Micro Propagare

65
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA Facultatea de Horticultură Str. Mănăştur Nr.3-5 ,400372, Cluj-Napoca, România Tel: 0264-596384; Fax:0264-593792 Conf.dr.ing. Corina Cătană MICROBIOLOGIE ŞI MICROPROPAGARE Note de curs Cluj-Napoca Editura AcademicPres 2010

description

Biotehnologie

Transcript of Micro Propagare

  • UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

    VETERINAR CLUJ-NAPOCA Facultatea de Horticultur

    Str. Mntur Nr.3-5 ,400372, Cluj-Napoca, Romnia Tel: 0264-596384; Fax:0264-593792

    Conf.dr.ing. Corina Ctan

    MICROBIOLOGIE I MICROPROPAGARE

    Note de curs

    Cluj-Napoca

    Editura AcademicPres

    2010

  • C1. Biotehnologia clasic i modern

    n prezent, umanitatea se confrunt cu o problem serioas i anume "hrana". Din

    pcate, pentru o parte a populaiei (mai evident n rile lumii a 3-a), producia agricol

    este incapabil s satisfac chiar i cele mai elementare nevoi, problema devenind i mai

    acut prin creterea numrului populaiei planetei (5,8 miliarde n prezent fa de 1,6

    miliarde n 1914 i, probabil, cam 8,3 miliarde pn n 2025), fapt care va face insuficient

    volumul produciei agricole actual. Pentru a asigura necesarul de hran preconizat pentru

    2025, nivelul mediu al produciei trebuie s creasc semnificativ (de exemplu, cel al

    cerealelor cu pn la 80%). Sofisticatele sisteme agricole de nalt tehnologie ale rilor

    dezvoltate (mrirea suprafeelor cultivate, dezvoltarea sistemelor de irigare i creterea

    numrului lucrrilor agricole) ncearc, dar cu rezultate limitate, s rezolve dorina de a

    crete masiv producia alimentar. n plus, la nivel mondial, sunt nregistrate i pierderi

    ale produciei agricole, estimate ntre 20-40%, cauzate de diferii factori: insectele- care

    produc pierderi de 14%, plantele duntoare- 10% sau bolile care produc pierderi de

    12%, acestea fiind doar pierderi de ordin primar.

    Natura a dezvoltat o diversitate vegetal enorm, fiind descrise pn n prezent un

    numr de aproximativ 250.000 de specii vegetale dintr-un total estimat la cel puin

    500.000 specii diferite. Plantele triesc n ecosisteme n care interacioneaz cu alte

    organisme, prin mecanismele de aprare, simbioze sau polenizare. Aceste interaciuni

    specifice implic o gam larg de compui chimici. La un anumit nivel, exist o

    biochimie similar necesar supravieuirii unei celule vii dar, pe lng aceste procese

    primare, organismele vegetale produc i o serie de metabolii secundari cu rol esenial n

    interaciunea cu alte organisme. Datorit numrului mare de organisme i a numrului

    practic infinit de interaciuni, n cursul evoluiei a aprut un numr enorm de metabolii,

    pn n prezent fiind nregistrai peste 100.000, numrul lor sporind anual, n medie, cu

    ali peste 4.000 (Verpoorte et al., 1998). Pe lng rolul lor n asigurarea calitii

    alimentare a plantelor (gust i culoare), aceti compui prezint i importan economic,

    fiind resursa de substane active pentru obinerea de medicamente, substane aromatice,

    esene i parfumuri, insecticide i colorani. Mai mult chiar, n ultimi ani a devenit tot mai

  • evident importana lor preventiv i terapeutic cnd sunt utilizai ca ingredieni i

    aditivi alimentari, aspect care fundamenteaz un domeniu complet nou i anume, cel al

    nutriceuticalelor.

    Progresul n tiina plantelor este cea mai bun speran pentru realizarea unei

    agriculturi profitabile, susinute economic i stabil din punct de vedere ecologic i, astfel

    cercul se nchide - Natura, om i tehnologie.

    Strategia iniial de selecie i meninere a unor forme vegetale valoroase a pornit

    de la o alegere simpl, adeseori ntmpltoare imediat ce observaia empiric c

    seminele unor plante czute pe pmntul rscolit ncolesc, cresc i fructific a

    fundamentat ideea de cultur, respectiv de agricultur. ncetul cu ncetul plantele au fost

    mai nti domesticite iar cultivarea lor a nlocuit treptat vntoarea i culesul. Profesorul

    Indra Vasil spunea odat c: alegerea fcut de omul neolitic s-a dovedit a fi neleapt

    i remarcabil de durabil i, de asemenea, a ajutat la susinerea dezvoltrii civilizaiei

    umane prin asigurarea unei bogate i dependente surse de nutriie pentru populaia aflat

    mereu n cretere numeric i deci, n nevoi.

    Dei ne-am dori o armonie continu ntre om i natur, nc din acele vremuri a

    existat o permanent lupt ntre forele naturale ale biodiversitii i nevoia omului de a

    produce alimente, ntr-un sistem de producie intensiv, din ce n ce mai progresiv. La

    nceput, ameliorarea plantelor n scopul mbuntirii lor, s-a bazat pe ncercare i eroare.

    Descoperirile fcute de Darwin i Mendel au demonstrat c: 1) combinaiile caracterelor

    genetice sunt favorizate ntre indivizi, n cadrul populaiilor, printr-un proces de selecie

    natural i 2) c aceste caractere individuale (genele) manifest un proces de segregare n

    descenden, n conformitate cu un program predictibil.

    n zilele noastre, din punct de vedere tehnic, n activitatea de creare de soiuri i

    hibrizi comerciali, amelioratorul trebuie s rezolve, trei grupe de probleme eseniale,

    reprezentate de:

    - utilizarea unei variabiliti genetice ct mai largi, n limitele resurselor sale

    materiale i umane,

    - gsirea posibilitilor de selecie a recombinaniilor care prezint

    caracteristicile dorite de el i,

  • - utilizarea unor metode rapide de obinere a unei descendene numeroase ale

    seleciilor valoroase, cu caracteristici previzibile i stabile.

    Biotehnologia vine s ntmpine aceste deziderate ale amelioratorului pe dou ci:

    - prin creterea randamentului i a eficienei de selecie propriu zis i,

    - prin lrgirea i completarea bazei genetice prin mecanisme directe sau

    indirecte de modificare genetic, baz din care amelioratorul poate selecta o

    form ct mai potrivit scopurilor sale.

