UNIVERSITATEA AL. I. CUZA IAI FACULTATEA DE FIZIC

Rezumatul tezei de doctorat

SINTEZA I CARACTERIZAREA UNOR SISTEME

HIBRIDE DE POLIMERI HIDROSOLUBILI

I MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAII

N BIOMEDICIN

Conductor tiinific, Prof. Dr. Dana Ortansa Dorohoi

Doctorand,

Daniela Angelica Bndar (cs. Pricop)

Iai 2012

Universitatea Al. I. Cuza Iai

n atenia

.. V facem cunoscut c n data de 18 februarie 2012, ora 10, n

amfiteatrul L1, doamna Daniela Angelica Bndar (cs. Pricop) va susine, n edin public, teza de doctorat:

SINTEZA I CARACTERIZAREA UNOR SISTEME HIBRIDE DE POLIMERI

HIDROSOLUBILI I MEDICAMENTE/NANOPARTICULE CU APLICAII N

BIOMEDICIN

n vederea obinerii titlului tiinific de doctor n domeniul fundamental tiine Exacte, domeniul Fizic.

Comisia de examinare a tezei:

Prof. Univ. Dr. Dumitru LUCA,

Preedinte Facultatea de Fizic, Universitatea Al. I. Cuza, Iai

Prof. univ. dr. Dana Ortansa DOROHOI Conductor tiinific Facultatea de Fizic, Universitatea Al. I. Cuza, Iai

CP. I Dr. Valeria Harabagiu Referent

Institutul de Chimie Macromolecular Petru Poni, Iai

Prof. Univ. Dr. Viorica IMON Referent

Facultatea de Fizic, Universitatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca

Prof. univ. dr. Viorel MELNIG

Referent

Facultatea de Fizic, Universitatea Al. I. Cuza, Iai

V invitm pe aceast cale s participai la edina public de susinere a tezei de doctorat.

Cuprins Introducere

Cap I. Stadiul actual al cunoaterii n domeniul materialelor polimere inteligente i a

obinerii de nanoparticule

Bibliografie

Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice, suprafeelor si filmelor

II.1 Voltametrie ciclic

II.2 Determonarea distribuiilor de dimensiuni prin mprtierea dinamic a luminii

II.3 Determinarea potenialului Zeta pentru dispersiile coloidale

II.4 Microscopie electronic de transmisie

II.5 Microscopia de for atomic AFM

II.6 Microscopie optic

II.7 Difracia radiaiei X

II.8 Determinri calitative i cantitative prin metode spectrale

Bibliografie

Cap III.Obinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe baz de lipid i chitosan

III.1 ncapsularea unor medicamente specifice n vezicule lipidice

III.1.1 ncapsularea clorurii de magneziu n vezicule lipidice

III.1.2 ncapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice

II.1.3 ncapsularea dexketoprofenului n vezicule lipidice

II.1.4ncapsularea tramadolului n vezicule lipidice

II.1.5 ncapsularea hidrocloridului hidrat n vezicule lipidice

III.2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de ctre sistemele de vezicule lipidice stabilizate n chitosan i compararea cu eliberarea in vivo

III.3 Evaluarea in vivo a proprietilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapai cu medicament

IV.3.1 Cinetica de fixare si eliberare controlat a compuilor sintetizai (in vivo)

IV.3.2 Testarea biocompatibilitii medicamentelor ncorporate n vezicule

IV.3.3 Cercetarea efectelor medicamentelor ncorporate n vezicule, pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IV.Obinerea i caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile , n

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV.2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV.3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV.2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obinute

IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au n chitosan n raport cu

diferii factori

IV.3.1 Analiza stabilitii n timp a soluiilor de chitosan cu nanoparticule de au IV.3.2 Analiza comportamentului soluiilor de chitosan cu nanoparticule de aur nclzite

IV.3.3 Analiza comportamentului soluiilor de chitosan cu nanoparticule de aur ngheate

IV.3.4 Analiza comportamentului soluiilor de chitosan cu nanoparticule de aur sub aciunea unor activatori

IV.3.4 Analiza comportamentului soluiilor de chitosan cu nanoparticule de aur sub aciunea radiaiei din spectrul vizibil

IV.4 Evaluarea in vivo a proprietilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV.4.1 Evaluarea proprietilor antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe diferite medii de cultur

IV.4.2 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrri publicate

1

Cap I. Stadiul actual al cunoaterii n domeniul materialelor polimere

inteligente i a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modern a fcut pai considerabili n nelegerea necesitii

compatibilizrii medicamentului cu esutul. Practica a artat c de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un duman i se comport n consecin. Un domeniu

de interes pentru aplicaiile din biomedicin, se ocup cu mbuntirea eficacitii

medicamentelor n medii biologice, folosind nanotehnologia, n scopul

dimensionrii acestora la nivel nanometric i creterea bio-disponibilitii lor. n

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici n eliberarea controlat a

medicamentelor i n aplicaii legate de funcionalizarea nanoparticulelor de metale

nobile. Interesul medical, n potenialul acestor nanomateriale, este motivat de

capacitatea lor de a interaciona individual cu biomoleculele i cu celulele. i ntr-

un caz i n cellat nu exist nc informaii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sntii organismelor i a mediului nconjurtor.

Rspunsul transportatorilor de medicamente, la stimulii mediului biologic,

este condiionat de nivelul de stabilitate al soluiilor coloidale care-i conin.

Aceast stabilitate depinde de mbuntirea proprietilor de suprafa a

coloizilor, realizat prin acoperirea cu polimeri i care induc ntre acetia procese

repulsive. Dac inem cont c stabilitatea sistemelor coloidale, att sub form de

vezicule lipidice ct i sub form de nanoparticule, este influenat de diferii

factori cum ar fi pH-ul, temperatura, fora ionic, dimensiunea particulei, etc. ne

putem atepta ca interaciunile ce au loc ntre polimeri i coloizi (vezicule sau

nanoparticule) s fie extrem de complexe. Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluiilor coloidale este definit n acord cu valoarea medie a potenialului Zeta.

Acesta indic dac particulele dintr-un lichid tind sau nu s aglomereze,

urmnd s precipite, sau prezint acel nivel de dispersivitate care s la permit

interaciunea cu mediul biologic.

Obinerea veziculelor lipidice

Studiile au artat c folosirea n medicaii a transportatorilor de

medicamente sub form de vezicule, avnd dimensiuni nanometrice, este mai puin

toxic. Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolin n soluie apoas. Celula vie pare s-i fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic dup aceeai strategie. Pentru a obine vezicule,

filmul lipidic de fosfatidilcolin, este hidratat cu diferite soluii (medicament) care,

2

de altfel, vor deveni coninutul veziculelor. Trecerea sistemului, din starea de

bistrat lamelar n starea de vezicule, are loc ca urmare a creterii entropiei

sistemului, care le determin autoansamblarea, mpachetndu-se unele n altele sub

form de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni.

