"Integrarea si interpretarea analizelor genetice si epigenetice in abordarea nutrigenomica a starii patologice."

Natalia Cucu (Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Departamentul de Genetica)Lucian Radu, Simona Litescu, Camelia Albu (Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Stiinte Biologice, Centrul de Bioanalize), Bucuresti-Radu Stefanescu, Daniela Nedelcu, Cosmin Arsene- GenXplore, Bucuresti-Pavel Chirila - Naturalia, Bucuresti-Tatiana Onisei- Phytogentec, Bucuresti

Metodele genetice si epigenetice capata actualmente o importanta din ce in ce mai evidenta in studiul starii patologice. Mai mult, abordarea nivelului informational ereditar aditional, epigenetic, implica integrarea unui element cheie, pana recent neglijat, si anume, influenta mediului, respectiv al dietei, nutritiei, poluarii. Mutatiile, precum cele punctiforme, care caracterizeaza polimorfismele de tip SNP (single nucleotide polimorphisms) in gene particulare, a caror expresie este cruciala in cai metabolice cheie pentru mentinerea sanatatii organismului, dar si a stabilitatii genomice sunt astazi frecvente abordate intr-un nou algoritm de diagnostic al numeroase boli, precum cancerul, bolile de reproducere si infertilitatea, bolile metabolice si neurodegenerative. Alaturi de acestea, factorii particulari non-mendelieni, epigenetici, sunt buni informatori ai efectelor pe termen lung al expunerii ambientale in decursul vietii indivizilor si, surpinzator, dar evident azi, in decursul vietii parintilor si bunicilor/strabunicilor.Nutrigenomica, relatia dintre mediu si genom, este asadar un domeniu extrem de tanar, care ofera oportunitatea evaluarii, alaturi de factorii genetici si epigenetici, potentialul pe care il are nutritia, alimentele si dieta, in general (care cuprinde asadar si stilul de viata) in mentinerea stabilitatii genomice, in diagnosticul unor stari patologice si in regandirea strategiilor de tratamente, in cadrul carora aspectul de personalizare si preventie este definitoriu.

Paralel cu studiile de nutritie, domeniul genomicii a luat o amploare exploziva in ultimele doua decade, mai cu seama prin intermediul aplicatiilor biologiei moleculare, ocupand actualmente locul central in majoritatea sectoarelor de activitate umana, incluzand in mod special sanatatea. Relatia care s-a stabilit in acest nou context dintre dieta si organismul uman se referea la intelegerea reactivitatii specifice a organismului uman fata de anumite conditii de mediu, respectiv, evident, fata de anumite tipuri de dieta. Actualmente, nutrigenomica este domeniul care se ocupa cu studiul raspunsului indivizilor la o anumita alimentatie, prin corelarea acesteia cu genotipul individual. O astfel de abordare personalizata a fost facilitata de tehnologiile postgenomice in plina dezvoltare, care iau in considerare nu numai informatia genetica (secventa nucleotidica la nivelul ADN), dar si un nivel aditional informativ, epigeneticInformatia ereditara implica nu numai informatia genetica, dar si un nou nivel informational, epigenetic. Informatia epigenetica este codificata, dupa cum indica si termenul, nu la nivelul secventei nucleotidice ADN, ci la nivelul structurii cromatinei- materialul genetic eucariot, care consta din complexul nucleoproteic: ADN/ proteinele histonice si nonhistonice. Cu alte cuvinte, codul epigenetic contine grupe chimice, precum metil, acetil, ubiquitil, poli ADP ribozil, biotinil, fosforil, care sunt transferate prin reactii enzimatice, endogene, la nivelul resturilor de citozina din cadrul ADN dublucatenar, pe de o parte si la nivelul resturilor de aminoacizi bazici (arginina si lizina) din cadrul proteinelor histonice si nonhistonice (histonele octamerice sau nucleozomale, H2A, H2B, H3 si H4, si histona linker-1). Reactiile enzimatice sunt catalizate de anumite transferaze, denumite efectori epigenetici (ADN metiltransferaze, histon metilaze, histon acetilaze si histon deacetilaze, histon ubiquitinaze, histon fosforilaze etc), care utilizeaza, in conditii de sanatate, in mod eficient stocurile de grupe metil, acetil, cofactori, etc, aflati in celula sub forme active adecvate

