. După înlăturarea supernatantului eprubeta cu biomasă se usucă, în trepte, mai

întâi la 600C, 4 ore, apoi la 105-1100C, 2 ore până la greutate constantă.

Formula de calcul:DCW % = a x 10

- 30 -

unde: a = cantitatea de biomasă uscată (greutatea eprubetei cu biomasă - greutatea eprubetei goală)10 = pentru a raporta la 100 ml mediu


BIOREACTOARE

1. Bioreactorul discontinuu de tip Braun

1.1. Descrierea şi operarea bioreactorului în sistem batch

Pentru obţinerea produselor biotehnologice, la nivel micropilot se utilizează diverse

tipuri de bioreactoare, în funcţie de tipul microorganismului utilizat, de natura produselor

obţinute şi de productivitatea urmărită.

Bioreactoarele, în funcţie de modul de operare pot fi conduse în regim discontinuu,

semicontinuu sau continuu.

Bioreactorul BRAUN este un bioreactor cu funcţionare discontinuă (“sistem batch”),

caracterizat prin operarea în şarje, ceea ce presupune încărcarea reactanţilor, iar după un

interval de timp determinat, descărcarea produşilor de reacţie.

Acesta reprezintă o construcţie modulară formată din corpul bioreactorului şi trei

module de automatizare (figura 5).

Corpul bioreactorului este alcătuit din două tronsoane: unul din sticlă, reprezentat de

vasul din sticlă şi unul metalic reprezentat de capacul bioreactorului. Vasul din sticlă are

forma cilindrică şi o capacitate totală de 5 litri (capacitate utilă de 4 litri) este prevazut la

partea superioară cu un capac metalic format dintr-un disc solid de inox fixat de vasul din

sticlă cu ajutorul unui inel metalic.

Pe capac se găsesc montate două buşoane, unul pentru electrodul de pH şi unul pentru

cel de oxigen si 6 racorduri: două pentru introducerea inoculului şi câte unul pentru

evacuarea aerului, pentru prelevarea probelor, pentru traductorul de temperatură şi pentru

intrarea aerului.

- 31 -

Figura 5. Bioreactorul BRAUNVasul de biosinteză este de asemenea prevăzut cu un condensator metalic, vertical,

montat pe capac, având rolul de a condensa vaporii de apă eliberaţi în timpul procesului de

biosinteză din mediul de cultură sau care sunt antrenaţi de aerul ce iese permanent din

bioreactor (în cazul fermentaţiilor aerobe). Picăturile de apă sunt returnate în mediul de

fermentaţie evitându-se astfel o eventuală concentrare a acestuia în timpul biosintezei.

Condensatorul este prevăzut cu o manta de încălzire-răcire, utilizată numai pentru răcire, fiind

cuplată permanent la o sursă de apă rece.

Bioreactorul este prevazut cu un plonjon, dispozitiv cu ajutorul căruia se recoltează

probe din mediul de fermentaţie (prin creşterea presiunii în vasul de biosinteză). Plonjonul

constă într-o ţeavă de inox care intră prin capacul bioreactorului şi ajunge până la fundul

vasului. Pentru o mai bună colectare a probelor, plonjonul este curbat la partea inferioară.

Capacul bioreactorului mai este prevazut cu 4 racorduri de diametru mai mic, utilizate

pentru diverse adaosuri, cum ar fi: soluţie acidă sau bazică bazică, antispumant, componente

de mediu.

Adaosurile se efectuează cu ajutorul a trei pompe peristaltice, anexe bioreactorului şi

grupate într-un modul de sine-stătător. Aceste pompe funcţionează manual sau automat, fiind

prevazute cu tuburi speciale de silicon şi vase de adaos sterilizabile. Principiul de funcţionare

al pompelor peristaltice se bazează pe o mişcare de contracţie şi una de relaxare a tubului de

silicon, ceea ce creează o diferenţă de presiune care asigură deplasarea lichidului din vasul de

adaos în bioreactor, prin tubul de silicon.

Bioreactorul este prevazut cu un rotametru, pentru masurarea debitului de aer furnizat

de compresor. Intre compresor şi rotametru se interpune un filtru de aer prevăzut cu vată de

sticlă (prefiltrare aer); între rotametru şi vasul de cultură este fixat un filtru Millipore

sterilizabil, cu diametrul porilor mai mic de 0,2 mm, care asigură sterilizarea aerului.

Pe capacul bioreactorului este montat şi sistemul de agitare, format dinntr-un motor,

un cuplaj metalic de fixare şi axul agitatorului. Turaţia agitatorului variază între 0-1200 rpm,

- 32 -

la o capacitate a vasului de 5 l. Când vasul de biosinteză este înlocuit cu unul similar, dar de

capacitate de 10 l, turaţia maximă este de 600 rpm.

1.2. Sistemul de automatizare şi control al bioreactorului

a) Modulul de automatizare şi control al agitării

Bioprocesul poate fi condus la o turaţie constantă, care se fixează la început, potrivit

recomandărilor biotehnologului sau la o turaţie variabilă (în anumite perioade de timp).

Turaţia agitatorului pe parcursul biosintezei poate fi programată pe panoul modulului.

b) Modulul de automatizare şi control al parametrilor de proces : temperatură, pH,

agitare, concentraţie de O2 şi antispumant

Pe panoul acestui modul se programează parametrii de bioproces, urmând ca aceştia să

fie menţinuţi la valoarea introdusă iniţial în memoria calculatorului.

c) Modulul de control şi automatizare al pompelor peristaltice (pentru adaosul

soluţiilor necesare corecţiei pH-ului şi soluţii de nutrienţi).

Acest modul cuprinde atât cele trei pompe peristaltice cât şi sistemul de automatizare

aferent. Când se intenţionează adăugarea automată a unei soluţii, programarea pompei se

realizează pe modulul de automatizare şi control. De exemplu, dacă se doreşte menţinerea

pH-ului la o anumită valoare, când acesta se modifică faţă de valoarea prescrisă, pompa

peristaltică se declanşează automat adăugând în mediu soluţie acidă sau bazică pentru

corecţie.