    Ulterior cultivrii plantelor, n demersul uman de cunoatere n sine a lucrurilor i

    proceselor pn la aciune i aplicaie practic (i invers) omul a descoperit prepararea

    vinului (vinificaia) dup ce a observat c sucul stors din struguri i pstrat mai mult

    vreme, fermenteaz i se transform ntr-o butur cu noi caliti. Tot aa, omul a ajuns s

    tie cum s-i prepare pinea, brnzeturile, s-i pstreze un timp mai ndelungat

    alimentele. Azi considerm tehnicile de panificaie, vinificaie, fabricare a berii, de

    preparare a brnzeturilor ca reprezentnd biotehnologiile tradiionale. Dup ce celebrul

    chimist francez Louis Pasteur (1822-1895) a descoperit rolul esenial al

    microorganismelor n procesele de fermentaie sau dup ce autori ca Takamine (1914) n

    SUA i Boidin i Effront (1917) n Frana i Belgia au reuit producerea biotehnologic a

    enzimelor, amilaza (folosind specii ca Asp. oryzea i Baccilus mesentericus) putem vorbi

    cu adevrat de o biotehnologie, clasificat azi ca fiind veche .

    Lucrrile lui Fleming (1929), Chain i Abraham (1940) asupra penicilinei,

    Waksman, (1943), asupra streptomicinei, Smith i Worrel, (1949-53), asupra

    cloranfenicolului, reprezint precursori ai biotehnologiei moderne deoarece ele

    reprezint primele realizri n acest domeniu. Prima producie industrial prin fermentaie

    a penicilinei a fost realizat de ctre o echip format din Florey i Chain i cea condus

    de Perlman n perioada 1940-48. Au urmat apoi, fabricarea prin fermentaie a acidului

    glutamic (n Japonia, 1957), a lizinei (Japonia, SUA, 1957-58), a treoninei (1960), a

    fenilalaninei, 1961 (USA). Brevetul de invenie pentru fabricarea vitaminei B12 este

    datat n 1960 .

    Descoperirea succesiv a antibioticelor (> 4000 ntre 1939-59), folosirea lor n

    timpul celui de al doilea rzboi mondial, au fost favorizate i de realizarea primelor

    bioreactoare (ceea ce a marcat apariia bioingineriei), a punerii la punct a procedeelor (de

  • exemplu: folosirea aa numitelor culturi pure, noiune fundamental n microbiologie,

    larg utilizat acum n biotehnologie.

    Dezvoltarea industriilor cosmetice, chimice, agro-industrial, i agro-alimentar

    (fermentative i de bioconversie), au contribuit la formarea, dezvoltarea i diversificarea

    biotehnologiilor moderne.

    Datorit valorii unor astfel de cercetri i realizri, n prezent au luat fiin

    Societi (1983 Socits de Biotechnologie dans le Monde). Exist aproximativ 700

    societi specializate (n Biotechnologie nouvelles (SSB), n SUA, aprox. 300 n Europa.

    ncepnd cu anii 80, guvernele lumii ntregi se intereseaz asupra perspectivelor

    bio-industriilor, de maniera orientrii politicii lor economice pentru stimularea i

    susinerea financiar a cercetrii i industrializrii n acest domeniu. Desigur, exist

    Programe naionale de Biotehnologii elaborate i coordonate de diverse ministere.

    S-au nfiinat firme specializate (Imunotech anticorpi monoclonali, 1981;

    Coletica (cosmetice), CLOMATEC (imunologie), Genset (sinteze ADN i ARN),

    BIOEUROPE (Contracte de cercetare) care supervizeaz i direcioneaz dezvoltarea

    biotehnologiei.

    Materia de baz o constituie de obicei experiena etno-farmacologic,

    etnomedical sau/i etnobotanic sau cunotine/informaii specifice de utilizare a unui

    anumit compus pentru un anumit scop. Sursa cea mai important i masiv o constituie

    speciile vegetale slbatice. Din cele peste 400 specii etnobotanice, doar 1/3 au fost

    analizate fitochimic n mod corespunztor. Se estimeaz c, n prezent, doar 5-15% din

    totalul de 25.000 pn la 75.000 de specii vegetale au fost studiate ca potenial surs de

    substane utile (Simon, 1986), iar n ri mai puin evoluate, n domeniul tiinei doar 1%

    din specii au fost analizate. Pentru un proces complet de analiz fitochimic sunt necesare

    aproximativ 100 kg de material original (rdcini, tulpini, frunze, flori, fructe, semine).

    Acest procedeu este destul de greu de realizat datorit numrului mare de indivizi ce

    trebuie colectai, situaie care poate perturba compoziia floristic a unui areal dat sau

    poate duce chiar la distrugerea-dispariia unor specii rare sau endemice.

    n domeniul biologiei celulare i moleculare ultimii ani au avut i continu s aib

    un impact considerabil asupra lucrrilor de ameliorare vegetal concretizndu-se,

  • conform unor reputai amelioratori precum Gallais, Jacobse, Elliot n trei direcii

    importante:

    -elemente de biologie celular utilizabile n ameliorare,

    -elemente de biologie molecular utilizabile n ameliorare,

    -manipularea genetic la plante n scop de ameliorare.

    Dezvoltarea biologiei celulare i moleculare, genetica molecular i ingineria

    genetic au permis punerea la punct a unor tehnici (de exemplu: tehnica amplificrii in

    vitro a ADN = PCR (Polymerase Chain Reaction), chromosome walking, chromosome

    painting, RFLP (Restriction Fragments Length Polimorphism), identificarea i cartarea

    genelor), care sunt n prezent mijloace aproape obligatoriu folosite n procesul

    biotehnologic.

    Dintre obiectivele noi realizate prin intermediul ingineriei genetice menionm:

    posibilitatea de cretere a randamentului fotosintetic, sporirea randamentului de cretere a

    utilizri ngrmintelor minerale, modificarea genelor care particip la activizarea cilor

    metabolice exprimate prin spor de producie. Prin utilizarea unor ageni, vectori de tipul

    plasmidei Ti de la Agrobacterium este posibil realizarea transferului unei heterogene de

    la o form donoare la plantele cultivate. Transferul de gene este, fr ndoial, o surs de

    variabilitate genetic. n momentul de fa, la plantele de cultur, este posibil transferul a

    unor gene care determin:

    -depozitarea unei mari cantiti de proteine n semine;

    -sinteza unor enzime specifice care s permit acumularea, n organe specializate, a unor

    cantiti dorite de amidon sau alte zaharuri;

    -sinteza unor compui toxici pentru anumite insecte duntoare;

    -sinteza unor proteine virale de tip capsidic care s asigure protecia impotriva infeciilor

    virotice;

    -sinteza unor produi ce induc androsterilitatea.

