PREPARAREA ȚESUTURILOR ȘI CELULELOR PENTRU OBSERVARE LA MICROSCOPUL ELECTRONIC

1. Microscopia electronică de transmisie (TEM, "transmission electron microscopy")

Există cinci modalităţi de pregătire a probelor pentru microscopia electronică de transmisie.

1.1 Studii pe secţiuni ultrafine ("Ultrathin scctioning ,, ) : Reprezintă cea mai folosită modalitate, implicînd etapele redate în fig. 1.a) Prelevarea materialului : din ţesuturile analizate se taie cu o lamă de ras cât mai repede posibil, piese dc circa 1mm3 care se introduc în fixatori.b) Fixarea materialului : are scopul păstrării structurii materialului biologic şi stabilizării ei cât mai aproape de structura "in vivo"; se face introducându-1 timp de 30 minute până la 24 ore în soluţii de fixatori: glutaraldehidă 1-2% pentru prefixare, apoi în acid osmic 1-2% pentru fixare definitivă. Glutaraldehida produce stabilizarea proteinelor ("cross - link"), prezintă avantajul păstrării în oarecare măsură a activităţilor enzimatice şi de aceea se foloseşte şi în studiile de histochimie la microscopul electronic. Acidul osmic ( introdus în 1952 dc Georgc Emil Palade) stabilizează lipidele şi fiind şi metal greu adaugă contrast la preparat.c) Deshidratarea : se face introducând piesele în soluţii de concentraţii crescătoare de acetonă sau etanol, solvenţi miscibili cu materialele utilizate pentru includere.

d) Includerea : piesele deshidratate sunt introduse în soluţii de răşini sintetice (epon, vestopal, metacrilat etc.) spre a fi pătrunse de acestea; după infiltrare piesele se incubează la 60°C timp de 24 ore în care timp se produce polimerizarca şi întărirea răşinii; piesele trebuie incluse pentru a se putea secţiona, iar deshidratarea este necesară pentru îndepărtarea apei care nu este miscibilă cu răşinile.

e) Secţionarea şi montarea pe grile: după o prelucrare preliminară a blocului de plastic conţinând preparatul se fac secţiuni la ultramicrotom, aparat prevăzut cu cuţit de sticlă sau de diamant. Secţiunile având suprafaţa sub 1 mm2 şi grosimea de aproximativ 60 nm, sc desprind de pe cuţit plutind pe suprafaţa apei din cuva ultramicrotomului, de unde sunt prinse pe grile (uneori acoperite cu carbon şi o peliculă de plastic, de pildă parlodion).

f) Colorarea secţiunilor se face cu săruri ale metalelor grele spre a măricontrastul imaginilor (cu acetat de uranil, citrat de plumb, acid fosfotungstic,permanganat de potasiu sau bariu).

g) Examinarea preparatelor la microscop şi fotografierea imaginilor deinteres.

Aplicaţii: microscopia de transmisie cu coloraţie pozitivă a secţiunilor fixate se

utilizează în studiul celulei în condiţii normale şi patologice. Astfel, microscopia electronică a precizat ultrastructura celulei, dovedind existenţa membranei plasmatice la exterior (plasmalema), a demonstrat existenţa membranei duble a nucleului cu porii nucleari, a precizat ultrastructura mitocondriilor, descriindu-se sistemul de membrane externe şi interne mitocondriale (crestele mitocondriale fiind evidenţiate prima dată de G. E. Palade), membranele rcticulului endoplasmic, aparatul Golgi, a făcut posibilă descoperirea peroxizomilor, a precizat structura diferenţierilor citoplasmatice (microfilamente, microtubuli).

Fig. 1 Pregătirea probelor pentru microscopia electronică de transmisie

Datorită microscopici electronice a devenit posibil studiul modificărilor ultrastructuralc patologice, de pildă în bolile mitocondriale, lisosomale (tezaurismoze) sau a modificărilor patologice în alte boli ce afectează structurile celulare, precum a efectelor unor tratamente asupra integrităţii structurale a celulei.