Operaţiile necesare conectării aparatului sunt urmatoarele:

- pregătirea aparatului

- calibrarea pompelor

- după autoclavarea vasului de cultură, conectarea electrozilor

- reglarea parametrilor de masură şi control

Caractensticile tehnice ale bioreactorului sunt urmatoarele:

- capacitate totală: 5 1

- capacitate utilă: 4 1

- debit aer furnizat: 0-240 1/h- 33 -

- temperatura de lucru: 20-600C

- suprapresiune: 0,2-0,5 atm

- presiune de sterilizare: 2 bar

- temperatura de sterilizare: 1200C

- turaţie agitator: 0-1200 rpm

1.3. Pregatirea bioreactorului în vederea efectuării unei şarje de biosinteză

Înainte de efectuarea unei şarje de biosinteză se procedează la sterilizarea

bioreactorului şi a anexelor acestuia după procedeul descris în continuare. Vasul

bioreactorului se demontează şi se sterilizează gol în autoclav la 1200C, timp de 20 minute (o

dată cu bioreactorul se sterilizează şi filtrul de aer). După răcire, vasul bioreactorului se umple

cu mediu de cultură şi se sterilizează in nou prin autoclavare.

După răcire la 20-400C, corpul bioreactorului se aşează pe masa de laborator

asigurand un montaj corespunzator unei bune funcţionari, se fixează motorul şi apoi se

introduc electrozii de pH şi de oxigen.

Se inoculează mediul cu microorganismul specific, în conditii sterile şi se fixează

parametrii de lucru (temperatură, debit de aer, pH, concentraţie de oxigen).

La încheierea procesului, se va decupla instalaţia şi se va proceda la descărcarea,

spălarea şi igienizarea utilajului.

După operaţiile de spălare şi igienizare, vasul se va şterge cu tifon uscat, apoi se vor

curăţa toate racordurile şi se vor unge cu vaselină siliconică numai suprafeţele de etanşare,

pregătind astfel vasul pentru un nou experiment.

1.4. Controlul pH-ului în bioreactor

1.4.1. Noţiuni generale

Într-o soluţie apoasă, concentraţia absolută a ionilor de hidrogen are valori mici şi este

incomod de intrebuinţat în practică. În anul 1909, S. Sorensen, a propus să se folosească

pentru calculul concentraţiei ionior de hidrogen dintr-un mediu lichid, logaritmul zecimal cu

semn schimbat numit exponent de hidrogen sau pH. Astfel, pH-ul se poate defini:

pH = – lg [H3O+] = lg (1 / [H3O+])

În mod analog se defineşte şi exponentul ionilor de hidroxil:

- 34 -

pOH = – lg [HO-] = lg (1 / [HO-])

O soluţie de HCl 1N are o concentraţie a ionilor de hidrogen de 1 ion g/l.

[H3O+] = 1 pH = – lg l = 0

Întrucât produsul ionic al apei este [H3O+] x [HO-] = 10-14,

[HO-] = 10-14 ion g/1

Pentru concentraţia unei baze se poate raţiona în mod analog.

Astfel, rezultă că în solutii apoase, concentraţia ionilor de hidrogen poate varia între 1

si 10-14 ion g/1.

Dacă se logaritmează expresia produsului ionic al apei se obtine:

– lg [H3O+] – lg [HO-] = – lg 10-14

pH + pOH = 14

Cu ajutorul acestei relaţii se poate exprima aciditatea sau bazicitatea unei soluţii apoase.

În concluzie, în soluţiile apoase, pH-ul poate varia între 0 si 14. Într-o soluţie cu pH

zero, concentraţia ionilor de hidrogen este 1, iar cea a ionilor hidroxil este 10 -14. Rezultă astfel

că soluţia este acidă. În mod asemănator, când concentraţia ionilor hidroxil este 1, pH-ul este

14, iar soluţia este bazică. În acest caz, concentraţia ionilor de hidrogen este 10-14.

[H3O+] = 10-7 [HO-] = 10-7 pH = 7

Atunci când concentraţia ionilor de hidrogen este egală cu cea a ionilor hidroxil, pH-ul

este 7, iar soluţia este neutră.

Rezultă că la valori de pH mai mari de 7 soluţiile sunt bazice, iar dacă pH-ul este mai

mic de 7, soluţiile sunt acide. Când pH-ul creşte cu o unitate, concentraţia ionilor de hidrogen

descreşte de 10 ori.

La determinarea pH-ului un factor important îl constituie temperatura de lucru. De

pildă, punctul neutru scade o dată cu creşterea temperaturii. În general, când nu se specifică,

masurarea pH-ului soluţiilor se face la 250C (temperatura ambiantă).

Determinarea pH-ului în soluţie se realizează cu hârtii indicatoare sau cu ajutorul

electrozilor de pH.

1.4.2. Electrodul de pH-IngoId

Principiul de acţiune

Determinarea pH-ului cu ajutorul electrozilor se realizează prin măsurarea

potenţialului de electrod al pilelor. Forţa electromotoare a unei pile se datorează diferenţelor

- 35 -

de potenţial apărute la interfaţa electrod-soluţie. Această diferenţă de potenţial se numeşte

potential de electrod şi apare deoarece ionii metalici din soluţie au un potenţial diferit faţă de

cel al ionilor din metal, astfel că între aceştia se stabileşte un echilibru.

Întrucât potenţialul unui singur electrod nu se poate determina se alege prin convenţie

un electrod de referinţă, al cărui potenţial, se consideră zero. Ca electrozi de comparaţie se

folosesc frecvent electrodul de hidrogen, electrodul de calomel, etc.

