1

Analiza structurala si modularea functionala a drenajului fluidului perivascular si al amiloidului Abeta in creier

Director proiect: Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel, U.M.F Craiova, Disciplina Metodologia Cercetarii Stiintifice, Departamentul I Stiinte Morfologie

Raport Stiintific Etapa a II-a (01.01.2018- 30.06.2018)

Obiectivele fazei de executie

In decursul celei de-a doua etape a proiectului de fata s-au definitivat toate experimentele propuse, si s-au publicat toate materialele proconizate, inclusive cele aflate in statusul de “acceptat sau in review” la sfarsitul etapei anterioare. S-au atins urmatoarele obiective si activitati:

1. Continuarea managementului proiectului.

Intalnirile dintre parteneri au avut ca scop pe intrega durata a proiectului in primul rand discutarea si ajustarea protocoalelor de lucru si evaluarea statusului experimentelor efectuate. S-a updatat in permanenta baza de date EndNote cu referinte bibliografice, membrii proiectului beneficiind de aproape 6.000 de indici bibliografici organizati pana la ora redactarii acestui raport (Figura 1).

Figura 1. Captura de ecran a bazei de date bibliografice completate in timpul derularii acestui proiect.

In plus s-a decis si redactarea si trimiterea spre publicare a unor articole de tip review, pe baza experientei si literaturii accumulate si discutate in timpul proiectului. Astfel, legat de participarea amiloidului Aβ in fiziopatologia dementelor, boala Alzheimer (BA) in special, este importanta si interactiunea sa cu celalalt denominator patologic al BA, respectiv proteina tau asociata microtubulilor. Modificarile acesteia post-transaltionale ce duc la hiperfosforilarea si acumularea sa drept ghemuri neurofibrilare (neurofibbrilary tangles) au fost descrise intr-un review publicat ca rezultat al studiului bibliografic (Figurile 2-3) (Pirscoveanu, Pirici et al. 2017).

Figura 2. Structura proteinei tau si prinicpalele sale situsuri de fosforilare.

2

Figura 3. Structura genei proteinei tau si matisarea sa alternative cu diferitele izoforme rezultate.

Avand in vedere tehnica de microscopie cu stimulare de tip doi fotoni (2PM) pe care am inceput sa o implementam in biobaza UMF Craiova, studiul bibliografic alaturi de experienta membrilor grupului in imagistica 2PM in vivo a dus la redactarea unui review ce se axeaza pe detalierea principalelor avantaje/ dezavantaje ale 2PM fata de microscopia confocala clasica (Stopper, Balseanu et al. 2018). Desi rezolutia spatiala este superioara in microscopia confocala, acest setup nu este compatibil cu evaluarea unui marker fluorescent pe adancimi mari de tesut nefixat, si in dinamica.

Trecand la implementarea practica, experienta echipei a aratat ca, utilizand un model animal cu microglii fluorescente endogen, desi morfologia microgliala este aparent mai completa pe tesutul fixat in formol si evaluat prin microscopie confocala (comparativ cu tesutul fixat evaluat prin microscopie 2PM), aplicarea tehnicii 2PM in vivo aduce un plus de rezolutie fata de imagistic ape tesutul fixat, fiind deci mai aproape de aspectul real al arborizatiei celulare vizualizate pe tesut fixat in fluoresecnta confocala (Figura 4).

Figura 4. Evaluarea comparativa a complexitatii microgliale in microscopie 2PM si confocala.

3

2. Analiza integrativa finala

2.1. Injectia intracerebrala a Aβ40 cu /fara inhibitorul de AQP4. Evaluarea in vivo in microscopie cu doi fotoni; analiza integrativa finala

Cu ajutorul unui sistem de microinjectare intracerebrala de conceptie proprie (cu transmitere pneumatica pentru eliminarea vibratiilor), s-a testat efectul injectarii amiloidului Aβ40 pe populatia microgliala. Pe un model animal transgenic CX3CR1 ce exprima microglii fluorescente, s-a aratat intr-o prima faza ca numarul si ramificatiile acestora sporesc dupa injectarea de amiloid intracerebral, fiind descrise in lietartura calitatile de fagocite pe care le au fata de amiloid (Figura 5).

