MICROSCOPIE ELECTRONICA

COCIURCA DUMITRU

1

CUPRINS

1. SCURT ISTORIC2. GENERALITATI3. PRINCIPIUL FIZIC4. VOLUMUL DE INTERACTIE AL FASCICULUI

PRIMAR CU CORPUL SOLID5. TIPURI DE SEMNALE6. PRINCIPII TEHNICE ALE MICROSCOPIEI

ELECTRONICE DE BALEIAJ7. PRINCIPII GENERALE DE FUNCTIONARE A

MICROSCOPULUI ELECTRONIC DE TRANSMISIE

8. FORMAREA IMAGINII9. FORMAREA CONTRASTULUI10. PREPARAREA PROBELOR11. DIFRACTIA DE ELECTRONI12. BIBLIOGRAFIE

2

1). Scurt Istoric

Primul microscop electronic a fost construit în 1931 de către inginerii germani Ernst Ruska și Max Knoll. Acesta era bazat pe ideile și descoperirile fizicianului francez Louis de Broglie. Desi primitiv si nepotrivit utilizărilor practice, instrumentul era capabil să mărească obiectele de patru sute de ori.

Reinhold Rudenberg, directorul de cercetări al companiei Siemens, a patentat microscopul electronic în 1931, desi Siemens nu făcea cercetări în domeniul microscoapelor electronice la acea vreme. În 1937 Siemens a început să-i finanteze pe Ruska si pe Bodo von Borries pentru dezvoltarea unui microscop electronic. Siemens l-a angajat si pe fratele lui Ruska, Helmut să lucreze la aplicații, în particular cu specimene biologice.(1)

Fig 1. Microscopul electronic construit de Ernst Ruska in 1933

3

Ecuatia lui Louis de Broglie pentru identificarea lungimii de unde a electronilor in miscare :

λ=h/mv

unde:λ = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa particulei consideratev = viteza de propagare a oscilatiei particulei

Ecuatia lui Louis de Broglie pentru identificarea lungimii de unde a electronilor in miscare :

λ=h/mv

unde:λ = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa particulei consideratev = viteza de propagare a oscilatiei particulei

2).Generalitati

Un microscop electronic este un tip de microscop care utilizeaza un fascicul de electroni pentru a ilumina specimenul si produce o imagine marita.Microscoapele electronice au o putere mai mare decat un microscop optic, deoarece electronii au o lungime de unda in jur de 100.000 de ori mai mica decat lumina vizibila ( fotoni ) si pot realiza mai mult de 50 pm rezolutie si o marire de pana la aproximatic 10.000.000x, pe cand un microscop optic este limitat la o rezolutie de aproximativ 200nm si o putere de 2000x. Microscopul electronic foloseste lentile electrostatice si electromagnetice pentru a controla fasciculul de electroni pe care il concentreaza pentru a forma o imagine.Aceste lentile sunt analoage, dar diferite de lentilele de sticla a unui microscop optic care formeaza o imagine marita, concentrandu-se pe lumina sau prin specimen.Microscoapele electronice sunt folosite pentru a observa o gama larga de probe biologice si anorganice, inclusive microorganisme, celule, molecule mari, probe de biopsie, metale si cristale.Industrial, microscopul electronic este adesea folosit pentru controlul calitatii si analizarea defectelor de fabricatie de marimi foarte mici/microscopice.

Fig.2

4

3).PRINCIPIUL FIZIC

Fig.3

O secţiune transversală printr-un microscop electronic modern relevă următoarele elemente constructive: coloana electrono-optică, sistemul de vidare, sistemele de detecţie, prelucrare, procesare şi redare a informaţiei şi blocul de alimentare cu energie a tuturor componentelor. Coloana electrono-optică se compune din tunul de electroni, lentilele condensoare şi lentila obiectiv.

Principial, construcţia unui microscop electronic este într-o oarecare măsură analogă construcţiei proiectorului optic obişnuit. Părţile principale, comune celor două instrumente, sunt următoarele: sursa (de iluminare la microscopul optic, de electroni la microscopul electronic), lentila condensoare (sau condensorul), obiectul de studiat, lentila proiectoare şi

5

sistemul de vizualizare şi înregistrare a informaţiei. Condensorul are rolul de a focaliza fasciculul de electroni pe probă,

asigurând un paralelism cât mai bun al radiaţiilor cu axa optică. Obiectivul formează imaginea primară, mărită, a obiectului; aceasta este preluată de lentila proiector care o măreşte mai mult, pentru observarea pe ecranul instrumentului.

Tunul de electroni are rolul de a genera fasciculul de electroni. În interiorul tunului de electroni un câmp electrostatic dirijează electronii emişi de o porţiune foarte mică a suprafeţei unui filament, printr-o apertură foarte îngustă. După aceea, tunul accelerează electronii prin coloană spre probă, cu energii cuprinse între căteva zeci şi zeci de mii de electronvolţi.

Fasciculul de electroni, emis de tunul electronic, care bombardează suprafaţa probei, este compus din electroni monocinetici şi poartă numele de fascicul incident sau primar. El poate fi supus unei tensiuni de accelerare de la 100V până la 40.000V, în funcţie de tipul de microscop folosit.

În momentul de faţă sunt utilizate căteva tipuri de tunuri de electroni: cu wolfram, cu hexaborură de lantan (LaB6) şi cu emisie de câmp. Constructiv, sunt utilizate materiale şi principii fizice diferite pentru obţinerea tunurilor de electroni, dar au ca scop comun generarea unui fascicul de electroni direcţionat, având curent stabil şi diametru cât mai mic posibil. Electronii parcurg tunul ca un fascicul divergent. O serie de lentile electromagnetice şi de diafragme din coloană reconverg şi focalizează fasciculul într-o imagine micşorată. Aproape de zona de jos a coloanei există câteva bobine de scanare în rastere, care deflectează fasciculul de electroni într-o grilă de baleiere pe suprafaţa probei. Lentila finală focalizează fasciculul într-o arie cu o dimensiune cât mai mică pe suprafaţa probei.

6

Figura 4. Reprezentarea schematică a microscopului electronic de baleiaj

După parcurgerea coloanei de electroni, fasciculul ajunge în camera probei. Aceasta încorporează dispozitivul de manevrare a probei, o uşă pentru introducerea sau extragerea eşantionului analizat şi câteva dispozitive pentru montarea detectorilor de semnale sau a altor accesorii. În momentul interacţiei fasciculului de electroni cu suprafaţa probei rezultă o serie de semnale, care după ce sunt detectate, amplificate şi procesate permit obţinerea unor informaţii privind morfologia, structura şi compoziţia probelor.

Semnalele rezultate în urma interacţiei fasciculului primar cu proba sunt: electronii secundari, electronii retrodifuzaţi (retroîmprăştiaţi), electronii Auger, electronii transmişi (în cazul probelor foarte subţiri), radiaţiile X, catodoluminiscenţa şi tensiunea electromotoare indusă.

Mărimea semnalelor obţinute, depinde de trei factori: grosimea probei investigate, compoziţia chimică a acesteia şi tensiunea de accelerare a electronilor.

O reprezentare schematică a diverselor tipuri de interacţiuni ale unui

7

fascicul electronic cu o probă solidă este prezentată în figura 5, unde sunt evidenţiate mecanismele de interacţiune utilizabile în diversele moduri de lucru specifice microscopiei electronice.

Fascicul electronic incident

Electroni retroimparstiati (reflectati elastic)

Electroni secundari (emisi)

Radiatii XRadiatii infrarosii

Radiatii luminoase (fotoni optici)

Microscopie electronica cu baleiaj sau de tip analitic

Microscopie electronica prin transmisie, microsopie electronica cu baleiaj prin transmisie, analiza dispersiva in energie

Electroni absorbitiCurent indus

Imprastiere elastica necoerenta

Imprastiere neelasticaFascicul nedeviat de electroni transmisi

Imprastiere elastica coerenta

PROBA

Figura 5. Semnalele rezultate în urma interacţiei dintre fasciculul de electroni şi corpul solid

În microscopia electronică de baleiaj, al cărui principiu a fost expus anterior, se utilizează fascicule de electroni incidenţi, cu energii de 1-50 keV, care fie sunt parţial împrăştiaţi înapoi (retroîmprăştiaţi, prin reflexie elastică pe atomii probei), fie determină emisia de electroni secundari prin interacţiune cu proba. Electronii retroîmprăştiaţi şi electronii secundari sunt efectiv utilizaţi pentru formarea imaginii în microscopul electronic de baleiaj. În microscopia electronică de transmisie convenţională, informaţia este obţinută prin intermediul electronilor transmişi, nedeviaţi, sau împrăştiaţi înainte, în diafragma unei lentile care va forma imaginea electronomicroscopică. În acest caz, energiile electronilor fasciculului

8

incident sunt cuprinse între 40 şi 200 keV, pentru microscopele convenţionale şi între 200 keV şi 3 MeV pentru microscoapele electronice de înaltă tensiune.