În anul 1947, dr. Werner Ingold a introdus pe piaţă modelul electrozilor combinaţi,

aceştia fiind utilizaţi astăzi în toată lumea. În electrodul combinat, electrodul de sticlă şi cel de

referinţă formează un corp comun. Electrodul de referinţă înconjoară electrodul de sticlă

coaxial, iar electrolitul vine în contact electric cu proba prin intermediul unei membrane.

Electrozii combinaţi sunt de obicei formaţi din electrozi de calomel sau de argint. În

cazul electrozilor sterilizabili, utilizaţi la măsurarea pH-ului în bioreactoare, se foloseşte

electrodul de argint. Acesta se notează simbolic prin:

Ag / AgCl solid / KCl (soluţie) sau HCl

Electrodul de argint constă dintr-o placă de argint, în contact cu clorură de argint, în

soluţie de acid clorhidric. La electrod au loc reacţii inverse, mai întâi de dizolvare a argintului

solid şi reacţia lui cu ionii de clor pentru a forma clorura de argint, insolubilă, pentru ca apoi

clorura de argint să se dizolve şi să reformeze argintul solid.

Ag ↔ Ag+ + e-

Ag+ + Cl- ↔ AgCl

Reacţia globală devine: AgCl + e- ↔ Ag + Cl-

Clorura de potasiu care înconjoară electrodul împiedică creşterea concentraţiei ionilor

de argint la electrozi, care ar putea face electrodul mai pozitiv şi l-ar polariza.

În biotehnologie, pH-ul constituie un parametru biochimic deosebit de important

pentru desfăşurarea diferitelor procese biologice, ceea ce impune controlul şi corecţia lui

permanentă la valoarea indicată în tehnologie.

- 36 -

Figura 6. Electrodul de pH Ingold

Păstrarea electrodului

Pentru o bună funcţionare, electrodul de pH nu se păstrează în atmosferă uscată (în aer

liber), ci se menţine permanent în soluţia electrolitului de referinţă (KCl).

După o perioadă lungă de stocare, membrana de sticlă trebuie reactivată cu acid

fluorhidric procedându-se astfel: membrana electrodului se introduce 1 minut, într-o soluţie

concentrată de acid fluorhidric, apoi se menţine 12 ore în soluţia stoc.

Calibrarea electrodului de pH aferent bioreactorului Braun

Electrodul de pH trebuie calibrat, înainte de a-l folosi într-un proces de fermentaţie în

bireactor. Electrodul de pH Ingold utilizat pentru controlul pH-ului în bioreactor este

sterilizabil (suportă sterilizare termică umedă).

Calibrarea electrodului de pH se realizează la temperatura de fermentaţie. Pentru

calibrare, se utilizează două soluţii tampon de pH cunoscut. În general, se folosesc o soluţie

acidă cu pH=4,1 şi o soluţie neutră cu pH=7.

Procedeul de calibrare a electrodului se realizează prin parcurgerea mai multor etape:

1. Se scoate electrodul din soluţia de stocare şi se spală cu apă distilată, cu ajutorul unei

pisete;

2. Se introduce electrodul în soluţia tampon de pH =4, se selectează canalul “Calibrare”,

se stabileste valoarea 4,1 pentru prima soluţie tampon (BUF Z) şi se confirmă cu “Enter“.

Sistemul de automatizare înregistrează această valoare ca fiind pH=4,1. Când valoarea

înregistrată pe panou este 4,1 se confirmă din nou cu “Enter“;

3. Se scoate electrodul din soluţia tampon cu pH=4,1, se spală cu apă distilată şi se

introduce în soluţia cu pH=7. Se selectează pe canalul “Calibrare” funcţia corespunzatoare

- 37 -

celei de-a doua soluţii tampon (BUF S) şi se confirmă cu “Enter“. Sistemul de automatizare

înregistrează această valoare ca fiind pH=7. Dacă semnalul măsurat şi înregistrat pe panoul de

comandă este constant şi egal cu 7, se confirmă din nou cu “Enter“;

4. Se selectează pe canalul “Calibrare” funcţia corespunzatoare “pantei” (Slope). Cele

două puncte înregistrate formează o dreaptă a cărei pantă trebuie să aibă o anumită valoare. În

momentul selectării funcţiei “Slope” se introduce o valoare cuprinsă între 54-60 mV si se

confirmă cu “Enter“.

1.5. Măsurarea concentraţiei de oxigen din mediul de fermentaţie

1.5.1. Noţiuni generale

Relaţia de echilibru între presiunea totală şi presiunea parţială de oxigen este dată de

legea lui Henry:

pAG = pT x yAG = H x CAL (1)

unde: pAG = presiunea parţială a componentului A în gazpT = presiunea totală a gazuluiyAG = fracţia molară a componentului A în amestecul gazosH = constanta lui Henry, care este funcţie de temperatura de lucru şi este tabelatăCAL = solubilitatea componentului gazos A în lichid, de asemenea tabelată în funcţie de

temperatura de lucru

Din ecuaţia (1), rezultă că la creşterea presiunii totale a gazului sau a concentraţiei de

oxigen în amestecul gazos, în condiţii de temperatură constantă, solubilitatea componentului

gazos în lichid creşte peste valoarea de echilibru ceea ce se concretizeză, în final, printr-o

intensificare a transferului de masă dintre cele doua faze.

De multe ori, în procesele de fermentaţie care necesită o aerare intensă, se introduce

aer îmbogăţit în oxigen pentru îmbunătăţirea transferului de masă dintre cele două faze.

1.5.2. Electrodul de oxigen

Concentraţia oxigenului dizolvat în fermentatoare se măsoară, în mod uzual, cu

ajutorul unui electrod de oxigen.

- 38 -

Există două tipuri constructive pentru un astfel de electrod:

1. electrozi galvanici

2. electrozi polarografici

La ambele tipuri, o membrană permeabilă pentru oxigen separă fluidul de fermentaţie,

de electrodul de măsură.

Principiul de acţiune

Oxigenul difuzează prin membrană la catod, unde reacţionează şi produce un curent

electric între anod şi catod, proporţional cu presiunea parţială a oxigenului în mediul de

fermentaţie.