Microscopia electronică pe secţiuni colorate pozitiv a permis apoi studiul fracţiunilor subcelulare izolate prin centrifugare diferenţiată şi efectuarea unor studii de histochimie, cu localizarea subcelulară a unor enzime.

Dezavantaje: necesită etape multe de pregătire a secţiunilor, în acestea existând şansa de apariţie a unor artefacte. Apoi este dificilă examinarea structurii spaţiale (tridimensionale) a obiectului, realizabilă numai prin secţiuni seriate. În sfârşit proba este fragilă şi se deteriorează prin radiaţii dacă este lăsată prea mult timp în fasciculul electronilor.

1.2 Colorarea negativă ("Negative staining')

Se foloseşte în special pentru examinarea particulelor. Proba este înconjurată de un strat de material dens ( molibdat de amoniu, fosfotungstat de Na, acetat de uranil), foarte opac pentru electroni. Deoarece colorantul împrăştie electronii fondul colorat apare negru, iar particulele prin care trec electronii apar albe. Deci particulele apar albe pe fond întunecat. Proba se prepară rapid, amestecând particulele cu o soluţie de acid fosfotungstic 1%, apoi se plasează o picătură din amestec pe o grilă carbonatată, lăsând să se usuce. În câteva minute preparatul poate fi examinat la microscop.

Această metodă se foloseşte la examinarea virusurilor, a componentelor celulei bacteriene (pili, flageli, perete celular izolat), a liposomilor sau a particulelor din membrane. De pildă prin această metodă se poate identifica membrana internă a mitocondriilor după particulele ce proemină din membrană, în care se află localizată ATP-aza, enzima cheie în sinteza de ATP în mitocondrii.

1.3. Umbrirea cu metale

Se utilizează pentru obţinerea reliefului obiectelor examinate. Într-un evaporator de vid un fir de platină este încălzit până la vaporizare. Apoi metalul este depus pe preparatul ce urmează a fi examinat. Depunerea se poate face în două feluri. În prima variantă depunerea metalului se face dintr-o singură direcţie, deci pe o faţă a preparatului se depune metal iar pe cealaltă nu se depune ; electronii trec uşor prin partea ce nu conţine metal, mai greu prin fond şi foarte greu prin partea metalizată. Particula va apare ca văzută în lumină puternică, deci cu o umbră. Acest procedeu se foloseşte în special pentru virusuri.

În a doua variantă proba este metalizată prin rotirea ei ("rotary shadowing ), astfel ca particula să apară în relief faţă de fond. Această tehnică se utilizează pentru îngroşarca unor filamente foarte subţiri, cum sunt cele de ADN (20 Å) care după metalizare apar de 10 ori mai groase ca în realitate.

1.4. Criofracturarea '("Freeze fracture" )

În această tehnică proba este îngheţată instantaneu pentru a se păstra-structura, apoi este fracturată în vid foarte înalt şi la temperatură foarte scăzută, după care se face o replică a suprafeţei fracturate. Replica se examinează apoi la microscopul de transmisie.

Prima etapă, îngheţarea, se face foarte rapid, cel mai adesea prin plasarea probei pe un suport dintr-un material bun conducător de căldură (cupru, argint, aur), care se aruncă într-un lichid criogen (propan, etan, azot lichid).

A doua etapă, fracturarea, se face în aparate speciale de criofracturare deoarece trebuie să se facă în vid înalt (spre a evita condensarea apei pe suprafaţa fracturată) şi la o temperatură cât mai joasă (pentru a evita deformarea plastică). Fracturarea probei se poate

face prin lovire cu un cuţit sau alte procedee.Planul de fractură trece prin liniile de minimă rezistenţă, de pildă prin centrul stratului dublu lipidic al membranelor biologice (fig. 2).

Fig.2 Schema criofracturării

Spre a se pune în evidenţă proeminenţele de pe suprafaţa de fractură, proba se încălzeşte la -100° C şi se lasă 30 - 90 secunde pentru evaporarea gheţii, proces numit gravare ("etching").

A treia etapă, replicarea, se face prin vaporizarea unui amestec de platină şi carbon proiectat sub un unghi de 45° pe suprafaţa fracturată, apoi se proiectează la 90° vapori de carbon spre a obţine un film de suport al replicii de 15 - 20 nm grosime. După aceea replica se scoate din aparat, se curăţă şi se examinează la microscopul electronic de transmisie.