Împrăştierea electronilor poate fi elastică (fără pierderi energetice importante şi cu schimbare de direcţie) sau inelastică (cu pierderi energetice în care energia poate fi transferată atomilor probei sau probei ca atare în diverse moduri). În cazul împrăştierii inelastice, transferul energetic poate produce excitarea sau ionizarea electronilor legaţi, fie excitarea electronilor liberi sau a vibraţiilor reţelei (vibraţii fononice), fie încălzirea probei sau formarea de defecte de iradiere. Măsurarea acestor pierderi energetice poate da informaţii asupra naturii chimice a probei.

O altă clasificare a împrăştierii electronilor ţine seama de numărul de evenimente de împrăştiere implicate: monoîmprăştiere şi împrăştiere multiplă. În primul caz, electronul suferă o singură interacţiune, fapt observat de exemplu în straturile sau foliile subţiri studiate în microscopul electronic de transmisie. Împrăştierea multiplă conduce la o împrăştiere de tip difuziv în care mişcarea electronilor devine întâmplătoare. Acest tip de împrăştiere este caracteristică probelor masive, groase, studiate în microscopia electronică de baleiaj.

La impactul fasciculului electronic cu proba are loc o emisie de radiaţii X care poate fi analizată cu aparate dispozitive speciale (spectrometre), care permit identificarea şi determinarea concentraţiei elementelor constituente ale probei.

4).Volumul de interacţie al fasciculului primar cu corpul solid

Semnalul obţinut pentru formarea imaginii în microscopia electronică de baleiaj nu este obţinut numai din suprafaţa probei analizate. Fasciculul de electroni penetrează o anumită distanţă în interiorul probei şi poate interacţiona o dată sau de mai multe ori de-a lungul traiectoriei sale. Regiunea din probă dintre care semnalul original şi scăpările subsecvenţiale care nu mai pot fi detectate, se numeşte volum de interacţie.

9

Figura 6. Schema volumului de interacţie al fasciculului cu substanţa

Tipul semnalului, compoziţia probei şi tensiunea de accelerare au un efect asupra rezoluţiei microscopului, prin modificarea mărimii şi formei volumului de interacţie. În figura următoare este reprezentată schematic detecţia semnalelor în microscopia electronică de baleiaj şi zonele volumetrice unde sunt generate. În cele mai multe cazuri volumul de interacţie este semnificativ mai mare decât mărimea spot-ului, iar acest volum va deveni limita actuală a rezoluţiei.

5).Tipuri de semnale

Electronii secundari

Electronii secundari (SE) sunt electronii atomilor din probă care sunt ejectaţi în mediu datorită interacţiei cu electronii primari din fascicul. În general, ei au energii foarte mici (prin convenţie mai mici de 50 eV). Datorită faptului că au energii foarte mici, acest tip de electroni poate scăpa din suprafaţa probei doar dintr-o regiune de foarte mică adâncime. Prin urmare, electronii secundari oferă imagini de cea mai bună rezoluţie. În imaginile de electroni secundari este oferit în principal de toporafia suprafeţei probei. Cu cât volumul de interacţie este mai aproape de suprafaţa probei, cu atât mai mulţi electroni secundari pot fi emişi din probă, acest

10

fenomen producându-se atât în zonele cu vârfuri, cât şi în cele mai joase. Astfel se obţin imagini în care vărfurile vor fi mai luminoase, iar văile mai întunecate. Datorită acestui fapt, interpretarea imaginilor de electroni secundari devine foarte intuitivă.

Electronii retrodifuzaţi

Electronii retrodifuzaţi (BSE), sunt electronii primari care au fost împrăştiaţi în afara suprafeţei probei, datorită ciocnirilor elastice cu nucleele din atomii probei. Aceşti electroni posedă energii mari, cuprinse (prin convenţie între 50eV şi tensiunea de accelerare a fasciculului). Acest tip de electroni provin dintr-un volum mai mare de interacţie cu substanţa, ceea ce contribuie la pierderea rezoluţiei în imaginile de electroni retrodifuzaţi. În aceste imagini, contrastul este determinat de diferenţa numerelor atomice din fiecare punct bombardat cu fasciculul de electroni, de la media numerelor atomice ale elementelor din compoziţia probei. Din zonele ce conţin elementele cu numere atomice mai mari vor fi reflectaţi mai mulţi electroni, ceea ce conduce la obţinerea unei arii mai luminoase în imagine. Imaginile de electroni retrodifuzaţi nu sunt atât de uşor de interpretat dar, evaluate corect, pot oferi informaţii importante privind compoziţia probei.

În general, intensitatea curentului de electroni retroîmprăştiaţi creşte cu creşterea unghiului de împrăştiere, nu variază sensibil cu energia fasciculului primar şi creşte cu numărul atomic al probei.

Semnalul oferit de electronii retrodifuzaţi este detectat de doi detectori cu corp solid, care lucrând în regim de substituţie, adiţie permit obţinerea unor imagini privind topografia sau compoziţia suprafeţelor analizate.

Recombinarea şi catodoluminiscenţa

Prin interacţiunea unui fascicul incident cu o probă, mulţi electroni secundari produşi nu pot părăsi proba şi sunt anihilaţi, în urma împrăştierilor, prin procese de recombinare electron-gol. Dacă procesul de recombinare este însoţit de emisia de fotoni optici, apare fenomenul de catodoluminiscenţă. Mecanismul acestei fotoemisii este similar cu luminiscenţa în sensul că este stimulată de o serie de elemente active, aflate în cantităţi foarte mici în aria probei bombardate cu fasciculul de electroni. Exact la fel ca în cazul luminiscenţei normale, catodoluminiscenţa poate indica distribuţia în probă a acestor elemente cu concentraţii mici,

11

completând astfel informaţia privind compoziţia chimică a ariei bombardate, obţinute prin emisie de radiaţii X sau electroni Auger.

Catodoluminiscenţa în probele semiconductoare este dependentă de tensiunea electrică aplicată şi, în consecinţă, stările de suprafaţă în unele materiale semiconductoare pot fi studiate prin acest efect care furnizează date privind timpul de viaţă al purtătorilor de sarcină majoritari, lungimi de difuzie, etc. Fenomenul de catodoluminiscenţă este afectat de asemenea de topografia superficială şi de prezenţa unor defecte interne (dislocaţii, precipitate, limite intercristaline).

Acest fenomen de excitare a luminiscenţei prin bombardament electronic a fost observat şi în unele materiale plastice, organice şi în unele probe minerale.

Emisia de radiaţii X şi electroni Auger

Emisia de radiaţii X se produce dacă un electron de pe un nivel energetic inferior este excitat de fasciculul primar de electroni şi trece pe un nivel energetic superior, sau părăseşte complet atomul (fotoelectron). Locul vacant este ulterior ocupat de un alt electron care cade de pe un nivel energetic superior şi emite un foton de radiaţie X, de energie hυ egală cu diferenţa dintre energiile corespunzătoare celor două niveluri energetice între care a avut loc tranziţia.

Este posibil ca anumiţi electroni să fie reflectaţi din probă, după ce în prealabil au interacţionat neelastic cu atomii din probă. Ceilalţi electroni, care sunt împrăştiaţi la unghiuri mai mici spre interiorul probei, îşi pierd din ce în ce mai mult din energie, după fiecare coliziune, până când nu mai pot participa la un proces de ionizare prin impact (de obicei energia de ionizare este cuprinsă între 3 şi 8 eV).

Energia rezultată în urma frânării acestor electroni este emisă sub forma unor fotoni de radiaţii X ce alcătuiesc spectrul continuu de emisie a probei. Intensitatea maximă a spectrului continuu creşte cu tensiunea de accelerare, cu intensitatea fasciculului şi cu numărul atomic al probei.

12

Figura.7. Tranziţiile posibile şi notaţiile radiaţiilor X rezultateUn proces de ionizare se desfăşoară astfel: un electron rapid, din

fasciculul incident, se apropie de un electron legat de unul din atomii probei (situat pe unul din nivelele interioare ale atomului) şi în urma schimbului de energie produs datorită interacţiunii între câmpurile coulombiene ale celor doi electroni, electronul legat este forţat să treacă pe o stare excitată permisă, adică pe un nivel energetic superior din atom sau este expulzat din atom (fotoelectron), în timp ce electronul incident îşi pierde din energie. Locul vacant de pe nivelul energetic inferior va fi ocupat de către un electron de pe un nivel energetic superior, cu respectarea regulilor de tranziţie ( şi

sau ), iar diferenţa dintre energia pe care o avea electronul pe nivelul superior şi cea pe care o are pe noul nivel se va emite sub forma unui foton (cuantă) ce corespunde domeniului radiaţiilor X.