Schema transferului de oxigen din mediu la catodul electrodului de masură

În funcţie de debitul de alimentare a mediului, de proprietăţile fizico-chimice ale

lichidului şi de proporţia de utilizare a oxigenului de către microorganisme, stratul de lichid

ce înconjoară membrana de măsură a electrodului formează o interfaţă între electrodul solid şi

lichidul de măsurat.

După cum rezultă si din figura 7, eliberarea şi transmiterea moleculelor de oxigen din

mediu spre catod se realizează prin procese de transfer de masă. Întrucât nu există o mişcare

propriu-zisă a fluidului prin membrană sau prin soluţia de electrolit, ci există o mişcare redusă

prin pelicula de lichid de la interfaţa membranei, în cazul operării cu sonda electrodului

oxigenul difuzează prin grosimea acestei pelicule de lichid. Acest proces necesită o perioadă

mai lungă de timp şi este cunoscut sub denumirea de timp de răspuns al electrolitului. Durata

acestuia poate fi masurată prin transferarea rapidă a sondei dintr-un mediu saturat cu azot

într-un saturat cu oxigen. Timpul de răspuns este definit ca timpul necesar aparatului pentru a

- 39 -

indica 63% din valoarea totală a concentraţiei de oxigen dizolvat în mediul de masurat.

Electrozii comercializaţi la ora actuală au timpi de răspuns cuprinşi între 10-100 secunde.

Timpul de răspuns al electrodului de oxigen poate fi îmbunătăţit prin urmatoarele

acţiuni:

- agitarea intensă a lichidului în care se măsoară concentraţia de oxigen dizolvat

- micşorarea grosimii peliculei de lichid de la suprafaţa membranei

- micşorarea catodului, deci a cantităţii de oxigen consumat, prin utilizarea de

microsonde

Ambele tipuri de electrozi, galvanic si polarografic, măsoară, presiunea parţială

a oxigenului sau tensiunea de oxigen în mediul de fermentaţie şi nu direct concentraţia de

oxigen dizolvat.

Pentru convertirea acestora în concentraţie de oxigen dizolvat este necesară

cunoaşterea solubilităţii oxigenului în lichidul de măsurat, la temperatura şi presiunea la care

au loc măsurătorile.

Determinarea concentraţiei de oxigen din mediile de fermentaţie se realizează cu

ajutorul unui electrod tip Mettler Toledo. Acest se compune din:

a) Senzorul de baza Clark, polarografic, care constă dintr-un electrod de lucru

(catodul), un electrod de numărare şi unul de referinţă (anodul) şi o membrană permeabilă

pentru oxigen, care separă electrodul, de mediul analizat.

b) Transmiţătorul, care se aplică la catod (tensiune de polarizare) şi asigură un voltaj

între 550 si 750 mV.

c) Moleculele de oxigen care migrează prin membrana permeabilă. Acestea sunt

reduse la catod. În acelaşi timp, la anod are loc un proces de oxidare, unde metalul anodic

oxidat este transferat în electrolit. Electrolitul închide circuitul electric dintre anod si catod

(conductivitate ionică).

Curentul produs de reacţia descrisă la punctul c) este măsurat de transmiţător. Acest

curent este proporţional cu presiunea parţială de oxigen din mediul de cultură.

Operarea electrodului

Cand se lucrează prima dată cu sistemul sau când senzorul a fost deconectat de la sursa

de tensiune pentru o durată mai mare de 5 sau 10 minute, acesta trebuie polarizat înainte de

calibrare, prin conectare la transmiţătorul de oxigen sau la un modul de polarizare Mettler.

- 40 -

Senzorul este polarizat şi gata de operare după 6 ore de polarizare. Mai puţin de 6 ore vor fi

suficiente dacă senzorul a fost deconectat numai pentru câteva minute.

Calibrarea electrodului

Electrodul trebuie recalibrat înainte de fiecare măsuratoare. Dacă senzorul lucrează cu

un transmiţător Mettler tip 170, este suficientă numai o calibrare simplă într-un punct, într-un

mediu saturat cu oxigen sau într-o incintă cu aer saturat în vapori de apă. Aducerea la zero nu

este necesară.

Dacă lucrul se desfaşoară în condiţii sterile, sistemul trebuie calibrat după sterilizare,

deoarece temperatura poate modifica panta senzorului. După răcire, fermentatorul este aerat.

La calibrare, dupa ce semnalul s-a stabilizat, se ajusteaza potentiometric "panta" pentru a

aduce pe ecran valoarea dorită. Modificarea pantei poate atinge câteva procente când se

utilizează un modul cu membrana nouă. Modificarea pantei este de obicei foarte mică.

Exemple:

• Transmiţător Mettler tip 170% aer; domeniu "mediu" → valoare setată pe display la

100% saturare aer;

• Transmiţător Mettler tip 170% O2, domeniu "mediu" → valoare setată pe display la

20,9% saturare O2;

• Transmiţător Mettler tip 170% O2 ppm, domeniu "mediu" → valoare setată pe

display la 11,25 mg O2/l apa la 10°C si 1013 mbar/1 atm.

Dacă senzorul lucrează cu alte tipuri de transmiţători Mettler trebuie efectuată o

calibrare în 2 puncte. În mod particular, aceasta se recomandă pentru măsurători la presiuni

parţiale de oxigen foarte scăzute.

În timpul calibrării punctului zero, senzorul trebuie sa fie plasat într-un gel de punct

zero sau într-un alt mediu care nu conţine oxigen (ex. 99,98% azot sau dioxid de carbon).

Dacă soluţia analizată poate fi eliberată complet de oxigen prin saturare cu azot sau dioxid de

carbon, aceasta poate fi utilizată drept etalon pentru calibrarea punctului zero. Dupa 10

minute citirea ar trebui sa fie stabilă şi punctul zero poate fi setat. Calibrarea pantei poate fi

efectuată în apă saturată cu aer sau într-o incinta cu aer saturat în vapori de apa. Verificarea

calibrării se face periodic pentru validarea punctului zero, cu ajutorul unui simulator de

oxigen Mettler.