Fig. 5 Formarea veziculelor lipidice din uniti individuale de form cilindric.

Pentru a produce mici vezicule unilamelare i cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm), se folosete o baie de ultrasunete (figura 5). Ultrasonarea

fragmenteaz aleatoriu veziculele multistrat, n ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24], a cror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor.

Adugarea chitosanului n soluiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii i morfologiei veziculelor unilamelare, provocnd

creterea stabilitii acestora.

Obinerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sintez a nanoparticulelor au fost inspirate din natur,

utiliznd faze suport polimerice. De exemplu, este bine cunoscut c n procesele de

biomineralizare, proteinele i polizaharidele pot aciona ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric. Aceste faze suport s-au

folosit pentru obinerea de nanoparticule bine definite i cu o distribuie ngust.

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obine prin sinteza

electrochimic a nanostructurilor mono i bimetalice [33 - 35] i i gsesc aplicaii

n domenii ce includ cataliza [35], sisteme de stocare a datelor, dispozitive

electronice noi, chemo i biosenzori electrochimici [34], senzori refractometrici i

de fluorescen. Folosirea efectului ultrasunetelor n electrochimie [37]

mbuntete mult transportul de mas, modificndu-i viteza i, de asemenea,

modificnd mecanismul reaciei electrochimice. Sinteza nanoparticulelor de aur n

soluii apoase de chitosan a pus n eviden faptul c acesta devine agent de

stabilizare i reducere datorit controlului nucleaiei. Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variaz n funcie de concentraia i masa molecular a chitosanului.

Stabilitatea acestor soluii, este asigurat prin adsorbia moleculelor de

polimer la suprafaa nanoparticulelor, producandu-se automat scderea tensiunii

interfazice, datorit interaciunii ntre faza dispersat i mediul de dispersie.

Cap II. Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice,

suprafeelor i filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice, este raportul foarte mare suprafa-volum, care duce la apariia unor

proprieti fizice sau chimice noi. Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul n polimer i modificrile ce apar la nivel local n cadrul

nanostructurilor. Caracterizarea soluiilor coloidale obinute a constat n: analiz

structural, mezofazic, nanofazic i a proprietilor optice i de stabilitate.

II.3 Determinarea Potenialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietii de stabilitate a soluiilor coloidale s-a realizat prin

msurarea potenialului Zeta. Aceast tehnic const n mprtierea unui fascicul

de lumin laser, incident prin centrul unei celule ce conine proba, sub un unghi de

aproximativ 13 pentru a fi detectat i comparat cu fasciculul laser de referint.

Potenialul Zeta se calculeaz din mobilitatea electroforetic a coloidului,

a crui spectru de frecvene va fi analizat cu un software. Stabilitatea soluiilor

coloidale este definit n acord cu o valoare medie a potenialului Zeta (tabelul 1)

care indic dac particulele dintr-un lichid tind sau nu s floculeze [8]. Particulele

care au potenialul Zeta mai pozitiv dect +30 mV sau mai negativ dect -30 mV,

sunt n mod obinuit, considerate stabile. Msurarea distribuiilor de dimensiune i

a stabilitii soluiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS, model Zen-3500.

4

II.4 Microscopia electronic de transmisie (TEM) i Microscopia de for

atomic (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM i AFM pentru nanoparticulele de Au, Ag

i Pt au fost fcute cu un microscop Phylips CM 100 i n modul semicontact cu un dispozitiv Solver pe filme subiri. Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofic a nanoparticulelor i evaluarea gradului de acoperire cu polimer.

n TEM, tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele dou lentile condensor, unde este focalizat [11]. Cmpul asociat unei lentile

electrostatice, sub form de diafragm metalic circular, modific viteza

electronilor, att n mrime ct i n direcie. Pentru a putea concentra cmpul

magnetic n vecintatea axei optice, se utilizeaz lentilele magnetice sub form de

solenoizi, coaxiali cu fasciculul electronic. Cmpul magnetic al lentilei modific

direcia micrii electronilor, nfurnd" traiectoria lor n jurul axei optice, fapt ce

produce rotaia imaginii electronice n raport cu obiectivul. Proba este plasat n

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv. Imaginea format de obiectiv se

numete prima imagine intermediar i servete drept obiect pentru lentila

electromagnetic intermediar. Apoi, aceast ultim imagine, este mrit de lentila

electromagnetic proiector, care va forma imaginea final a obiectului pe un ecran

fluorescent.

n ceea ce privete realizarea schiei topografice a suprafeei probei,

efectuat prin AFM, s-a folosit un aparat Solver Pro 7M. Imaginea este obinut

prin msurarea fore de interaciune, n care fora repulsiv este influenat de

densitatea total a electronilor din jurul unui atom. n timpul deplasrii vrfului de-

a lungul suprafeei probei, fora de interaciune pune uor n micare un cantilever.

Componentele de baz ale unui AFM sunt vrful ascuit montat pe

cantilever, sistemul de detecie pentru msurarea devierii cantileverului, traductorul

piezoelectric pentru micarea sondei n raport cu proba, sistemul de feedback

pentru meninerea constant a devierii prin reajustarea nlimii sondei i sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor nregistrate ntr-o imagine. Devierea

cantileverului este amplificat cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului i este reflectat spre un detector cu fotodiod.

II.6 Microscopie optic. Microscopie n cmp ntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibil prin DF

datorit efectului de plasmon, care s-a creat la interaciunea nanoparticulelor cu

lumina, i care extinde dimensiunea aparent a acestora cu peste 100 nm.

Cmpul ntunecat este obinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic,

astfel nct razele nedifractate s nu poat fi colectate de lentilele obiectiv. Efectul

de cmp ntunecat poate fi obinut rapid, din cmpul luminos, prin rotirea

5

condensorului, astfel nct s fie captat de obiectiv doar lumina difractat de

prob [13] i s-a realizat utiliznd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti.

II.7 Difracia radiaiei X

Structura micro- i nano- fazic, ca i dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracie de radiaie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000, utiliznd radiaia CuK (1,54060 ) care

opereaz la 40 kV i 30 mA. Difracia radiaiei X este o metod folosit n

principiu pentru evaluarea constantei de reea, d a unei probe cristaline [14, 15].

Datorit lungimii de und mici, relativ la cea din lumina vizibil, radiaia

X poate interaciona cu planele atomice din structura intern a materialelor.

Picurile de difracie a radiaiei X sunt obinute prin interferena constructiv a

fasciculului monocromatic mprtiat [15]. Utiliznd legea lui Bragg, putem

prezice unghiurile de difracie. Lrgimea picurilor este dat de ecuaia lui Scherrer

[14].