    Pentru a se ilustra ctigurile ce se ateapt de la manipulrile genetice utillizate

    n ameliorarea plantelor nu este lipsit de interes s se prezinte i principalele gene ce se

  • doresc a fi transferate plantelor de cultur, de la alte organisme. Dintre acestea,

    deocamdat, au fost realizate:

    -rezistena la boli virotice, prin transferul la plantele de cultur, a unor gene virale

    ce determin sinteza proteinelor capsidice sau a ARN-ului viral antisens ;

    -rezistena la atacul insectelor, bazat pe transferul la plante, al genelor pentru

    sinteza proteinelor cristale i a inhibitorilor proteinazei ;

    -rezistena la erbicide, obinut prin realizarea unei mutaii n gena ce determin

    sinteza proteinei int sau prin introducerea n plante a unor gene ce determin

    supraproducia de protein int sau detoxifierea substanei active a erbicidului ;

    -rezistena la bolile bacteriene realizat prin transferul la plantele de cultur a

    genelor ce codific sinteza unor peptide cu efect bactericid ;

    -reglarea coninutului n amidon al tuberculilor de cartof prin transferul de gene ce

    influeneaz sinteza enzimei GBSS, responsabil pentru producia de amidon ;

    -obinerea unei fermiti ridicate a pulpei fructelor de tomate prin includerea, n

    genotipul soiurilor valoroase, a unor gene ce regleaz sinteza enzimei poligalacturonaza,

    responsabil cu nmuierea pieliei i pulpei fructelor.

    La acest nivel vorbim deja de o altfel de strategie a dezvoltrii biotehnologiei

    adic de o strategie caracteristic tiinelor aplicative, care pornete de la idee spre

    aplicaiile practice. Aceasta presupune obligativitatea ca naintea oricrui demers practic

    s se efectueze mai multe investigaii teoretice (aa numita cercetare fundamental).

    Tehnologia se distinge de tiin prin obiectul su, prin realitatea tehnic, dar este totui

    tiin datorit coninutului su. n zilele noastre, tehnologia se hrnete din tiin i

    hrnete tiina prin executarea tehnic a acesteia, ceea ce presupune (dup Soran et al.,

    1993):

    - manier metodic (deci se pun probleme care trebuiesc rezolvate n tiin un

    rspuns negativ este acceptat; n tehnologie nu are valoare, pentru c nu poate fi

    aplicat. Exemple de probleme puse i rezolvate de biotehnologie: prepararea laptelui

    lipsit de lactoz, medicamente pe baz de enzime, modelarea artificial a fotosintezei,

    obinerea de semine artificiale)

  • - rigoare n demersuri datorit preurilor de cost ridicate, programele aprobate

    pentru finanare n biotehnologie trebuie s fie temeinic fundamentate

    - precizie n observaii i msurtori, chiar dac conceptele rezultate sunt de manier

    general.

    - necesitatea susinerii matematice (asigurarea statistic a rezultatelor) (spre

    deosebire de cercetarea n tiin unde simpla observaie i descriere a unui

    fenomen sau proces este suficient, n biotehnologie, rezultatele se finalizeaz sub

    forma tehnologiilor de producie ceea ce presupune elaborarea unui program care

    poate i trebuie s fie reproductibil i funcionabil, oricnd i de ctre oricine, n

    condiiile respectrii condiiilor indicate n aa numitele protocoale de lucru.

    Definirea biotehnologiei

    Termenul de Biotehnologie este rezultatul asocierii a dou cuvinte de origine

    greac BIOS-via i TECHNE-art, artefact, lucru fcut de mna omului; adic, n sens

    modern, tehnic. Pn la apariia i intrarea n vigoare a noilor legiferri internaionale,

    biotehnologia se putea defini ca fiind o ramur a biologiei care se ocup de elaborarea

    unor procedee tehnice pentru obinerea diverselor bunuri necesare omului, folosindu-se

    de particularitile metabolice ale diverselor sisteme vii, n particular ale celulelor de

    diverse proveniene (Soran, 1993). Totui, aa cum atrgea atenia Topal (1986), nu

    tot ceea ce are tangen cu biologia i cu tehnica este biotehnologie, dup cum nu orice

    tehnic biologic sau tehnologie bazat pe o materie prim biologic este biotehnologie.

    Aspect foarte bine demonstrat de limitarea precis a noiunii de biotehnologie, n

    accepiunea sa modern, legiferat prin Protocolul de la Cartagena, n Articolul 3, ca

    fiind aplicaia :

    (a). tehnicilor in vitro asupra acidului nucleic, incluznd tehnica ADN-ului

    recombinant i injectarea direct de acid dezoxiribonucleic (ADN) n celule sau

    organite celulare, sau

    (b). fuziunea celulelor dincolo de limita taxonomic a familiei, care depesc

    barierele fiziologice reproductive naturale sau cele de recombinare i care nu

    sunt tehnici folosite n ameliorarea i selecia clasic

    Aplicaiile practice se pot ntrevedea i realiza dup elucidarea aspectelor

    teoretice. Principala diferen ntre ceea ce ar putea nsemna termenul de tradiional

  • i nou (cu sensul de noutate) n biotehnologia vegetal este aceea c primul se

    bazeaz esenial pe organismul ca ntreg, n timp ce cel de-al doilea se refer la

    nivelul celular al organismului.