Energia fotonilor rezultaţi în urma tranziţiilor electronice depinde de energia nivelelor între care au loc tranziţiile şi, prin urmare, este caracteristică fiecărei specii atomice ( ). Aceste radiaţii alcătuiesc spectrul caracteristic de emisie al probei şi se suprapun peste spectrul continuu.

Lungimea de undă sau frecvenţa radiaţiilor X caracteristice, emise de

13

probă, se notează cu K sau K pentru tranziţiile efectuate între nivelul L şi K şi respectiv M şi K. În figura de mai sus este prezentat schematic modul de efectuare a tranziţiilor posibile pentru trei nivele electronice şi notaţiile radiaţiilor rezultate.

Radiaţia emisă în urma tranziţiei de pe nivelul L pe nivelul K constă dintr-un dublet K şi K. Raportul între intensitatea radiaţiei K şi K (

) rezultate din tranziţiile LII la K, respectiv LIII la K este proporţional cu

numărul electronilor în subnivelele corespunzătoare care este (regula

sumei). Raportul intensităţilor liniilor K şi K descreşte de la 10 pentru aluminiu (Z=13) până la 3 pentru staniu (Z=50). Motivul acestei variaţii este probabilitatea efectuării unei tranziţii care creşte pentru nivelele N şi M odată cu creşterea numărului atomic. O deviaţie puternică de la regula sumei este observată pentru seria L, care poate fi atribuită tranziţiilor Coster-

Kroning în care un loc gol de pe LI sau LII este ocupat de un electron de pe subnivelul LIII, iar energia rezultată este transferată unui electron de lângă nivelul Fermi şi liniile care rezultă din tranziţiile pe subnivelul LIII sunt relativ mai intense.Din punctul de vedere al analizei microscopice, este foarte important faptul că fiecare element chimic posedă un spectru unic de radiaţii X. Partea discretă a spectrului (adică partea formată din linii de maxime distincte) cuprinde linii care corespund tranziţiilor electronilor între păturile electronice L şi K din atom, tranziţiilor între păturile M şi K, tranziţiilor între păturile M şi L. Spectrul continuu de radiaţii X cuprinde fotonii proveniţi

14

din ciocnirile inelastice ale electronilor fasciculului incident cu electronii ţintei. Prezenţa spectrului unic de radiaţii X serveşte deci atât la analiza elementelor constituente dintr-un material, cât şi ca sursă potenţială de contrast de imagine.

În scopul producerii radiaţiei X caracteristice unui element, este necesar ca tensiunea de accelerare să depăşească un potenţial critic. În cazul unei tensiuni de accelerare de 30 kV, o radiaţie K suficient de intensă poate fi excitată în atomi cu numărul de ordine până la Z=40.

În general, radiaţiile X provin dintr-un volum al probei de ordinul câtorva m2 situat în imediata vecinătate a suprafeţei, din partea inferioară a volumului de interacţie a fasciculului cu substanţa (vezi figura 3). Analiza radiaţiei X emise de probă se poate efectua cu ajutorul unor spectrometre de construcţie specială, prin două moduri: metoda dispersivă după lungimea de undă şi metoda dispersivă după energii.

Rezultatul este prezentat sub forma unui spectru compus din intensitatea semnalului radiaţiilor X, pe axa verticală, respectiv energia, pe axa orizontală. Maximele reprezentate în spectrul de radiaţii X corespund elementelor prezente în probă, care se identifică după energia caracteristică. Concentraţia elementelor prezente în probă se evaluează după intensitatea maximelor caracteristice.

Din schema volumului de interacţie a fasciculului de electroni cu substanţa prezentată anterior, rezultă că rezoluţia spaţială în imaginile de radiaţii X este mai scăzută decât în imaginile de electroni secundari sau în imaginile de electroni retrodifuzaţi (volumul de probă de unde provin radiaţiile X este mult mai mare decât cel din care provin electronii secundari).

Este posibil ca în urma tranziţiilor electronice între nivelele interne ale unui atom să nu rezulte un foton de radiaţii X, ci energia rezultată să fie preluată de un electron legat şi acesta să fie emis. Energia electronului emuis este egală cu energia sa de pe nivelul pe care se afla plus energia rezultată din tranziţie. Electronnul astfel emmis se numeşte electron Auger.

Pentru elementele uşoare, probabilitatea de emisie a unui electron Auger este mai mare decât cea de emisie a unui foton de radiaţii X.

Mecanismul de producere a unui elecron Auger este următorul: dacă un electron de pe nivelul LI va efectua o tranziţie pe nivelul K, unde există un loc neocupat creat prin ionizare, şi energia rezltată va fi preluată de un electron de pe nivelul LII, acesta va fi expulzat din atom.

Energia electronului expulzat va fi egală cu energia pe care o are nivelul K minus suma energiilor nivelelor şi , ,

15

energia electronilor Auger fiind caracteristică fiecărei specii atomice.Deoarece energia electronilor Auger este foarte mică pot să iasă din

probă numai acei electroni formaţi în imediata apropiere a suprafeţei, fenomen evidenţiat în schema volumului de interacţie a fasciculului cu substanţa prezentată anterior. Se consideră că reuşesc să emeargă din probă numai electronii formaţi în primele două trei plane atomice de la suprafaţă.

Fenomenele de emisie a radiaţiilor X caracteristice şi a electronilor Auger constituie baza microanalizei cu radiaţii X şi a electronilor Auger.

6).Principii tehnice ale microscopiei electronice de baleiaj

În microscopul electronic de baleiaj, fasciculul de electroni, produs de tunul de electroni, este micşorat la maximum prin intermediul a 2 sau 3 lentile electromagnetice, urmărindu-se astfel obţinerea unui fascicul extrem de îngust, care este proiectat pe suprafaţa probei. Cu ajutorul a două bobine de deflexie, plasate în interiorul ultimei lentile electromagnetice, activate de un curent produs de un generator de baleiaj, fasciculul primar de electroni astfel focalizat, este determinat să efectueze o mişcare în zig – zag (raster), linie cu linie, a unei zone rectangulare de pe suprafaţa probei, realizându-se un fel de măturare a acesteia. La orice moment dat din timpul de scanare a suprafeţei probei, fasciculul de electroni iluminează un singur punct pe tiparul delimitat pe suprafaţa probei. Pe măsură ce fasciculul se deplasează pe suprafaţa probei punct cu punct, este generată o variaţie a intensităţii semnalului, ceea ce va reflecta diferenţele prezente pe suprafaţa probei investigate. Semnalul de ieşire obţinut va fi o înşiruire de date formate din curenţi seriali. Instrumentele de baleiaj mai noi includ posibilitatea obţinerii unor imagini digitale, care sunt obţinute prin conversia semnalului analog obţinut de detectori într-o serie de valori numerice. Ca urmare, fasciculul de electroni se află la perioade diferite de timp, în puncte diferite pe suprafaţa preparatului. În urma impactului fasciculului primar de electroni cu preparatul, semnalele generate sunt captate de detectori, transformate în semnal electric, amplificate şi trimise într-un modulator electronic, urmând ulterior ca intensităţile semnalelor să fie prelucrate digital şi afişate pe un ecran.

Baleierea se poate realiza prin două metode: deviaţia fasciculului de electroni cu ajutorul unor câmpuri

electrostatice sau electromagnetice variabile pe două direcţii reciproc perpendiculare;

prin deplasarea mecanică a probei în fasciculul electronic menţinut

16

fix.Generatorul de baleiaj trimite un curent în formă de dinte de fierăstrău

în bobinele de deflexie ale microscopului, în vederea producerii mişcării de baleiere a fasciculului pe suprafaţa probei. Fiecare punct scanat pe suprafaţa probei va corespunde unui punct din imaginea finală.

Analog luminii la microscopul optic, electronii nu formează o imagine reală în microscopia electronică de baleiaj, fiind construită o imagine virtuală din semnalul emis de probă.

Fiecare semnal colectat şi amplificat se aplică pe o grilă de înregistrare a semnalului. În majoritatea cazurilor, modul standard de lucru este cel emisiv în care sunt colectaţi electronii secundari emişi de probă. Colectorul se află la un potenţial de 250-300 V faţă de probă, ceea ce determină atragerea electronilor secundari. După o accelerare suplimentară până la o energie eU de circa 10 keV, electronii ajung pe un scintilator de plastic acoperit cu un strat subţire de aluminiu. Lumina creată în scintilator trece printr-o fibră optică spre un fotomultiplicator, unde este convertită în curent electric care poate fi amplificat. Timpul de zbor al electronilor este foarte scurt, de aproximativ 10-7 s. Acelaşi dispozitiv poate servi de asemenea pentru detectarea electronilor reflectaţi (retroîmprăştiaţi), cu condiţia aplicării unui potenţial mărit care să nu permită colectarea electronilor secundari de energii mai joase.

