MICROBIOLOGIE GENERALA Gr. Mihaescu, Carmen Chifiriuc, Lia Mara Ditu CUPRINSPrefa Cuvnt nainte Introducere Evoluia microbiologiei ca tiin Diviziunile microbiologiei Importana practic a microorganismelor Poziia microorganismelor in sistemele de clasificare a lumii vii Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor Clasificarea lumii vii n 3 domenii pe baza criteriilor moleculare Caracteristicile distinctive ale organismelor celor trei domenii Tipuri morfologice de bacterii Capitolul I. STRUCTURA i FUNCIILE CELULEI BACTERIENE Peretele celular Structura molecular a peretelui celular la bacteriile Gram pozitive Peretele celular la bacteriile Gram negative Peretele celular la Archaea Peretele celular acido-rezistent al micobacteriilor Stratul S Funciile peretelui celular Protoplatii Spaiul periplasmic Membrana plasmatic Membrana archaea Funciile membranei plasmatice Difuzia i transportul moleculelor n celul Difuzia pasiv Sisteme de transfer cu molecule purttor Difuzia facilitat Translocaia de grup Transportul activ Ttransportut ionilor Aparatul fotosintetic Mezosomul Citoplasma Echilibrul osmotic al celulei Echilibrul osmotic la bacteriile halofile Nucleoidul bacterian Organizarea fizic a cromosomului Replicarea ADN bacterian Ribosomii Particularitile sintezei proteinelor la bacterii Secreia proteinelor extracelulare la bacterii Sporul Structura intern a endosporului Particularitile biochimice ale sporului Semnificaia biologic a procesului de sporogenez Formarea sporilor de multiplicare la actinomicete Vacuolele cu gaz (aerosomii) Incluziile Glicocalixul

Natura chimic a materialului capsular Sinteza exopolizaharidelor Glicocalixul comportamental Flagelul Structura flagelului Motilitatea i chimiotaxia Fimbriile Pilii Capitolul II. CRETEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR Creterea celulei bacteriene Multiplicarea prin diviziune Mecanismul molecular al diviziunii Diviziunea asimetric Segregarea cromosomilor Reglarea procesului de diviziune Dinamica unei culturi bacteriene discontinui Culturi continui Capitolul III. NUTRIIA BACTERIAN~ Tipuri de nutriie a microorganismelor Nutriia autotrof Nutriia fotolitotrof Nutriia chimiolitotrof Bacteriile care oxideaz H2 i CO Bacteriile metanogene Importana ecologic a bacteriilor metanogene Bacteriile care oxideaz sulful i compuii si Bacteriile care oxideaz compuii Fe Bacteriile care oxideaz amoniacul i nitritul Fixarea CO2 la bacteriile chimiolitotrofe. Ciclul Calvin Nutriia organic a bacteriilor chimiolitotrofe Nutriia chimioorganotrof (heterotrof) Factorii de cretere Capitolul IV. METABOLISMUL BACTERIAN Particularitile generale ale metabolismului bacterian Metabolismul energetic bacterian Tipuri de metabolism energetic n funcie de acceptorul final de electroni Reacii de oxidare a substratului energetic Potenialul redox si fora proton-motrice Respiraia aerob bacterian Componentele catenei respiratorii bacteriene Sinteza ATP dependent de gradientul protonic Mecanisme moleculare protectoare care permit respiraia aerob Respiraia anaerob Respiraia nitrailor Reducerea asimilatorie a nitrailor Respiraia sulfatului Respiraia fumaratului Respiraia carbonatului(Reducerea respiratorie a CO2) Fermentaia Fermentaia glucidelor Fermentaia lactic Fermentaia alcoolic produs de levuri Fermentaia alcoolic bacterian Fermentaiile acide Fermentaia butiric

Fermentaia butanediolului Fermentaia acidului propionic Catabolismul lipidelor Catabolizarea compuilor organici cu azot Catabolismul compuilor aromatici Catabolismul compuilor cu un atom de C. Bacterii metilotrofe si metanotrofe Catabolismul alcoolului etilic Reaciile de anabolism Cile anaplerotice. Calea glioxilatului Cap. V. INFLUENA FACTORILOR FIZICI I CHIMICI ASUPRA MICROORGANISMELOR Temperatura Microorganisme criofile Microorganisme mezofile Microorganisme termofile Microorganisme hipertermofile Sterilizarea Principiile sterilizrii termice i dezinfeciei Presiunea osmotic Presiunea hidrostatic Energia radiant Aciunea laserului Aciunea ultrasunetelor Aciunea substanelor chimice asupra microorganismelor Mecanismele de aciune a substanelor antibacteriene Substane antibacteriene active prin modificri de permeabilitate Substane care acioneaz prin denaturarea proteinelor Evaluarea potenialului antibacterian al agenilor chimici Coeficientul fenolic Substane care acioneaz prin interferen cu gruprile active ale proteinelor-enzime Colorani antiseptici Ageni sterilizani n faz de vapori Agenii chimioterapeutici Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv. Sulfonamidele Quinolonele Ali ageni chimioterapeutici Antibioticele Clasificarea antibioticelor in funcie de structura chimic Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune Antibiotice care inhib sinteza peretelui celular Antibiotice antiribosomale Antibiotice care modific permeabilitatea membranei plasmatice Antibiotice care interfer cu funciile acizilor nucleici Capitolul VI. VIROLOGIE Modelul general de structur a virionului Capsida viral Inveliul extern Genomul viral. Organizare fizic Modaliti particulare de codificare a informaiei genetice Genomuri virale ARN segmentate (divizate, multipartite) Definirea conceptului modern de virus Natura virusurilor Simetria virusurilor Simetria helical Simetria icozaedric Construcia virionilor icozaedrici

Simetria complex (binar) Multiplicarea virusurilor Iniierea procesului infecios Ptrunderea virusului n celul Sinteza ARNm la dezoxiribovirusuri Sinteza ARNm la ribovirusuri Biosinteza proteinelor timpurii Replicarea genomului viral Replicarea genomului ADN Replicarea i transcrierea genomului viral ARN Biosinteza proteinelor tardive Asamblarea (morfogeneza) viral Eliberarea virionilor Infeciozitatea acizilor nucleici Tipuri de relaii virus-celul Patologia celulelor infectate cu virusuri Mecanismele moleculare ale interaciunii virus-celul. Efectul citopatic (ECP) 1. Modificri metabolice 2. Pierderea funciilor membranei celulare 3. Modificri ale citoscheletului 4. Apariia corpilor de incluziune Relaii ntre virusuri i organisme Tropismul viral Tipuri de infecii in vivo Persistena viral Mecanismele persistenei virale Bacteriofagii Anatomia molecular a fagilor din seria T-par Relaiile fag-bacterie Ciclul litic al interaciunii fag-bacterie. Multiplicarea bacteriofagului Importana fenomenului de bacteriofagie Ciclul lizogen Proprietile bacteriilor lizogene Importana studiului cuplului lizogen fag -E. coli Noiuni generale de oncogenez Agenii fizici i chimici ai malignizrii Caracterele generale ale celulelor normale Particularitile funcionale ale celulelor maligne Oncogenele celulare Virusuri oncogene Oncogeneza cu retravirusuri Oncogenele retravirale Interaciunea oncodnavirusurilor cu substratul celular Transformarea cu papovavirusuri Transformarea cu papilomavirusuri Latena Dezvoltarea verucilor Ageni infecioi subvirali Viroizii Patogenitatea viroizilor Virusoizii Virino Prionii Originea i apariia prionilor Originea i evoluia virusurilor Originea virusurilor din acizii nucleici celulari Originea ribovirusurilor Evoluia virusurilor

Recombinarea ca factor de evoluie Rolul mutaiilor n evoluia ribovirusurilor Capitolul VII. NOIUNI DE GENETIC~ BACTERIAN~ Organizarea funcional a genomului bacterian Plasmidele Clasificarea plasmidelor Structura molecular a plasmidelor Structura genetic i funciile plasmidelor Controlul numrului de copii plasmidiale Incompatibilitatea plasmidelor Eliminarea plasmidelor Replicarea plasmidelor Distribuia plasmidelor in procesul diviziunii celulare Recombinarea plasmidelor Plasmidele F Plasmidele R Mecanismele rezistenei bacteriene la antibiotice Cauzele fenomenului de rezisten la antibiotice Plasmidele Col Mecanismele de aciune a bacteriocinelor Mecanismele variabilitii la bacterii 1. Mutaiile Mecanisme de reparaie genetic Fotoreactivarea Rspunsul reparator adaptativ Excizia bazelor catalizat de glicozilaze i endonucleaze Reparaia prin excizia i resinteza nucleotidelor Sistemul reparator inductibil SOS 2. Elementele genetice transpozabile ale bacteriilor Secvenele de inserie Transpozonii Bacteriofagii transpozani Transpoziia Consecinele transopoziiei 3. Mecanisme de transfer al materialului genetic la bacterii Transformarea genetic Mecanismul molecular al transformrii genetice Conjugarea bacterian Determinismul genetic al procesului de conjugare Etapele procesului de conjugare Rolul pililor n procesul de conjugare Transferul ADN plasmidial n cuplul F+ x FTransferul ADN cromosomal n cuplul Hfr x FConjugarea la bacteriile Gram pozitive Sexducia Transducia genetic Conversia fagic Transfecia Reglarea activitii celulei bacteriene Modelul reglator al operonului Reglarea pozitiv(Inducia sintezei enzimelor) Reglarea negativ(Represia sintezei enzimelor) Represia sintezei enzimelor ntr-un sistem biosintetic. Operonul triptofanului Controlul activitii enzimelor. Inhibiia prin produsul final Controlul sintezei proteinelor la nivelul traducerii Represia prin catabolit

Principii de inginerie genetic Ingineria genetic la nivel celular Fuziunea protoplatilor bacterieni Premisele tiinifice ale ingineriei genetice moleculare Enzimele de restricie Enzimele de modificare Etapele reprogramrii microorganismelor prin tehnologia ADN recombinant(clonarea molecular) Aplicaii ale clonrii moleculare Utilizarea microorganismelor n biotehnologie Fazele culturii unui microorganism industrial Scopul biotehnologiilor cu microorganisme Enzime glicolitice Proteaze Celulaze Lipaze Acidul lactic Acidul citric Acidul acetic Aminoacizi Vitamine Utilizarea levurilor in microbiologia industrial Fermentaia alcoolic a. Obinerea alcoolului etilic din cartofi i cereale b. Utilizarea levurilor in vinificaie c. Utilizarea levurilor n industria berii d. Utilizarea levurilor n panificaie Biosinteza substanelor antibiotice Biosinteza penicilinei Bioconversia Producerea masei celulare Dirijarea proceselor fermentative Capitolul VIII. BIODIVERSITATEA MICROORGANISMELOR Importana studiilor de biologie molecular pentru determinarea biodiversitii Particularitile diversitii microorganismelor n diferite ecosisteme Semnificaia marii diversiti microbiene ntr-un habitat Grupe de microorganisme eucariote Alge Organizare celular i fiziologie Reproducere Clasificare Chlorophyta(Alge verzi) Phaeophyta (Alge brune) Rhodophyta(Alge roii) Bacillariophyta(Diatomee) Pyrrophyta(Dinoflagelate) Euglenophyta Importana algelor Protozoare Organizare celular i fiziologie Reproducerea Clasificare Mastigophora (Flagelate) Sarcodina Sporozoa Ciliophora