    Micropropagarea Biotehnologia Material: celule organizate, esuturi, fragmente de esuturi, plant ntreag

    Obiectiv: multiplicarea nelimitat a aceluiai tip de material biologic valoros

    Procese biologice implicate: creterea i dezvoltarea

    Stabilitate genetic: obligatorie

    Metode i tehnici : simple i ieftine

    Aplicaii imediate: comerciale

    Material: celule neorganizate: calus, suspensii

    celulare, celule imobilizate, celule individuale

    Obiectiv: obinere de material genetic modificat, obinere de metabolii secundari Procese biologioce implicate: metabolismul celular

    Stabilitate genetic: variabilitate genetic i somaclonal

    Metode i tehnici: complexe i sofisticate, destul de costisitoare

    Aplicaii imediate: tiinifice, comerciale i industriale

    Cultura in vitro a unor specii agricole i horticole este, probabil, primul exemplu

    de implicare a cuceririlor biologiei celulare n ameliorarea plantelor. Concret, cultivarea

    in vitro a materialului vegetal (esuturi meristematice, celule, embrioni) permite obinerea

    rapid a unui numr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.

    Potenialul culturii in vitro este imens, ns incomplet exploatat.

    Noiunea de cultur de esuturi vegetale este sinonim cu cultura in vitro (n sticl) i se refer la:

    cultura n condiii aseptice a unor:

    Organisme vegetale

    Organe vegetale

    esuturi vegetale

    Celule, suspensii celulare vegetale

    Protoplati

    Organite celulare, vegetale, etc.

    Ce nseamn cultura n condiii controlate?

    Cultura aseptic (axenic)

    Lips de contaminare (bacterii, ciuperci, virusuri, drojdii)

  • Mediu sterilizat

    Lipsit de microorganisme

    Condiii controlate de cultur

    Suport nutritiv artificial (mediu lichid sau solid)

    Fizice (temperatur, lumin, umiditate)

    Cursul nr 2

    Ce este micropropagarea?

    Micropropagarea poate fi definit ca un sistem de cultur pe un suport

    nutritiv n condiii de asepsie total a oricarei pri, organ, esut sau

    celul vegetal.

    Aplicaiile micropropagrii sunt:

    Principale -multiplicarea clonal rapid a formelor de interes agronomic -stabilirea, meninerea i desfacerea pe pia a clonelor libere de viroze

    Secundare -n cazul speciilor recalcitrante -ca metod suport n procesele de ameliorare

    Paralele (alternative) - metod folosit pentru conservarea materialului genetic, -metod de transport a materialului vegetal (se realizeaz n containere mici)

    De ce este important micropropagarea ? Pentru c asigur producie prin:

    cantitate- obinerea ntr-un timp scurt, pe tot parcursul anului a unor cantiti de material extrem de uniform i ntr-un numr practic nelimitat

    calitate- fiind o metod de multiplicare vegetativ asigur uniformitatea genetic a materialului biologic, ntr-o stare fitosanitar excelent

    i pentru activitatea de cercetare i studiu asupra unor aspecte precum:

    organogeneza

    elemente consumate

    reglare hormonala vegetal

    metoda suport pentru programele de ameliorare genetic

    Caracteristicile obligatorii ale micropropagrii:

    Se realizeaz pe medii nutritive

    Asigur controlul total al influenei factorilor fizici i chimici

    Principiile de baz ale micropropagrii

    1. Totipotena celular 1902 Haberland 2. Asepsia 1922 Robbins 3. Mediul de cultur 1934 White 4. Reglarea hormonal 1957 Skoog i Miller 5. Etapizarea culturii 1964 Murashige.

    Avantajele micropropagrii

  • n principal, alturi de celelalte ramuri ale economiei, agricultura cunoate i ea profunde

    transformri. n contextul acestor prefaceri intervenite n agricultur, biotehnologiile moderne devin o

    alternativ viabil.

    Una din aceste noi bio-tehnologii este cultura de esuturi la plante.

    Importana utilizrii tehnicii de nmulire a plantelor prin culturi de esuturi rezult din

    numeroasele avantaje pe care le prezint aceast metod n comparaie cu metodele de nmulire vegetativ

    tradiionale (clasice). Potenialul acestei metode este prezentat de unii autori ca fiind nelimitat. Exist ns

    si reineri cu privire la folosirea pe scar larg a micropropagrii, reineri ce se refer la posibilitatea

    meninerii valorii biologice a materialului produs, ntruct nu poate fi exclus riscul apariiei unor mutaii

    accidentale. Folosit ns corect, cultura in vitro, poate deveni din acest punct de vedere competitiv

    culturii in vivo.

    Pentru a scoate mai bine n eviden importana acestei metode, n cele ce urmeaz enumerm

    cteva din principalele avantaje oferite de ctre utilizarea n practic a tehnicilor in vitro de

    micropropagare:

    tehnica de multiplicare in vitro se poate aplica la toate speciile de plante, atunci cnd sunt cunoscute i

    ndeplinite condiiile i cerinele la nivel optim;

    se pot iniia i practica culturi pe tot parcursul anului, n laboratoare special amenajate, cu explante

    provenite de la culturi din cmp, din ser sau din alte culturi controlate putndu-se obine material de

    plantat independent de sezon;

    n comparaie cu metodele tradiionale de nmulire, cultura in vitro permite multiplicarea rapid, ntr-

    un ritm accelerat;

    favorizeaz crearea de noi genotipuri, prin inducerea variabilitii genetice (mutaii, hibrizi somatici

    prin fuzionare de protoplati, transfer de informaie genetic, etc.);

    n majoritatea cazurilor se transmit fidel, la toi descendenii, caracteristicile prinilor din care provin

    explantele ( sunt i unele excepii, exemplu la culturile de calus poate apare fenomenul de

    poliploidizare);

    creaz o economie important de for de munc i de spaii de producie n comparaie cu nmulirea

    clasic;

    se poate realiza rentinerirea plantelor foarte mbtrnite, respectiv juvenilizarea materialului de plantat

    obinndu-se plante de valoarea celor generate din embrionul seminei;

    scurteaz perioada de ameliorare a soiurilor la toate speciile de plante dar, n mod deosebit, la speciile

    lemnoase ( dela 10 15 ani la numai 2-3 ani);

    permite obinerea de material de plantat cu valoare biologic ridicat fiind, prin definiie, liber de

    viroze;

    exist posibilitatea nmulirii plantelor pentru producerea de samn hibrid

    atunci cnd genotipul parental este inapt de autopolenizare.

  • uureaz schimburile de material biologic ntre laboratoare de acelai tip att la nivel naional ct i la

    nivel internaional

    faciliteaz conservarea fondului genetic n "bnci de gene", ntruct prin pstrarea genotipurilor

    valoroase existente se mpiedic eroziunea (degradarea genetic) a speciilor;

    nlesnete crearea de plante cu caliti speciale privind coninutul n glucide, aminoacizi, vitamine etc.

    micropropagarea constitue o metod mbunattit de munca, activitatea desfsurndu-se n condiii de

    igien maxim.