Un detector utilizat pe scară largă este detectorul cu semiconductori în care electronii incidenţi care lovesc detectorul produc perechi electron-gol, care determină apariţia unui curent electric în circuitul exterior. Deoarece detecţia este realizată electronic (neformându-se propriu-zis o imagine în sensul optic) se pot imagina diverse proceduri de prelucrare a semnalelor, acestea putând fi adunate, scăzute sau multiplicate.

La început, era utilizat un sistem de obţinere a imaginii simplu, format dintr-un tub catodic sau un sistem CRT. Sistemul CRT era format dintr-un tub vidat închis la un capăt cu o suprafaţă destinată imaginii, acoperită cu fosfor, care emitea lumină. La celălalt capăt al tubului se aflau tunul de electroni şi un set de bobine electromagnetice de deflecţie. Similar cu SEM-ul, sistemul CRT utiliza un fascicul de electroni acceleraţi spre suprafaţa acoperită cu fosfor. Bobinele de deflecţie scanau cu fasciculul tiparul imaginii pe suprafaţa afişajului. Fosforul avea rolul de a realiza conversia energiei electronilor incidenţi în lumină vizibilă. Intensitatea luminii depindea de intensitatea curentului din fasciculul de electroni. Prin sincronizarea sistemului de scanare CRT cu sistemul de scanare SEM şi prin

17

modularea curentului din CRT cu semnalul imaginii, sistemul cartografia semnalul punct cu punct pe o suprafaţă de formare a imaginii a sistemului CRT, ceea ce ducea la obţinerea unei imagini de electroni.

Având în vedere cele prezentate mai sus, schematic, funcţionarea unui microscop electronic de baleiaj se bazează pe câteva etape:

formarea şi accelerarea unui fascicul de electroni; fasciculul de electroni este delimitat si concentrat folosind

diafragmele metalice şi lentilele condensoare; utilizând lentila obiectiv (finală), fasciculul este focalizat pe suprafaţa

probei; interacţiile generate în interiorul probei bombardate generează

semnale care sunt identificate şi transformate într-o imagine sau în date privind conţinutul sau concentraţia elementelor din probă.

Din

punct de vedere constructiv, sistemul electrono-optic este constituit din coloana microscopului, camera de lucru în care se montează proba şi sistemul de detectori.

Coloana microscoapelor electronice de baleiaj nu depaşeste 80 cm în înalţime şi este aşezată de obicei pe aceiaşi masă pe care se află sistemul de

Figura 8. Formarea imaginii în microscopul electronic de baleiaj

18

operare şi afişaj, sau este fixată pe un suport separat în raport cu panoul de operare. În partea superioară a coloanei se află tunul electronic. Aproape la toate microscoapele de baleiaj se utilizează tunurile triodă cu termocatod de wolfram.

Tensiunea de accelerare aplicată la tun nu depaşeşte 40.000 V şi se aplică în trepte de la 100 V în sus, în funcţie de proba examinată. Fasciculul de electroni acceleraţi are la ieşirea din cilindrul Wehnelt un diametru cuprins între 250.000 şi 500.000 Å.

Pentru a putea fi exploatat, acest fascicul trebuie redus mult şi adus la nivelul preparatului, până la un diametru de 100 Å sau chiar mai mic. La unele microscoape, reducerea în diametru a fasciculului se realizează cu ajutorul a două lentile condensoare, iar altele cu un sistem format din trei lentile condensor. Aceste lentile de tip electromagnetic, alături de lentila obiectiv, constituie partea principală a coloanei microscopului. Trecând prin acestea şi prin aperturile centrate din planul principal al lentilei finale, fasciculul, care la emiterea din tunul de electroni are o densitate electronică de aproximativ 1015 electroni pe secundă şi un curent de 10-4 A, ajunge la final doar cu 6x106 electroni pe secundă, cu un curent extrem de mic, de ordinul a 10-10 – 10-12 A şi un diametru de 100 Å.

Lentila finală, fie că este vorba de o coloană cu două lentile, fie de una cu trei, este cea mai importantă; adesea este denumită lentila obiectiv, deşi rolul este de focalizare finală a fasciculului pe preparat. În partea centrală ea include sistemul de deflexie sau de baleiaj al fasciculului şi un stigmator pentru corectarea astigmatismului lentilei.

În partea inferioară a coloanei se află camera probei şi detectorii pentru semnalele emise de către probă. În interior, camera propriu-zisă este circulară, cu diametrul şi înalţimea variabile, în funcţie de instrument.

Suportul pentru probe este format dintr-o măsuţă pe care se pot fixa preparate, cu diametrul de până la 50 mm şi înalţimea de 10-20 mm, sau chiar mai mari. Suportul este mobil, astfel că preparatul poate fi rotit şi înclinat sub diferite unghiuri, pentru a fi expus fasciculului de electroni. De asemenea, el poate fi adus până la 5 mm distanţă de lentila finală, în special pentru obţinerea unor imagini de înaltă rezoluţie.

Sistemul de detectori reprezintă partea cea mai importantă a microscoapelor de baleiaj, care permit funcţionarea instrumentelor în unul sau mai multe moduri de operare. Sistemul de bază, din dotarea standard a microscoapelor, este format din detectorul pentru electroni secundari şi detectorul de electroni retrodifuzaţi.

Foarte multe dintre cele mai moderne microscoape de baleiaj au şi detectori pentru electroni transmişi, catodoluminiscenţă, forţe

19

electronomotoare şi detectorul de radiaţii X, utilizat pentru analize privind compoziţia chimică a probei. Tipurile de semnale care se obţin în microscopia electronică de baleiaj şi modalităţile de detectare pot fi diferite.

Fiecare detector este conectat cu o unitate electronică montată pe consola de control. Cu ajutorul unităţilor de control se poate trece uşor de la captarea unui semnal la altul, dacă aparatul este dotat cu toate tipurile de detectori.

Deoarece la toate microscoapele se utilizează în principal electroni secundari şi retrodifuzaţi, prezentăm în cele ce urmează principiul de detectare şi amplificare a acestora.

Detectorul de electroni este format dintr-un colector, un scintilator şi un fotomultiplicator.

Electronii rezultaţi din probă în numar destul de mic, sunt captaţi de colector şi acceleraţi cu o tensiune de peste 10.000 V, înainte de a atinge scintilatorul. Acesta din urmă este confecţionat fie din materiale plastice, dar în acest caz are o viaţă scurtă şi sensibilitate redusă, fie din silicat de ytriu, cunoscut in literatură şi sub denumirea de P-47 şi care are sensibilitate ridicată şi o durată lungă de exploatare. În urma impactului cu scintilatorul, fiecare electron dă naştere la un numar mare de fotoni care sunt dirijaţi într-un fotomultiplicator, unde fiecare fotoelectron formează un număr impresionant de mare de electroni secundari care sunt trimişi în tubul catodic şi utilizaţi la modularea fasciculului acestuia.

20

Figura 9. Tipuri de semnale şi modalităţi de prelucrare în microscopia electronică de baleiaj

În tabelul 1 sunt prezentate diversele moduri de lucru şi tipurile de informaţii obţinute în microscopia electronică de baleiaj.

21

Tabelul 1

Emisie Electroni secundari emişi

TopografiePotenţial electricCâmpuri electrice şi magnetice

10 nm100 nm1 m

Luminiscenţă Fotoni Compoziţional 100 nmConducţie Curenţi de probă Conductibilitate indusă 100 nmAbsorbţie Curenţi de probă

absorbiţiTopografie 1 m

Radiaţii X Fotoni X Compoziţional 1 mAuger Electroni Auger Compoziţional 1 mTransmisie Electroni transmişi Cristalografic 1-10 nm

Ultima generatie de microscoape electronice scanning, microscoapele ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope) permit efectuarea investigatiilor tuturor categoriei de probe: probe metalice, ceramice, biologice, umede, murdare uleioase fara nici o pregatire prealabile. Mai mult, pot fi investigate probe aflate inmediul lor natural de viata sau de lucru.

7).Principii generale de functionare a microscopului electronic de transmisie

Partea principala a microscopului electronic de transmisie o constituie coloana vidata care contine tunul electronic si ansamblul de lentile electromagnetice, dupa cum s-a aratat in capitolul anterior. Dupa iesirea din tun, electronii sunt focalizati pe proba prin intermediul a doua lentile condensoare. In timp ce prima lentila condensoare formeaza o imagine de spot de circa 1 µm diametru, a doua lentila condensor o mareste de doua ori. Deci spotul final al fasciculului observat pe ecran este de circa 2 µm, dar pata luminoasa a fasciculului va ocupa intreg ecranul la mariri mari.