Pattern-urile particuare de modificari epigenetice constituie epigenotipuri care definesc un anumit tip celular si deci o anumita fiziologie celulara. Devierea de la normalitate a acestor pattern-uri inseamna o reprogramare a pattern-ului specific de expresie genica. Unele seturi de gene critice pot fi astfel silentiate, altele, activate in mod aberant. Mai mult, modificarile epigenetice, ca si cele genetice, sunt ereditare, dar, in schimb ele sunt reversibile. Epigenomul este reprogramabil in functie de semnalele ambientale. In mod normal, el depinde de expresia spatio-temporala a genelor: este foarte important de stiut ca anumite gene nu se modifica prin mutatii in diferite tesututri. Ele sunt programate sa fie exprimate intr-un anumit tesut si intr-o anumita etapa de dezvoltare a organului. In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului geneticcelular normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne.

In acest mod, se poate explica de ce pattern-ul celular, reprezentat de un anumit set de gene exprimate intr- un anumit set de proteine celulare, poate varia ca raspuns atat la semnalele endogene, legate de dezvoltarea orhganismului, deci ontogenice, cat si la semnalele exogene, de mediu. Astfel de modificari de pattern-uri celulare pot fi normale, de citodiferentiere si maturizare, intr-o dezvoltare sanatoasa, armonioasa in interactie cu conditiile de mediu, sau poate fi, dimpotriva, aberanta. Aceasta din urma se refera la transformarea programului genetic celular normal si deci la obtinerea unei noi specializari celulare, de obicei maligne. Este clar actualmente faptul ca starea patologica este definita de o transformare a programului de expresie genica fie prin modificari ale informatiei genetice, la nivelul secventei ADN, fie ale informatiei epigenetice, codificate prin modificarile covalente ale ADN (metilarea ADN in resturile de citozina), dar si a altor componenti cromatinici- proteinele histonice si nonhistonice. Modificarile covalente ale ADN si histonelor sau nonhistonelor, precum metilarea ADN, pe de o parte si, pe de alta parte, metilarea/ demetilarea, acetilarea/deacetilarea, fosforilarea, ubiquitinarea, poliADPribozilarea, biotinilarea histonelor in anumite situri representate de resturi de citozina si, respectiv, aminoacizi bazici precum lizina si arginina, conduc la o remodelare activa a conformatiei cromatinei, ceea ce are un efect dramatic asupra proceselor de transcriere si replicare ADN, deci a proceselor de expresie genica si diviziune celulara.