Fungii Organizare celular i fiziologie Reproducerea Clasificare Oomycetes Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes (Fungi Imperfecti) Myxomycetes (Gymnomyxa) Importana fungilor Micotoxine Capitolul IX. NOIUNI DE ECOLOGIA MICROORGANISMELOR A. TIPURI DE INTERACIUNI {NTRE POPULAIILE DE MICROORGANISME Interaciuni negative Interaciuni pozitive Simbioza Rolul endosimbiozei n geneza celulei eucariote Simbioze insecte-microorganisme Simbioze fixatoare de N2 Simbioza Rhizobium-plante leguminoase Simbioze asociative. Fixarea azotului n rizosfer Actinorize. Simbioza Frankia-angiosperme neleguminoase Micorizele Ectomicorize Endomicorize. Micorizele veziculo-arbusculare Rolul micorizelor in biologia plantelor Simbioza cianobacterii-fungi sau alge-fungi (Lichenii) Parazitismul intracelular Prdarea Procariote prdtoare B. MICROBIOTA NORMALA A MAMIFRELOR Colonizarea i succesiunea populaiilor de microorganisme ale organismului uman Microbiota normal a tegumentului Microbiota tractului respirator Microbiota tractului digestiv Microbiota din rumen Rolul fiziologic al microbiotei gastrointestinale Translocaia bacteriilor din intestin Microorganismele probiotice Microbiota tractului urogenital Gnotobioza i animalele gnotobiotice Caracteristicile animalelor germ-free PROPRIET~ILE MICROORGANISMELOR PATOGENE Patogenitatea Virulena Factorii care condiioneaz virulena a)Infeciozitatea Adezinele Sideroforii ca factori de virulen b)Agresivitatea (Invazivitatea) c)Toxigenitatea Toxine bacteriene

Clasificarea toxinelor Toxicitatea exotoxinelor Receptori celulari pentru toxine Mecanismele generale de aciune a toxinelor Endotoxine Efectele endotoxinelor LPS Condiile de apariie a procesului infecios a)Izvorul de infecie b)Cile de eliminare a agenilor patogeni c)Cile de transmitere a agenilor infecioi d)Poarta de intrare in organism Tipuri de infecii D. ROLUL MICROORGANISMELOR {N CIRCUITUL GLOBAL AL MATERIEI {N NATUR~ Circuitul biogeochimic al azotului Amonificarea Nitrificarea Denitrificarea Circuitul oxigenului Circuitul carbonului Degradarea biologic a constituienilor vegetali Scoaterea din circuit a carbonului organic sau anorganic Circuitul fosforului in natur Circuitul sulfului in natuir Mineralizarea compuilor organici ai sulfului Oxidarea compuilor anorganici ai sulfului E. NOIUNI DE MICROBIOLOGIA APELOR Diversitatea mediilor acvatice Factorii fizici si chimici care influeneaz prezena microorganismelor in mediile acvatice Comportamentul microorganismelor n mediul salin Marea - mediu natural pentru microorganisme Degradarea substanelor organice n ocean ACTIVITATEA GEOLOGIC~ A MICROORGANISMELOR Transformrile microbiene ale fierului i manganului Biosolubilizarea metalelor. Leierea bacterian Recuperarea metalelor prin acumulare de ctre microorganisme Rolul microorganismelor n formarea zcmintelor de petrol NOIUNI DE MICROBIOLOGIA SOLULUI Formarea solului Materia organic din sol Factorii de mediu care influeneaz microbiota din sol Microbiota din sol Interaciuni intre rdcinile plantelor i microorganismele din sol. Rizosfera BIODEGRADAREA SI BIODETERIORAREA MICROBIAN~ Modificri ale substratului induse de aciunea microorganismelor Biodegradarea petrolului Biodeteriorarea cauciucului Degradarea tesuturilor vegetale asociat cu termogeneza microbiana Coroziunea bacterian a metalelor Substanele xenobiotice-poluani ai mediului nconjurtor Efectele ecologice ale substanelor xenobiotice Degradarea microbian a substanelor xenobiotice Bazele genetice ale degradrii compuilor organici halogenai

Incapacitatea poluanilor de a induce sinteza enzimelor degradative Cap. X. Imunologie A. Antigene Modelul general al structurii antigenelor Proprietile definitorii ale antigenelor Determinanii antigenici Haptene Clasificarea i imunogenitatea antigenelor Antigene moleculare Antigene corpusculare B. Sistemul imunitar Mecanisme de aprare la nevertebrate Organizarea sistemului imunitar la vertebrate Limfocitele Limfocitele B Limfocitele T Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT) Celulele NK Imunoglobulinele (Anticorpii) Structura moleculei de Ig Funciile moleculei de Ig Heterogenitatea anticorpilor Heterogenitatea izotipic Ig G Ig A Ig M Ig E Ig D Variantele alotipice Variantele idiotipice C. Bazele genetice ale generrii diversitii receptorilor de antigen Mecanismele genetice ale diversitii imunoglobulinelor Mecanismele genetice ale generrii diversitii RCTi D. Moleculele complexului major de histocompatibilitate Structura moleculelor CMH clasa I Structura moleculelor CMH clasa II E. Rspunsul imun adaptativ Particularitile generale ale rspunsului imun Etapele rspunsului imun Celulele prezentatoare de antigen (CPA) Prelucrarea antigenelor Rolul moleculelor CMH n prezentarea antigenelor Prezentarea antigenelor exogene n asociaie cu moleculele CMH II Prezentarea antigenelor endogene n asociaie cu moleculele CMH I Modelul recunoaterii antigenelor de ctre limfocitele T Dinamica rspunsului imun mediat humoral Rspunsul imun humoral secundar F. Rezistena antiinfecioas nscut Sisteme celulare cu rol n rezistena antiinfecioas nespecific Sistemul fagocitar mononuclear Receptorii membranari ai macrofagului Activarea macrofagului Sistemul fagocitar polimorfonuclear Diferenierea neutrofilelor

Sisteme bactericide n PMNN Sistemul complement Mecanismul general de activare a sistemului complement Calea clasic de activare a complementului Calea altern a fixrii complementului Calea lectinic Funciile complementului Rolul complementului n aprarea antiinfecioas Procesul inflamator Efectorii celulari ai inflamaiei Reactanii de faz acut

Bibliografie selectiv Coninutul acestui manual a fost elaborat pe baza consultrii unui vast material bibliografic, reprezentat n primul rnd Microbiological reviews, MMBR sau Annual Reviews of Immunology, la care se adaug numeroase articole din alte reviste, dar i cri sau tratate de specialitate. Periodice Applied Microbiology Applied and Environmental Microbiology Archives of Microbiology J. of Biological Chemistry Can. J. of Microbiology Clinical Microbiological Reviews Journal of Bacteriology J. of. Gen. Microbiology J. of Clinical Microbiology J. of Medical Virology Journal of Virology Journal of General Virology Microbiological Reviews Microbiology and Molecular Biology Reviews (MMBR) Nature Proc. Natl. Acad. Sci. USA Science Virology Scientific American, etc. Cri Alberts B., Bray D., Lewis J. Molecular biology of the cell, 3rdEdition, Garland Publishing, 1994. Black J. G. Microbiology. Principles and Applications, 3rd Edition, Prentice Hall, Upper Sadle River, 1996 Brock Th. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988, 2000, 2003. Cajal N. Tratat de Virologie Medical, vol. I, Editura Medical Bucureti, 1990.

Davis B., Dulbecco R., Eissen H. Microbiology, 4th Edition, New York Lippincott, 1990. Fields B. N., Knipe D. M. Virology, Second Edition, Raven Press, Ltd., New York, 1990. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology, 3rd Edition Lippincot-Raven Publishers, Philadelphia, 1996 Freifelder D. Molecular Biology, second Edition, Jones adn Bartlett Publishers Inc., Boston, 1987. Lederberg J. Encyclopedia of Microbiology, Academic Press Inc., 1992. Lehninger A. L. Biochimie, vol. I, Traducere dupa editia a II-a, Editura Tehnica Bucuresti, 1975. Le Minor Leon, Michel V. Bacteriologie medicale, Flamarion Medicine Sciences, 1990. Mihescu G., Gavril L. Biologia microorganismelor fixatoare de azot, Editura Ceres, Bucureti, 1989. Nester E., Pearsall N., Roberts J., Roberts E. The Microbial Perspective, Saunders College Publishing, 1982 Stanier R. Y., Doudoroff M., Adelberg E. A.- The Microbial world, Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, 1970. Starr M. P si colab., The Prokaryotes, Springer Verlag, Berlin, New York, 1981. Streips N. U., Yasbin R. E. - Modern Microbial Genetics, Willey- Liss, 1991. Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Edition, Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990 Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, A. Sussman, 1998. Watson J. D., Hopkins R, Steitz W. Molecular Biology of the Gene, The Benjamin Cummings Comp.,1987. Wistreich G. A., Lechtman M. D. Microbiology, Macmillan Publishing Comp., 1984. Zarnea G. Microbiologie general, Editura Didactic i Pedagogic Bucureti, 1970 Zarnea G. Tratat de Microbiologie general, volumele I, II, III, V, 1983-1994. Pentru elaborarea seciunii de Imunologie au fost consultate urmtoarele titluri de reviste i cri: Periodice Annual Reviews Biochemistry Annual Reviews Immunology Annual Reviews Microbiology Bulletin dInstitut Pasteur Cancer Immunology Cell Clinical Microbiology Reviews EMBO Journal Immunology Today Journal of Immunology Mediators of inflamation Microbiology and Molecular Biology Reviews Nature Scientific American Science Cri Delves P.J, Roitt I. M. Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4, sec. ed., 1998, Acad. Press. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. Fields Virology, 3rd edition, Lippincot Raven Publishers, Philadelphia, 1996. R. A Goldsby, T. J. Kindt, Barbara A. Osborne - Kuby Immunology, 4-th Ed., W.H. Freeman and Company, New York. Male D., Champion B., Anne Cook Advanced Immunology, J.B. Lippincot Company, 1987. Patrick S. and Larkin M. J. - Immunological and molecular aspects of bacterial virulence, J. Wiley & Sons, 1995. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, 1997, Blackwell Science Samter M, Talmage D.W., Frank M.M., Austen K.F., Claman H.N. Immunological diseases, vol. I, II, fourth ed., Boston, Toronto. Serhan C. N., Ward P. A. - Molecular and Celular basis of Inflamation, 1999, Humana Press. Sheehan Catherine Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis, sec. edition,

1997, Lippincot, Philadelphia, New York Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990 Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, vol. IV Immunology, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998. Weir D.M., Stewart J. Immunology , seventh edition, Longman Group, UK, 1993. Zarnea G. Tratat de Microbiologie, vol. IV Imunobiologie, Ed. Academiei Romne, 1990. Zarnea G., Mihescu Gr., Ioni A. - Principii i tehnici de imunologie, Ed. Univ. Buc., 1993. Zarnea G., Mihescu Gr. Imunologie, Ed. Universitii Bucureti, 1995. Zwilling B.S., Eisenstein T. K. Macrophage- Pathogen Interactions, 1994, New York, Basel, Hong Kong.