II.8 Determinri calitative i cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existena legturilor ntre polimer i nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile n

cei doi polimeri. Spectroscopia n domeniul (IR) este cea mai potrivit metod de

identificare a prezenei gruprilor funcionale polare din structura moleculelor

compuilor organici. Spectrometrul IR clasic este un aparat n care radiaia

electromagnetic furnizat de o surs este separat n dou fascicule: un fascicul de

referin i unul care trece prin prob [17]. Msurnd absorbia radiaiei ca funcie

de frecven, se obine spectrul de absorbie ce poate fi considerat ca o amprent

molecular i care este utilizat pentru identificarea compuilor i gruprilor

funcionale. Spectrele FTIR au fost nregistrate ntre 4000 i 400 cm-1 cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker.

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafa (SERS)

Pentru a obine informaii despre structura molecular i dinamica strii

electronice excitate a nanoparticulelor de Au, s-a folosit o tehnic de mprtiere

Raman la rezonan. Acest fenomen se obine pentru moleculele adsorbite pe

suprafaa nanoparticulei i care determin amplificarea semnalului Raman

cunoscut, n literatura de specialitate, sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificat de suprafa). mprtierea Raman la rezonan, are loc atunci cnd

6

fotonul incident are o energie egal cu energia unui nivel de vibraie al moleculei

aflate n stare excitat. n urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensiti foarte mari (106) fa de difuzia Raman normal. Spectrele Raman au

fost obinute cu un microscop inVia Raman, Renishaw, avnd un laser cu o singur

lungime de und (633 nm).

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de mbtrnire a soluiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbie molecular UV-Vis utiliznd

un spectrofotometru Hitachi U2001.

Msurtorile se bazeaz pe absorbia radiaiilor electromagnetice n

domeniul de lungimi de und 200 - 1100 nm de ctre speciile absorbante, de

nanoparticule de aur n soluii de chitosan. Spectroscopia de absorbie molecular

const n aceea c se iradiaz proba de analizat cu radiaii de lungimi de und

diferite (UV -Vis) i se nregistreaz spectrul de absorbie (intensitatea radiaiei

funcie de lungimea de und) [33].

CONTRIBUII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1. Obinerea n condiii blnde a unor soluii coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bun dispersitate sub form de:

- vezicule lipidice ncrcate cu medicament i stabilizate n chitosan,

- nanoparticule din metale nobile sintetizate n polimeri biocompatibili.

2. Evaluarea proprietilor acestor materiale att sub aciunea unor stimuli reactivi

(temperatura-nclzire/rcire, pH-ul n procese de dializare, activatori chimici,

radiaie luminoas) ct i n studii in vivo n interaciune cu esutul biologic pe

medii de cultur, la eliberarea n medii gastrice sau n snge ca i la trecerea de

bariera hemato-encefalic.

Cap III. Obinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe baz de

lipid i chitosan

Obinerea n condiii blande a soluiilor coloidale , se refer la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii, n copolomerii bloc, prin reglarea

echilibrului hidrofilic/hidrofobic. n acest studiu s-a analizat obinerea de vezicule

lipidice, de dimensiuni nanometrice, ncrcate cu diferite medicamente care s

poat fi stabilizate cu un polimer care s suporte pH-ul fluxului sanguin i s

7

asigure un control optim al eliberrii medicamentului. Medicamentele ncapsulate

n veziculele lipidice de fosfatidilcolin au fost clorura de magneziu, ketoprofenul,

dexketoprofenul, U50488 (hidroclorid hidratul) i tramadolul.

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat, dup

evaporarea solventului, cu o soluie de ap distilat i medicament. Dup ce a fost

supus ultrasonrii timp de 20 min, pentru a obine vezicule unilamelare, soluia de

lipid a fost combinat cu o soluie de 0,5% chitosan [5]. Pentru a aduce soluia de

vezicule lipidice, cu medicament stabilizat n chitosan, la un pH neutru, aceasta a

fost dializat timp de 10 de ore.

Fig. 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV i a veziculelor crcate cu ketoprofen i stabilizate n chitosan CKLV.

S-a observat c formulele obinute nu au prezentat eliberri de

medicament n primele minute de dup administrare, ceea ce indic faptul c prin

ultrasonare, ntreaga cantitate de medicament a fost ncapsulat n vezicule.

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor i a permis ncrcarea

lor cu sarcin pozitiv. Ca urmare, n toate sistemele analizate, chitosanul a fcut

posibil creterea stabilitii veziculelor, corespunznd criteriilor soluiilor

suspendate. Procesul de dializare, necesar aducerii soluiilor la un pH fiziologic, a

condus la diminuarea stabilitii veziculelor, datorit proceselor de protonare/

deprotonare.

III.3 Evaluarea in vivo a proprietilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

ncrcai cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de ctre sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a artat c eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face ntr-un ritm mai lent fa de creterea concentraiei, la dizolvarea

unei cantiti de cristale solide pure de ketoprofen n acelai mediu de eliberare.

i eliberarea, n snge, a medicamentului din veziculele lipidicese, se face

cu ntrziere fa de medicamentul nencorporat. n snge, concentraia maxim de

medicament, eliberat din vezicule, se menine cu cteva ore n plus i efectul se

prelungete fa de medicamentul neancorporat.

8

Fig. 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate,

comparativ cu un coninut echivalent de cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

n acelai mediu de eliberare.

Fig. 33 Variaia n timp a concentraiei

de ketoprofen n snge, la oarecii

tratai att cu vezicule cu medicament

ct i cu o soluie simpl de ketoprofen.

n studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificri semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei, pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan i ncrcate cu oricare din medicamentele utilizate.

Graficele obinerii efectului maxim posibil, pentru toate soluiile

ncorporate n vezicule lipidice stabilizate n chitosan, au artat c:

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce n acelai timp; - intensitatea efectului scade fa de substanele nencorporate; - maximul de efect, se obine aproximativ n acelai timp (cam la 4 ore) dup administrarea oricrei soluii; -efectul medicamentelor ncorporate se prelungete n acelaii interval de

timp.

Corobornd efectele medicamentelor ncorporate, cu nivelul de

medicament eliberat n snge la diferite momente de timp, din testele de

comportament i testele de nocicepie, s-a putut realiza o corelaie relativ sub

aspect somatic.

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Meninerea nivelului maxim

Prelungirea

eliberrii

Ket. eliberat n snge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket. n tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket. n writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observ o bun corelare ntre obinerea concentraiei maxime de

medicament n snge i inducerea unui efect antinociceptiv, semnificativ statistic,

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

once

ntr

atie

mola

ra (m

ol/

L)

x 1

05

%

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

*

**

**

** KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

g/m

L)

Timp (ore)

9

doar n testul tail-flick. La nivel gastric, n testul Writhes, efectul ntrzie o or iar

la nivelul sistemului nervos, din cadrul testului de comportament, ntarzie cu 4 ore.

Fenomenul se datoreaz instabilitii chitosanului, ce acoper veziculele

cu medicament, la pH-urile specifice acestor medii de eliberare.