Pornind de la aceste considerente, starea patologica este definita in prezent nu numai prin mutatii ale genelor, respectiv prin modificarea secventei ADN sau a informatiei genetice. Acestea sunt fixate in genom devenind ireversibile si deci transmisibile din generatie in generatie, pornind de la un fondator al mutatiei initiale. Ele sunt indicii ale unui anumit tip de vulnerabilitate fata de o anumita boala, denumit risc familial. Se determina prin detectia mutatiilor la nivelul genelor corespunzatoare, critice pentru o anumita eredopatie. Un alt aspect care trebuie luat in considerare cand se doreste definirea unei stari patologice este, pe langa genotipul, si epigenotipul sau pattern-ul distributiei grupelor chimice mentionate, dintre care grupele metil au o prevalenta neta in discutia aspectelor de nutrigenomica, dar si grupele acetil, la nivelul ADN si histone (metilarea AND si metilarea histonelor-mai cu seama, in conceptul actual, metilarea histonei H3) si respectiv, la nivelul histonelor H3 si H4. Exista dovezi numeroase care implica de asemenea si ubiquitinarea histonei H2B, inlocuirea anumitor histone (precum histona H3) cu anumite variante (precum histona H3.3, de exemplu), ca si multe alte modificari covalente care pot avea loc atat la nivelul componentelor cromatinei, histonele si nonhistonele, dar si la nivelul efectorilor epigenetici, cum au fost denumite enzimele ADN metiltransferaza (DNMT), histonmetilaza (HMT), histonacetilaza (HAT), histondeacetilaza (HDAC) etc. Activitatea acestor enzime, dupa cum s-a mentionat anterior, depinde de anumite conditii de reactie, precum concentratia enzimei/ substratului, de aciditatea mediului de reactie si de temperatura sau concentratia in anumite minerale, de anumiti cofactori: vitamine, donori de grupe metil/acetil, de structura specifica a proteinei cu activitate enzimatica, in special referitoare la domeniul catalitic dar si de cele prin intermediul carora enzima interactioneaza cu alte componente ale reactiei enzimatice. Cu alte cuvinte, reactiile endogene enzimatice sunt deosebit de complexe, pe masura diversitatii alternativelor oferite de natura organismelor superioare de a-si proteja genomul, dar in acelasi timp, de a capata si procesa corect toate informatiile importante provenite din mediu.

Metabolomica- este un domeniu tanar, care aduce un element in plus complexitatii abordarii genomice si epigenomice in relatia cu mediul: caile metabolice complexe prin care elementele externe sunt aduse in reactiile importante ale sintezei de acizi nucleici, de intretinere a strabilitatii genomice, deci a unei structuri cromatinice adecvate unui pattern de expresie genica corecta, normala. Enzimele si deci genele care controleaza aceste cai metabolice cu efect indirect asupra stabilitatii genomice au un potential informativ extraordinar asupra vulnerabilitatii unui organism fata de anumite conditii de mediu si deci de a dezvolta o anumita boala. Totodata, metabolitii intermediari, precum anumiti donori de grupe metuil (SAM sau S-adenozilmetionina si derivatul sau S-adenozilhomocisteina sau SAH) / acetil / fosforil / ubiquitil etc, ca si anumiti cofactori precum vitamina B6, B12, vitamina C sau anumite minerale (precum cationii de Zn si Mg) sunt extrem de importanti in desfasurarea optima a reactiilor metabolice critice in intretinerea genomica. Estimarea acestora, ca si a polimorfismelor genelor care controleaza caile metabolice respective fac parte din obiectivele de studiu ale metabolomicii in relatie cu mediul, respectiv, dieta. In cadrul acestui domeniu, metilomul a capatat recent o importanta cruciala in nutrigenomica. S-a dovedit de altfel ca grupa metil, sau grupa purtatoare de un singur atom de carbon, este cruciala in mentinerea unui genom care sa poata exercita functiile sale in conditii optime.

Fig. 1 Influenta dietei bogate/sarace in folati (donori de grupe metil)Si a activitatii enzimei critice MTHFR asupra proceselor de metilare ADN si asupra stabilitatii genomice

Fig.2 Reactiile metabolice ale grupei metil in celula; procesele de sinteza si metilare ADN sunt corelate cu activitatea de metabolizare in celula a folatilor, sinteza de metionina si de S-adenozilmetionina; alterarea acestor procese induce instabilitatea genomica.

Factorii endogeni ereditari, precum mutatia in anumite gene care controleaza cai metabolice critice, cat si factorii exogeni, reprezentati de o dieta precara in elemente esentiale desfasurarii reactiilor metabolice cu efecte importante asupra mentinerii stabilitatii genomice, pot conduce la dezechilibre interne la nivelul genomului cu potential patogen, prin inducerea instabilitatii genomice. Organismele pot deveni vulnerabile la o varsta inaintata, devenind sensibile la aceste efecte aparent minore, dar cu efecte dramatice asupra integritatii genomice si asupra functiei corecte genomice, respectiv asupra mentinerii pattern-urilor celulare corecte.