Aplicaţii: Studiul membranelor biologice naturale (evidenţierea proteinelor integrale de membrană) al joncţiunilor celulare, studiul liposomilor (structură şi dimensiuni).

1.5. Examinarea directă a preparatelor pe grilă

Se utilizează la examinarea cromozomilor sau a altor preparate relativ groase, care împrăştie suficient de puternic electronii pentru a da o imagine fară secţionare, colorare sau metalizare. Se poate realiza şi cântărirea cromozomilor deoarece împrăştierca electronilor este proporţională cu masa lor.

2. Microscopia electronică de baleiaj ("scanning electron microscopy")

În această variantă un fascicul subţire de electroni este mişcat pe suprafaţa obiectului (baleiat) la fel cum un fascicul de electroni baleiază suprafaţa ecranului unui televizor. De fapt, electronii împrăştiaţi de probă vor fi colectaţi de un fotomultiplicator, apoi detectaţi pe ecranul unui televizor. Fasciculul de electroni pe ecran se mişcă sincron cu fasciculul de electroni ce baleiază suprafaţa obiectului (fig. 3). Din depresiunile obiectului sunt reflectaţi mai puţini electroni, deci acestea apar mai întunecate; dimpotrivă, proeminenţele sunt mai

luminate fiindcă împrăştie puternic electronii. Consecinţa este obţinerea în relief a imaginii, care poate fi şi fotografiată.

Fig. 3 Schema microscopului electronic cu baleiaj

Specimenele care se examinează la microscopul cu baleiaj trebuie să fie uscate (deshidratate). Uscarea se poate face în aer numai în cazul probelor foarte rigide precum sporii de ciuperci. În cazul altor specimene, pentru a le păstra structura nemodificată (fiindcă suprafaţa s-ar „zbârci” prin deshidratare) se pot folosi două tehnici:

- una este criouscarea ("freeze drying") care se face îngheţând proba foarte rapid în vid foarte înalt (cum s-a descris la criofracturarc), apoi lăsând gheaţa sa sublime; procedeul este similar cu cel de "etching", doar că se lasă proba până sublimează toată gheaţa;

- a doua tehnică se numeşte uscarea la punct critic ("critical point drying") şi se bazează pe fenomenul fizic al dispariţiei suprafeţei de separare între lichid şi gaz la o anumită temperatură şi presiune (punctul critic). La punctul critic lichidul devine gaz fară ca să existe forţe de tensiune superficiale. Deci dacă un specimen umed este imersat complet într-un lichid sub punctul critic într-un vas de presiune şi apoi se încălzeşte până presiunea şi temperatura devin superioare punctului critic, specimenul va ajunge în gaz fără să existe forţă de tensiune superficială (deci se evită deformarea suprafeţei specimenului).

Apa are punctul critic la valori care ar distruge probele (374° C şi 3212 psi); de aceea se foloseşte ca fluid C02 (ce are punctul critic la 31° C şi 1072 psi). Fiindcă apa şi dioxidul de carbon nu sunt miscibile sunt necesare întâi etapele de fixare (cu glutaraldehidă şi tetraoxid de osmiu) şi deshidratare (prin treceri succesive în serii dc acetonă sau etanol). Apoi se plasează proba în aparatul de uscare la punct critic se imersează în CO: lichid, se încălzeşte cu câteva grade peste 31 ° C, după care se îndepărtează C02 şi se scoate proba din aparat.

Apoi se aplică pe suprafaţa specimenului un strat subţire de metal (aur, aur/paladiu, platină), cu grosimea sub 15nm, după care preparatul poate fi examinat la microscopul cu baleiaj. Microscopia cu baleiaj permite examinarea formei celulei şi a suprafeţelor ceea ce nu se poate face cu microscopul de transmisie. De pildă se pot vedea formele hematiilor umane modificate în unele forme genetice de anemii hemoîitice (sferocitoză, ovalocitoză, anemia falciformă cu celule în formă de seceră) faţă de forma normală de disc biconcav.