    Numeroasele avantaje enumerate au determinat pe muli specialiti din cercetare i producie s

    treac la introducerea i aplicarea acestei tehnici, pe scar din ce n ce mai larg, iar la expoziii

    internaionale de horticultur i-au fcut apariia incinte aspetice, posibil de a fi instalate n condiii mai

    puin proprii nfiinrii unor laboratoare pretenioase. In acest mod chiar i micii productori i amatorii pot

    beneficia de utilizarea acestor tehnici moderne de nmulire a plantelor.

    Dezavantajele i riscurile micropropagrii Cnd vorbim despre avantajele multiplicrii in vitro a plantelor trebuie s lum n considerare i

    anumite riscuri pe care le implic aceast tehnic n condiiile unei producii lrgite, de tip industrial, de

    generare a materialului de plantat, prin operarea de subculturi, respectiv prin micropropagare, i anume:

    exist pericolul introducerii "explozive" n cultur ntr-un anumit sezon sau an, a speciilor sau soiurilor

    atunci la mod, ceea ce poate cauza saturarea pieei cu acelai tip de produs, conducnd la o scdere a

    cererii;

    rspndirea n cultur a unui numr redus de clone sau chiar nfiinarea de culturi monoclonale, ce va

    conduce la o "srcire genetic" a speciilor sau a varieilor aflate n cultur, apare pericolul selectrii

    naturale de duntori care pot decima ntr-un timp scurt exemplarele unei anumite clone ;

    n condiiile micropropagrii in vitro se remarc prezena unor fenomene fiziologice nedorite, cum este

    cazul vitrificrilor sau necrozelor;

    pierderi pot fi cauzate i din lipsa de profesionalism i contiinciozitate a persoanelor angajate n

    operaiunile implicate n lanul tehnologic de micropropagare in vitro.

    trebuie avute n vedere posibile accidente i ntoxicrii personalului muncitor cu diferite substane

    toxice folosite n decursul fluxului tehnologic, precum i procentul de pierderi de plante datorat fazelor

    de aclimatizare.

    Tehnicile i metodele de cultur in vitro permit obinerea a dou tipuri de cretere: creterea

    materialului vegetal n form organizat (celule, esuturi specializate i organe) i respectiv, creterea

    materialului vegetal n form neorganizat (calus, suspensii celulare).

    Creterea organizat

  • Creterea organizat const n crearea sau/i meninerea unei structuri vegetale definite. Aceasta

    se realizeaz cnd diferite organe vegetale, cum sunt vrfurile de cretere ale lstarilor sau rdcinilor

    (zonele meristemelor apicale), primordiile foliare, muguri floriferi sau flori aflate ntr-o faz iniial de

    dezvoltare, fructe mici n faz incipient de dezvoltare, transferate pe medii de cultur i continu

    creterea. Creterea organizat se realizeaz i cnd sunt create organe rezultate direct dintr-un fragment de

    esut plasat n cultur (deci dintr-un explant) sau dintr-o mas de celule iniial neorganizat (creterea din

    timpul proceselor de regenerare). Acest din urm proces, care duce la formarea unor organe de novo, se

    numete organogenez (formarea organului vegetal) sau morfogenez (adic dezvoltarea formei).

    Cultura esuturilor organizate

    Cultura de organe: se folosete ca termen general pentru acele tipuri de culturi n care formele

    organizate ale creterii (adic structuri definite cum sunt primordiile foliare, flori, fructe imature) pot fi

    meninute in mod continuu.

    Cele mai importante tipuri de culturi de organe sunt:

    cultura de meristeme, n care pri extrem de mici ale vrfului de cretere (0,5-1 mm) ,

    respectiv domul meristematic cu una-dou primordii foliare sunt izolate aseptic din planta

    mam i crescute pe mediu. Acest tip de cultur duce la formarea unei singure plante

    cultura de noduri, izolai aseptic din mugurii laterali, fiecare fiind purttorul unui

    fragment mic de tulpin (1 cm) care poart 1-2 muguri laterali. Acest tip de cultur duce

    la formarea a 1-2 lstari

    cultura de lstari, este iniiat aseptic din mugurii laterali sau din vrfurilor ramificaiilor

    laterale, vrfuri de dimensiuni mai mari dect cele ale meristemelor (1-2 cm), i care

    conin i cteva primordii foliare. Acest tip de cultur duce la formarea lstarilor multipli

    cultura de embrioni zigotici, const n disecia aseptic a seminelor fertilizate sau

    nefertilizate provenind din fructe mature sau imature i creterea lor pe mediu pn n

    faza de plantul. Acest tip de cultur duce la formarea unui numr mai mare de plantule.

    Cultura embrionilor zigotici este total diferit de ceea ce nseamn cultura embrionilor

    somatici!

    Cultura de rdcini izolate, presupune cultura pe mediu nutritiv, n condiii aseptice i

    controlate a rdcinilor plantelor separat de restul plantei. Acest tip de cultur duce la

    formarea unui sistem radicular ramificat. Cultura de rdcini izolate este total diferit de

    ceea ce nseamn cultura de rdcinue lnoase (hairy roots), care sunt esuturi tumorale

    foliare sau caulinare!

    Creterea neorganizat

  • Existena plantelor superioare depinde de alocarea organizat a unor funcii specifice pentru

    fiecare parte a organismului. Aceste pri devin difereniate, adic pentru ndeplinirea unor activiti

    specifice sunt modificate i funcioneaz diferit.

    Creterea neorganizat nu se gsete frecvent n natur dar poate fi realizat cu succes n condiii

    de cultur in vitro prin plasarea unor fragmente vegetale pe un mediu special. esutul care rezult n urma

    creterii pe acest tip de mediu nu conine nici o structur vegetal care s poat fi identificat, coninnd

    doar un numr limitat de celule specializate sau difereniate tipice plantei ntregi. O celul difereniat este

    o celul care a dezvoltat o form (o morfologie specific) sau/i funcie (fiziologie specializat). Un esut

    difereniat (de exemplu epiderma) este agregarea mai multor celule difereniate. Obinerea separat doar a

    unui tip de celule difereniate este greu de realizat deoarece formarea lor n cultur poate fi controlat

    numai pe o durat limitat de timp, adic nu putem menine i multiplica, pe o durat nedeterminat n

    timp, o cultur alctuit strict numai din celule epidermale (de exemplu). esuturile neorganizate ns

    permit meninerea lor, prin transfer repetat pe un mediu nutritiv, pe o durat foarte lung de timp.