Intretinerea electrodului

- 41 -

Înainte de fiecare calibrare se inspectează vizual membrana pentru a evidenţia

eventuale deteriorări. Dacă membrana este murdară, aceasta se şterge cu atenţie, utilizând o

bucată de cârpă moale, fină. În funcţie de natura mediului, electrolitul poate fi schimbat

periodic. Acesta nu ar trebui utilizat mai mult de 6 luni.

Modulul membranei trebuie schimbat când arată semne de îmbătrânire sau dereglări

cum ar fi:

- un timp de răspuns prea mare

- citiri zgomotoase sau eronate

- imposibilitatea de a fi calibrat

- distrugeri mecanice

Inspectarea electrodului

Se recomandă măsuratori periodice ale punctului zero pentru verificarea funcţionării

corecte a senzorului. Aceasta se poate face utilizând gelul de zero sau gaze pure (99,98% azot

sau dioxid de carbon).

După 1 minut într-un mediu liber de oxigen senzorul ar trebui să afişeze mai puţin de

10% din conţinutul în oxigen al aerului şi după încă 10 minute, mai puţin de 1% din valoarea

dedusă a oxigenului din aer. Valori mai mari sugerează o distrugere a electrolitului sau a

membranei.

Păstrarea electrodului

Electrodul poate fi păstrat câteva luni, asigurându-ne că este plin cu oxigen electrolitic

şi că membrana este acoperită cu manşonul de protecţie. Pentru a evita polarizarea, senzorul

poate fi păstrat la un modul de depozitare Mettler.

- 42 -


OBŢINEREA UNUI PREPARAT BIOLOGIC CU LACTOBACILLUS PLANTARUM

În ultimii ani s-a extins tot mai mult folosirea preparatelor biologice ca aditivi pentru

stimularea proceselor fermentative acido-lactice, favorabile din silozuri. Aceste preparate se

obţin cu ajutorul bacteriilor acido-lactice şi propionice, drojdiilor şi enzimelor.

Microorganismele au capacitatea de a se multiplica foarte rapid răspândindu-se în toată masa

silozului, cu producerea unei fermentaţii acido-lactice eficiente în procesul de conservare. În

plus, în momentul consumării acestor produse intervine şi un efect probiotic. Utilizarea

acestor microorganisme se poate realiza fie prin administrarea directă în hrană, fie prin

adaugare în nutreţ, încă de la însilozare.

Obţinerea biomasei de Lactobacillus plantarum la nivel micropilot presupune

parcurgerea următoarelor etape:

- prepararea inoculului laborator

- fermentaţia micropilot

- prelucrarea mediului de fermentaţie

- determinarea cantitativă a biomasei şi caracterizarea fizico-chimică a produsului obţinut

1.1. Obţinerea culturii de Lactobacillus sp. în bioreactor

Culturile de Lactobacillus plantarum sunt obţinute şi prelucrate în funcţie de materiile

prime utilizate şi de temperatura la care se face fermentaţia.

Prepararea inoculului de laborator

Materii prime si materiale:

- cultură stoc de Lactobacillus plantarum

- ansă

- pipete sterile

- ser fiziologic steril

Compoziţia mediului nutritiv utilizat pentru prepararea inoculului:

- glucoză 2%

- (NH4)HPO4 0,1%

- 43 -

- peptonă 0,5%

- CaCO3 1% , pH = 5,5

Mod de lucru:

Se recoltează cu ansa cultură de Lactobacillus plantarum şi se însămânţează 25 ml

mediu de cultură sterilizat. Se incubează la 400C, timp de 24 de ore, static, în condiţii de

anaerobioză.

Fermentaţia în bioreactor


- inocul de Lactobacillus plantarum

- pipete sterile

- bioreactor cu mediu lichid steril

Compoziţia mediului nutritiv utilizat în bioreactor:

- glucoză 2%

- (NH4)HPO4 0,1%

- peptonă 0,1%

- CaCO3 1%

pH = 5,5

Mod de lucru:

Se prepară 3000 ml mediu de cultură care se introduce în bioreactor. Se închide etanş

bioreactorul, se introduce în autoclav şi se sterilizează la 1200C, timp de 20 de minute. După

răcire, mediul astfel pregătit şi sterilizat se inoculează cu inocul de laborator, iar apoi se

fixează parametrii de lucru la: 400C, pH=5,5, fără aerare, agitare 20 rpm, timp de 24 ore.

Pe parcursul şi la sfârşitul fermentaţiei se determină următorii parametrii:

- D.O. la 570 nm - la 8, 16, 24 ore (se urmăreşte o cantitate cât mai mare de lactobacili

pentru a realiza conservarea furajelor)

- aspectul microscopic şi puritatea culturii

- concentraţia în glucoză prin metoda enzimatică (conform metodei descrise la pct.

6.2.1.2.2.)

- 44 -

1.2. Prelucrarea mediului de fermentaţie

După încheierea procesului de fermentaţie, prima operaţiune în cadrul prelucrării

post-biosinteză este reprezentată de separarea biomasei acido-lactice din mediul lichid, prin

centrifugare. Aceasta se realizează cu ajutorul separatoarelor centrifugale de turaţie mare

(4000-5000 rpm). După centrifugare, bimasa umedă se usucă până la greutate constantă.

Materiale necesare:

- mediu de fermentaţie obţinut în bioreactor

- etuvă, tăvi de uscare

- centrifugă

Mod de lucru:

După terminarea fermentaţiei, mediul de cultură din bioreactor este măsurat şi apoi

repartizat în cuve de centrifugă, tarate în prealabil. Centrifugarea se efectuează la 4000 rpm,

timp de 20 min, la rece.