INTRODUCERE Obiectul de studiu al Microbiologiei este biologia microorganismelor, adic studiul organismelor mici, vizibile numai la microscop. Etimologic, noiunea de microorganism are sensul de organism mic. Cu acelai sens se folosete noiunea de microb, mai ales in cazul microorganismelor patogene. Dei utilizat n mod curent, termenul de microb nu este tiinific. Noiunea de microb a fost introdus de Sedillot (l878), cu sensul ei tiinific: micro + bios = via scurt. Termenul s-a pstrat i a dat numele domeniului Microbiologiei. Noiunea de microorganism nu are semnificaie taxonomic, deoarece reunete un grup vast i heterogen de organisme diferite ca poziie sistematic i ca organizare structural, dar care se aseamn prin trei proprieti comune: - toate au dimensiuni microscopice, ceea ce le face invizibile cu ochiul liber; - n general au organizare unicelular. Chiar dac unele microorganisme formeaz asociaii pluricelulare, ele rmn, n esen, organisme unicelulare, deoarece, o celul izolat din complexul multicelular i pstreaz viabilitatea, crete, se divide i reface asociaia; - structura lor intern este relativ simpl, comparativ cu a macroorganismelor. Heterogenitatea microorganismelor este definit de alte trei caracteristici: - poziia sistematic a microorganismelor este foarte diferit; - activitile biologice (fiziologice) pe care le desfoar sunt foarte diversificate - morfologia si structura intern a diferitelor grupe de microorganisme sunt foarte diferite. Cadrul larg al noiunii de microorganism cuprinde urmtoarele grupe: 1. Eubacteria (bacterii adevrate); 2. Cyanobacteria (fostele alge albastre-verzi) 3. Archaea, un grup de microorganisme asemntoare cu bacteriile adevrate, din punct de vedere morfologic i structural. Toate cele trei grupe au organizare celular de tip procariot. Celelalte microorganisme, cu poziie sistematic heterogen au organizare celular de tip eucariot: 1. Fungii microscopici, cu un numr mare de reprezentani; - levurile cu organizare unicelular - mucegaiurile (fungi filamentoi), cu organizare pluricelular; 2. Algele microscopice 3. Protozoarele. Denumirea de bacterie a fost introdus de Ehrenberg (l838). El a creat denumiri de gen: Bacterium, Spirillum, Spirochaeta, fr s stabileasc deosebiri ntre bacterii i protozoare. Dei virusurile nu sunt microorganisme, aceast lucrare cuprinde un capitol de Virologie n care sunt prezentate, ntr-o form general, virusurile i entitile moleculare infecioase cu organizare subviral (viroizii i prionii). Virusurile sunt entiti infecioase cu un nivel nalt de organizare, alctuite n esen, din proteine i un acid nucleic (ADN sau ARN). Studiul interaciunii virus-celul (in special fagul lambda-E. coli) a avut un rol decisiv in dezvoltarea biologiei moleculare. Viroizii sunt entiti infecioase alctuite dintr-o molecul de ARN pur, patogene pentru unele plante de cultur. Prionii sunt entiti infecioase de natur proteic. Pentru studiile referitoare la natura lor, modalitatea de transmitere i la mecanismele patogenezei, lui S. Prusiner, n l997 i s-a decernat Premiul Nobel. Evoluia Microbiologiei ca tiin Microbiologia este o tiin relativ tnr. Ea s-a cristalizat ca un domeniu particular al tiinelor biologice, n a II-a jumtate a secolului l9. In l655, A. Kircher a intuit existena unor forme de via, invizibile cu ochiul liber. Primele microorganisme au fost vzute cu ajutorul unui aparat optic de mrire a imaginii, de ctre olandezul A.van Leevenhoek in l676. Cu aparatele sale de construcie proprie, el a examinat picturi de ap din diferite surse naturale sau de saliv cu raclaj dentar i a observat o lume fascinant, cu densiti neobinuite, ntr-o micare perpetu. In descrierile i n desenele sale pe care le-a prezentat Societaii Regale din Londra, printre alte organisme se recunosc bacteriile. Din acest motiv, pn n l976, Leevenhoek a fost considerat descoperitorul bacteriilor. Dar gndirea de atunci nu a reuit s reuneasc lumea microorganismelor cu restul lumii vii. In l976, la 300 de ani de la descrierea lor, chiar cercettorii olandezi au considerat c este nedrept ca Leevenhoek s fie considerat descoperitorul bacteriilor, deoarece el nu a intuit particularitile structurale i

funcionale ale acestor organisme, ci le-a considerat ca fiind nite pui ai animalelor acvatice mai mari. De aceea le numea animalcule. Dei lupele sale aveau o putere de mrire net superioar celor de azi, Leevenhoek nu a sesizat noutatea lumii pe care a vzut-o. Caracterele aparte ale microorganismelor au fost intuite de F. Cohn (l875). El le-a definit ca organisme microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct i este considerat ntemeietorul Microbiologiei ca tiin. De o importan excepional pentru dezvoltarea Microbiologiei sunt descoperirile lui L. Pasteur (l822l895). El era preocupat de activitile fziologice ale microorganismelor, n special fermentative i patologice. Pentru a le descrie, Pasteur folosete diferite denumiri: ciuperci, infuzori, bacterii, levuri, monade. El a nfiinat primele laboratoare de cercetare microbiologic. Contribuiile sale de excepie se nscriu n urmtoarele domenii: - a demonstrat experimental, ca fermentaiile nu sunt procese pur chimice, ci sunt procese biologice, rezultatul activitii metabolice a microorganismelor anaerobe. A definit procesul fermentativ ca fiind rezultatul vieii fara aer a microorganismelor anaerobe. Odat cu descrierea proceselor fermentative, Pasteur a pus bazele Microbiologiei industriale; - a pus bazele teoretice ale Microbiologiei medicaleumane i veterinare, demonstrnd cauzele producerii maladiilor infecioase. Pn atunci se cunotea caracterul transmisibil (contagios) al acestora, dar nu se tia ca ele sunt rezultatul ptrunderii in organism a unor ageni patogeni; - a demonstrat ca proprietile de patogenitate si virulent a microorganismelor se pot modifica in vitro. Astfel, din culturile de bacterii patogene i virulente deriv culturi cu virulen atenuat, care se pot utiliza ca vaccinuri. Pasteur a pus astfel bazele unei activiti practice de o importan practic excepional vaccinarea; - a fundamentat tiinific domeniul imunitii antiinfecioase, creind un domeniu nou al tiinelor biologice Imunologia, nscut ca o ramur a Microbiologiei, dar care ulterior s-a separat complet, ca un domeniu de sine stttor; - este ntemeietorul primului Institut de Microbiologie din lume Institutul Pasteur din Paris; - n plan teoretic, Pasteur a a rezolvat controversa generaiei spontane, demonstrnd cu argumente experimentale c microorganismele sunt forme de via cu un grad nalt de organizare, ce nu pot lua natere spontan din materia organic. Totdeauna microorganismele i au originea n alte celule, care contamineaz materia organic. In l897, Beijerinck a descoperit virusurile. El a intuit natura particular a agentului mozaicului la tutun i l-a considerat ca fiind contagium, vivum, fluidum (agent contagios, viu-corpuscular-filtrabil). Iniial, Virologia s-a dezvoltat ca o ramur a Microbiologiei, dar raportndu-ne la natura particular a virusurilor, Virologia este o tiin independent. La noi n ar, V. Babe, mpreun cu Cornil (Frana) este autorul primului Tratat de Bacteriologie din lume. In sistemul nervos al animalelor moarte de turbare a descris prezena incluziilor Babe-Negri. I. Cantacuzino este ntemeietorul Institutului de Microbiologie i mentorul colii de Microbiologie din perioada interbelic. Diviziunile Microbiologiei Procariotele populeaz orice mediu adecvat pentru formele superioare de via, dar i o varietate de medii cu condiii extreme, restrictive pentru majoritatea organismelor superioare. Diversitatea proceselor fiziologice bacteriene, precum i rolul lor esenial n ecosistemele naturale, dar i capacitatea de a sintetiza substane utile sau de a produce procese infecioase la organismele superioare au creat, nc de la nceputurile dezvoltrii sale ca tiin, premisele diversificrii domeniilor de studiu al microorganismelor, unele cu un accentuat caracter utilitar. Microbiologia industrial s-a dezvoltat pornind de la descoperirea proceselor fermentative de ctre Pasteur. Ea studiaz utilizarea microorganismelor productoare de substane utile pentru alimentaie, terapeutic sau pentru diferite industrii. Domeniul s-a extins la studiul proceselor de biosintez si bioconversie. Microbiologia solului studiaz ansamblul microorganismelor din sol, interrelaiile dintre ele, precum i interaciunile dintre microorganisme si plante, dar n mod deosebit, rolul microorganismelor n fertilitatea solului i n circuitul elementelor biogene n natur. Geomicrobiologia se distinge prin caracterul ei pregnant utilitar. Studiaz, n special, microbiologia petrolului: rolul microorganismelor n geneza petrolului; posibilitatea utilizrii microorganismelor n exploatarea petrolului; rolul microorganismelor n biodegradarea petrolului. Studiaz rolul microorganismelor n geneza zcmintelor minerale i posibilitatea utilizrii microorganismelor pentru exploatarea zcmintelor i pentru recuperarea metalelor din zcmintele srace.