Efectul produs de analgezice n snge, s-a meninut maxim cea mai lung

perioad de timp (6 ore) urmat de opioide, la care efectul s-a meninut maxim (4

ore), deoarece chitosanul, la pH-ul ridicat al sngelui, devine mai puin solubil,

permind o mai lent destrmare a veziculelor. La nivel abdominal, efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament, n testul Writhes, s-a meninut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit, deoarece chitosanul devine mai

solubil permind eliberarea mai rapid a medicamentului.

Cap IV.Obinerea i caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile n medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

n acest capitol este prezentat sinteza, caracterizarea i evaluarea in vivo

a proprietilor nanoparticulelor din platin, argint i aur. Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicaii medicale, ce necesit obinerea lor printr-un proces de

nucleaie, n condiii blnde, asiguranduli-se o bun dispersabilitate, prin reducerea

n ageni de stabilizare. Evaluarea proprietilor nanoparticulelor in vivo s-a fcut

urmrind efectul antibacterian pe culturi de bacterii i inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos.

IV.1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platin i argint , s-a utilizat o celul

electrochimic alctuit din doi electrozi. Prin reducere la catod se formeaz atomi

zero valenti provenii din disoluia oxidativ a anodului. Prezena electrolitului,

alctuit din soluia de precursor i polimer, permite formarea de microdomenii de

reacie restricionat pentru nanoparticulele ce se formeaz.

Nanoparticulele de platin acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU,

s-au obinut printr-o metod sonoelectrochimic [2, 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formeaz n microdomeniile

polimerului.

Nanoparticulele de argint, acoperite cu poliamidhidroxiuretan, s-au

sintetizat prin electrosintez n regim galvanostatic, pentru densiti de curent de

6,25 mA/cm2 (AgI) i 1,56 mA/cm2 (AgII), la temperatura camerei, sub agitare

puternic i n atmosfer de azot. Timpul optim pentru sintez a fost de 15 min.

Nanoparticulele de Au au fost obinute prin reducere n soluii de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7]. Prepararea soluiilor precursor, pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan, s-a fcut amestecnd 2, 4, 6, 8 i 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38, 36, 34, 32 i respectiv 30 ml de chitosan 0,1%; sub agitaie cu

ultrasunete .

Caracterizarea structural a nanoparticulelor a artat c nanoparticulele de

platin au dimensiunile cristalitelor cuprinse n domeniul 10 - 42 nm i o stabilitate

situat pe pragul de dispersie pentru densiti de curent 0,6 mA/cm2 1,2 mA/cm2.

Dimensiunile, mai mari, obinute prin AFM sugereaz c nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interaciunii ntre

polimer i nanoparticule, conform studiilor FTIR. Sistemele coloidale prezint un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenialului Zeta.

Nanoparticulele de argint, mpachetate n polimer par a avea o stabilitate

mai bun pentru dimensiuni mai mari (100nm). Nanoparticulele de aur prezint o

anumit dinamic a dimensiunilor, de la civa zeci de nm pn la cteva sute de

nm, ca urmare a procesului de maturare Oswald i o multitudine de forme, puse n

eviten att prin DF ct i prin TEM. Prin AFM s-a observat c nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan i prin analiz FTIR s-au identificat gruprile

funcionale care permit interaciunea cu polimerul.

Fig. 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentraiile de precursor HAuCl4.

Fig. 70 Micrografia obinut prin microscopie optic DF, evideniaz faptul c nanoparticulele de Au au geometrii diferite,

deoarece plasmonii acestora sunt colorai diferit.

Soluiile proaspt sintetizate se afl pe pragul de dispersie, urmnd ca prin

mbtrnire n timp s li se mbunteasc nivelul de stabilitate.

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

0.05

0.10

0.15

0.20

PG

MMW

LMW

OSL

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungim

ea d

e und

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV.3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au n chitosan

n raport cu diferii factorii externi

Supuse proceselor de mbtrnire n timp, soluiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (meninute la 23C), au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2, 3, 4, 7, 8 i respectiv 11 luni, i determinate distribuiile de

dimensiuni i de potenial Zeta la 2, 3, 7 i 11 luni dup sintez.

Fig. 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluiile de chitosan cu concentraii mici de aur.

Soluiile cu cea mai ndelungat stabilitate, de 11 luni, s-au dovedit a fi

cele care conin concentraii mici de precursor de aur, indiferent de masa

molecular a chitosanului. Soluiile cu concentraii medii de precursor de aur au

avantajul c-i pot pstra forma i dimensiunea medie a nanoparticulelor, n

polimerul cu mas mic i mare molecular. Stabilitatea acestor soluii scade odat

cu creterea concentraiei de precursor de aur.

Soluiile coloidale meninute la temperatura de 500C ntr-o etuv

termostatat, au fost analizate spectral i li s-au determinat distribuiile de

dimensiune i potenial Zeta, fiind apoi analizate prin TEM i spectroscopie

Raman[10].

Fig. 89 Spectre Raman pentru soluiile 6PG, 6MMW i 6LMW la concentraii mari de aur.

400 600 8000,0

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

2918,5

1571,8

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

1571,8

1599,7

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

659,5

603,6

1570

15152132,5

2118 2945

2917,6

400 600 800

0,0

Ab

sorb

anta

(u

.a.)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 8000,0

Abso

rban

ta (

u.a

.)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

524,5

12

S-a observat c cu ct masa molecular a chitosanului este mai mare (PG)

cu att soluiile prezint o mai bun stabilitate, odat cu creterea timpului de

nclzire. Supuse procesului de nclzire, sistemele coloidale tind, n primele ore,

s-i creasc progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm, fapt ce indic o

mbuntire a mediului dielectric n imediata vecintate a nanoparticulelor [12].

Acest lucru duce la i atomii din metalul nanoparticulelor, fenomen pus n

eviden i de intensificarea semnalului Raman [13], mai ales la soluiile cu cea

mai mare concentraie de precursor de aur.

Soluiile coloidale supuse la o temperatur constant de -20 0C, n cicluri

de cte 20 min n care au atins starea solid prin ngheare i apoi au fost readuse n

stare lichid prin dezgheare la temperatura camerei tot n 20 min, au fost analizate

spectral, li s-au efectuat msurtori de potenial Zeta, distribuii de dimensiune i

micrografii TEM [10]. S-a observat c, cu excepia probelor ce conin chitosan PG,

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapid. Pierderea stabilitii a

fost motivat, n toate cazurile, de creterea brusc a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule, lucru dovedit i de pierderea culorii soluiilor i existena

precipitatului depus pe fundul flaconului. Cu ct masa chitosanului scade cu att

maximul de absorbie scade mai repede, ceea ce dovedete c succesiunea unui

numr de congelri i decongelri conduce la degradarea stabilitii soluiilor care

au suferit o cretere a vscozitii i determin precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15].

Fig 99 Spectrul de absorbie pentru soluiile 6PG, 6MMW i 6LMW la ngheare.

O proprietate care se manifest, de altfel i la nclzirea soluiilor

coloidale, este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular. Aceasta pare s

13

fie motivat de faptul c dup legarea nanoparticulelor de aur se micoreaz

intensitatea vibraei legturii N-H, fcndu-o mai flexibil [16].

Soluiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic i bufer Tris),

supuse unui proces de oxidare electrochimic n regim galvanostatic la un curent

de 0,25 mA timp de 10 min, au fost analizate spectral n UV-Vis-NIR dup 30

minute i n final prin DF i RAMA.

(a) (b)

Fig. 102 Modificarea absorbanei (a) i semnalului Raman (b) a sol. 2LMW n ac. formic.

Procedura de oxidare electrochimic, a probelor, s-a repetat de nc 4 ori,

la intervale de 24 de ore. S-a observat o scdere a absorbanei, nsoit i de o

deplasare spre lungimi de und mai mari. Soluiile proaspt preparate nu au

prezentat creteri ale absorbanei, ci mai curnd mici scderi nsoite de deplasri

spre lungimi de und mai mari.

n final dispariia semnalului Raman pune n eviden tocmai scderea

activitii optice a soluiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative.

Fenomenul poate fi datorat adsorbiei/absorbiei de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] n urma oxidrii electrochimice. Se induc astfel

schimbri structurale n masa de substa i rezult o activitate metastabil ce se

menine i dup eliminarea hidrogenului [21 - 22]. Odat cu mbtrnirea acestor

soluii, are loc o reorganizare structural lent, care conduce la stri mai puin

active.

Au fost supuse iradierii, n spectrul vizibil, probe de nanoparticule de aur

epuizate prin mbtrnire n timp, n scopul reactivrii efectelor de Plasmon

Rezonant i SERS. S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min, distana

optim de 15 cm de lampa cu halogen i au fost termostatate la temperatura de

25 0C. S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) i

SERS.

400 600 800 1000

0.0

0.2

0.4

Ab

sorb

ance

(a.

u.)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac. Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

.a.)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

235,5

14

Cretea semnalului Raman sugereaz o nbuntire a relaiei (interaciei

intime) mediu-polimer i nanoparticule. Soluiile care conin chitosani, cu mase

mici i medii moleculare, prezint cel mai puternic semnal Raman. La toate

soluiile cu chitosan cu mas mare molecular, acest fenomen este mai slab.

(a) (b)

Fig. 110 Spectrul de absorbie (a) i spectrul Raman (b) pentru soluia 2LMW aflat

sub aciunea luminii.

IV. 4 Evaluarea in vivo a proprietilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru nceput au fost evaluate proprietaile nanoparticulelor de argint

introduse n medii de cultur bacterian. S-a urmrit modul n care efectul

antibacterian este influenat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I i 23 nm la Ag

II), de concentraia (10, 30, 60 g/ml n mediu) i modul n care prezena

polimerului modific aciunea nanoparticulelor n mediile biologice [25].

Fig. 129 Dinamica de cretere a curbei bacteriene n mediu LB cu E. coli pentru

diferite mrimi i concentraii ale nanoparticulelor de argint

Fig. 130 Dinamica de cretere a curbei bacteriene n mediu LB cu S. aureus. pentru

diferite mrimi i concentraii ale nanoparticulelor de argint.

400 600 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Inte

nsi

tate

(u

.a.)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

u.a

.

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

1546,5

2134

2123,4

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Control

AgI (1g/ml)

AgI (5g/ml)

AgI (5g/ml)

AgII (1g/ml)

AgII (5g/ml)

AgII (5g/ml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1g/ml)

AgI (5g/ml)

AgI (50g/ml)

AgII (1g/ml)

AgII (5g/ml)

AgII (50g/ml)

15

Prin microscopie DF i SEM s-au pus n eviden prezena

nanoparticulelor de argint n mediul de cultur i inducerea unor modificri n

morfologia celulei. Acest studiu a artat c nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar i la concentraii mai mici dect cele din literatur. Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o cretere cu 10 ore a ratei de inhibiie a mediului

bacterian, datorit asigurrii unei mai bune dispersii a nanoparticulelor. Eficiena

bactericid a soluiilor coloidale crete cu scderea dimensiunii nanoparticulelor,

aderena la suprafaa bacteriei fiind datorat proprietilor de suprafa.

Control Ag I, 10 g/mL Ag II, 10 g/mL

a b c

d e f

Fig. 131 Micrografiile SEM prezint efectele nanoparticulelor Ag I 29 nm i Ag II 23 nm asupra morfologiei celulelor de E. coli (a, b, c) i S. aureus (d, e, f).

Totui mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprieti antibacteriene eficiente, pare a fi datorat formrii de aglomerri i

ancorrii la suprafaa celulei bacteriene, ceea ce ne determin s credem c

dispersia nanoparticulelor n polimer se menine chiar i n formele aglomerate.

Studiul i propune, de asemenea, s evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la oareci i a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea obolanilor tratai cu tulpini

bacteriene test ca i asupra reactivitii imune a obolanilor n condiii de stres. S-a

folosit o tulpin test (LPS, 250 micrograme) de endotoxin lipopolizaharid

bacterian comun, produs de bacteriile Gram negative.

16

Dup administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraii de 5 g/ml, 10

g/ml i polimer (grupului de control), n analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferene semnificative a formulei elementelor leucocitare, GOT, GPT i

a nivelurilor de LDH, nici a parametrilor imunitari (OC, PC, BC. ).

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135), prin creterea nivelului anticorpilor.

Fig. 135 Nivelul anticorpilor n a 9-a zi,

postimunizate cu (LPS, 250 g/kg) la administrarea AuNP1 i AuNP2.

Fig. 137. Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante n a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 i AuNP2.

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137).

n urma inducerii stresului electric, s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS i tratate cu AuNP1 i AuNP2, sugerndu-se c nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres i a LPS (figura 138). Rezultate

experimentale similare au fost observate i n cazul aplicrii edinelor de stres prin izolare

individual n tub (figura 139), ns efectele sunt mai pronunate.

Fig. 138 Nivelul anticorpilor evaluat n a

4-a zi postimunizate cu (LPS, 250 g/kg) la administrarea AuNP1 i AuNP2, pentru animalele supuse stimuluilui electric

Fig.139 Nivelul anticorpilor n a 4-a zi

postimunizate cu (LPS, 250 g/kg) la administrarea AuNP1 i AuNP2, pentru animalele supuse izolrii.

17

Studii de comportament i modificri neurocomportamentale, la oareci, au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub aciunea nanoparticulelor de argint.

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologic a creierului

de obolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag. De asemenea rezultatele de

limitare a toxicitii induse de LPS, de ctre nanoparticulele de Au mpachetate n

chitosan, la obolanii de laborator, au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului i a ficatului.

S-a constatat, la oarecii tratai cu nanoparticule de Ag, cum coeficienii

creierelor au sczut semnificativ fa de lotul de control [28]. Putem spune c

nanoparticulele de Ag induc degradri ale structurilor nervoase implicate n

procesele memoriei, n loturile tratate cu nanoparticule de Ag, indiferent de

dimensiunea acestora.