Instabilizarea genomica este o marca cunoscuta atat a unei celule canceroase, dar si a unei celule senescente si a celulelor unui organism imbatranit. Din punct de vedere genetic, celulele in procesul imbatranirii sufera schimbari majore ale controlului proesului de dezvoltare. Etapa imbatranirii este deci caracterizata de un program genetic si epigenetic nou, deci de pattern-uri modificate celulare, care difera de cele ale celulelor unui organism tanar prin elemente inca neidentificate cu precizie. Se cunosc insa foarte bine efectele modificarii acestui program genetic vizibile la nivelul tesuturilor pielii, la nivelul functionarii sistemului digestiv, neuronal, dar si circulator, organismul batran fiind mult mai vulnerabil la anumite boli precum cele cognitive (Alzheimer, Parkinson, pierderea memoriei, demente etc), metabolice (diabetul, bolile cardiovasculare), dar si cancerul. Aceasta vulnerabilitate este evident legata de instabilitatea genomica, dar biomarkerii specifici ai procesului de imbatranire sunt departe de a fi definiti. Exista numeroase descoperiri privind modificarile specifice acestei perioade de dezvoltare la nivelul anumitor gene (acumularea de mutatii, dar si de modificari epigenetice) cat si la nivelul unor proteine interesante cu activitate enzimatica, reprezentand tinte moleculare in studiile farmacogenomice.

Actualmente exista teorii privind mutatiile in cadrul unor anumite gene asociate cu bolile mentionate anterior, precum genele pentru apolipoproteine (A,B,C,E etc), care sunt corelate cu nivelul trigliceridelor, colesterolului, dar si cu longevitatea sanatoasa si dezvoltarea bolii Alzhheimer, genele pentru proteina TAU, corelate cu formarea placii proteice specifice bolii Alzheimer, genele pentru sirtuine, proteine cu activitate HDAC, avand rol protector genomic, fiind activate in special in urma dietelor de restrictie calorica, genele pentru angiotensina (ACE) corelate cu bolile cardiovasculare, dar si gena mthfr, asociata cu imposibilitatea asigurarii unui nivel de folati celulari adecvati pentru reactiile de metilare genomica sau proteica. Noutatile din domeniu sunt extrem de numeroase: ele se refera la o pleiada de multe alte gene care controleaza capacitatea de reparare a ADN, desfasurarea ciclului celular in conditii optime, de inhibare a proliferarii celulare in cazul in care exista o tentdinta marita a genomului imbatranit de a acumula mutatii sau epimutatii si de a angaja nucleul in proliferare necontrolata, precum cea neoplazica.

In continuare se vor prezenta rezultatele obtinute in diferite sisteme biologice asociate imbatrabirii prin abordarea analizei polimorfismelor SNP.

Bolile cardiovasculare (CVD) si sistemul renina-angiotensina-aldosterona, caracterizat prin polimorfismul genei ACE (angiotensincatabolizing enzyme)

ACE- angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1Locus cromozomal : 17q23.3

Regiunea ADN codificata: 21 kb -26 exoni

Produsul genei ACE: enzima ACE,; contine1306 aa,; este o peptida cu rol de semnalizare in axa raa contine doua domenii catalitice C-terminal reprezinta approximativ 75% din capacitatea catalitica N-terminal-este folosit in inactivareat bradykininei, neurotensinei si a substantei-PRol: este o enzima proteolitica converteste forma inactiva a angiotensinei II intr-o forma activa (vasoconstrictoare) ; inactiveaza bradykinina si kallidina (vasodilatatoare)

ACE-structura 3D

A. Titia Lely 2007 Polimorfismul genei ACE: insertie-deletie (I/D) a unui segment de baze de dimensiunea 287 pb in intronul 16Genotipul ACE DD a fost asociat cu concentratia crescuta in plasma a enzimei ACE circulante, ceea ce determina conversia mai eficienta a angiotensinei I la II

Pattern-ul electroforetic al polimorfismelor ACE I/D L- LadderID- heterozigot (insertie/deletie)DD- homozigot (deletie)II- homozigot (insertie)