Hidromicrobiologia studiaz microorganismele din mediile aquatice i rolul lor n lanurile trofice. Microbiologia marin, ramur a Hidromicrobiologiei studiaz microorganismele din marile bazine de ap srat, dar n special rolul lor n circuitul elementelor biogene. Microbiologia insectelor studiaz relaiile dintre microorganisme i artropode. S-a concretizat ca domeniu de sine stttor datorit rolului important pe care l au artropodele n patologia uman, animal i vegetal, ca vectori ai unor microorganisme patogene i ai unor virusuri. Microbiologia medical studiaz microorganismele patogene pentru om i animale. Studiaz particularitile lor fundamentale, adic patogenitatea i virulena, factorii care condiioneaz virulena, precum i modul lor de transmitere i posibilitile de combatere. Ecologia microorganismelor este o stiin de sintez care stabilete legitile generale de evoluie i interaciune a microorganismelor n natur. Studiaz interaciunile dintre microorganisme, precum i interrelaiile microorganismelor cu macroorganismele. Genetica microorganismelor este o ramur tnr, conturat dup l940. Studiaz substratul molecular al ereditii i variabilitii microorganismelor i mecanismele de transfer al materialului genetic la bacterii. Microbiologia general este o tiin biologic fundamental, care studiaz particularitile generale ale organizrii structurale i funcionale ale celulei bacteriene, sistematica, rspndirea microorganismelor n natur, relaiile lor ecologice cu alte microorganisme i cu macroorganismele, originea i evoluia lor, fenomenele de ereditate i variabilitate microbian. Microbiologia general este o tiin de sintez i se bazeaz pe datele domeniilor aplicative ale microbiologiei. Cadrul larg al Microbiologiei generale, contribuia sa imens la dezvoltarea multor ramuri ale biologiei i implicaiile ei teoretice i practice n evoluia altor stiine, determinate de posibilitatea utilizrii microorganismelor ca model experimental fac, ca studiul principiilor fundamentale ale microbiologiei generale s fie de o necesitate absolut pentru orice biolog modern indiferent de domeniul sau de specialitate ca i pentru biochimist i biofizician, genetician, medic, agronom, cercettor n industria fermentativ etc. Importana practic a microorganismelor De la descoperirea lor i pn astzi, interesul pentru studiul microorganismelor a nregistrat o cretere permanent, deoarece un mare numr de specii desfoar activiti benefice, realiznd procese de o valoare imens pentru societatea uman sau produc infecii la om i animale, cu efecte patologice mai mult sau mai puin grave. In mediile naturale, microorganismele realizeaz treapta mineralizrii (descompunerii) materiei organice vegetale i animale, avnd astfel un rol decisiv pentru ncheierea ciclului unor elemente biogene n natur (C, N, P, S), fcndu-le disponibile pentru reintegrarea lor n circuitul vieii. Fertilitatea i productivitatea sistemelor agricole depind n mare msur de activiti fiziologice ale bacteriilor din sol. Fixarea N2 este o activitate fiziologic exclusiv a unor procariote (eubacterii, cianobacterii). Cele din g. Rhizobium produc nodoziti pe rdcinile plantelor leguminoase. Ele reduc N2 la NH4, pe care l pun la dispoziia plantei gazd, fiind utlizat pentru sinteza proteinelor proprii. Astfel, bacteriile simbiotice, dar ntr-o msur mai mic i cele libere reduc necesarul de fertilizatori industriali pentru producia agricol. Bacteriile produc amonificarea materiei organice din sol, iar cele nitrificatoare oxideaz NH4+ la nitrai, iar cele denitrificatoare, reduc nitraii diminund fertilitatea solului. Microorganismele care populeaz tractul digestiv al animalelor i al omului formeaz microbiota normal, ce sintetizeaz vitamina K, esenial pentru mamifere, acidul folic, nicotinic, pantotenic, tiamina, riboflavina, biotina. De o importan deosebit este microbiota din compartimentul ruminal al mamiferelor rumegtoare. Rumenul are rolul unui fermentator natural, n care substratul vegetal este transformat n mas celular, format n special din bacterii i protozoare. Microorganismele constituie adevrata surs de proteine a ierbivorelor. Fr microbiota ruminal, producia ierbivorelor ar fi imposibil. In industria farmaceutic, producia de antibiotice (circa loo ooo t/an) este rezultatul activitii microorganismelor. Microorganismele au roluri multiple in industria alimentar. Majoritatea microorganismelor contaminante au aciune degradativ si de aceea alimentele trebuie protejate prin conservare chimic, prin ngheare sau uscare. Unele microorganisme au efecte favorabile asupra unor produse alimentare: brnzeturile, iaurtul i alte derivate din lapte sunt rezultatul activitii fiziologice a unor microorganisme asupra substratului. Dospirea aluatului de pine, producerea vinului i berii sunt rezultatul fermentaiei alcoolice a levurilor. Conservarea alimentelor vegetale i a furajelor se bazeaz pe fermentaia lactic produs be bacterii. Microorganismele sunt utilizate pentru producerea buturilor acidulate. Acidul citric, adugat multor buturi pentru conferirea aciditii este produs industrial de Aspergillus. De multe ori, astfel de buturi conin

fructoza, obinut din amidonul de porumb, prin aciunea bacteriilor amilolitice. Aspartamul, ca ndulcitor este un amestec de doi aminoacizi (acid aspartic si fenilalanina), ambii obinui pe cale microbiologic. Metanul este produs prin aciunea bacteriilor metanogene. Un interes deosebit prezint microorganismele n raport cu industria petrolului. Petrolul brut este supus atacului viguros al microorganismelor si de aceea forarea, exploatarea, dar in special depozitarea se fac in condiii care minimalizeaz aciunea microorganismelor. Microorganismele fotosintetizante utilizeaz energia solar pentru producerea biomasei, care poate fi convertit, ca i deeurile vegetale, in biocombustibili (metan si etanol), de alte microorganisme. Activitatea uman diminu rezervele diferitelor substane (metale) i microorganismele se folosesc pentru recuperarea metalelor din minereurile srace. Unul dintre cele mai importante domenii practice ale Microbiologiei este biotehnologia. In sens larg, biotehnologia utilizeaz microorganismele n procesele industriale, dar n ultimii l5 20 de ani, biotehnologia folosete microorganisme reprogramate genetic, prin tehnicile de inginerie genic. Importana microorganismelor a fost subliniat de Pasteur n aseriunea rolul unor fiine infinit de mici este infinit de mare. Microorganismele nu sunt numai benefice pentru activitatea uman. Un numr relativ mic de microorganisme patogene cauzeaz o larg diversitate de procese patologice, de la infecii locale, pan la septicemii. Microorganismele triesc n mediile naturale (ap, sol), pe suprafaa tegumentului i n tractul digestiv al omului i animalelor. Majoritatea populeaz mediile cu condiii obinuite, dar bacteriile cresc n mediile care ofer condiii fiziologice i biochimice extreme. Condiiile extreme sunt acelea care se abat mult de la cele normale(pH neutru, atmosfer aerob, salinitate de 1,5%, substratul energetic glucoza). Bacteriile sunt importante att din punct de vedere practic ct i teoretic, pentru studiul proceselor vieii n condiii extreme. Unele bacterii supravieuiesc n condiiile cele mai neadecvate: temperaturi extreme, desicare, ngheare, iar bacteriile extremofile, pentru creterea optim, sunt dependente de condiii speciale de mediu: presiunea uria a abisurilor marine, temperaturi mai mari de l00 grade, concentraii saline apropiate de nivelul de saturare a soluiei de NaCl, pH mai mic de 2 sau mai mare de 10. Bacteriile cresc n condiiile stresului produs de substratul energetic (energie chimic limitat sau chiar n prezena substanelor toxice). Dintre bacteriile extremofile, speciile hipertermofile anaerobe (Pyrococcus furiosus) cresc la temperaturi mai mari de 100o. Exist habitate naturale cu temperaturi crescute: solurile expuse radiaiei solare, platformele de gunoi (cu temperaturi de 60-70o), pn la lava vulcanic, de circa 1000o. Care este temperatura care permite desfurarea proceselor vieii ? Dup Brock, bacteriile cresc la orice temperatur la care exist ap lichid, chiar deasupra punctului de fierbere. Pn de curnd, mediile naturale cunoscute ca fiind populate de bacterii au avut circa 100o. In ultimele decade s-au identificat medii cu temperaturi de peste 350o, n emanaiile de pe fundul oceanelor, ridicnd problema existenei vieii n aceste medii. Din astfel de medii s-au izolat specii hipertermofile anaerobe, ce cresc la peste 100o. Deoarece legturile covalente ale proteinelor, ale ARN, ADN, ATP i NADP hidrolizeaz la 250 o i pentru c structura teriar a celor mai multe macromolecule este alterat la temperaturi mult mai mici, temperatura limit pentru procesele vieii pare a fi de peste 100o, dar mult sub 250o. Cel mai interesant grup de bacterii termofile este cel hipertermofil. Izolarea lor a ridicat pragul termic la care se cunoate c exist via. Pyrodictium occultum crete la 110o. Poziia microorganismelor in sistemele de clasificare a lumii vii In sistemul vechi de clasificare al lui Aristotel, lumea vie este mparit n dou regnuri: Plantae si Animalia. Odat cu descoperirea altor grupe de organisme, aceast clasificare a devenit nesatisfctoare, astfel nct numrul regnurilor s-a extins treptat Hogg (l86o) si Haeckel (l866) au sesizat dificultile de incadrare a unor organisme (Euglena, Chlamydomonas) si au propus un nou regn - Protista , pe care ulterior Hogg l-a denumit Protoctista , alturi de Plantae i Animalia. Acest sistem de clasificare a fost ameliorat de R. Stanier, prin diviziunea regnului Protista in dou subregnuri: - protiste inferioare, in care include microorganismele cu organizare de tip procariot (bacterii si cianobacterii) ; - protiste superioare, corespunznd microorganismelor eucariote si care cuprind algele, fungii si protozoarele. In aceas clasificare, regnul Protista include toate microorganismele eucariote i procariote, dar i un numr de macroorganisme pluricelulare nedifereniate (alge marine, bazidiomicete) .

Copeland (l938) a propus sistemul celor patru regnuri de clasificare a lumii vii: l. Regnul Monera, n care sunt incluse bacteriile i cianobacteriile. 2. Regnul Protoctista, cuprinznd organismele eucariote inferioare, cu organizare, n esen, unicelular, sinciial sau multicelular, fr difereniere celular avansat (alge, fungi, mixomicete si protozoare). 3. Regnul Plantae cuprinde plantele terestre i acvatice. 4. Regnul Animalia. Whittaker (l969) a propus un nou sistem de clasificare, care mparte lumea vie n 5 regnuri: Monera, Protoctista, Fungi, Plantae, Animalia. Bergey a schimbat denumirea regnului Monera, n cel de Procaryota. Criteriile de grupare ale sistemului se bazeaz pe trei niveluri de organizare: procariot; eucariot unicelular i pluricelular, precum i pe existena a trei modaliti principale de nutriie: fotosintetic si secundar absorbtiv caracteristic plantelor, ingestiv, tipic pentru majoritatea animalelor i absorbtiv, caracteristic fungilor. In acord cu aceste principii, sistemul de clasificare a celor 5 regnuri are urmtoarea structur: l. Regnul Monera include organisme unicelulare, cu organizare de tip procariot: bacterii, cianobacterii, actinobacterii. Toate sunt unicelulare sau unicelular-coloniale, cu excepia actinomicetelor, care au o organizare de tip micelial. Modul de nutriie este absorbtiv, iar metabolismul este de tip foto- sau chimiosintetizant. 2. Regnul Protoctista cuprinde microorganismele eucariote: algele microscopice, fungii acvatici flagelai i protozoarele. Limitele sale fa de celelalte regnuri nu sunt bine precizate. Termenul de Protoctista este preferat celui de Protista, deoarece, pe lng protozoare sunt incluse i organisme pluricelulare (alge marine, fungi inferiori), dar datorit absenei diferenierii tisulare sunt mai apropiate de organismele unicelulare. Metabolismul este foto- sau chimiosintetizant, iar nutriia este absorbtiv sau ingestiv. 3. Regnul Fungi cuprinde organisme eucariote imobile ce formeaz spori. Din spori, prin germinare se formeaz hifele, compartimentate n celule, prin septuri transversale. O aglomerare de hife formeaz miceliul. Prezint procese sexuale de tip connjugativ, rezultatul fiind un miceliu dicarion. Starea dicariot este eventual urmat de fuziune, iar diploidia este tranzitorie, deoarece prin diviziuni meiotice se formeaz spori haploizi. In absena procesului sexual, sporii se formeaz pe cale asexuat la vrful unor hife specializate i se numesc conidii. La germinare, sporii sexuai sau asexuai formeaz o hif. Aproape toi fungii sunt aerobi, dar sunt heterotrofi fr excepie. Nutriia este de tip absorbtiv. Fungii secret enzime care degradeaz moleculele nutritive complexe din mediul extern. Moleculele simple sunt transportate prin peretele i membrana fungic. 4. Regnul Plantae este mprit n dou grupe: plante nevasculare (briofite) i plante vasculare (trachaeofite). Ultimele au esuturi conductoare (xilem si floem). Xilemul transport apa i ionii de la rdcini spre parile aeriene, iar floemul transport seva elaborat n fotosintez, de la nivelul frunzelor, n toat planta. Plantele se dezvolt din embrioni diploizi. Spre deosebire de animale, formate n cea mai mare parte din celule diploide i de fungi care sunt organisme haploide sau dicariote, plantele alterneaz n ciclul lor de dezvoltare, generaiile haploid i diploid. Generaia haploid se numete gametofit, iar cea diploid se numete sporofit. La briofite predomin faza de gametofit, iar sporofitul este mic i cu aspect total diferit. La tracheofite, predomin sporofitul, iar gametofitul este constituit dintr-un grup de celule dependente de sporofit. 5. Regnul Animalia cuprinde organisme multicelulare, cu nutriie de tip ingestiv. Celulele sunt diploide si se dezvolt din doi gamei haploizi: ovulul si spermatozoidul. Dup fertilizare rezult celula ou diploid, ce strbate etapele de blastul i gastrul. Celulele animale sunt lipsite de perete i de plastide, dar au o difereniere tisular foarte inalt. Sistemele de clasificare cu 4 i 5 regnuri scot n eviden heterogenitatea microorganismelor. In sistemul celor 5 regnuri, microorganismele aparin regnurilor Monera, Protoctista i Fungi. Bacteriile se disting de celelalte organisme prin organizarea celular de tip procariot., pe care Chatton a evideniat-o nc din l925. Toate sistemele moderne de clasificare rezerv bacteriilor o poziie sistematic separat. Incadrarea lor alturi de plante este arbitrar si nelogic (Stanier, l977), iar pstrarea ei n pofida numeroaselor argumente tiinifice care probeaz contrariul este rezultatul refuzului de a privi lucrurile n fa. Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor Estimarea diversitii vieii este o provocare permanent a biologiei. Pentru microorganisme, scopul este complicat de faptul c subiectul inventarierii nu este vizibil cu ochiul liber i nici nu se difereniaz pe criterii morfologice. Estimrile anterioare ale numrului de specii bacteriene erau de 107- 109.