Figura 5. Dupa injectarea Aβ40 microgliile devin mai dense si mai ramificate (activate) (dreapta).

Dupa punerea in evidenta a rolului de macrofage al microgliilor activate, obiectivul studiului nostru a fost sa evaluam distributia fractiei difuzibile si nefagocitate de amiloid. In acest scop am injectat sub microscop, o solutie de Aβ40 HiLyte FluorTM (AnaSpec, USA; 3µl in 1% NH4OH), si de dextern marcat fluorescent in scopul vizualizarii simultane a difuziei Aβ40 in relatia sa cu vasele de sange.

Testul s-a facut pe animale fara modificari functionale ale barierei hematoencefalice, dar si pe animale tratate cu inhibitorul de AQP4, TGN-020 [N-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)pyridine-3-carboxamide], in doza de 200 mg/kg dizolvat in ser fiziologic (Huber, Tsujita et al. 2009, Igarashi, Huber et al. 2011, Nakamura, Suzuki et al. 2011).

.

Figura 6. Difuzia in vivo a Aβ40 (verde) in jurul vaselor de singe (dextran, rosu) prin microscopie 2 fotoni Sagetile albe indica remanenta peptidului perivascular, in timp, la animalele tratate cu TGN-020.

4

Publicatia noastra recenta ce arata ca inhibitia AQP4 duce la blocarea lichidului interstitial in spatiile perivasculare si paravasculare (si la ingrosarea membranelor bazale vasculare) preconize ca si Aβ in drenajul sau perivascular ar putea fi blocat in acest spatiu (Pirici, Balsanu et al. 2017).

Rezultatele acestui studiu (Figura 6) au aratat fara echivoc, ca dupa injectia intracerebrala lenta, Aβ40 difuzeaza incet si este degradat la nivelul parenchimului (microglii, enzime interstitiale, captare la nivelul vaselor de sange. Injectarea Aβ40 la 30 de minute dupa dministrarea de TGN-020 a aratat insa pentru prima data in literatura, captarea peptidului amiloid si remanenta acestuia la nivelul spatiilor perivasculare, chiar si dupa captarea si difuzia sa la nivelul parenchimului.

Aceasta este prima dovada experimentala a ipotezei noastre, conform careia inhibarea transportului de apa paravascular mediat de AQP4 duce si la blocarea preluarii lichidului interstitial din parenchim, si implicit a peptidului Aβ, probabil aceasta cale fiind una din primele elemente fiziopatologice implicate in maladia Alzheimer.

2.2. Microscopie electronica de transmisie; analiza integrativa finala

In cadrul primei etape a proeictului, o parte din blocurile incluse au fost postfixate in glutaraldehida, procesate si fotografiate prin microscopie electronica de transmisie (TEM) in cadrul UMF Carol Davila. Analiza integrativa a aratat acum o ingrosare a membranelor bazale endoteliale la animalele injectate cu inhibitorul de AQP4 comparativ cu animalele de control, analiza fiind facuta dupa o fereastra de supravietuire de 30 de minute de la injectarea intraperitoneala a inhibitorului (Figura 7).

Ca si in cazul difuziei Aβ40, aceasta este prima evidenta directa ultrastructurala a blocarii curgerii fluidului paravascular dupa inhibarea transportului de apa mediat de AQP4.

Figura 7. Ingrosarea membrane bazale endoteliale la animalele tratate cu inhibitorul de AQP4 (pe verticala) versus control. Barele albe identifica morfologic membranele bazale endoteliale.

5

2.3. Screening anatomo-histologic al vaselor limfatice durale; analiza integrativa finala

Proiectul nostru a propus analiza vaselor limfatice durale de la nivelul encefalului, in lumina descoperirii prezentei reactivitatii pentru markeri limfatici la acest nivel, iar in prima etapa a proiectului s-au evaluat tehnici de procesare a craniului pentru a decalcifica si mentine meningele in contextul sau anatomic, dar s-au testat si anticorpi pentru vizualizarea vaselor de sange si limfatice.