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR )

Caile metabolice ale obtinerii metioninei/ homocisteinei /ADN metilat(THF-tetrahidrofolat,SAM S-adenosimetionina- donor de grupe metil)M. C. Koch et al, 1997

Gena MTHFR Locus cromozomal 1p36.3DNA codificator: 2,2kb , 11 exoniProdusul genei: enzima MTHFR 656AA; 74,5kDaForma activa este un dimer cu 2 domenii majore- N-terminal (catalitic) si C- terminal (reglator)

Polimorfismul C677T in gena MTHFRExonul 4 : 677 C - - - T; alanina - - - valinaEfectul: forma termolabila, instabila, a enzimeiHomozigotii TT : prezinta o activitate mai slaba MTHFR 35-50% fata de cea normala aceasta forma este asociata cu concentratie mare de homocisteinaPolimorfismul 1298C polymorphism in gena MTHFRExonul 7: 1298 A ---C, glutamat ---alaninaHomozogotii CC prezinta o scadere slaba a activitatii (60%)Nu este asociat cu cresterea honcentratiei in HcisEfectul: de obicei este in combinatie cu efectul polimorfismului C677T-heterozigotii cu ambele polimorfisme: prezinta o crestere semnificativa a Hcis, in particular- in conditiile unei concentratii scazute de folati

Metoda-Reverse hybridization - pentru analiza polimorfismelor in gena pentru MTHFR C677 si A1298A- homozigota pentru MTHFR 1298C MutB- heterozigota pentru MTHFR C677 WT si MTHFR 677T MutC- heterozigota pentru MTHFR A1298 WT si MTHFR 1298C MutD- homozigota ptr MTHFR 1298C MutE- homozigota ptr MTHFR C677 WT F- homozigota ptr MTHFR A1298

SNP-MTHFR-C677T este foarte comun. -Cca 40% din populatie este homozigota pentru tipul salbatic C677, -45% este heterozigota pentru ambele alele C677 si T677; iar --cca 15% sunt homozogoti purtatori ai alelei cu mutatia T677.

Factorii epigenetici studiati: procesele de metilare ADN. La nivel global, un proces de instabilizare genomica este frecvent asociat cu hipometilarea ADN. La nivel local, in gene critice, procesul de metilare ADN aberant este asociat cu hipermetilarea promotorilor. Metoda de estimare a hipometilarii globale ADN utilizeaza perechi de enzime isoschizomere ex. (MspI/HpaII) si este abordata pentru estimarea comparataiva a profilelor de restrictie a ADN genomic.

Hipometilarea aberanta ADN global este frecvent asociata cu aneuploidii si cu fenomene de anafaze timpurii sau disocieri promature de cetromeri (cromatide surori)-PCD.

Metoda de estimare a hipermetilarii (methylation specific PCR-MSPCR) este deseori asociata cu silentierea aberanta a unor gene critice precum cele care sunt implicate in metabolismul si activitatea hormonala. O astfel de gena critica in cancerogeneza si in imbatranire este gena pentru receptorul de estrogen (ESR). Hipermetilarea promotorului acestei gene a fost asociata cu cancerul mamar, endometrial si cu imbatranirea.

Exemple de electroforegrame reprezentand profile de restrictie cu enzime izoschizomere care demonstreaza hipometilarea globala ADN genomic la persoane varstnice (b) , comparativ cu persoane tinere (a)

ESR1 (Estrogen Receptor 1)Locus cromozomal 6q25.1Fragmentul DNA: 412.78kb;8exoniProdusul genic: ER- , subfamilia 3 de receptori nucleari, grupa A, member 1Domenii:N terminal -modulatorDomeniul central- bipartite zinc finger DNA binding domainDomeniul NLS (nuclear localization signal ) cu afnitate pentru ADN; este necesar pentru interactia cu inalta afinitate indusa de estradiolC terminal - domeniu de legare a ligandului; include un domeniu de transactivare si un domeniu de dimerizareEste activat de hormonul de sex, estrogen