Fig. 144 Imagini de microscopie optic n DF indic formarea de aglomerri de

nanoparticule de Ag n creierul de obolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig. 145 Histopatologia creierelor. Control (A), Ag I 5 g/ml (B), Ag I 10 g/ml (C), Ag II 5 g/ml (D), Ag II 10 g/ml (E). Sgeile indic clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint.

18

n cazul oarecilor tratai cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 i LPS, ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporal,

comparativ cu controlul. S-a constatat de asemenea o scdere semnificativ a

greutii creierului n raport cu greutatea corporal numai n cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul. Cu toate acestea n grupurile tratate cu LPS i cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificri patologice semnificative n creier.

AuNP1(n insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig. 146 Imaginile de microscopie optic n DF indic formarea de aglomerri de nanoparticule AuNP2 n creierul de obolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observ foarte

puini plasmoni (a) i comparativ cu controlul (n insert).

Fig. 147 Histopatologia esuturilor cerebrale la obolanii masculi Wistar tratai cu LPS dup expunerea la AuNP1 i AuNP2. A. control; B. LPS; C. LPS + AuNP1; D. LPS + AuNP2.

A

B

C

D

19

Concluzii generale

n aceast lucrare mi-am propus s obin n condiii blnde, vezicule de

dimensiuni nanometrice i nanoparticule platforme n biomedicin.

Pentru a mpiedica procesul de absorbie a proteinelor opsonice pe

suprafaa acestor transportatori a fost necesar stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili.

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprieti biodegradabile i

chitosanul, un biopolimer cationic, care poate interaciona att cu bistratul lipidic al

veziculelor ct i cu membranele anionice ale celulelor. Pentru ajustarea pH-ului,

la nivel fiziologic, toate sistemele coloidale au fost dializate, stabilitatea acestora

fiind medie acceptabil pentru aplicaiile propuse.

Caracterizarea formulrilor obinute a artat c veziculele sunt stabile

datorit polimerului de acoperire, carea a rigidizat structurile veziculelor i a creeat

o ncrcare cu sarcin pozitiv a acestora.

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus n eviden

urmtoarele:

procesul de eliberare se prelungete n timp fa de substana

nencorporat;

momentul eliberrii medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obinut cu ntrziere fa de obinerea maximului de

concentraie din snge, de asemenea efectul sedativ obinut la nivelul

sistemului nervos dup administrarea de magneziu ncorporat n vezicule,

a suferit intrzieri i mai mari).

Caracterizarea nanoparticulelor a artat c acestea sunt acoperite cu

polimer i prezint o bun stabilitate.

Studiul comportamentului soluiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (nclzire, rcire) a artat c soluiile sufer n timp un proces de

oxidare care se manifest mai rapid la ngheare i care n final poate fi considerat

un proces de mbtrnire mai lent.

Sub aciunea unor formulri chimice, nanoparticulele sufer un proces de

oxidare care destabilizeaz foarte rapid structura sistemului coloidal. Prin iradiere

n vizibil, am reuit s ntrziem procesul de oxidare n soluiile coloidale,

provocnd intensificarea efectului LPR.

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag i Au a artat c:

- att nanoparticulele de argint ct i cele de aur n cei doi polimeri prezint o bun

biocompatibilitate cu organismul.

- creterea activitii antibacteriene, datorit prezenei polimerului de asociere n

soluiile cu nanoparticule de argint, a permis obinerea unor rezultate superioare

pentru soluii de nanoparticule cu dimensiuni i concentraii mai mici dect cele

studiate n literatur. Mai mult dect att s-a observat c argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ dect argintul de 29 nm.

- soluiile cu nanoparticule de aur n chitosan acioneaz mpotriva toxicitii

induse de (un factor nociv) LPS, fapt demonstrat prin analiza detaliat a

parametrilor hematologici i a unor metabolii n serul animalelor experimentale.

Sub aciunea celor dou forme de stres, nanoparticulele de aur, nu au

putut contracara efectele supresive i ale activrii sistemului simpatic prin

administrarea LPS.

- soluiile cu nanoparticule de argint (23 nm i 29 nm) n PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de obolan. Ambele soluiil de aur n chitosan

nu au produs efecte neurotoxice, chiar dac la aurul de 22,22 nm s-au manifestat

uoare modificri la nivelul indicelui ficatului i al creierului.

Evaluarea histopatologic a creierelor n vederea determinrii

neurotoxicitii induse de nanoparticule, a artat modificri sub form de clivaj

local al neuronilor n cazul nanoparticulelor de Ag n PAmHU i lipsa total a

modificrilor patologice n cazul nanoparticulelor de Au n chitosan.

Comparnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile n cei doi

polimeri se poate spune c:

Nanoparticulele stabilizate n chitosan prezint modificri de

comportament la interaciunea cu mediul n care ajung, datorit

comportamentului diferit al chitosanului n funcie de pH.

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate n PAmHU sau n chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile, att n mediile de cultur ct i n testele pe obolani.

21

Lucrri tiinifice

Lucrri publicate ISI

1. M. Stefan, L. Hritcu, M. Mihasan, Daniela Pricop, Irina Gostin, R-I. Olariu,

Simona Dunca, V.Melnig, Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media, Journal of Materials Science: Materials in Medicine,

Volume 22, Issue 4 (2011), Pages 789-796, DOI 10.1007/s10856-011-4281-z,

ISSN:0957-4530 (print version). ISSN: 1573-4838 (electronic version),

Article;ISI Factor 2.325 (2010) Influence Score 0.597

2. Laura Obreja, Dana Pricop, N. Foca, V. Melnig, Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47(1), 2010, p.

42 - 47. ISSN 0025/5289.

3. L. Hritcu; M. Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; M. Mihasan; Liliana

Tartau; V. Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats,

Materials Science and Engineering C, 2011 (Impact factor 2,407), Influence

Score 0,61 (trimisa spre publicare ).

4. D. Bndar, C. Ionescu, V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J.

Colloid. Interf. Sci. (trimis spre publicare)

Abstracte publicate n reviste ISI

5. L. Tartau, D. Bindar, D. Ciubotariu, V. Melnig, Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats, Conference:24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location: Paris,

FRANCE Date: SEP 03-07, 2011, Sponsor(s): European Coll

Neuropsychopharmacol,Source:European Neuropsychopharmacology

Volume: 21 Supplement: 3 Pages: S267-S267, Published: SEP 2011, Impact

Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 1,5779)

6. L. Tartau, D. Bindar, V. Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European

Neuropsychopharmacology, Vol 20 Supplement 3, 2010, p. S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology, AUG 28-SEP 01, 2010 Amsterdam, Netherlands,

22

ISSN 0924-977X. (Abstract) Impact Factor: 4,201; AIS 1,208 (2010).

http://dx.doi.org/10.1016/S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 1,5779)

7. Daniela Bndar, Ana Garlea, Liliana Tartu, Viorel Melnig, Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p.

185S, ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor: 1.246 (2009))( Influence

Score 0,267).