    Procesele de difereniere care sunt induse in vitro pot fi studiate pentru descrierea botanic a

    formrii organelor distincte n timpul morfogenezei.

    Cele mai importante tipuri de culturi neorganizate sunt:

    cultura de calus (esut), reprezint creterea i meninerea unei mase mari de celulare

    neorganizate care rezult din creterea coordonat sau dezorganizat a unor organe

    vegetale mici, pri de esut vegetal sau culturi de celule iniiate anterior

    cultura de suspensii celulare (celule), reprezint creterea unor populaii de celule i

    agregate celulare mici, 20-100 celule, dispersate ntr-un mediu lichid i n condiii de

    agitare continu pe platform rotativ orizontal

    cultura de protoplati (cte o singur celul) reprezint cultura unor celule vegetale

    izolate ca urmare a ndeprtrii temporare a peretelui celular

    cultura de antere (grunciori imaturi de polen), reprezint cultura anterelor ntregi care

    conin microspori imaturi de polen n scopul obinerii de plante haploide prin formarea

    embrionilor somatici direct din polen. Cultura de polen este cea obinut prin creterea

    polenului scos din antere.

  • C3 Compoziia mediului de cultur i rolul componentelor sale

    n corpul plantei s-au dezvoltat funcii specializate ale diferitelor tipuri de esuturi, care

    interacioneaz pentru a asigura creterea i dezvoltarea organismului ca ntreg. n culturile de pri,

    organe, esuturi sau celule vegetale separate de corpul ntreg al plantei mam creterea autotrofic nu mai

    poate fi realizat astfel nct funciile prilor lips trebuie asigurate de mediul nutritiv. Sruri, vitamine,

    aminoacizi, fitoregulatori de cretere , zaharuri sunt componentele mediului de cultur care asigur una

    sau mai multe funcii pentru creterea plantelor in vitro. Fiecare specie vegetal, esut sau tip particular

    de cultur are o alt formul de optim pentru alctuirea sa. Gsirea formulei de mediu optime pentru

    cultur reprezint parte din arta i tiina culivrii materialului vegetal in vitro.

    n reuita cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol important revine compoziiei

    chimice a mediilor de cultur (a naturii elementelor prezente n substrat, proporia lor i compuii sub care

    ele sunt administrate), epuizrii prefereniale a unor compui din mediu sau a concentrrii acestora,

    fenomene ce duc la instalarea unor manifestri de caren, de toxicitate, soldate uneori, chiar cu

    necrozarea inoculilor.

    nc din momentul efecturii primelor ncercri de cultivare pe medii aseptice a explantelor

    vegetale pe baza cercetrilor de nutriie s-au fcut tatonri pentru elucidarea rolului jucat de ctre diferite

    elemente chimice, compui i concentraiile optime n care trebuie s fie prezente acestea n mediile de

    cultur. Mediile de cultur sunt concepute astfel nct s asigure creterea explantului ntr-un spaiu total

    artificial. Fa de mineralele obinuite gsite i n sol, pentru cultura in vitro substratul nutritiv trebuie s

    conin i compui organici cum sunt vitaminele, regulatori de cretere i o surs de carbon.

    Substane anorganice

    Poate cea mai consacrat i utilizat formul de mediu de cultur este MS, formul realizat de

    Murashige i Skoog n 1962. Acest mediu a fost realizat prin analiza compuilor anorganici din plantele de

    tutun, compui care apoi au fost testai, prin adugarea experimental n compoziia substratului nutritiv n

    doze asemntoare celor gsite n plante.

    Macroelementele

  • Elementele chimice de baz care intr n structura materiei vii sunt: C, O, H, N, S, P, K, Mg, Na,

    Cl, Al, Fe. Aceste elemente asigur cca 99,9 % din materia vie.

    Cele mai ntlnite macroelemente n formulele de mediu sunt: calciu (Ca), magneziu (Mg), azotul (N),

    fosforul (P), potasiu (K) i sulful (S). Prezena lor este indispensabil plantelor crescute pe medii de cultur

    datorit rolului lor structural i funcional n sinteza proteinelor (N i S), sinteza nucleotidelor (P, N, i S),

    sinteza peretelui celular (Ca), co-factor enzimatic (Mg) i integritatea membranei celulare (Mg). Srurile

    utilizate pentru prepararea mediilor de cultur trebuie s prezinte un nalt grad de puritate.

    Calciul. Calciul funcioneaz ca i co-factor pentru majoritatea enzimelor i are un rol de o

    importan particular n procesele de sintez a peretelui celular. Carena n calciu n mediile de cultur

    duce la necrozarea vrfurilor de cretere prin provocarea unor tulburri grave n esuturi, iar suprimarea din

    mediu duce la moartea celuleor n cca dou luni. La prepararea mediilor de cultur, calciul se folosete n

    cantiti de 1-3 mM, sub form de clorur de calciu sau nitrat de calciu.

    Magneziul. Magneziul este un element critic pentru funcionarea enzimelor i totodat este un

    compus integral al moleculei de clorofil. n corpul plantei cationul de magneziu echilibreaz ionii

    negativi. n mediul de cultur se utilizeaz n concentraii asemntoare clor de calciu, sub form de sulfat

    de magneziu.

    Azotul. Prezena azotului este esenial pentru creterea i viaa plantelor. Majoritatea azotului

    anorganic este convertit n aminoacizi i apoi n proteine. Azotul necesar culturilor in vitro se asigur pe

    dou ci: sruri anorganice i/sau organice. Azotul anorganic este reprezentat de ionii de amoniu i nitrat.