Dupa finalizarea optimizarilor proceselor de decalcificare si de imunocolorare s-au urmat doua cai de analiza a tesutului:

a. Scanarea sectiunilor seriate rezultate din procesarea cutiilor craniene si urmarirea morfologiei vaselor limfatice si a piei mater, realizate cu ajutorul statiei grafice Leica Ariol din cadrul UMF Carol Davila (Figurile 8-9).

Figura 8. Sectiuni seriate scanate complet pentru analiza morfometrica a piei mater.

Figura 9. Imunomarcarea pentru vasele limfatice (Lyve1) a aratat pe sectiuni seriate (sagetile rosii) continuitatea vaselor limfatice subcutanate cu sinusurile venoase si cu pia mater.

6

b. Continuarea investigarii imunofluorescente de inalta rezolutie a expresiei celor doi markeri la nivelul vaselor meningeale (CD31 - verde si Lyve1 - rosu) (Figura 10).

Figura 10. Imunomarcarea vaselor limfatice (rosu) si de sange (verde) meningeale.

In concluzie, analiza pe sectiuni seriate a fenotipului de expresie a markerilor limfatici si endoteliali a aratat, pentru prima data, ca acest fenotip este exprimat puternic la nivelul piei mater, vaselor meningeale si a unei proportii din vasele corticale; precum si ca aceste vase comunica larg cu sinusurile venoase intraosoase si cu vasele scalpului.

3. Diseminarea rezultatelor

Pe parcursul desfasurarii proiectului s-a mentinut o pagina web dedicata proiectului (http://www.umfcv.ro/143ped), s-au stabilit si confirmat protocoalele finale de lucru, si s-au obtinut acordurile comisiilor de Etica ale UMF Craiova si UMF Carol Davila.

La data finalizarii celei de-a doua etape a proiectului, in plus fata de prima etapa, au existat urmatorii indicatori de diseminare:

Articole acceptate care intre timp au fost publicate:

1. Catalin B, Rogoveanu OC, Pirici I, Balseanu TA, Stan A, Tudorica V, Balea M, Mindrila I, Albu CV, Mohamed G, Pirici D, Muresanu DF. Cerebrolysin and aquaporin 4 inhibition improve pathological and motor recovery after ischemic stroke. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2018 Apr 25. doi: 10.2174/1871527317666180425124340. [Epub ahead of print]

2. Pirici I, Balsanu TA, Bogdan C, Margaritescu C, Divan T, Vitalie V, Mogoanta L, Pirici D, Carare RO, Muresanu DF. Inhibition of Aquaporin-4 Improves the Outcome of Ischaemic Stroke and Modulates Brain Paravascular Drainage Pathways. Int J Mol Sci. 2017 Dec 23;19(1). pii: E46. doi: 10.3390/ijms19010046.

3. Pîrşcoveanu DFV, Pirici I, Tudorică V, Bălşeanu TA, Albu VC, Bondari S, Bumbea AM, Pîrşcoveanu M. Tau protein in neurodegenerative diseases - a review. Rom J Morphol Embryol. 2017;58(4):1141-1150.

7

4. Tudoraşcu DR, Pirici D, Târtea EA, Mustafa ER, Florescu C, Vere CC, Balea AM, Puiu I, Târtea GC, Albu VC. Synaptophysin expression as prognostic factor for survival in colorectal carcinomas. Rom J Morphol Embryol. 2017;58(4):1409-1415.

Articole acceptate si publicate:

1. Stopper L, Bălşeanu TA, Cătălin B, Rogoveanu OC, Mogoantă L, Scheller A. Microglia morphology in the physiological and diseased brain - from fixed tissue to in vivo conditions. Rom J Morphol Embryol. 2018;59(1):7-12.