8. Liliana Taru, Daniela Bndar, Raoul Vasile Lupuoru, Viorel Melnig, The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 212S, ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor: 1.246 (2009)) (Influence Score 0,267) .

Publicaii non-ISI publicate

1. Liliana Tartau, Daniela Bindar, V. Melnig, Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488, Acta Chemica Iasi, Vol 18(2)

2. A. Cazacu, D. Bndar, L. Taru, L. Hricu, M. tefan, L. Ni, C. Ionescu, V.

Nica, G.Rusu, M. Dobromir, V. Melnig (2011): Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis.

Analele tiinifice ale Universitii Alexandru Ioan Cuza, Seciunea Genetic

i Biologie Molecular, XII(1), pg.45-51.

3. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, V. Melnig, Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice, Academic Journal

of Manufacturing Engineering, vol.8 Issue 1, 2010, pp. 12-17 ISSN 1583-

7904.B+

4. D. Pricop, M. tefan, M. Mihasan, L. Hricu, R. Olariu, V. Melnig,

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis, The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania, Conference

Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization International

Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation Index.B+

5. D. Bndar, L. Taru, A. Grlea, L. Ni, V. Melnig, Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, Romanian

Journal of Biophysics, vol. 20, nr. 1, p. 2335, 2010.B+

6. L.Taru, R.V. Lupuoru, D.Bndar, V.Melnig, Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice, Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology, Volume XIV,

Number 2, June 2010, pp. 113-117.B+

23

7. L.Taru, C.E Lupuoru., D.Bndar, V.Melnig, Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the

Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December

2010.B+

8. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A. Chiriac, L. Ni, V. Melnig, Effect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice,

Annals of the Romanian Society for Cell Biology, Vol. XIV, Issue 2, p. 256-

260, 2009 .B+

Participri la conferine/congrese internaionale i naionale:

9. D. Pricop, M. tefan, M. Mihaan, L. Hricu, R. Olariu, V. Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis. The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization: Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies, November 25-27 2010, Sibiu, Romania (prezentare oral).

10. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A. Chiriac, V. Melnig, Acetaminophen

entrapped in soft matter vesicles design based on nociceptive model in mice

effects correlation, The 2nd

International Conference on Polymers Processing

in Engineering, Galai, 22 23 octombrie 2009 (prezentare oral).

11. L. Tartau, D. Bndar, R. V. Lupusoru, V. Melnig , The effects of magnesium

soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in mice International

magnesium symposium, Romania, The XII th International Magnesium

Symposium 22-25 Septembrie 2009 Iasi (prezentare oral).

12. L.Taru, L.V. Lupuoru, D.Bndar, V. Melnig, Experimental Reseaches on

the effects of tramadol soft matter vesicles in a somatic pain model in mice.

Post.Satelite to the 46-th EUROTOX Meeting, Inovation Trough

Nanotechnology and Nanomaterials- Current Aspect of Safety Assesment and

Regulation, 22-24 april 2010, Dresden Germany (prezentare orala)

13. L.Taru, D.Bndar, V.Melnig, Experimental researches on the effects of

original tramadol loaded nanoparticulate formulations in visceral nociception

, Joint meeting of 2-nd Hungarian Symposium on Neurostimulation,

Hungarian Pain Society and Teaching course on Neuromodulation for Central

and Eastern Europe , Greece and Israel, 30sept -2oct 2010, Pecs

Hungary.(prezentare orala)

14. L. Taru, C. E. Lupuoru, D. Bndar, V. Melnig Biocompatibility

investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles

Al XXVIII Simpozion Stiintific SRBC 9-12 Iunie 2010 , Constana

(prezentare oral).

24

15. L. Taru, C.E. Lupuoru, D.Bndar, V.Melnig, Designul, evaluarea toxicitii

acute i studierea eliberrii in vivo a ketoprofenului trapat n nano-vezicule

lipidice, , A XXVIII-a Sesiune Anuala a SRBC, 9-12 iunie 2010, Constana

(prezentare oral)

16. L. Taru, R.V. Lupuoru, D. Bndar, V Melnig, In vivo release and visceral antinociceptive effect evaluation of ketoprofen loaded vesicles in mice 11-th

International Congres of Clinical Pharmacology, Therapeutics and Toxicology

8-11 June Oradea 2010 (prezentare oral). 17. V. Melnig, L. Obreja A. Garlea, D. Bndar, Quantum nanoparticles effects

used for biological application. The X-th National Coference of Biophysics

CNB 2009 1-3 october 2009 Cluj (prezentare orala). 18. V.Melnig, N.Foca, L.Obreja, D. Pricop Size-controled synthesis of

monodisperse platinum nanoparticle by sonoelectrochemical methods. 3-rd

International Confertence Biomaterials & Medical Devices BioMed 2008,

13-16 november 2008 Bucuresti

Participri cu poster

1. L. Taru, D. Bndar, V. Melnig The effect of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice,The 23rd

ECNPCongres, Amsterdam, The Netherlands, 28 august-1 september 2010

(poster).

2. L. Taru, R.V. Lupusoru, D. Bndar, C. Lupusoru, V Melnig Experimental

researches on the effects of tramadol soft vesicles in a somatic pain model in

mice Inovation through nanotechnhology and nanomaterialsDresden 22-24

April 2010 (poster).

3. D. Bndar, A. Garlea, L. Tartau, V. Melnig, Design of magnesium chloride

soft vehicle carrier, 12th International Magnesium Symposium, Iasi 22-25

septembrie 2009 (poster).

4. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A.Chiriac, L Nit, V Melnig, Eeffect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice

The 15 th International Scientific Conference Land Force Academy 26-28

November 2009 Sibiu (poster).

5. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A. Chiriac, L. Ni, V. Melnig, Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-assemble characterization,

NanoRomania International Workshop Iasi, 2-5 iunie 2009 (poster).

6. A. Grlea, D. Pricop, V. Melnig, M. I. Popa, Paracetamol Nanocontainers

Obtained in Cationic Polymer-Surfactant Self-Assembling Matrices, 8th

International Conference on Physics of Advanced Materials, Iasi, 4-7 iunie,

2008 (poster).

25

7. L.Taru, D.Bndar, V.Melnig, Mophologic analysis and in vivo subacute

toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488,

1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale, Iasi 07-08 oct 2010

(poster)

8. M. Viorel, . Marius, H. Lucian, M. Mihan, C. Irina, D.Pricop, Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in

Poly(amide-hydroxyurethane) media. Al III-lea Congres Internaional i a

XXIX-a sesiune anual a S.R.B.C., 8-12 iunie 2011, Arad

9. D. Bndar, L. Taru, A. Grlea, L. Ni, V. Melnig, Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice, National

Conference on Biophysics, Cluj-Napoca, 1-3 octombrie 2009 (poster).

10. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A. Chiriac, L. Ni, V. Melnig, Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization,

Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB), Xth edition.

Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster).

11. A. Cazacu, L. Ursu, D. Pricop, L. Hricu, S. Marius, V. Melnig, Silver

nanoparticles plasmon resonant applications in biological microscopy,

Conferina Naional de Fizic CNF 2010 - Iai 23-25 septembrie 2010,

Rezumatele Lucrarilor p.174 (poster)

12. D. Bndar, A. Grlea, L. Taru, A. Chiriac, V. Melnig, Efectele

acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la

soareci, 21-22 octombrie 2009, Bucuresti (prezentare poster)

Contract de cercetare

PN II Idei cod 1996 nr. 509/2008: Sinteza in conditii blande prin

nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici

de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie

26

Bibliografie selectiv

1. D.D. Lasic, Elsevier, New York, 1998. 2. El-Sayed, I. H.; Huang, X.; EL-Sayed, M. A. Nano letters, 5, 821, 2005 3. Mie G (1908) Ann Phys 25:377 4. El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34:257 5. Kreibig U, Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters, Vol. 25. Springer,

Berlin

6. P. Buseck, J. M. Cowley, L. Eyring eds., High resolution transmission electron microscopy and associated techniques, New York, London, Amsterdam, Oxford

University Press 1988).

7. Douglas B. Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging, a John Wiley & Sons, Inc., Publication.

8. D. Cullity, Elemnts of X-Ray Diffraction, Reading, Addison-Wesley Publishing Co. Inc., 1978.

9. J. P. Glusker, M. Lewis, M. Rossi, Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists, VCH Publishers, New York, 1994.

10. R. Griffiths, J. A. De Haseth, Fourier Transform Infrared Spectrometr, Wiley, N York, 1986

11. J. R. Ferraro, K. K. Krishnan, Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Industrial and Laboratory Chemical Analysis, Academic Press, San Diego, 1990.

12. R. K. Poole, Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption: visible and ultraviolet spectra, n Michael. G. Gore (ed.), Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13. Grlea, A., M.I. Popa, V. Pohoa, V. Melnig, Ibuprofen/ketoprofen entrapment in chitosan based vesicle carrier, Rom. J. Biophys, 2007, 17, 157-168.

14. Daniela Bndar, Ana Garlea, Liliana Tartu, Viorel Melnig, Design of magnesium chloride soft vehicle carrier, Magnesium Research 22(3) 2009, p. 185S, ISSN 0953-

15. Taru L., Lupuoru C.E., Bndar Daniela, Melnig V., Biocompatibility investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles, Annals of the

Romanian Society for Cell Biology, Volume XVIII, Issue 2, December 2010

16. Snchez-Carpena, J., Domnguez-Hervella, F., Garca, I., Gene, E., Bugarn, R., Martn, A., Toms-Vecina, S., Garca, D., Serrano, J.A., Roman, A., Marin M,

Mosteiro ML. Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic. Eur J Clin Pharmacol. 63 (8):751-60, 2007

17. Zippel, H, Wagenitz, A., A multicentre, randomised, double-blind study comparing the efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain. Clin Drug Investig, 27 (8):533-43,

2007.

18. Jimnez-Martnez, E., Gasco-Garca, C., Arrieta-Blanco, J.J., Gomez del Torno, J., Bartolome Villar, B.. Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg. vs. Ibuprofen 600mg. after their administration in patients subjected to oral

surgery. Med Oral, 9 (2):143-8, 138-43, 2004.

19. L.Tartau, D. Bindar,V.Melnig, The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter vesicles in an experimental pain model in mice, European Neuropsychopharmacology,

Vol 20 S.3- Papers of the 23rd ECNP Congress,p. S276, ISSN 0924-977X

20. Obreja, l., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 31.

21. Cismaru, l., Hamaide, T., Popa, M., Materiale Plastice, 44(3), 2007, p. 243.

27

22. Laura Obreja, Daniela Pricop, Neculai Foca, Viorel Melnig, Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods, Materiale Plastice, 47 (1) pg.42-47 2010

23. Obreja, L., Foca, N., Popa, M. I., Melnig, V., Analele Univ. Al. I. Cuza, 7, 2008, p. 3

Obreja L, Dorohoi DH, Melnig V, Foca N, Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis. Mater Plast 3: 261-2641

24. Melnig, V., Ciobanu, C., J Optoelectron Adv Mater, 7(6), 2005, p. 2809.

25. Ana Cazacu, Daniela Bndar, Liliana Taru, Lucian Hricu, Marius tefan, Loredana

Ni, Cezar Ionescu, Valentin Nica, George Rusu, Marius Dobromir, Viorel Melnig

(2011): Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis. Analele tiinifice ale Universitii Alexandru Ioan

Cuza, Seciunea Genetic i Biologie Molecular, XII(1), pg.45-51

26. Bndar Daniela, Cezar Ionescu , V. Melnig, Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions, J. Colloid.

Interf. Sci. (trimis spre publicare)

27. M. Baia, F. Toderas, L. Baia, J. Popp, S. Astilean, Chem. Phys. Letters 422, 127, 2006

28. Panacek A, Kevitek I, Prucek, R, Kolar M, VecerovaR, Pizorova M, Sharma VK,

Nevena T, Zeboril R. Silver colloid nanoparticles: synthesis,characterization, and their

antibacterial activity

29. Ming-Hua Hoa, Pei-Yun Kuoa, Hsyue-Jen Hsieha, Tzu-Yang Hsienb, Lein-Tuan

Houc,Juin-Yih Laid, Da-Ming Wanga, Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129138)

30. L.D. Burke, A.M. O'Connell, A.P. O'Mullane, J. Appl. Electrochem. 33 (2003) 1125.

31. B. Bozzini, G. Giovannelli, S. Natali, Scr. Mater. 43 (2000) 877.

32. O'.M. Bockris, Z. Minevski, Int. J. Hydrogen Energy 25 (2000) 747.

33. J. Das, S. Patra, H. Yang, Chem. Commun. (2008) 4451

34. Hyun Ju Kang, Srikanta Patra, Jagotamoy Das, Abdul Aziz, Jinkyung Jo, Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles H.J. Kang et al. /

Electrochemistry Communications 12 (2010) 12451248

35. Lucian Hritcu; Marius Stefan; Daniela Pricop; Anca Neagu; Marius Mihasan; Liliana

Tartau; Viorel Melnig, Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C.

36. D. Pricop, M. tefan, M. Mihasan, L. Hricu, R. Olariu, V. Melnig, Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis, The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization: Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies, November 25-27 2010, Sibiu,

Romania, Conference Proceedings Book Series: Knowledge Based Organization

International Conference Volume: 7, ISSN 1843-6722. ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37. Garner J.P., Mason G.J., Behav Brain Res. 2002; 136(1):8392.

38. L. Hritcu, A. Ciobica, L. Gorgan, 2009, Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress. Cent. Eur. J. Biol., 4(3), 335342.