Proba consta dintr-un strat subtire sau o folie de material supusa iradierii cu fasciculul electronic. In urma proceselor de interactiune (v. cap. 4), electronii transmisi si difractati (imprastiati elastic) trec prin aperture (diafragma) lentilei obiectiv. Imaginea I1 formata de lentila obiectiv este preluata de o lentila intermediara P1 care va forma o imagine intermediara I2. Aceasta va fi in final marita cu ajutorul lentilei proiector P2 si proiectata pe

22

ecran. In figura 1.a este prezentata schematic diagrama traiectoriilor electronice pentru obtinerea imaginii unei probe in microscopul electronic prin transmisie.

Prin excitarea diferita a lentilelor P1 si P2, este posibila asigurarea unui domeniu de mariri de la circa 1000 × si pana la peste 100 000 × .

Daca fasciculul incident este paralel, atunci fasciculele difractate care

23

parasesc proba pot fi focalizate in planul focal posterior al lentilei obiectiv si formeaza astfel o imagine de difractie. In acest scop lentila P1 este excitata la curenti mici, iar apertura obiectiv este plasata in jurul fasciculului nedeviat pentru a produce conditiile favorabile contrastului de difractie.

Diagrama traiectoriilor electronice, corespunzatoare obtinerii unei imagini de difractie, este reprezentata schematic in figura .2.b.

24

In figura de mai sus este prezentata o sectiune transversala printr-un microscop electronic de transmisie de tip JEM-100 S in care se observa principalele parti componente ale acestuia: tunul electronic (1); anodul (2); lentila condensoare (3); diafragma condensor (4); a doua lentila condensoare (5); suportul probei (6); diafragma obiectiv (7); lentila obiectiv (8); diafragma pentru microdifractie (9); lentila intermediara (10); lentila proiectoare (11); binocularul (12); ecranul (13); camera fotografica (14).

In tabelul 1 sunt prezentate comparativ caracteristicile unor microscoape electronice de transmisie moderne.

8).Formarea imaginii

Bazele fizice ale microscopiei electronice prin transmisie sunt determinate pe de o parte de interactiunea campurilor electromagnetice, produse in lentile, cu electronii, care influenteaza parametrii electronooptici ai instrumentului, si pe de alta parte de interactiunea electronilor cu proba de investigat. Ultimul factor joaca rolul hotarator in formarea imaginii in microscopia electronica.

Duap cum s-a aratat anterior, electronii sunt puternic imprastiati de corpurile solide; deci pentru ca electronii sa poata traversa proba este necesar ca aceasta sa aiba o grosime suficient de mica, iar electronii sa posede energii suficient de mari.

Interactiunea electronilor cu substanta poate conduce la doua tipuri de imprastiere ; imprastiere inelastica si imprastiere elastica.

Imprastierea inelastica rezulta in urma ciocnirii fluxului de electroni cu “norii” electronici ai atomilor substantei imprastietoare ceea ce duce la pierderea unei parti din energia fasciculului, cu schimbarea corespunzatoarea a lungimii de unda asociata. Energia pierduta se regaseste sub forma de energie termica, care ridica temperatura probei, sau sub forma de energie a fotonilor de radiatii X emisi de proba.

Imprastierea elastica se produce fara pierderea de energie si variatie a lungimii de unda a electronilor, aparand ca rezultat al devierii electronilor sub actiunea nucleelor atomice din substanta imprastietoare.

Intrucat intensitatea imprastierii electronilor pe nuclee este mult mai mare decat cea a imprastierii pe norii electronici, contributia imprastierii elastice la imprastierea totala va fi mult mai mare decat cea corespunzatoare imprastierii inelastice. De asemenea, imprastierea elastica a fasciculului electronic creste cu cresterea numarului de ordine al elementului respectiv.

Avand in vedere cele mentionate anterior, datorita imprastierii, fasciculul incident de electroni, paralel si cu sectiune mica, devine dupa

25

traversarea probei un fascicul divergent mult largit. Astfel electronii imprastitati vor forma un con spatial a carui axa este reprezentata de traiectoria nedeviata a fasciculului incident.

Cu cat este mai mic unghiul conului sub care sunt deviate electronii de la directia initiala, cu atat mai mare va fi densitatea electronilor imprastiati, deci implicit a electronilor care vor atinge in final ecranul sau placa fotografica. In general, imprastierea electronilor, deci marimea unghiului conului de deviatie, este influentata de densitatea substantei imprastietoare si de grosimea probei. Prin cresterea grosimii sau densitatii probei, fractia de electroni imprastiati la unghiuri mari creste. Acelasi fenomen se observa si la micsorarea energiei electronilor incidenti. Datorita acestui fapt, in microscopia electronica prin transmisie, probele au grosimi de cateva sute de angströmi la energii ale fasciculului electronic de 50 – 100 keV. In aceste conditii, fasciculul electronic este imprastiat la unghiuri mici, de ordinal a 1°, iar dispersia energetica la traversarea probei nu depaseste 10 eV.

Imaginea elecrono-optica a obiectului se formeaza prin intermediul lentilei obiectiv cu ajutorul electronilor imprastiati. Fasciculul paralel, format in tunul electronic si lentilele condensoare, contine electroni de aproximativ aceeasi energie (fascicul monocromatic).Dupa traversarea probei, fasciculul emergent contine electroni deviati sub unghiuri diferite. Ulterior, acest fascicul electronic transmis intra in lentila obiectiv, prevazuta cu o diafragma circulara cu deschidere de 0,03-0,04 mm, care joaca un rol important intrucat opreste electronii deviati la unghiuri mai mari decat deschiderea sa.

Electronii care nu trec prin diafragma nu vor participa la formarea imaginii in timp ce electronii nedeviati sau slab deviate vor trece prin lentila obiectiv si vor forma pe ecranul fluorescent imaginea electronooptica a obiectului de studiat ..

Probele supuse investigarii electrono-microscopice sunt de obicei asezate pe straturi suport care imprastie mult mai slab electronii decat proba, deci pe un fond luminos se va obtine imaginea mai intunecata a probei. Imaginea obtinuta astfel se numeste imagine in camp luminos .

26

Fig.10

Un alt tip de imagine care se poate obtine in microscopul electronic prin transmisie este imaginea in camp intunecat ( “dark field”), unde pe un fond intunecat se obtine imaginea luminoasa a obiectului. In acest caz, fasciculul electronic cade pe proba sub un anumit unghi fata de axa optica a microscopului, in asa fel incat electronii nedeviati sa fie stopati (absorbiti) de diafragma, prin deschiderea acesteia trecand si formand imaginea doar electronii care au suferit o imprastiere (difractie) suficient de intensa in proba (fig. 10b). Astfel, portiunile cele mai dense si mai groase vor aparea pe ecran cele mai luminoase, iar detaliile slab imprastietoare vor fi cele mai intunecate.

Pentru formarea imaginii in camp intunecat se poate utiliza fie inclinarea sistemului de iluminare (tunului electronic), fie deplasarea diafragmei din pozitia sa centrala. Imaginea in camp intunecat are o rezolutie ceva mai slaba decat cea in camp luminos, intrucat la obtinerea sa participa electronii imprastiati la unghiuri mari, cu o dispersie energetica relativ mare, ceea ce determina cresterea aberatiilor cromatica si sferica ale lentilei obiectiv.

Este interesant de observat ca, desi imaginea in camp intunecat poate fi considerata ca un negativ al imaginii in camp luminos, totusi exista o serie de detalii fine care nu coincid in cele doua tipuri de imagini. Din acest motiv, cele doua metode de obtinere a imaginii in camp luminos si intunecat sunt utilizate complementar.

Formarea imaginii unor seturi de plane ale retelei cristaline in probe metalice a fost posibila prin trecerea prin apertura lentilei obiectiv atat a fasciculului direct transmis cat si a fasciculelor difractate pe respectivul set

27

de plane. Imaginea formata poate fi considerata ca un tip de imagine de interferenta, utilizata curent ca test de rezolutie pentru microscopul electronic.

9).Formarea contrastului

Datorita neomogenitatii probei, diferitele sale zone vor imprastia electronii in mod diferit. Intrucat stralucirea imaginii va depinde de cantitatea de electroni care cad pe ecran, densitatea minima de electroni pe ecran va corespunde acelor detalii ale probei, cu cu grosime si densitate maxima, reprezentand zone de imprastiere puternica. Aceste detalii ale probei vor aparea in imagine mai intunecate. Invers, unele detalii slab imprastietoare ale probei vor apare pe ecran ca zone mai luminoase.

Diferenta de stralucire intre zone invecinate ale imaginii probei defineste contrastul imaginii in microscopia electronica. Pentru obtinerea contrastului in imagine pe ecranul fluorescent este necesar ca densitatea electronilor sa nu fie aceeasi pe sectoarele corespunzatoare diferitelor detalii ale obiectului, ceea ce va face ca aceste sectoare sa apara distincte. In cazul contrar, al unei densitati egale de electroni, ecranul se va lumina uniform, neaparand deci nici o imagine.