Noi articole acceptate spre publicare:

1. Mitran SI, Burada E, Tanasie CA, Manea NC, Ciorbagiu MC, Mirea CS, Balseanu TA. Microglial morphology determined with confocal and two-photon laser scanning microscopy. Rom J Morphol Embryol. 2018;59(1):2 in press

Prezentari la conferinte si congrese nationale si internationale:

1. Pirici D, Catalin B, Balsanu TA, Pirici I, Nicola CG, Ofiteru AM, Mogoanta L, Margaritescu C. Inhibiting aquaporin 4 modulates the perivascular drainage of amyloid Aβ peptide in the brain. European Journal of Neurology (The 4th Congress of the European-Academy-of-Neurology: Lisabona, Portugalia, 16-19 iunie 2018), Vol 25, Suppl 2

2. Pirici D, Bogdan C, Balsanu TA, Manole E, Bastian AE, Pirici I, Mogoanta L, Margaritescu C. Inhibitia aquaporinei 4 moduleaza fluxul perivascular al peptidului Aβ in creier. Al XVI-lea Simpozion National de Morfologie Microscopica cu participare internationala, Craiova, 23-26 mai, 2018

3. Pirici I, Catalin B, Balsanu TA, Silvia PE, Margaritescu C, Mogoanta L, Ion DA, Pirici D. Analiza tridimensionala a vaselor limfatice durale la soarece. Al XVI-lea Simpozion National de Morfologie Microscopica cu participare internationala, Craiova, 23-26 mai, 2018

Ca si concluzie generala, in cadrul acestui proiect am aratat ca (1) inhibarea AQP4 reduce curgerea fluidului perivascular si drenajul acestuia de-a lungul membranelor bazale vasculare cerebrale, si (2) ca vasele de sange meningeale exprima markeri limfatici, si ca sunt in continuitate cu sinusurile venoase ale calvariei si cu vasele limfatice ale scalpului.

05.07.2018 Director proiect, Prof. Univ. dr. Pirici Nicolae-Daniel

8

Referinte Huber, V. J., M. Tsujita and T. Nakada (2009). "Identification of aquaporin 4 inhibitors using in

vitro and in silico methods." Bioorg.Med.Chem. 17(1): 411-417. Igarashi, H., V. J. Huber, M. Tsujita and T. Nakada (2011). "Pretreatment with a novel aquaporin

4 inhibitor, TGN-020, significantly reduces ischemic cerebral edema." Neurol.Sci. 32(1): 113-116. Nakamura, Y., Y. Suzuki, M. Tsujita, V. J. Huber, K. Yamada and T. Nakada (2011). "Development

of a Novel Ligand, [C]TGN-020, for Aquaporin 4 Positron Emission Tomography Imaging." ACS Chem.Neurosci. 2(10): 568-571.

Pirici, D., L. Mogoanta, S. Kumar-Singh, I. Pirici, C. Margaritescu, C. Simionescu and R. Stanescu (2009). "Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype." J.Histochem.Cytochem. 57(6): 567-575.

Pirici, I., T. A. Balsanu, C. Bogdan, C. Margaritescu, T. Divan, V. Vitalie, L. Mogoanta, D. Pirici, R. O. Carare and D. F. Muresanu (2017). "Inhibition of Aquaporin-4 Improves the Outcome of Ischaemic Stroke and Modulates Brain Paravascular Drainage Pathways." Int J Mol Sci 19(1).

Pirscoveanu, D. F. V., I. Pirici, V. Tudorica, T. A. Balseanu, V. C. Albu, S. Bondari, A. M. Bumbea and M. Pirscoveanu (2017). "Tau protein in neurodegenerative diseases - a review." Rom J Morphol Embryol 58(4): 1141-1150.

Stopper, L., T. A. Balseanu, B. Catalin, O. C. Rogoveanu, L. Mogoanta and A. Scheller (2018). "Microglia morphology in the physiological and diseased brain - from fixed tissue to in vivo conditions." Rom J Morphol Embryol 59(1): 7-12.