La sfârşitul operaţiei de centrifugare se cântăreşte şi se colectează biomasa umedă

cu ajutorul unei spatule, se aşează în tăvi de uscare şi se usucă în etuvă, la 1050C, sub curent

de aer. Se cântăreşte cantitatea totală de biomasă uscată obţinută, iar apoi se analizează din

punct de vedere fizico-chimic, în vederea caracterizării preparatului obţinut.

- 45 -


OBTINEREA ENZIMELOR CELULOZOLITICE CU TULPINI DE

STREPTOMYCES SP.

Celulazele sunt enzime care catalizează hidroliza legaturilor β-1,4-glicozidice din

molecula celulozei. Ele sunt compuse dintr-un amestec complex de proteine enzimatice, cu

diferite specificităţi de hidroliză a legăturilor glicozidice. În funcţie de activitatea lor

enzimatică, enzimele celulozolitice pot fi împărţite în trei clase majore:

- endoglucanaze sau endo-β-1,4-glucanaze (E.C.3.2.1.4)

- celobiohidrolaze (E.C.3.2.1.91)

- β-glucozidaze (E.C.3.2.1.21)

celulaza-C1 celulaza-Cx β GlucozaCeluloza nativa Celuloza modificata Celobioza

-glucozidaza

Schema de degradare biologică a celulozei native

Studii efectuate pe diverse materiale biologice au identificat aceste enzime la o serie

de microorganisme, Myrothecium verrucaria, Tricoderma viride precum şi la nevertebrate

capabile să utilizeze celuloza ca hrană, în special moluste (Helix pomatra, Limax flavus).

Ierbivorele, datorită modului de nutriţie strict vegetarian, sunt direct dependente de

prezenţa unei microflore celulozolitice la nivelul tubului digestiv care să realizeze

descompunerea celulozei în glucide uşor asimilabile.

Frecvent asociate cu enzimele celulozolitice se găsesc hemicelulazele. Acestea sunt

enzime care participă la degradarea hidrolitică a hemicelulozelor (componente ale celulelor

vegetale, care însotesc celuloza).

Din punct de vedere practic, preparatele celulozolitice pot fi utilizate pentru

prelucrarea materiilor prime celulozice, în industria alimentară, textilă, a hârtiei, în

agricultură, în reciclarea deşeurilor menajere.

Printre cele mai importante aplicaţii practice ale acestor enzime se menţionează:

- creşterea randamentului de extracţie a diferitelor substante prin degradarea pereţilor

celulelor vegetale

- grăbirea proceselor de fermentaţie la unele produse alimentare prin disponibilizarea

glucidelor reducatoare din materiile lignocelulozice

- prelucrarea furajelor brute în vederea creşterii coeficientului de asimilare- 46 -

Prepararea inoculului de Streptomyces sp.:


- cultură stoc de Streptomyces sp.

- ansă

- pipete sterile

- ser fiziologic steril

Compoziţia mediului de cultură pentru prepararea inoculului de laborator:

- NH4H2PO4 0,2 %

- KH2PO4 0,06 %

- K2HPO4 0,04 %

- MgSO4x7H2 0,05 %

- CaCO3 0,01 %

- MnSO4x 4H2O 0,0005 %

- Extract de drojdie 0,1%

- Carboximetilceluloza (CM-celuloza) 1%

pH = 5-5,5

Mod de lucru:

Mediul sterilizat se inoculează cu o tulpină selecţionată de Streptomyces în stare

vegetativă. Inoculul se dezvoltă timp de 72 h, la 350C.

Fermentaţia în bioreactor:


- inocul de Streptomyces


- pipete sterile

Mediul de cultură pentru biosinteza celulazelor conţine:

- tarâţe de grâu 3 %

- şrot soia 1,5%

- glucoză 1,428 %

- fosfat monopotasic 0,4 %

- sulfat de magneziu 0,02 %

pH=5-5,5, volum = 3 l

- 47 -

Mod de lucru:

Mediu de fermentaţie sterilizat din bioreactor Mediul se inoculează în raport de 10%

cu inocul de laborator şi se incubează în condiţii de agitare la 220 rpm, aerare180 1 aer/h, la

350C, timp de 48 de ore.

Parametrii biochimici urmariţi:

- pH

- activitate celulozolitică

Determinarea activităţii celulozolitice

Principiul metodei

Metoda se bazează pe reacţia la cald a glucidelor reducătoare formate în urma

hidrolizei enzimatice a carboximetil-celulozei (CMC), cu reactivul dinitrosalicilic (DNS).

Compusul rezultat, de culoare cărămizie, se determină spectrofotometric la λ=640 mn,

intensitatea culorii fiind direct proporţională cu concentraţia glucidelor în proba de analizat.

O unitate de activitate celulozolitica (UE) este acea cantitate de enzimă care în

condiţiile metodei, eliberează dintr-o soluţie de CM-celuloză, o cantitate de glucide

reducătoare care dau cu reactivul DNS aceeaşi D.O., ca cea a 1 mg de glucoză.

Reactivi:

- CM-celuloza 1% în tampon pH=6,4

- soluţie tampon fosfat acid de sodiu 0,2N-acid citric 0,1N, pH=6,4

- reactiv dinitrosalicilic (DNS)

Mod de lucru:

In două eprubete se pipetează astfel:Probă Martor

- 2 ml soluţie substrat CM-celuloză 1%

- 0,2 ml soluţie enzimă

- 2 ml soluţie substrat CM-celuloză 1%

- 3 ml DNS- 0,2 ml soluţie enzimă

Incubare 10 minute la 500C- 3 ml DNS

Incubare de 15 minute la fierbereCitire D.O. la 640 nm faţă de martor


U/ml = (mg glucoză probă - mg glucoză martor) x 5x l/10

unde: 5 = factor de transformare pentru 1 ml enzimă1/10 = timp incubare

- 48 -


OBŢINEREA ŞI CARACTERIZAREA UNUI PREPARAT PROTEAZIC DIN

BACILLUS SUBTILIS

Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de

proteaze alcaline (EC 3.4.2.1. proteaze serinice) şi proteaze neutre (EC 3.4.2.4.

metaloproteaze). Aceste diferă între ele prin proprietăţi distinctive:

- proteazele serinice au în centrul catalitic activ serina şi histidina. Din acest grup mai

fac parte şi subtilizinele sau subtilopeptidazele care sunt produse în general de bacterii

din genul Bacillus, numindu-se bacilopeptidaze;

- metaloproteazele sunt proteaze activate de ioni metalici legaţi la centrul catalitic activ

al enzimei (Ca2+ Zn2+, Mg2+, Fe2+). Ele pot fi metaloproteaze neutre şi alcaline.