Contrastul imaginii creste cu cresterea diferentelor de densitate si grosime in diferitele zone ale obiectului si cu micsorarea deschiderii diafragmei lentilei obiectiv si a tensiunii de accelerare. Intr-adevar, cresterea tensiunii de accelerare produce cresterea vitezei elctronilor si, prin urmare, micsorarea imprastierii lor, ceea ce va slabi contrastul in imagine.

Un contrast foarte bun va permite observarea celor mai fine detalii existente in structura probei.

Din punct de vedere cantitativ, in microscopia electronica prin transmisie,, contrastul dintre doua zone diferite ale probei este dat de diferenta relativa a numarului de electroni care trec prin diafragma dupa imprastierea in cele doua zone; deci intensitatea contrastului, G, se defineste prin

, (19)

unde N1 si N2 reprezinta numarul de electroni pe unitatea de suprafata proveniti din cele doua zone invecinate ale probei.

28

In cazul probelor de grosimi mici, un calcul bazat pe proportionalitatea numarului de electroni imprastiati cu numarul de electroni incidenti si cu grosimea probei, duce la urmatoarea relatie:

, (20)

unde NA este numarul lui Avogadro, A masa atomica, ρ densitatea, σ capacitatea de imprastiere a electronilor de catre un anumit tip de atomi sub un unghi mai mare decat cel al diafragmei lentilei obiectiv, iar x1 si x2 sunt grosimile zonelor respective din proba. Marimea reprezintă coeficientul de transparenta al probei fata de fasciculul de electroni.

Din relatia (20) rezulta ca , la grosimi foarte apropiate, diferenta de contrast este legata exclusiv de diferenta dintre numerele atomice si masele atomice caracteristice elementelor din proba. In cazul unei probe care contine acelasi tip de atomi, contrastul depinde numai de variatia grosimii probei.

Din punctual de vedere al formarii contrastului exista o diferenta principiala intre microscopul electronic prin transmisie si microscopul optic obisnuit. In microscopul optic, contrastul apare din cauza absorbtiei diferite a luminii in zonele invecinate ale probei. In microscopul electronic, contrastul se formeaza pe baza imprastierii diferite a electronilor in portiuni adiacente din proba.

In probele amorfe (fara structura cristalina, deci cu o distributie haotica a atomilor substantei), fasciculul de electroni sufera o imprastiere dezordonata pe nucleele atomice avand ca rezultat devierea de la directia initiala. O fractie oarecare din flux patrunde prin diafragma, ceea ce conduce la formarea in imagine a unui contrast slab, numit contrast de absorbtie.

In cazul probelor cristaline, constratul imaginii in microscopia electronica prin transmisie este in principal un contrast de difractie, deoarece grosimea mica a probelor si tensiunile mari de accelerare fac ca absorbtia electronilor sa joace un rol neglijabil.

Contrastul de difractie este legat de imprastierea prin difractie a electronilor pe planele retelei cristaline dupa anumite directii preferentiale.. Electronii din fasciculul primar, difractati sub anumite unghiuri, modifica densitatea de electroni care formeaza imaginea, ceea ce explica aparitia contrastului de difractie. Intrucat, de obicei, unghiurile sub care electronii sunt difractati depasesc unghiul de deschidere al diafragmei lentilei obiectiv, zonele cristaline din imaginea in camp luminos vor aparea mult mai

29

intunecate decat cele amorfe.Contrastul de difractie este dependent de tensiune ade accelerare si de

particularitatile de difractie ale obiectului (gradul de cristalinitate, orientarea cristalografica, numerele atomice ale elementelor din proba, grosimile diferitelor zone ale probei).

In cazul in care reteaua cristalina are defecte (dislocatii, defecte de impachetare, pori, granite intercrstaline, limite de macle), conditiile locale de difractie vor fi alterate, fata de cazul unei periodicitati ideale a retelei cristaline, ceea ce va permite evidentierea acestor defecte prin metoda contrastului de difractie. Concomitent poate fi evaluata densitatea si distributia diferitelor tipuri de defecte in proba studiata.

10).Prepararea probelor

Metode de preparare a probelor fizico-metalurgiceProbele preparate pentru microscopia electronica prin transmisie trebuie

sa tina seama, in privinta grosimii, de tensiunea acceleratoare, pentru ca transmisia electronilor sa se faca fara pierderi energetice excesive. In general, pentru tensiuni acceleratoare pana la 100 kV, grosimea probelor poate varia intre 100Å si 1000Å , in functie de natura materialului si caracterul studiului intreprins.

In principiu se disting doua tipuri diferite de metode de pregatire a probelor in functie de scopul urmarit in cadrul investigatiilor structurale: metode de studiu a topografiei si morfologiei suprafetei si metode in vederea examinarii structurii interne.

a) metode de preparare a probelor pentru studiul topografiei si morfologiei superficiale. Una dintre tehnicile cele mai utilizate pentru investigarea suprafetelor este metoda replicilor. Aceasta metoda consta in depunerea pe suprafata probei investigate a unui strat subtire de substanta, care apoi se separa de proba, constituind o replica care se studiaza in microdcopul electronic prin transmisie, tinand seama ca replica reprezinta o copie negativa a topografiei suprafetei. Principala cerinta a unor replici de calitate este preluarea exacta prin replicare a topografiei superficiale a probei. Se pot obtine replici de pe suprafete rugoase, de pe suprafete de rupere (fractura) sau de pe suprafete polizate si lustruite, atacate chimic, electrochimic sau prin bombardament ionic. In cazul suprafetelor atacate, morfologia unor constituenti sau faze secundare poate fi usor relevata datorita ratei diferite de atac a acestora in rapot cu matricea.

In functie de natura si propietatile materialelor investigate exista mai

30

multe tipuri de replica: 1) replici in plastic; 2) replici obtinute prin evaporare; 3) replici obtinute prin oxidare.Replicile in plastic se obtin prin depunerea pe suprafata probei a unei

solutii de material plastic intr-un solvent organic corespunzator. Dupa evaporarea solventului, pe suprafata probei ramane un strat de lac solid si subtire, care se poate desprinde de proba pe cale mecanica sau chimica (prin dizolvarea probei). In acest scop se utilizeaza curent solutii de 0,5 – 2% colodiu in acetat de amil sau 1-5% formvar in dioxin. Uneori aceste replici sunt insa putin transparente pentru fasciculul de electroni si contrastul in imagine este scazut.

Mult mai utilizate sunt replicile obtinute prin evaporare care confera in general rezolutii inalte si contrast ridicat. In mod obisnuit aceste replici se obtin prin evaporarea termica in vid a carbonului in instalatii speciale de evaporare.

Replicile oxidice pot fi obtinute numai in cazul unor metale si aliaje care se oxideaza usor ( de exemplu aluminiul si aliajele sale). Stratul de oxid se poate obtine de exemplu ca rezultat al unui proces de electroliza si se desprinde de proba intr-un solvent corespunzator, fiind apoi asezat pe un suport special pentru studiul direct in microscopul electronic.

Frecvent, in functie de numarul etapelor parcurse pentru obtinerea preparatului de studiat, metodele de pregatire a replicilor ( replicare) se clasifica in :

- metode de replicare cu o singura treapta;- metode de replicare cu doua trepte.In prima metoda se obtine replica direct de pe suprafata investigate, asa

cum s-a descries anterior, aceasta copie negativa fiind studiata ulterior in miocroscopul electronic prin transmisie.

In a doua metoda , replica se obtine in doua etape: la inceput se obtine o replica intermediara groasa ( matrita) de pe suprafata probei, iar ulterior, dupa separarea mecanica a acesteia, se pregateste replica finala ( prezentand acelasi microrelief ca si proba initiala) printr-un procedeu asemanator primei metode. In acest scop, se executa evaporarea de carbon in strat subtire pe suprafata matritei, urmand ca replica finala de carbon sa se separte de matrita de plastic prin dizolvarea acesteia intr-un solvent organic.Ca materiale plastice pentru matrite se pot utiliza: polistirol, formvar, colodiu sau celuloza, iar ca silventi tipici pentru acestea se folosesc: benzol, dioxin, acetat de amil si acetona.

31

Replica monotreapta Replica in doua trepte Replica de extractie

a b c

Fig. 11

Contrastul in imaginea microscopica este neomogen in diferitele portiuni ale replicii, in functie de microrelieful suprafetei probei. In unele cazuri, contrastul poate fi atat de slab, incat unele detalii investigate nu pot fi distinse pe fondul general al imaginii. Pentru intensificarea contrastului se utilizeaza metoda umbririi cu metale grele care au o putere mai mare de imprastiere a electronilor. In principiu, metoda consta in depunerea prin evaporare in vid , sub anumite unghiuri fata de suprafata probei, a unor straturi subtiri de metal.