Clasificarea microorganismelor, anterior utilizrii analizei moleculare, s-a fcut pe baza urmtoarelor criterii: - morfologice (coci, bacili, spirili) - tinctoriale (reacia Gram) - structurale - metabolice (prin evidenierea capacitii de a metaboliza anumite glucide sau aminoacizi) - biochimice prin evidenierea markerilor moleculari caracteristici (mureina, acizii teichoici, lipidele cu legturi eterice din membrana Archaea etc). Criteriile clasice de clasificare a bacteriilor s-au dovedit utile pentru determinrile curente de laborator, dar nu au permis elaborarea unui sistem de clasificare bazat pe criterii naturale i nici explicarea legturilor filogenetice dintre procariote i eucariote. Pornind de la observaia lui Chatton (l925), n acord cu care exist dou tipuri distincte de organizare a lumii vii, procariot i eucariot, R. Stanier (n anii 60) a elaborat conceptul clasic, unificator, privind structura i funciile celulei bacteriene, pe baza unor criterii discriminatorii de tipul "totul sau nimic". Procariotele au fost definite pe baza diferenelor de compoziie chimic i a funciilor pe care le ndeplinesc structurile omologe ale organismelor procariote i eucariote. Conceptul elaborat de Stanier, dei a dominat gndirea microbiologic circa 30 de ani, nu corespunde realitii tiinifice, deoarece nu cuprinde toate procariotele. Clasificarea lumii vii n 3 domenii pe baza criteriilor moleculare In ultimii 15-20 de ani, locul criteriilor clasice a fost luat de metodele de analiz molecular. Descoperirea organismelor procariote, grupate n domeniul Archaea a invalidat conceptul clasic de bacterie, bazat pe particulariti biochimice i funcionale discriminatorii, n raport cu celula eucariot. Microorganismele Archaea creeaz o punte de legtur ntre tipul de organizare procariot i eucariot (Woese, l994), permind elaborarea unui arbore filogenetic comun al organismelor procariote i eucariote. Metodele de biologie moleculara, de secventiere a proteinelor si acizilor nucleici (denumite semantide Zuckerkandl si Pauling, 1965) au permis conturarea filogeniei bacteriene intr-un sistem de clasificare care cuprinde toate procariotele. Cu cat secventele semantidelor a doua organisme sunt mai asemanatoare, cu atat ele sunt mai apropiate filogenetic. Acest criteriu presupune ca genele codificatoare sa nu se transfere pe orizontala, de la o celula la alta. La bacterii, secvenierea proteinelor pentru scopuri filogenetice este neadecvat, pentru c uneori, o protein are o distribuie limitat sau este greu de secveniat (Zinder, l998). Metodele de biologie molecular au fost orientate n primul rnd asupra studiului acizilor nucleici. S-a determinat procentul G + C din ADN, dar testul nu este edificator, deoarece dou organisme cu secvene diferite de ADN pot avea aceeai proporie de G + C. Testul ramne valabil pentru a caracteriza un organism nou. Tehnica secvenierii ADN a revoluionat sistemele de clasificare a bacteriilor, deoarece a permis accesul la informaia coninut n ADN. Un alt test furnizat de biologia molecular, util pentru studiul filogeniei bacteriene este hibridarea ADN-ADN. ADN se denatureaz prin tratament termic sau cu baze. Metoda evideniaz capacitatea unei secvene de ADN monocatenar al unui organism de a forma un heteroduplex cu ADN monocatenar de la alt organism, pe baza omologiei secvenei de baze. Dac deosebirile secvenei de baze sunt mai mari de l5%, heteroduplexul nu se formeaz, astfel c acest test este negativ pentru organismele ndeprtate filogenetic, dar este decisiv pentru delimitarea speciei bacteriene. Woese i Fox au propus, ca instrument filogenetic pentru evaluarea raportului evolutiv dintre microorganisme, analiza secvenei ADN din care este transcris ARNr 16S (ribotipia). Ribotipia presupune folosirea probelor capabile s detecteze genele ce codific ARNr. Utilizarea genelor ARNr pentru identificarea bacteriilor i are originea n gradul nalt de conservare a genelor codificatoare a ARNr. Genele pentru sinteza ARNr sunt organizate n operoni, n care genele individuale sunt adeseori separate prin ADN necodificator. O prob de ARNr marcat sau ADN de la o specie va hibrida cu variate regiuni ale ADN de la specii bacteriene nenrudite. Tehnica de ribotipie implic izolarea ADN total al celulei bacteriene i fragmentarea sub aciunea unei enzime de restricie. Rezult astfel o colecie de fragmente de ADN cu o distribuie uniform a dimensiunilor. Fragmentele se separ prin electroforez n gel de agaroz i se transfer pe o membran de nitroceluloz prin capilaritate (blotting). Apoi fragmentele sunt hibridate cu o prob marcat care conine genele ARNr (ARNr de E. coli). Hibridarea apare numai n acele fragmente cromosomale care conin secvenele genelor ARNr.

Ribotipia a fost una dintre primele tehnici moleculare folosit cu succes pentru taxonomia vibrionilor. Astfel s-au identificat (i s-au depozitat n GenBank) peste 78 000 secvene ale genei pentru sinteza ARNr 16S, izolate de la bacterii cultivate sau obinute prin amplificare, direct de la probele din sol, fr cultivare. In anii 70, C. Woese a iniiat studiul secvenei ARNr (16S), ca un posibil marker filogenetic, folosind ARNr l6S cu lungimea l500-l600 nucleotide, component al subunitii mici (30 S) a ribosomului. Tehnica presupune izolarea ARNr i digestia sa cu RN-aza T1, care cliveaz dup fiecare rest de G. Rezult o varietate de fragmente de oligoribonucleotide, cu lungimea de l-25 baze, fiecare terminndu-se cu G. Amestecul se separ prin metoda electroforezei bidimensionale. Se nregistreaz tabloul oligonucleotidelor i se compar cu cel obinut de la alte organisme, stabilindu-se un coeficient de asemnare, a crui valoare variaz ntre 0 (pentru neasemnare) i 1 pentru identitatea complet. Astfel s-a evideniat c Cyanobacteria sunt asemntoare cu cloroplastele. Secvenele obinute prin amplificarea direct a probei din mediu, ofer singura informaie disponibil pentru 99% dintre procariotele din mediile naturale. Studiile recente sugereaz c numrul total al speciilor bacteriene, evaluat prin secvena de baze a genelor pentru ARNr 16S, este de peste 1030, grupate n cel puin 50 de filumuri bacteriene. Jumtate dintre ele sunt alctuite n ntregime din bacterii necultivabile. Alte 3 filumuri sunt formate din specii cultivate n proporie mai mic de 10%. Membrii a numai 6 filumuri au fost cultivai n proporie de peste 90%. Rezultatele cercetrilor de nivel molecular au artat ca sistemul de clasificare a lumii vii n cele 5 regnuri nu este corect din punct de vedere filogenetic, din mai multe motive: - cele dou regnuri de microorganisme eucariote Protista i Fungi sunt artificiale; - plantele i animalele (Metaphyta i Metazoa) au evoluat din organisme eucariote unicelulare; - n sistemul celor 5 regnuri, diferenele dintre Monera (Procaryotae) i celelalte 4 regnuri sunt mult mai mari dect diferenele ntre reprezentanii celor 4. Noul sistem de clasificare accept c forma de organizare eucariot nsumeaz o multitudine de caractere comune i definete o unitate filogenetic. Regnul Procaryotae (Monera) reunete diviziunea EUBACTERIA i ARCHAEA. La nivel citologic, ambele sunt procariote, dar la nivel molecular ARCHAEA se disting de EUBACTERIA. Ele nu constituie o unitate filogenetic, deoarece nu ntrunesc caractere unitare. La nivel molecular, organismele ARCHAEA se aseamn mai mult cu EUCARIOTELE dect cu EUBACTERIILE. Din aceast cauz, regnul Procaryotae (Monera) este un taxon nevalidat de datele de ordin molecular. Woese (l990) consider c noul sistem filogenetic, pe baza criteriilor moleculare, permite mprirea lumii vii n trei sisteme primare distincte. Clasificarea trebuie s recunoasc, n primul rnd, cele trei tipuri fundamentale de organisme: Eubacteria, Archaea i Eucaryotae. Gruprile trebuie s aib statutul de domenii, o categorie taxonomic superioar regnului. Autorul propune abandonarea denumirii de Archaebacteria, deoarece sugereaz nrudirea strns cu Eubacteria, care n realitate nu exist. Cele trei domenii se numesc Bacteria (sinonim Eubacteria), Archaea si Eucarya (sinonim Eucaryotae), care include organismele eucariote (protozoare, alge, fungi, plante, animale). Din punct de vedere fiziologic, microorganismele domeniului Archaea aparin la trei tipuri: metanogene, halofile i sulf-dependente. Metanogenele sunt strict anaerobe i produc gaz metan ca produs final al fermentaiei. Cele sulf-dependente triesc n medii termofile i reduc sulful elementar sau oxideaz compuii sulfului pentru a obine energie sub forma potenialului reductor. Sunt specii aerobe si anaerobe. Halofilele triesc n medii hipersaline i unele se protejeaz de lumin cu un pigment care conine carotenoizi. Sunt aerobe obligate. Din punct de vedere filogenetic, domeniul Archaea are dou diviziuni distincte (Kandler, l993): - Crenarchaeota (crenos = izvor) cuprinde exclusiv microorganisme hipertermofile dependente de sulf, care i dobndesc energia prin reacii de reducere a sulfului (Thermoproteus, Pyrodictium etc.), sau de oxidare a compuilor cu sulf (Sulfolobus). Sunt rspndite n mediul marin i n mediile vulcanice terestre; - Euryarchaeota cuprinde metanogenele chimiolitotrofe hipertermofile strict anaerobe ce cresc la ll0o (Methanopyrus) i metanogenele mezofile (din ap, sol, intestinul animalelor). Ali reprezentani sunt halofilele extreme ce triesc n soluii saturate de NaCl (Halobacterium halobium), sulfat-reductorii termofili (Thermococcus, Pyrococcus). Clasificarea lumii vii in trei domenii recunoate independena filogenetic a bacteriilor (Eubacteria) i a reprezentanilor Archaea. Nici unul dintre sistemele de clasificare a lumii vii nu include virusurile. Ele formeaz un grup de entiti infecioase fr echivalent n lumea vie, dar au relaii foarte strnse cu aceasta, deoarece se multiplic numai n substratul celular viu.