Culturile de Bacillus subtilis sunt obţinute şi prelucrate în funcţie de mediile de cultură

utilizate şi tehnicile de cultivare specifice.

Fermentaţia în bioreactor


- inocul de Bacillus subtilis


- pipete sterile

Pentru cultivare în bioreactor se utilizează următoarea formulă de mediu nutritiv:

- făină de porumb 2%

- srot soia 3%

- (NH4)2HPO4 0,9%

- MgSO4 x 7H2O 0,05%

pH = 6,5, volum = 3000 ml

Mod de lucru:

Se preparară inoculul de laborator prin însămânţarea a 25 ml bulion nutritiv, care cu o

cultură vegetativă de Bacillus subtilis. Cultura se dezvoltă 24 ore, sub agitare, la 35°C.

După sterilizarea şi răcirea mediului din bioreactor, acesta se însămânţează cu inocul

de Bacillus subtilis şi se incubează la 370C, debit aer 1l aer/l mediu/min, pH=7.

- 49 -

Determinarea activităţii proteolitice a proteazelor de Bacillus subtilis

Principiul metodei

Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson, modificată pe substrat de

cazeină, metodă descrisă în catalogul firmei Merck [12].

O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în

condiţiile de reacţie eliberează 1 μmol tirozina în unitatea de timp.

Reactivi:

- soluţie cazeină 1% in tampon fosfat 0,05 M, pH=8

- soluţie TCA 5%

- soluţie NaOH 0,5N

- reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat 1:3)

Mod de lucru:

Se urmează schema de lucru descrisă în continuare:

Proba Martor- 1 ml caseină 1% în tampon fosfat- 0,5 ml enzimă

- 1 ml caseină 1% în tampon fosfat- 2 ml TCA 5% - 0,5 ml enzimă

Incubare 10 minute, la 350C- 2 ml TCA 5%

Filtrare- 1 ml filtrat - 2 ml NaOH 0,5N - 0,5 ml Folin-Ciocâlteu (diluat 1:3)

- 1 ml filtrat - 2 ml NaOH 0,5N - 0,5 ml Folin-Ciocâlteu (diluat 1:3)

Incubare, 10 minute, la 350CCitire extincţie la 660 nm

Interpretarea rezultatelor:

Din mediul de cultură din bioreactor, se iau probe din 8 în 8 ore şi se determină

activitatea proteolitică.

A [μmoli Tyr/ml preparat enz./min] = (μmoli Tyrproba–μmoli Tyrmartor) x 3,5 / (10 x 0,5 x 1,0)

unde: μmoli Tyr = μmoli determinati din curba de etalonare pentru tirozina0,5 = volumul de enzima luat în lucru (ml)1,0 = volumul filtratului luat in lucru (ml)3,5 = volumul total luat in lucru (ml)10 = timpul de incubare (min.)

- 50 -


OBŢINEREA DE ENZIME AMILOLITICE CU TULPINI DE BACILLUS SP.

Amilazele sunt enzime hidrolitice care catalizează scindarea legăturilor -1,4-

glicozidice din macromolecula amidonului, glicogenului, oligo şi polizaharidelor înrudite.

Hidroliza amidonului de realizează sub acţiunea unui complex enzimatic format dintr-

un amestec de 4 enzime, care acţionează diferit asupra substratului:

- -amilazele (-1,4-D-glucan glucanohidrolază) – catalizează hidroliza legăturilor

glicozidice situate în interiorul lanţului poliglucidic (endo-amilaze) până la dextrine şi

maltoză, ceea ce conduce la lichefierea şi reducerea vâscozităţii amidonului (amilază

lichefiată)

- β-amilazele (-1,4-D-glucan maltohidrolază) – acţionează la capătul nereducător al

lanţului polizaharidic eliberând resturi de maltoză (exo-amilaze)

- amiloglucozidaza (γ-amilază, glucan -1,4-glucozidază, glucoamilază) – catalizează

hidroliza legăturilor glicozidice -1,4 de la capătul nereducător al lanţului poliglucidic si a

celor -1,6 din structura amilopectinei cu formare de glucoză

- maltaza catalizează hidroliza maltozei în glucoză

amidon amilodextrine şi eritrodextrine acrodextrine

maltodextrine maltoză glucoză

-amilazele se gasesc în boabe de cereale germinate, în culturi de fungi de Aspergillus

oryzae, Aspergillus niger, culturi bacteriene de Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,

Bacillus polymyxa şi Clostridium acetobutylicum şi la animale, în pancreasul de porc,

pancreas sau salivă umană

β-amilazele se gasesc numai în plantele superioare, cereale germinate şi negerminate,

cartofi dulci şi boabe de soia.

Dintre numeroasele aplicaţii practice ale amilazelor microbiene putem enumera:

- în panificaţie, pentru ameliorarea calităţii făinii

- în industria de detergenţilor, pentru îndepărtare urmelor de amidon de pe haine

- în industria berii, pentru zaharificarea plămezilor amidonoase

- în industria alimentară, la clarificarea sucurilor de fructe şi obţinerea siropului de

glucoză

- 51 -

- obţinerea de malto-dextrinelor

Dintre enzimele amilolitice, doar -amilaza şi amiloglucozidaza pot fi obţinute la

nivel industrial prin biosinteză. Microorganismele capabile să producă enzime amilolitice sunt

bacteriile (Bacillus, Pseudomonas, Clostridium) şi mucegaiurile (Rhizopous, Aspergillus,

Endomyces).