Depunerea are loc prin incalzirea electrica a materialului metalic intr-o spirala sau cosulet de wolfram sau tantal care se monteaza in acelasi dispozitiv de evaporare mentionat.

Particulele de metal formeaza straturi cu grosimi diferite, in functie de unghiul format de diversele portiuni al replicii in directia fluxului particulelor evaporate. Zonele din relieful replkicii, care se afla situate normal pe directia fluxului, vor fi acoperite cu un strat mai gros de metal, spre deosebire de celelalte zone unde grosimea stratului va depinde de unghiul de inclinare. Portiunile mascate de alte elemente de relief vor fi “ umbite”, deci in acele zone nu se va depune metal. Aceste regiuni vor fi mai transparente la electroni si, deci, in imaginea electrono-miocroscopica mai luminoasa decat portiunile acoperite cu un strat mai gros de metal, unde luminozitatea va fi in functie de grosime acestuia.

Metoda umbririi permite valoarea inaltimii h a elementelor de microrelief prin masurarea lungimii “umbrelor” lasate de acestea pe imagine, cu ajutorul relatiei:

32

, (21)

unde l este lungimea “ umbrei”, iar α unghiul sub care s-a facut “umbrirea”.Prin urmare, in cazul unor detalii de dimensiuni mari, se vor utilize

unghiuri de cca 45°, raportul inaltime-umbra fiind in acest caz de 1:1, iar in cazul unor detalii mai fine ale reliefului se recomanda folosirea unor unghiuri mici de umbrire de pana la 10-12°.

Metalele grele cele mai utilizate pentru umbrire sunt: crom, aur, platina, aliaje de platina cu paladiu sau aur, uraniu, oxid de uranium, oxid de wolfram etc.

Un tip special de replici il constituie repliocile de extractie ( fig.11c), care sunt replica obisnuite extrase de pe suprafete atacate chimic un timp mai indelungat, deci in replica vor fi retinute doar microparticule sau faze izolate. Microparticulele sau fazele extrase isi vor pastra morfologia si localizarea, iar prin tehnici de microdifractie sau microanaliza se va putea preciza natura acestora.

O alta metoda de preparare pentru investigarea suprafetelor prin microscopie electronica prin transmisie este metoda decorarii care consta in depunerea prin evaporare de scurta durata pe suprafata probei a unor germeni cristalini metalici, care vor forma aglomerari sau lanturi de particule in zonele continand defecte cristaline, pe care le “ decoreaza”, marcand prezenta si locul acestora in imagine. Prin metoda decorarii este posibila vualizarea directa a acelor elemente de relief superficial care constituie centre electric active sau concentratoare de tensiuni. De asemenea, se poate urmari evolutia defectelor respective ca rezultat al diverselor interactiuni fizico-chimice.

Toate tipurile de replici, fiind de grosimi reduse si, in general, fragile, sunt asezate pe suporti metalici sub forma de retea, avand uzual un diametru de cca 3mm.

b) metode de preparere a probelor in vederea examinarii structurii interne. O mare varietate de metode a fost propusa pentru reducerea grosimii probelor pana la obtinerea unor folii subtiri, cu grosimi adecvate investigatiilor electrono-microscopice. Straturi subtiri au fost obtinute prin evaporare si depunere in vid, sau prin pulverizare cu fascicule ionice a materialului respective pe suporti convenabili. Unele cristale ( de exemplu mica) pot fi direct clivate la grosimi suficient de subtiri, pentru a permite examinarea in microscopul electronic prin transmisie.

Metodele curente de obtinere a unor probe cu grosimi sub 0,5mm constau in taierea mecanica, eroziunea chimica sau electrochimica.

33

Materialele ceramice pot fi de asemenea subtiate prin utilizarea bombardamentului ionic.

In final, probele cu grosime redusa trebuie sa fie aduse la “transparenta electronica” printr-un process controlat de polizare electrolitica. Electropolizarea se efectueaza prin doua tehnici standard: metoda ferestrei si metoda Bollmann.

In prima metoda, proba acoperita cu un lac protector in zona marginilor, pentru a preveni un atac chimic excesiv, este suspendata intr-un electrolit. In fata probei, care constituie anodul, se afla catodul confectionat din acelasi material. Aplicand o tensiune si o densitate de curent adecvate, in “fereastra” constituita de zona nelacuita a suprafetei probei se formeaza gauri, pe marginea carora sau intre care se afla portiuni transparente pentru fasciculul electronic, acestea din urma putand fi decupate si studiate in microscop.

In metoda Bollmann, proba de subtiat (anodul) se afla intre doi catozi de otel inoxidabil ascutiti. Acesti doi electrozi sunt plasati la cca 0,5mm de centrul suprafeti probei. Dupa obtinerea unei perforatii, proba este deplasata astfel incat electrozii sa se afle intre perforatia anteriaoa si marginea cea mai apropiata a probei. Subtierea continua in acelasi regim, pana in momentul in care marginile perforatiei si probei aproape se unesc. Zona foliei cuprinsa intre cele doua margini poate fi taiata si examinata direct in microscop.

Solutiile de electroliti se aleg in functie de natura materialului iar regimul de subtiere electrolitica( tensiune, densitate de curent) este variabil si necesita uneori lucrul la temperature fie scazute, fie ridicate. Un exemplu tipic de electrolit, utilizat pentru subtierea otelurilor inoxidabile, este cel format din 42% H3PO4, 34% H2SO4 si 24% H2O, intr-un regim de polizare caracterizat prin U= 8-9 V, I=9-10A, t=30° -60° C .

Dupa cum s-a mentionat anterior, stratul subtiri metalice sau ceramice pot fi obtinute prin procedee de depunere prin evaporare in vid, prin pulverizare catodica sau cu fascicule ionice, prin depunere electrolitica, sau prin depunere chimica in faza de vapori (CVD). Straturile obtinute de grosimi variabile pot fi mono sau policristaline. Factorii esentiali pentru controlul dimensiunii grauntilor, orientarea cristalografica si compozia chimica a straturilor depuse sunt: viteza de depunere, temperature suportului, natura chimica a suportului si stratului. In calitate de suport se utilizeaza curent halogenuri alcaline, carboni, sticla, mase plastice etc.

Metode de preparare in domeniul biomedical

34

Deoarece probele biologice sunt extreme de fine si au rezistenta mecanica scazuta, obtinerea preparatelor biologice necesita utilizarea unor metode specifice de pregatire. In functie de natura preparatelor biologice ( suspensii continand virusuri sau bacterii, sectiuni ultrafine de tesuturi, replici ale unor probe biologice) se adopta diverse tehnici de preparare, avand in vedere faptul ca grosimea probei nu trebuie sa depaseasca 100 nm la o tensiune acceleratoare de 100 kV. In foarte putine cazuri ( virusuri, organite subcelulare izolate) grosimea este suficient de mica pentru observare directa.

Suspensiile pot fi depuse pe grilele suport (discuri de retea metalica acoperite cu un strat subtire organic lipsit de structura) prin pipetare, adsorbtie, intindere sau pulverizare.

Tehnicile de replicare ale probelor biologice sunt similare cu cele descrise in 2.4.1. In multe cazuri, replicare este precedata de o operatie de uscare prin congelare (“freeze-drying”) sau corodare prin inghetare (“freeze–etching”). Pentru marirea constratului preparatelor biologice se utilizeaza metalizarea sau umbrirea cu maetale grele prin evaporare in vid. Investigarea aspectelor morfologice implica metalizarea pentru observarea electronomicroscopica a virusurilor, bacteriilor, structurilor subcxelulare sau macromoleculare (acizi nucleici, proteine, enzime).

Principalele etape de preparare a unor sectiuni ultrafine de probe biologice sunt: fixarea, deshidratarea, inglobarea si sectionarea. Scopul principal al intregii proceduri este de a produce felii subtiri de preparat in care structura fina sa fie conservata cu o alterare minima fata de realitatea biologica.

Fixarea are ca scop stabilizarea organizarii celulare astfel incat relatiile ultrastructurale sa fie pastrate in cursul etapelor ulterioare de deshidratare, inglobare si expunere la fasciculul electronic. Fixarea poate avea loc “in vivo” (pe viu) sau imediat dupa moartea organismului. Mentionam printre agentii de fixare curent utilizati: tetraoxidul de osmium, aldehidele (in special glutaraldehidele), acetatul de uranil.

Deshidratarea se efectueaza imediat dupa fixare. Cei mai folositi agenti de deshidratare sunt etanolul si acetona. Intrucat rasinile poliesterice utilizate ca mediu de inglobare, sunt insolubile in etanol, probele sunt deshidratate in acetona sau in etanol cu utilizarea unei trepte intermediare de deshidratare in stiren sau acetona.