Exemplu de electroforegrame reprezentand ampliconii unei reactii MSPCR de detectie a statusului de metilare in promotorul genei ESR 1; forma M-metilata este asociata cu silentierea aberanta a ESR1 in cancerogeneza si in imbatranire

Nr pacient123456789ERUMUUUUU-M

ABA - fenomene PCD-premature chromatides dissociationsB - deletii pe cromozomii 4,6,15Exemplu de cariotip alterat datorat demetilarii ADN centromeric si pericentromeric; acest fenomen este asociat cu aneuploidii si PCD (A), dar si cu mutatii precum deletii (cr. 4,6,15 (B) in cancerogeneza si la persoane varstnice

Investigatiile metabolomice au implicat abordarea HPLC pentru estimarea metabolitilor :donor de grupe metil -SAM si a produsului acestuia, SAH. Exemplu de rezultate obtinute in urma examinarii raportului SAM/SAH in probe de sange uman. Variatia este asociata cu varsta, sex, stare de sanatate.

Colectivul propune un algoritm de studiu al instabilitatii genomice in diferite stari patologice si in procesul imbatranirii, care include:

Factori genetici- Testele clasice de cariotipare, care urmaresc identificarea mutatiilor prin variatia morfologiei cromozomale (deletii, ruperi cromozomale etc)

Factori epigenetici- Fenomene PCD in cariotipuri clasice-asociate cu alterarea conformatiei heterocromatinei in regiunea pericentromerica-Hipometilarea ADN globala-Hipermetilarea ADN locala (gene critice/tumor supresoare)

Factori bipchimici (metabolomici) asociati cu instabilitatea metilomului celular -genotiparea mutatiilor punctiforme- (SNP) - estimarea raportului SAM/SAH, ca precursori ai Hcis

ReferinteAbdel Halim Salem and Mark A Batzer (2009); High frequency of the D allele of the angiotensin-converting enzyme gene in Arabic populations. BMC Research Notes, 2:99

Zhang R, Xu X, Chen T, Li L, Rao P (May 2000). "An assay for angiotensin-converting enzyme using capillary zone electrophoresis". Anal. Biochem. 280 (2): 28690.

M. C. Koch K. Stegmann A. Ziegler B. Schro ter A. Ermert; Evaluation of the MTHFR C677T allele and the MTHFR gene locus in a German spina bifida population. Eur J Pediatr (1998) 157: 487-492

Goyette P, Summer JS, Milos R, Duncan AMV, Rosenblatt DS, Matthews RG and Rozen R (1994) Human methylenetetrahydrofolate reductase: Isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet 7:195-200.

Goyette, P., A. Pai, R. Milos, P. Frosst, P. Tran, Z. Chen, M. Chan and R. Rozen, 1998. Gene structure of human and mouse methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR). Mamm Genome, 9: 652-656.

Walter P, Green S, Greene G, Krust A, Bornert JM, Jeltsch JM, Staub A, Jensen E, Scrace G, Waterfield M (December 1985). Cloning of the human estrogen receptor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (23): 788993

Greene GL, Gilna P, Waterfield M, Baker A, Hort Y, Shine J (March 1986). "Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA". Science (journal) 231 (4742): 11504.

Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest. 1990;86:13431346.

Bowen DJ, Bowley S, John M (1998) Factor V Leiden (G1691A), the Prothrombin 3'-Untranslated Region Variant (G20210A) and Thermolabile Methylenetetrahydrofolate Reductase (C677T): A Single Genetic Test Genotypes all Three Loci - Determination of Frequencies in the S. Wales Population of the UK Thromb Haemost 79: 949-954

This work was supported by the National Research Program contract AGECVD coordinated by National Institute of Gerontology and Geriatry Ana Aslan; parteners of the Consortium: University of Bucharest, Stefan Nicolau Institute of Virology, Coltea Hospital, National Institute of Biological Sciences. The contribution of the Cytogenomic Medical Laboratory is aknowledged.