Fig. 1: Arborele filogenetic universal, bazat pe secvena ARNr a subunitaii ribosomale mici, care cuprinde cele trei domenii (dupa Woese, 1991)

Caracteristicile distinctive ale organismelor celor trei domenii Particularitile lumii bacteriene au fost sesizate de F. Cohn, in perioada l850-l875. El le-a definit ca organisme de dimensiuni microscopice, unicelulare, care se nmulesc prin diviziune direct. Din acest motiv, F. Cohn este considerat intemeietorul microbiologiei ca tiin. Arhitectura celular a organismelor grupate in domeniul Archaea se aseamn cu cea a eubacteriilor. Moleculele componente ale celulelor Archaea se aseamn, unele cu ale eubacteriilor, altele cu ale eucariotelor, dar exist i molecule specifice (tabel nr. 1).Tabel nr. 1: Caracterele structurale si funcionale ale eubacteriilor, Archaea si eucariote Caracter Dimensiuni Perete celular Eubacterii Civa m Prezent constant (cu excepia micoplasmelor). Conine un peptidoglican (mureina), totdeauna cu acid muramic. Permeabilitate foarte selectiv (pentru ap i molecule cu diametrul mai mic de o,8 nm), pentru enzimele degradative i pentru fragmente mici de ADN. Nu fac endocitoz sau exocitoz. Lipsesc sterolii (cu excepia micoplasmelor). Lipidele sunt esteri ai acizilor grai cu glicerolul. Archaea Civa m Conine proteina denumit pseudomurein fr acid muramic. Lipsete la Thermoplasma. Idem Eucariote Celule mult mai mari (zeci de um). Unele eucariote sunt unicelulare Lipsete la celulele animale. La cele vegetale conine celuloz, iar la fungi conine chitin.

Membrana plasmatic

Are o plasticitate accentuat. Celula face endocitoz prin fagocitoz sau pinocitoz. Sterolii sunt prezeni constant.

Lipidele au legturi eter ntre glicerol i catenele de C. Au catene izoprenoidice ramificate cu metil. Unele lipide sunt tetraeteri. Transformri reversibile sol-gel. Prezint cureni citoplasmatici. Idem

Citoplasma

Este ntr-o permanent stare de gel, necesar meninerii integritii structurii materialului nuclear. Lipsesc

Membrane intracitoplasmaice Organite care conin ADN Citoschelet Organite de locomoie

membranele interne. Curenii citoplasmatici sunt abseni. Dimensiunile mici ale celulei uureaz difuzia substanelor nutritive i de catabolism. Absente. Membrana poate trimite invaginri la nivelul crora se desfoar activiti respiratorii --------------Flagelul cu structur simpl, format din molecule de flagelin, aezate dup o simetrie helical. Flagelul este pus n micare de un motor rotativ situat ntre perete i membrana. Energia de micare este produs de un gradient protonic de o parte i de alta a membranei Diviziunea este simpl (direct). Rareori are loc o diviziune asimetric prin nmugurire. Bacteriile filamentoase sufer diviziuni multiple prin segmentare sau fragmentare. Un cromosom circular ce conine o,6l26 perechi de baze. Material genetic accesoriu (plasmide) Un echivalent nuclear denumit nucleoid cu aspect de mas fibrilar, nedelimitat de membran, ce corespunde cromosomului bacterian. Absena membranei delimitante a materialului genetic este particularitatea fundamental a organizrii celulare de tip procariot. Cromosomul mezosom 70 S Abseni este legat fizic de

Idem

Au organite delimitate de o membran cu o structur trilaminar de unit membrane. Mitocondrii, cloroplaste

--------------

Prezent Accesorii. Dac exist sunt cili sau flageli de tip eucariot, cu o structur complex de 2 x 9 + 2 tubuli.

Idem

Tipul diviziune

de

Diviziunea este indirect, cu aparatul mitotic si fazele caracteristice. Idem Un cromosom circular cu l-4 x lo6 baze perechi i plasmide. Un numr constant de cromosomi, cu caracter de specie. ADN este asociat cu proteine histonice. In mitocondrii i cloroplaste, ADN dublu catenar circular nu conine histone. Nucleu tipic, cu nucleol. Idem

Cromosomi

Nucleul

Distribuia materialului genetic dup diviziune Ribosomi* Introni

Prin intermediul aparatului mitotic Idem 70 S Prezeni n genele ce codific ARNr si ARNt. Genele ce codific proteinele sunt continui. Ribosomii lor sunt 70 S, dar sunt rezisteni la inhibitorii clasici ai sintezei proteice la Eubacteria (streptomicin i cloramfenicol) (--) 80 S. In mitocondrii si cloroplaste sunt ribosomi 70 S. Prezeni n genele ce proteinele, ARNr i ARNt.

codific

Sensibilitatea ribosomilor la streptomicin (inhiba initierea catenei polipeptidice) i la cloramfenicol (inhiba alungirea

+

Nu inhiba sinteza proteinelor in citoplasma, dar cele doua antibiotice inhiba sinteza proteinelor in cloroplaste si mitocondrii pentru ca au ribosomi cu caracteristici functionale de tip procariot.

catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la cicloheximid (inhiba alungirea catenei polipeptidice. Sensibilitatea ribosomilor la toxina difteric

_

_

Cicloheximida inhiba specific functia ribosomilor celulei eucariote.

_

Toxina difterica inhiba alungirea catenei peptidice, la Archaea, pentru ca inactiveaza un factor de alungire. (+) Metionina Complex (minimum 7 subuniti). + Proteina care se leag de secvena TATA 110 grade

Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor la eucariote se produce dupa acelasi mecanism ca si la Archaea.

Aminoa-cidul iniator al catenei polipepti-dice Structura ARNpolimerazei** Operoni Iniierea transcrierii Tempera-tura maxim de cretere Sinergonul respirator i fotosintetic

N-formyl-metionina

Metionina Idem _ Idem 60 grade Cele dou funcii au sedii diferite i se desfoar independent. Sinergonul respirator este localizat n mitocondrii, iar cel fotosintetic, n cloroplaste.

Simpl (5 subuniti) + Factorul sigma 95 grade Sinergonul se definete ca un ansamblu de enzime ce functioneaz coordonat pentru realizarea unei ci metabolice. Cele dou sinergoane sunt nempachetate, sediul lor structural fiind membrana plasmatic. De aceea, cele dou funcii sunt interrelate, modificarea uneia antrennd modificarea celeilalte Nu adpostesc niciodata endosimbioni Absenta. Sunt organisme unicelulare. Uneori formeaz asociaii coloniale, dar totdeauna fiecare celul i pstreaz individualitatea structural i funcional. Prin diviziune reface asociaia. Foarte rar si limitat la structuri de rezisten (sporul i echivalentul sau chistul). Fac excepie mixobacteriile, care au ciclu de dezvoltare i capacitate de difereniere Sunt heterospecifice. Transferul informatiei genetice se face ntre specii i chiar ntre genuri diferite. Informaia genetic este ntr-o permanent mobilitate, ceea ce face dificil definirea speciei bacteriene.

Idem

Formarea endosimbiontilor Capacitatea de a forma organisme multicelulare Capacitatea de difereniere celular Mecanisme de transfer genetic

Idem

Inglobeaz frecvent celule pe care le pstreaz ca endosimbioni Uneori, celula eucariot constituie organisme unicelulare, dar de cele mai multe ori formeaz organisme multicelulare.

Idem

Absent

Foarte marcat

Fuziunea gameilor este intraspecific. Idem

*

Pentru proteinele ribosomale, omologia dintre Archaebacteria i Eucariotae nu are corespondent la Eubacteria (Kandler, l993). Dar Archaea i eucariotele sunt foarte diferite i se disting, fiecare n parte, de eubacterii.**

Eucariotele se disting prin existena a 3 ARN-polimeraze*: ARN-polimeraza I transcrie ARNr; ARN-polimeraza II transcrie ARNm; ARN-polimeraza III transcrie ARNt. Cele 12 subuniti ale ARN-pol II sunt codificate de de tot attea gene i sunt foarte bine conservate la eucariote. De exemplu, 6 subuniti ale ARN-pol II uman pot nlocui omologele lor la levuri. Toate cele 3 ARN-polimeraze ale celulelor eucariote sunt alctuite fiecare din 12 subuniti. 5 dintre ele sunt comune pentru toate cele 3 ARN-polimeraze, iar 3 dintre ele sunt specifice ARN-pol II. Astfel, ARN-polimerazele sunt asamblate din subuniti comune i subuniti specifice de clas.

Uneori, moleculele Aarchaea se aseamn cu omologele lor de la eucariote, mai mult dect cu ale eubacteriilor. Tipuri morfologice de bacterii Anatomia bacterian studiaz forma celulelor, ultrastructura si structura molecular a diferitelor organite celulare, in strns corelaie cu funciile pe care le indeplinesc. Forma celulelor bacteriene este controlat genetic i se realizeaz n mare masur prin intermediul peretelui care confer celulei un grad de rigiditate i prin aceasta, forma tipic (fig. 2). Peretele celular este rigid, dar n acelai timp, suplu i elastic, adic este deformabil.