Mod de lucru:

Se recoltează cu ansa, steril, o cantitate de cultură de Bacillus globigii dezvoltată pe

mediu solid şi se face o suspensie omogenă în 10 ml bulion nutritiv. Această suspensie

reprezintă inoculul folosit la însămânţarea mediul de biosinteză.

Materii prime şi materiale:

- amidon, făină de soia, clorură de calciu, fosfat monopotasic, sulfat de magneziu,

amestec sulfocromic, soluţie de iod în KI

- cultură inocul

- balon Erlenmayer de 500 ml, baloane Erlenmeyer de 50 ml, pipete gradate, baghetă de

sticlă, pH-Box, autoclav, balanţă, pahare Berzelius, pipete, cilindru gradat

Fermentaţia la baloane agitate

Mod de lucru:

Mediul de cultură utilizat are următoarea compoziţie:

- amidon 2%

- făină de soia 0,5%

- CaCl2 0,1%

- KH2PO4 0,1%

- MgSO4 0,01%

pH = 6,5

Se cântăresc cantităţile necesare pentru prepararea mediului de cultură. Din volumul

total de apă distilată, necesar preparării mediului de cultură, se iau câţiva ml în care se dizolvă

amidonul, până se obţine o probă omogenă. Peste soluţia de amidon se adaugă încă o porţie de

apă caldă şi se amestecă. Amidonul astfel preparat, se adaugă în balonul Erlenmeyer în care

se prepară mediul de cultură. Se adaugă pe rând şi celelalte componente, amestecându-le bine

- 52 -

şi se aduce mediul la volumul dorit cu apă distilată. Se verifică pH-ul mediului şi se

corectează dacă e nevoie cu soluţie NaOH 40% sau HCl 1N.

Din volumul total de mediu, se reţin 10 ml pentru identificarea prezenţei amidonului,

cu soluţie de iod.

Mediul astfel preparat, se sterilizează prin autoclavare, la 1100C, 20 de minute. După

răcire, se însămânţează cu inocul de Bacillus globigii şi se incubează sub agitare, la 300C,

timp de 72 ore. Pe parcursul bioprocesului, se prelevează probe în care se determină

activitatea amilolitică, precum şi ceilalţi parametrii de control indicaţi în tehnologie.

1. Controlul interfazic al bioprocesului de obţinere a enzimelor amilolitice

1.1. Identificarea amidonului cu soluţie de iod

Într-o eprubetă curată se introduc 2 ml mediu de cultură peste care se adaugă o

picătură soluţie de iod. Apariţia culorii albastre evidenţiază prezenţa amidonului.

Pe parcursul procesului de biosinteză, cantitatea de amidon scade treptat din mediu,

datorită sintezei de amilaze de către microorganisme. Acest fenomen poate fi evidenţiat prin

reacţia cu iod, care la sfârşitul procesului de biosinteză este negativă.

1.2. Determinarea activităţii amilolitice

Principiul metodei

Determinarea activităţii enzimatice a amilazei se efectuează printr-o metodă

spectrofotometrică, bazată pe determinarea maltozei rezultate în urma acţiunii enzimei asupra

substratului său specific, amidonul, printr-o reacţie de culoare caracteristică acestuia.

Reactivul folosit pentru evidenţierea produsului reacţiei enzimatice este acidul 3,5-

dinitrosalicilic, care formează cu maltoza un compus colorat a cărei absorbţie în vizibil se

determină spectrofotometric, la =546 mn

Reactivi:

- soluţie tampon fosfat 0,2 M, pH=6,9

- soluţie amidon 1% în tampon fosfat 0,2 M, pH=6,9

- reactiv DNS: 10 g DNS se dizolvă la cald în 300 ml apă distilată, se adaugă 400 ml

soluţie NaOH 1N şi 300 g tartrat de Na şi K; se aduce la 1000 ml cu apă distilată

- 53 -

- soluţie etalon de maltoză 0,2%

Mod de lucru:

În două eprubete se pipetează conform schemei descrise în continuare.

Proba Martor- 0,5 ml soluţie tampon fosfat 0,2 M, pH=6,9- 1 ml soluţie amidon 1%- 0,5 ml probă

- 0,5 ml soluţie tampon fosfat 0,2 M, pH=6,9- 1 ml soluţie amidon 1%- 2 ml DNS - 0,5 ml probă

Incubare la 30oC, 10 minute- 2 ml reactiv DNS -

Incubare la 1000C, 5 minuteRacire şi diluare până la 12 ml cu apă distilată

Citire E546 nm


m x D Unităţi DNS /ml =

e x 10

unde: m = moli maltoză, determinaţi din curba de etalonare (moli maltoză probă - moli maltoză martor)

D = factorul de diluţiee = ml soluţie probă luaţi în lucru

10 = timpul de incubare

Trasarea curbei de etalonare pentru maltoză

Mod de lucru:

Din soluţia etalon de maltoză 0,2% se pipetează în 6 eprubete după cum urmează:

Eprubetănr.

Soluţie maltoză(ml)

Apă distilată(ml)

Concentraţie maltozămol

1 - 2,1 -2 0,4 1,7 2,243 0,8 1,3 4,484 1,2 0,9 6,725 1,6 0,5 8,966 2,0 0,1 11,2

În fiecare eprubetă se adaugă câte 2 ml DNS, apoi se menţin pe baie de apă la fierbere

5 minute. Se răcesc, se diluează până la 12 ml cu apă distilată şi după 20 minute li se

determină extincţia la 546 nm,.

Datele obţinute se reprezintă grafic, trecând pe abscisă concentraţia de maltoză şi pe

ordonată extincţia..

- 54 -

sdadas

Documents

Transcript of sdadas