    Ionul de nitrat (NO3-), care are rol oxidant, se d n concentraii de 25-40 mM, iar cel de amoniu (NH4

    +), cu

    rol reductor, se d n concentraie de 2-20 mM, sub form de sruri anorganice. Plantele prezint o

    cretere mult mai bun n prezena ambelor forme de ioni, dar mai ales n medii de cultur slab tamponate

    este necesar utilizarea ambelor forme, fiind asigurat astfel meninerea valorii stabile a pH-ului. Cnd se

    administreaz numai ioni de amoniu acesta are un efect toxic. n mediul de cultur valorile concentraiei de

    azot anorganic sunt cuprinse ntre 25-60 mM

    Azotul se poate asigura i sub form organic ca aminoacizi cum sunt: glicina (2mg/l), l-

    glutamin, asparagin, tirozin (100mg/l), l-arginina sau cisteina (10 mg-l), hidrolizate (cazeina hidrolizat

    0,02-0,1%) sau acizi organici. Formele organice sunt utilizate mai ales cnd nu se administreaz amoniu.

    Avantajul utilizrii formulelor organice este dat de faptul c majoritatea formelor sunt deja reduse la forme

    tipice din plante, astfel c pot fi asimilate la nivel celular cu mare uurin. Prezena aminoacizilor pot avea

    i rol inhibitor astfel nct trebuie utilizai cu atenie, mai ales n mediile destinate stimulrii formrii de

    calus. Formele organice nu pot nlocui total prezena formelor anorganice.

  • Fosforul. Fosforul este necesar datorit faptului c face parte integrant din acizii nucleici i ali

    compui structurali. Obinuit este utilizat sub form de fosfai (PO4-) cu valori cuprinse ntre 1-3 mM. n

    exces, fosforul are efect toxic.

    Potasiul. Potasiul reprezint majoritatea ionilor pozitivi din plant avnd rol n schimburile de ioni

    prin echilibrarea ionilor negativi. Valorile de potasiu cerute de plante difer foarte mult n funcie de specie.

    n general prezena lui n mediul de cultur este corelat cu concentraia de nitrai fiind utilizat la valori de

    10-30 mM. Carena potasiului duce la necrozarea esuturilor, iar excesul stimuleaz evoluia doar a unor

    esuturi.

    Sulful. Sulful este esenial n structura proteinelor, prezena lui fiind critic n sinteza

    aminoacizilor pe baz de sulf. Sulful prezint valoare nutritiv difereniat, astfel c i sulfiii sunt mai

    asimilabili dect sulfurile. Se d n concentraii de 1-3 mM, sub form de ion de SO4- n asociaie cu

    magneziul i rar npreun cu ioni de amoniu.Carena de sulf induce o clorozare a esuturilor in vitro, iar

    excesul de sulf exercit un efect toxic care produce necrozarea esuturilor.

    Microelemente

    Microelementele cele mai utilizate n mediile de cultur sunt: borul (Bo), manganul (Mn), cuprul

    (Cu), iodul (I), fierul (Fe), molibdenul (Mo), zincul (Zn), nichelul (Ni), cobaltul (Co), aluminiul (Al), etc.

    Microelementele sunt indispensabile, exercitnd un rol special asupra esuturilor vegetale,

    constituind co-factori enzimatici eseniali plantelor (citocromoxidaza, peroxidaza). Se administreaz de

    ordinul M. Suprimarea lor din mediu determin reducerea creterilor cu 40% la primul transfer,

    determinnd la cel de-al treilea transfer moartea celulelor. ntre ionii din mediul de cultur se stabilesc

    anumite interactiuni si chiar substituiri. Unele substante chimice pot imobiliza unii ionii sau pot provoca

    precipitarea unor sruri.

    Borul (Bo). Borul este un element esenial n activitatea enzimatic legat de biosinteza ligninei i

    metabolismul acizilor fenolici.. Se d sub form de acid boric iar carena lui duce la moartea meristemelor

    i a vrfurilor de cretere.

    Manganul (Mn). Prezena lui este necesar n reaciile enzimatice, n mod special n procesele

    respiratorii i de fotosintez dar i n cresterea rdcinilor, fiind implicat si n sinteza proteic. Se d sub

    form de sulfat cu valori ntre 5-30 M.

    Cuprul (Cu). Cuprul, administrat sub form de sulfat cupric, are rol n creterea rdcinilor. La

    nivel celular, prezena lui, dei n cantiti extrem de mici (0,1M), este un factor critic n reacia multor

    enzime, nclusiv n sistemul de oxidare al citocromului. Excesul de cupru este toxic.

  • Iodul (I). Efectul iodului difer n funcie de specie. Dei nu este un element esenial se adaug n

    mediul de cultur deoarece stimuleaz creterea rdcinilor i a culturilor de calus.

    Cobaltul (Co). Nici acest element nu este esenial n fiziologia plantei dar se regsete n

    majoritatea mediilor de cultur destinate unei palete largi de aplicaii. Se d n concentraii asemntoare

    celor ale cuprului (0,1 M) iar n concentraii mari poate fi toxic.

    Fierul (Fe) Fierul este implicat n sinteza proteic si intr n compozitia unor metalo-enzime.

    Prezena fierului, n concentraie de 1M, este necesar att pentru sinteza clorofilei ct i pentru majoritatea

    reaciilor de oxidare i reducere. Aspectul cel mai important legat de prezena fierului l reprezint

    meninerea valorii optime a pH-ului n mediul de cultur, astfel nct ionii de fier s fie uor asimilai de

    celulele vegetale. Pentru stabilizarea ionilor de fier sunt utilizai agenii de chelatizare, compui care leag

    ionii metalelor, ionii devenind astfel mult mai accesibili esuturilor vegetale la valori diferite ale pH-ului.

    Marea problem n adugarea fierului este dat de formarea compuilor insolubili n mediile cu valori

    alcaline, fenomen evident mai ales n mediile lichide. Dei exist mai multe tipuri de ageni de chelatizare,

    la culturile in vitro cel mai folosit este forma potasic sau sodic a acidului etilen-diamino-tetra-acetic

    (EDTA). Acesta prezint avantajul c, fa de ali chelani, nu este toxic i poate fi folosit la valori variabile

    ale pH-ului (pn la pH 8,0). Fe-EDTA-ul poate fi cumprat ca atare sau poate fi preparat din sulfatul feric

    (FeSO47 H2O) i Na2EDTA.

    Molibdenul (Mo). Molibdenul este co-factor a dou enzime implicate n procesul de transformare

    a nitrailor n amoniu i are aciune pozitiv asupta ritmului de cretere al celulelor. Se d sub form de

    molibdat de sodiu n concentraii mici (1 M).