Fig. 2: Tipuri morfologice de bacterii: A = diplococi; B = streptococi; C = stafilococi; D = bacili; E = cocobacili; F = bacili fusiformi; G = forme bacilare filamentoase; H = vibrioni; I = spirili; J = sarcina

Datorit elasticitii sale, forma celulei bacteriene, n diferite condiii de mediu are tendina s varieze ntre anumite limite, ns forma tipic a celulelor unei populaii rmne dominant. Celulele bacteriene aparin urmtoarelor tipuri morfologice: a. Forma sferic (sferoidal) denumit coc (coccus, latin = smn). Celulele sunt izodiametrice. Dup modul de grupare se disting urmtoarele subtipuri: - cocul simplu (celule solitare) - diplococ (celule perechi) - streptococ (celule asezate n lan, streptos = lan) - tetracoc (tetrada) - sarcina (dou tetrade suprapuse) - stafilococ (staphylos = ciorchine) La diplococi i streptococi, diviziunile celulare se succed dup un singur plan. La ali coci (Pediococcus, Thiopedia, Lampropedia, Deinococcus), prin diviziuni succesive se formeaz grupri de 4 celule aranjate n tetrade bidimensionale. Ulterior se formeaz tablete de form ptrat, de 16-64 celule, ceea ce denot existena a dou planuri de diviziune, perpendiculare unul pe cellalt i care se succed alternativ. La

Sarcina i la Synechocystis, dup trei diviziuni celulare rezult 8 celule aranjate n pachete tridimensionale cuboide. Diviziunile se succed dup toate cele trei planuri ale spaiului, fiecare perpendicular pe celelalte dou. b. Forma bacilar (bacillus, latin = bastona). Diametrul mare (lungimea) depete de cteva ori pe cel transversal. Extremitile celulei sunt rotunjite sau tiate n unghi drept. Se disting mai multe subtipuri morfologice, n funcie de modul de grupare a celulelor: - cocobacil, o forma intermediar intre coc si bacil - diplobacil - streptobacil - rozet (stea) - palisad - litere chinezeti c. Forma spiralat, cu cteva subtipuri: - vibrion - spiril - spirochet La spirili, spirele sunt rigide i puine, iar la spirochete sunt laxe i numeroase. Celulele unei populaii bacteriene unitare, teoretic aparin aceluiai tip morfologic, dar frecvent apare un polimorfism, mai accentuat n mediile naturale (ap, sol, tractul digestiv). Morfologia celulelor este mai uniform n culturile bacteriene in vitro, dar se modific n cursul evoluiei unei populaii celulare. De aceea, pentru a evita confuziile, descrierile morfologice, considerate tipice pentru o populaie bacterian se refer la celulele cultivate n laborator pe medii optimale (medii care conin toate substanele necesare creterii celulelor), in condiii adecvate de temperatura, pH, grad de aerare. Deoarece n culturile bacteriene mbtrnite apar frecvent forme de involuie, cu morfologie atipic, forma caracteristic a celulelor unei specii este aceea a celulelor tinere, dintr-o cultur bacterian aflat la sfritul perioadei de multiplicare. Bacteriile care se abat de la tipurile morfologice eseniale sunt mai rare. Astfel se disting: bacterii ptrate, bacterii prostecate, bacterii cu apendice acelulare, bacterii cu trichoame (filamentoase), bacterii miceliene. Bacterile ptrate, au fost descrise de Walsby (l980) n apele hipersaline din peninsula Sinai. Pe seciune au aspect de lentil biconcav, datorit coninutului foarte mic de ap. Din aceast cauz, presiunea intern a celulei este practic nul. Nu se exercit presiune asupra nveliurilor celulare. Pentru ele s-a propus denumirea de gen Quadra i aparin archaebacteriilor. Bacteriile prostecate (prosteca = apendice, coad, anex, adaus). Caracteristica structural este existena prostecii, o prelungire semirigid n continuarea celulei, cu diametrul mai mic dect al celulei mature. Prosteca este o prelungire celular, ceea ce o deosebete de structurile apendiculare acelulare. Se disting dou categorii de bacterii prostecate: bacterii pedunculate (de exemplu, Caulobacter); bacterii prostecate care nmuguresc (de exemplu, Hyphomicrobium). Bacteriile cu apendice acelulare (de exemplu, Gallionella) sunt reniforme. De pe faa concav pornete un apendice acelular lung, format dintr-un produs de secreie a celulei Bacteriile ce formeaz trichoame (de exemplu Beggiatoa, Sphaerotilus) au aspectul unui filament multicelular, n care celulele vin n contact prin extremitile lor i sunt nvelite printr-un nveli parietal comun. Bacteriile miceliene (actinomicete, iar denumirea nou este aceea de actinobacterii) au un aparat vegetativ reprezentat de micelii fine, ramificate, cu organizare procariot.

CAPITOLUL I

STRUCTURA I FUNCIILE CELULEI BACTERIENECunoaterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizrii tehnicilor de citochimie i de microscopie electronic. Tehnicile de citochimie presupun utilizarea unor metode de colorare selectiv, adic a

coloranilor cu afinitate pentru o anumit structur celular. Astfel s-a demonstrat structura si arhitectura molecular a componentelor celulare. Prin arhitectur molecular se intelege modalitatea de aranjare ordonat a moleculelor constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alctuiesc protoplastul bacterian) i structurile extraparietale (fig. 3). Structurile intraparietale sunt: - spaiul periplasmic - membrana plasmatic - mezosomul - citoplasma - ribosomii - incluziile - vacuolele - sporul - aparatul fotosintetic - rhapidosomii (rhapidos = baston) incluzii ribonucleoproteice n form de baston - magnetosomii incluzii intracelulare delimitate de membran, cu structur cristalin formate din magnetit (Fe3O4). Magnetosomii confer dipol magnetic permanent celulei, permindu-i s se alinieze pasiv la cmpul geomagnetic. Bacteriile care produc magnetosomi manifest magnetotaxie, adic procesul de orientare i migrare de-a lungul liniilor cmpului magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de; - glicocalix cu variantele sale structurale: capsula i glicocalixul comportamental; - flageli - fimbrii i pili - spini structuri pericelulare groase la baz i ascuite la vrf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt eseniale (obligatorii) i se gsesc la toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsul, flageli), fiind prezente numai la anumite grupe de bacterii.

Fig. 3. Diagrama organizrii unei celule procariote (un bacil cu flagel polar).

Peretele celular Perete celular este o structur rigid de nveli, care nconjur complet celula bacterian. La cele mobile, peretele este strbtut de flageli. Structura parietal lipsete la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum i la cele halofile extreme (cele care triesc n medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare fa de ocul osmotic nu este necesar). Evideniere. La microscopul optic, peretele celular se evideniaz dup colorare selectiv, cu colorani de mare afinitate fa de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se evideniaz fie direct, fie dup utilizarea unor artificii de tehnica, ce constau in lezarea mecanic a structurii parietale cu perle de sticl sau cu ultrasunete. Coninutul celular se pierde i peretele rmne ca un sac gol i rigid, care

pstreaz forma original a celulei, ceea ce sugereaz rolul esenial al peretelui n determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprins ntre l5-30 nm (uneori pn la 80 nm). n ciuda strii incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric cu o valoare practic deosebit n clasificarea i identificarea procariotelor este comportamentul la coloraia Gram (C. Gram 1884). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebiri structurale majore ale peretelui. n funcie de particularitile structurale ale peretelui, bacteriile se mpart in 4 categorii: l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = nveli) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros i rigid, la care mureina reprezint pn la 80% din greutatea uscat a acestei structuri i bacteriile acidoalcoolo-rezistente 2. Gracillicutes (gracillis = subire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subire, la care mureina reprezint circa l0% din greutatea uscat a peretelui. 3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete. Periferia celulei este acoperit de o membran ce conine steroli, cu rol protector fa de liza osmotic. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a crete pe medii inerte. Se dezvolt ca saprobionte n cavitile organismului uman i animal sau sunt patogene pentru om, animale i plante. 4. Mendosicutes (mendosus =o structur cu defecte). Noiunea desemneaz organismele domeniului Archaea, care au perete celular din care lipsete mureina. Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparin grupului Gram pozitive sau Gram negative. Structura molecular a peretelui la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent i rigid. Componenta esenial este mureina, denumit nc i peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formeaz un strat rigid, adiacent membranei plasmatice i sub aspectul compoziiei chimice este unitar la toate eubacteriile (Gram pozitive i Gram negative). Mureina este alctuit dintr-o component peptidic i una glucidic. Componenta glucidic repetitiv este un dizaharid format din N-acetil-D-glucozamin i acid N-acetilmuramic, legate l-4. Acidul Nacetilmuramic rezult prin stabilirea unei legturi ester ntre N-acetil-D-glucozamin i acidul lactic (Fig. 4, 5).

Fig. 4. Derivaii glucidici cei mai comuni n structura peretelui celular bacterian : N-acetil-glucozamina si acidul N-acetilmuramic.

Fig. 5. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitaile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale. Aceasta structura chimica se gasete la E. coli, dar bacteriile conin si ali aminoacizi.

La fiecare unitate diglucidic este legat o component peptidic, reprezentat de un tetrapeptid, a crui compoziie n aminoacizi este variabil n funcie de specie, dar conine L-alanin, acid D-glutamic, acid diaminopimelic (derivat al lizinei) sau lizina i D-alanina i se leag de acidul N-acetilmuramic. Acidul Nacetil muramic i D-aminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

a. Acidul diaminopimelic, derivat al lizinei. b. Lizina.

Legturile glicozidice nu sunt suficiente pentru a asigura rigiditatea structurii parietale. Tetrapeptidele sunt legate prin puni peptidice transversale (Fig. 6). La bacteriile Gram negative, punile transversale reunesc gruparea NH2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-alaninei terminale a altei grupri peptidice.

a.

b

c

dFig 6. (a) Structura chimic general a peptidoglicanului. (b) Sgeile indic situsurile la care peptidoglicanul poate fi atacat de hidrolazele peretelui celular. Sunt reprezentate trei catene de peptidoglican ce constau din resturi alternante de acid N-acetil muramic i N-acetil glucozamina. Tetrapeptidele legate de acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin puni de pentaglicin. (c) La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin puni de pentaglicin. (d) Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid N-acetilmuramic). Liniile groase reprezint legaturi peptidice transversale (dupa Brock, 1988).

La bacteriile Gram pozitive, legtura transversal a tetrapeptidelor nvecinate este realizat de o punte peptidic, cu compoziie variabil. La S. aureus este format de pentaglicin. Cu ct numrul de legturi peptidice este mai mare, cu att crete rigiditatea sa. Se formeaz astfel o structur covalent perfect continu n jurul celulei, o molecul mureinic gigant, un adevrat sac mureinic, cu structur tridimensional dinamic.

Peptidoglicanii diferitelor specii difer prin aminoacizii 2 i 3 ai tetrapeptidului i prin frecvena punilor transversale de pentaglicin. Speciile patogene au o frecven superioar a punilor transversale, ceea ce se coreleaz cu o rezisten mai mare a mureinei la aciunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul etc.). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modeleaz creterea sa: murein-hidrolazele taie legturile chimice ale mureinei, iar murein-sintetazele inser noi uniti de construcie. Importana mureinei, ca element structural esenial al peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive a reieit din studiul aciunii a doi ageni antibacterieni: lizozimul i penicilina. Lizozimul cliveaz legturile glicozidice l-4 i hidrolizeaz mureina celulelor aflate n faza staionar. Penicilina inhib celulele bacteriene aflate n faza de cretere, deoarece inhib treapta final a sintezei mureinei, reacia de transpeptidare, adic formarea legturilor peptidice transversale ntre catenele de glican adiacente. Inhibiia transpeptidrii sub aciunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subire, urmat de liza i moartea celulei, pentru c autolizinele continu s funcioneze, iar alte puni peptidice nu se mai formeaz. De aceea, penicilina este activ numai asupra celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active i peptidoglicanul nu este degradat. Mureina formeaz o matrice, n care se gsesc ali polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii teichoici sunt molecule lungi i flexibile. Din punct de vedere chimic sunt polimeri de l-3poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legai fosfo-diesteric. Polimerii formeaz axul central al moleculei. Gruprile OH libere ale glicerolului i gruparea OH C3 a ribitolului sunt ocupate de resturi de D-alanin, Dglucoz sau de N-acetilglucozamin.