Inglobarea se aplica in stadiul final de preparare a unei probe biologice; pentru obtinerea prin taiere a unor sectiuni subtiri, proba este infiltrata cu un mediu de inglobare lichid care produce prin polimerizare un corp solid. Un mediu ideal de inglobare trebuie sa fie solubil in etanol sau acetona inaintea

35

polimerizarii, san u altereze proba fizic sau chimic, sa se durifice uniform, dar sa ramana totusi destul de plastic in vederea taierii sis a fie relativ stabil la bombardament electronic. Principalele tipuri de medii de inglobare sunt rasinile epoxidice, rasinile poliesterice si metacrilatii, primele fiind cele mai des folosite.

Sectionarea se face cu aparate speciale numite ultramicrotoame, care taie felii subtiri de 0,01-0,2 µm din blocul de inglobare continand tesutul de studiat. Taierea se face cu cutite speciale de sticla sau diamante.

In scopul imbunatatirii contrastului si rezolutiei se utilizeaza metode speciale, cum ar fi: colorarea pozitiva, colorarea negativa si umbrirea sau metalizarea.

Colorarea pozitiva consta in impreganarea structurilor biologice cu un colorant compus din saruri ale unor metale grele. Deoarece fiecare tip de molecula prezinta o afinitate chimica caracterisrica fata de colorant, imprastierea electronilor de catre atomii grei ai colorantului va fi diferita, in functie de cantitatea de colorant retinuta de molecula respective. Prezenta ionilor metalice mareste densitatea specifica a preparatului, ceea ce implica o marire a contrastului in imaginea electrono-microscopica, conform relatiei (20). Colorantii cei mai utilizati sunt sarurile de uraniu, de plumb, de thorium, de lantan, etc.

Colorarea negativa, metoda larg utilizata in studiul virusurilor, microorganismelor si fractiunilor celulare, consta in plasarea preparatului biologic intr-o solutie care contine un pigment cu putere foarte mare de imprastiere si care nu reactioneaza chimic cu preparatul. Dintre substantele utilizate ca pigmenti amintim fosfotungstenatii, acetatul de lantan, wolframatul de sodium , acetatul de uranil, etc.

Metalizare sau umbrirea este o metoda descrisa deja in 2.4.1.. In scopul evidentierii aspectelor morfologice ale unor preparate biologice ca virusuri, bacterii, structuri celulare sau macromoleculare (acizi nucleici, proteine, enzyme), pentru evaporate in vid se utilizeaza metale cum ar fi: aur, aliaj aur-paladiu, oxizi de uraniu, platina-carbon etc..

11).Difractia de electroni

Datorita proprietatilor ondulatorii ale electronilor, la trecerea acestora prin reteaua cristalina a probelor, are loc un fenomen de imprastiere dupa anumite directii, numit difractie. Electronii imprastiati formeaza, prin suprapunere, maxime de difractie a caror pozitie ordonata corespunde distributiei regulate a atomilor in reteaua cristalina. Astfel, ca urmare a difractiei electronilor, se obtine pentru fiecare substanta o imagine de

36

difractie caracteristica, care permite identificarea structurii si naturii probei investigate.

Considerand, intr-o prima aproximatie, difractia electronilor ca un rezulata al reflexiei fasciculului electronic pe unele plane atomice ale retelei cristaline, se poate stabili, pe baza directiei fasciculelor difractate, oreintare in spatiu a acestor plane, ceea ce echivaleaza cu legea de difractie descoperita de W. H. Bragg:

2d sinθ = n λ. (22)

Intr-adevar, in fig.12 se observa ca, daca un fascicul de electroni cade pe un cristal sub unghiul θ fata de un set de plane cristalografice-complet caracterizate ca pozitie spatiala prin trei numere denumite indici Miller ( h,k,l) – situate la distanta interplanara d, atunci difractia se produce, conform legilor din fixica clasica, daca drumul electronilor reflactati de plane atomice adiacente difere cu un numar intreg de lungimi de unda.

Fig. 12

Daca raza difractata pleaca de la planul de reflexie sub unghiul θ, atunci diferenta de drum a razelor, nλ., care corespunde drumului suplimentar parcurs de fiecare raza in raport cu precedenta (distanta ABC) va fie gala cu 2dsinθ, ceea ce reprezinta legea lui Bragg (22) mentionata anterior.

37

Fenomenul de difractie a electronilor prezinta o mare similitudine cu fenomenul de difractie a radiatiilor X in cristale. Totusi difractia electronilor prezinat o serie de particularitati legate de lungimile de unda mici associate electronilor si de imprastierea lor puternica pe atomii retelei. Astfel se explica faptul ca dimensiunea limita a particulelor cristaline care formeaza imagini de difractie corespunde la cca 102 – 103 Å pentru electroni si la cca 103 – 106 Å pentru radiatiile X. De asemenea, cu ajutorul difractiei de elctroni se pot studia straturi foarte subtiri de substanta (grosimi intre 20 si 1000 Å), fapt dificil de realizat prin investigatii roentgeno-structurale.

Cea mai simpla camera de difractie a electronilor consta dintr-un tun electronic, o lentila obiectiv, proba si ecranul de observare (fig. 13). Notand cu R distanta dintre pata centrala, corespunzatoare fasciculului electronic incident nedifractat, si un maxim de difractie, eset evident din figura ca:

R = L tg 2θ, (23)

unde L este lungimea camerei de difractie (in principiu, distanta proba-ecran). Masurand R si L se poate calcula unghiul de imprastiere θ. Apoi, cu ajutorul relatiei lui Bragg, se poate determina distanta interplanara d, cunoscand lungimea de unda λ calculata conform relatiei (3). Deoarece unghiul θ este foarte mic, in general, relatiile (22) si (23) pot fi aproximate prin:

2dθ nλ. (24)

și, respectiv,R L 2θ. (25)

Inlocuind valoare unghiului θ din relatia (24) in relatia (25) se obtine:

Rd = L λ (26)

38

Fig.13

Aceasta formula este des utilizata in interpretarea imaginilor de difractie a electronilor.

Dupa cum s-a mentionat in 2.3, in planul focal posterior al lentilei obiectiv este asezata o aperture care produce contrastul de difractie in imaginea electrono-microscopica. Daca in planul imaginii intermediare, formata de lentila obiectiv, sunt plasate aperturi de difractie care selecteaza o zona restransa a probei, atunci se poate obtine o imagine de difractie asociata acestei arii. Aceasta tehnica se numeste micro-difractie sau difractie pe arie selectata si are numeroase aplicatii practice, permitand identificarea cristalografica si a naturii chimice a unor particule izolate, precipitate, faze secundare etc., vizualizate deja prin microscopie electronica. Similar difractiei radiatiilor X este posibila determinarea cu o precizie relativ buna (0,1%) a parametrilor retelei cristaline.

Imaginile de difractie electronica au un caracter dependent de natura probei si de metoda de obtinere a imaginii. Astfel, exista urmatoarele tipuri de imagini de difractie obtinute la trecerea fasciculului electronic prin proba:

a) Imagini de difractie associate monocristalelor, în care maximele de difractie apar sub forma unor puncte izolate, provenite de al familiile de plane – existente in proba monocristalina- caracterizate de aceiasi indici Miller (fig. 14a). Simetria dispunerii maximelor de difractie punctuale in imagine este direct legata de simetria structurii cristaline a materialului din proba.

b) Imagini de difractie associate probelor policristaline, în care maximele de difractie se prezinta sub forma unor inele concentrice luminoase pe fond intunecat, rezultat al prezentei unui numar mare de cristalite in proba cu orientari diferite in spatiu. In acest caz fasciculul primar intalneste un numar mare de plane cristaline, apartinand aceleiasi familii, iar fasciculele difractate se vor aseza pe panzele unor conuri avand drept axa fasciculul primar nedeviat. Din intersectia acestor conuri cu ecranul de observare rezulta inelele de difractie observate in figura 14b.

39

Fig. 14

c) Imagini de difractie pe probe texturate, in care apar o serie de arce de cerc a caror lungime este proportionala cu gradul de texturare. Prin grad de texturare al unei probe policristaline se intelege procentul statistic majoritar de cristalite orientate dupa o directie comuna [hkl].

40

BIBLIOGRAFIE

1. Ernst Ruska (1986). Autobiografia lui Ernst (versiunea in engleza). Nobel Foundation. Accesat la 2007-02-06.

2. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1986/3. http://www.scribd.com/doc/57678478/Microscopie-electronica

4. OÅM: World-Record Resolution at 0.78 Å, (18 mai 2001) Berkeley Lab Currents5. http://dexonline.ro/definitie/in%20situ

6. Microscopia electronică cu scanare , 1928 - 1965

41