Poliglicerol fosfat

Poliribitol fosfat Bacteriile Gram pozitive au dou categorii de acizi teichoici: a) acizi lipoteichoici (ALT) traverseaz peptidoglicanul i cu o extremitate se leag de glicolipidele din membrana, iar cellalt capt este liber la suprafaa celulei; b) acizi teichoici parietali, ataai covalent de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei. mpreun cu mureina, acizii teichoici formeaz o reea polianionic sau matrice, cu rol n meninerea echilibrului cu cationii metalici, dar i n reglarea traficului de ioni, nutrieni, proteine i antibiotice. Funciile acizilor teichoici sunt multiple: - acizii teichoici sunt structuri moleculare filamentoase, care confer un plus de rigiditate peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive ; - fiind polianionici, au rol n transportul cationilor metalici n/i din celul; - au rolul de receptori de fagi; - au rolul de adezine (mediaz aderena celulei la substrat, favoriznd formarea biofilmelor), confer rezisten la antibiotice. La bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de virulen, deoarece au proprieti chimiotactic negative fa de fagocite. Acizii teichoici parietali sunt imunogeni, att n stare liber ct i asociai celulei. Uneori bacteriile secret cantiti mari de acizi teichoici solubili. Nu toate bacteriile Gram pozitive au acizi teichoici: cele care nu au acizi teichoici, poart molecule anionice cu funcii asemntoare (de exemplu, lipomananul, n locul ALT la Micrococcus luteus). Peretele celular la bacteriile Gram negative

Bacteriile Gram negative se caracterizeaz prin prezena membranei externe. Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvenierii proteinelor a dus la concluzia existenei unor diferene filogenetice majore ntre organismele cu nveli dublu membranar (didermice) i cele cu membran simpl (monodermice). La bacteriile Gram negative, mureina reprezint numai 2,5-l0% din greutatea uscat a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorit unei structuri caracteristice denumit membrana extern a peretelui celular, o replic structural a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerat ca membran intern (fig. 7).

Fig. 7. Reprezentarea schematic a structurii moleculare a peretelui la bacteriile Gram negative. Proteinele trimere matriceale din membrana externa sunt asociate cu lipoproteine i cu lipopolizaharide (LPS). LPS sunt legate covalent de peptidoglican.

La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorit structurii trilaminare a membranei externe a peretelui. Mureina este localizat n stratul cel mai intern al peretelui. Dup un tratament adecvat, membrana extern se poate ndeprta i se obine sacul mureinic pur, extrem de fin care pstreaz forma original a celulei i care sugereaz c mureina ar putea fi o reea bidimensional (un monostrat molecular), n timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult. Membrana extern a peretelui conine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) i lipopolizaharide (50%). Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece regleaz permeabilitatea i constituie canalele membranare de transport celular. Iniial s-au descris trei tipuri de porine trimerice : OmpF, OmpC i PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze x relev c porinele sunt proteine transmembranare a cror configuraie secundar este cea de -pliere. Aproape invariabil, secvenele porinelor la captul C-terminal au fenil-alanina. Rareori restul C-terminal este triptofanul. O celul de E. coli produce circa 105 molecule porine, al cror rol este barier selectiv de permeabilitate. In mediul hiperosmotic, numrul porinelor diminu. Cel puin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric: - stratul extern conine aproape exclusiv LPS - stratul intern conine aproape exclusiv fosfolipide. Lipoproteinele leag ferm membrana extern, de peptidoglicanul profund. Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate n membrana extern. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia) (fig. 9). Dei sunt localizate la suprafaa celulei, se numesc endotoxine, deoarece se elibereaz numai dup pierderea integritii celulei.

Fig. 8. Raporturile macromoleculelor componente ale peretelui celular (dupa Todar, 2004).

Structura chimic a moleculei de LPS Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alctuite dintr-o fracie lipidic i una polizaharidic. De aici deriv proprietile amfipatice ale acestui agregat molecular, conferit de grupri polare hidrofile i grupri apolare hidrofobe. Datorit poziiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45- 60%. La microscopul electronic, filamentele LPS au o structura trilaminar, corespunztoare celor dou straturi poliozidice i stratului lipidic. Cele mai studiate LPS sunt cele produse se tulpinile de Salmonella. Din punct de vedere structural, molecula LPS are trei regiuni(fig. 9): - o regiune polizaharidic extern (polizaharidul O) - o regiune oligozaharidic intermediar (regiunea R) - o regiune intern hidrofob, denumit lipidul A, prin care LPS se ancoreaz n membrana extern, printre moleculele fosfolipidice.

Fig. 9. Reprezentarea schematica a structurii moleculei de LPS

Regiunile intermediar i intern ale moleculei LPS au compoziie chimic relativ constant la diferite specii de bacterii Gram negative. Polizaharidul regiunii externe este un polimer de uniti oligozaharidice repetitive i confer specificitate serologic de grup, diferitelor variante antigenice de Salmonella. Unitile oligozaharidice conin 2-4 glucide: D-manoza, D-galactoza, L-ramnoza, o dezoxihexoza, o didezoxihexoza. Didezoxihezozele sunt zaharuri care nu exist n stare liber n natur, dar intr frecvent n structura polizaharidului enterobacteriilor i au primit denumiri care deriv de la speciile de origine: abequoza, tiveloza, paratoza, colitoza. Variaia antigenic a polizaharidului regiunii externe se amplific pe urmtoarele ci: - schimbri ale poziiei legturilor (de exemplu, 1-4 n loc de 1-6); - configuraii moleculare modificate; nlocuiri la nivelul diferitelor subuniti repetitive; deleia sau substituia unui rest glucidic din subunitile oligozaharidice. Regiunea centrala a LPS (miezul R) are o variabilitate chimic mult mai restrns i confer specificitate de gen. Oligozaharidul este legat covalent de lipidul A printr-un trizaharid, 2-ceto-3-dezoxioctonat (KDO). -

-

Lipidul A este inserat i ancorat, prin catenele acizilor grai, cu lipidele membranei externe. Intreaga molecul LPS este astfel orientat, nct polizaharidul O se proiecteaz la exterior i determin specificitatea antigenic a celulei bacteriene. La Salmonella, lipidul A este alctuit din dizaharide de D-glucozamin, legate l-6 (fig. 10). Perechile de D-glucozamin sunt interconectate l-4, prin puni pirofosfat.

Fig. 10. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO i cu resturile de acizi grai.

Gruprile OH din poziiile 3, 4 si 6 ale fiecrui dizaharid sunt substituite de acizi grai (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic). Grupul OH din poziia 3 se leag de componenta polizaharidic (acidul 2-ceto,3-deoxioctanoic) (KDO). Gruprile -NH2 ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic. Componenta lipidic confer moleculei LPS, calitatea de toxin. Lipidul A are proprieti endotoxice, evideniate la mutantele R care sintetizeaz LPS incomplet, cruia i lipsete polizaharidul O i unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R. In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizeaz polizaharidul O i formeaz colonii S. Cele care nu sintetizeaz polizaharidul O formeaz colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenitii, deoarece formele coloniale R ale B. pertusis, N gonorrhoeae sunt patogene. Permeabilitatea membranei externe Membrana extern, ca i celelalte membrane biologice, este alctuit din stratul lipidic dublu, puin permeabil pentru moleculele hidrofile. Membrana extern conine proteine, denumite porine, ce formeaz canale pentru influxul nutrienilor i pentru eliminarea produselor de catabolism. Porinele s-au gsit la toate bacteriile Gram negative i chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium-Nocardia-Mycobacterium, care produc un perete celular bogat n lipide, asemntor dublului strat. Porinele clasice OmpF i OmpC transport preferenial cationi, iar PhoE, transport anioni. Moleculele de LPS formeaz baza structural a membranei externe. LPS este polianionic datorit sarcinilor negative ale lipidului A i leag cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivaleni (Ca2+, Mg2+) i formeaz o structur compact ca un acoperi de igl, pe suprafaa membranei externe. Situsurile LPS care leag cationii

sunt eseniale pentru integritatea membranei externe, dar n acelai timp ele reprezint clciul lui Ahile al acestei structuri, deoarece antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern. n clasificarea empiric a bacteriilor, un rol deosebit l-a avut comportamentul lor la coloraia Gram. Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebirile structurale majore ale celor diviziuni. Coloraia Gram implic tratamentul succesiv al celulelor cu cristal-violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluie de iod i ulterior, extracia cu un solvent organic polar (alcool sau acetona). In celul, cristal-violetul i iodul formeaz un complex insolubil. Celulele care rezist etapei decolorrii i rein complexul insolubil (cristal violet-iod) albastru nchis sunt celule Gram pozitive, iar cele care nu rein colorantul sunt Gram negative Reacia Gram nu se coreleaz direct cu compoziia chimic a peretelui, ci depinde de structura sa fizic, de starea fiziologic a celulei, de integritatea ei structural. Astfel, levurile, dei au perete celular gros, dar cu o compoziie chimic diferit de a mureinei, se coloreaz Gram pozitiv. Peretele celular la Archaea Archaea constau din 2 linii filogenetice: linia metanogen include halofilele extreme (Thermococcus, Thermoplasma) ; termofilele extreme (Sulfolobales i Thermoproteales). La Archaea, peretele celular prezint diferene structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor (fig. 12). Diferitele specii de Archaea se coloreaz Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conine acid muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei.-

Fig. 11. Structura pseudomureinei, polimerul peretelui celular la Methanobacterium sp.

Din punct de vedere chimic, peretele la Archaea este heterogen. La Archaea Gram pozitive (Methanobacterium - productoare de metan), peretele conine o pseudomurein, metanocondroitin sau hetropolizaharide. Pseudomureina (markerul biochimic al metanobacteriilor) este alctuit din uniti repetitive formate din dou zaharuri aminate (N-acetilglucozamin i acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al metanobacteriilor), legate l-3. Resturile acidului N acetiltalosaminuronic sunt legate prin puni peptidice (ca i la murein), iar aminoacizii sunt numai izomeri L. Legturile l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la aciunea lizozimului. Componenta peptidic este alctuit din 3 L-aminoacizi: acid glutamic, alanina i lizina.

Ambele componente pot fi modificate : N-acetilglucozamina poate fi nlocuit total sau parial de Nacetilgalactozamin, iar resturile de glicin, treonin, ornitin sau asparagin pot lua locul celor 3 aminoacizi, dac sunt n concentraii mari n mediul de cretere. Mureina i pseudomureina sunt componente omologe ca structur i funcie, dar diversitatea compoziiei chimice exclude originea lor comun. La Methanosarcina, celulele au un perete celular ce const din N-acetilgalactozamin, acid glucuronic sau galacturonic, glucoz i manoz. Forma celulei este meninut de un polimer fibrilar alctuit din acid uronic i 2 resturi de N-acetilgalactozamin. Polimerul formeaz o matrice, reminiscen a esutului conjunctiv al eucariotelor. La Methanospirillum i Methanothrix, lanurile de celule sunt nvelite de o teac tubular format din proteine i glucide. In interiorul tecii, fiecare celul este nconjurat de un strat format din subuniti proteice, cu aezare bidimensional paracristalin (strat S) (Konig, 1988). Archaea cu alte tipuri de nveli celular reacioneaz Gram negativ, dar structura tipic de perete Gram negativ lipsete. La g. Halobacterium, la Sulfolobales i Thermoproteales (specii termofile extreme) cel mai comun nveli celular, care menine forma celulei, este reprezentat de un singur strat molecular alctuit din subuniti proteice sau glicoproteice (stratul S), strns asociate cu faa extern a membranei. Peretele celular acido-alcoolo- rezistent al al micobacteriilor Cel de al IV-lea tip de structur chimic a peretelui se gsete la micobacterii (fig. 13). Unele genuri (Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae, Nocardia asteroides) conin lipide complexe, care nu se gsesc n structura parietal a altor bacterii. Ele se coloreaz slab dup protocolul