    Zincul (Zn). Prezena zincului este necesar n activitatea multor enzime i joac un rol esenial n

    dezvoltarea cloroplastelor. n mediul de cultur, concentraia de zinc difer destul de mult, avnd valori

    cuprinse ntre 5-30 M i nu are efect toxic la concentraii mai mari. Cea mai folosit form de

    administrare este cea de sulfat de zinc.

    Nichelul (Ni), aluminiul (Al) i siliciul (Si) nu au rol esenial n creterea i dezvoltarea plantelor

    in vitro i de aceea se gsesc mai rar n formulele de mediu de cultur.

    Compui organici

    Exist o diversitate de compui organici care sunt utilizai la preopararea mediilor de

    cultur. Compuii organici au rol n cretere (zaharurile) i pentru stimularea evident a proceselor de

    cretere celular (vitaminele, compuii organici nedeterminai i acizii organici).

  • Carbonul organic

    Datorit faptului c celulele inoculilor nu sunt complet autotrofe meninerea lor n via depinde

    de prezena unei surse de carbon, de tipul glucidelor, alcoolilor sau a acizilor organici.

    Zaharurile servesc ca surs energetic pentru esuturile i plantele crescute in vitro.

    Glucidele se adaug n concentratiile de 1,2-8% n anumite experimente se pot utiliza si fructoz

    ,glucoz, maltoz , arabinoz .

    Dintre alcooli , eficient s-a dovedit glicerolul (polialcool) , n unele cazuri putndu-se aduga si

    mezo inozitol (alcooli ciclici).

    Acizii organici de tipul acizilor :fumaric , succinic ,si citric au un rol

    favorabil n crestere desi au o valoare energetic mai mic dect cea a zaharozei.

    Vitamine

    Vitaminele sunt indispensabile unei multiplicri i creterii optime

    Tiamina (vitamina B1) - stimuleaz creterea biomasei celulare i tisulare.

    Piridoxina (vitamina B6 ) - este precursorul unor enzime .

    Vitamina C se recomand ca agent antioxidant

    Ciancobalamina se folosete n cazuri foarte rare.

    Biotina este stimulator n proliferarea celulelor.

    Acidul nicotinic influeneaz dezvoltarea celular.

    Se mai folosesc : riboflavina, acidul pantotenic.

    Mezo-inizitolul

    Apa

    Apa este solvent pentru substanele hidrofile, asigurnd mediul de dispersie pentru coloizii

    organitelor celulare. Calitatea apei utilizat la prepararea mediilor de cultur este un factor deosebit de

    important. Apa utilizat trebuie s fie distilat sau bidistilat. n unele situaii este necesar utilizarea apei

    pure (ap distilat, sterilizat prin autoclavare i apoi filtrat prin filtru Millipore. Apa distilat se pstreaz

    n recipiente bine nchise pentru evitarea solvirii CO2 i scderea pH-ului.

    Fitohormonii

  • Fitohormonii ocup poziii cheie in procesele de multiplicare celular i n creterea acestora, n

    general i n sinteza plantelor cormofite in special.

    Biogeneza fitohormonilor este localizat de regula n alte organe dect organele inta. Din locurile

    de sintez ei sunt translocate spre esuturile apte de a recepiona semnale si de a reaciona la stimuli primii,

    ei determin producerea unor rspunsuri: biochimice, fiziologice, morfologice.

    Celulele responsabile de biogeneza fitohormonilor, trebuie sa dein un sistem enzimatic adecvat

    sintezei sau deblocrii cilor metabolice, responsabile de asigurarea manifestrii integrale a activitaii

    fiecrui compartiment biomolecular.

    Tip de fitohormon Funciile de baz Locul sintezei

    AUXINELE Stimuleaz alungirea celular; sunt implicate n fototropism, gravitropism, dominana apical, difereniere vascular; stimuleaz sinteza etilenei i induce formarea rdcinilor adventive la butai

    n meristemele mugurilor apicali, embrion, frunze

    tinere

    CITOCHININELE Stimuleaz diviziunea celular, contracareaz dominana apical, implicate n creterea tulpinii, prelungete succesiunea frunzelor

    n rdcini i transportate la alte

    organe

    ACIDUL

    GIBERELINIC

    Stimuleaz alungirea tulpinilor, stimuleaz nflorirea la speciile bienale, reglementeaz producia enzimelor hidrolitice la cereale

    n meristemele mugurilor apicali i radiculari, frunzele tinere, n embrion

    ACIDUL ABSCISIC Inhib creterea, stimuleaz nchiderea stomatelor, menine starea de repaus

    n frunze, tulpini i fructele verzi

    ETILENA Stimuleaz coacerea fructelor, determin senescena frunzelor i a florilor, precum i cderea lor

    n esuturile fructelor coapte, nodurile

    caulinare, frunze i flori senescente

    Ali aditivi la mediul de cultur

    Suplimeni organici complecsi

    Partea voodoo a mediilor de cultur este asigurat de cantiti necunoscute a unor compui

    complecsi, substane provenind din extracte naturale, care dei nu sunt de dorit a fi folosite neputnd fi

    stabilite exact din punct de vedere cantitativ i calitativ, reprezint uneori singura cale pentru reuita unor

    culture mai dificile. Aceti suplimeni organici sunt:

    Laptele de nuc de cocos

    Suc de portocale

    Extract de drojdie

    Extract de mal

    Suc de tomate

    Pudr de banane, etc.

  • Crbunele activ

    La unele specii favorizeaz creterea esuturilor n culturi de apex i de antere, deoarece s-a

    constatat c pulberea de crbune absoarbe compuii toxici rezultai n urma degradrii zaharozei n timpul

    sterilizrii prin autoclavare, i totodat absooarbe fitohormonii prezeni n mediu. De asemenea, este folosit

    ca substan antioxidant.

    .

    Clasificarea mediilor de cultur

    In funcie de complexitatea formulei chimice: mediu de baz, mediu complex

    n funcie de destinaia culturii: de iniiere, de multiplicarede regenerare, de induicere a calusogenezei, de

    nrdcinare, culturi doic, medii cu val osmotic ridicat (pt. protoplati) de producie (elicitatori,

    precursori) etc.

    n funcie de tipul de suport asigurat: lichid, solid, n dublu strat, semisolid

    Sisteme de suport

    Ageni gelifiani

    Agarul este cel mai comun agent solidificator, utilizat n prepararea mediilor de cultur,

    preparndu-se din alge roii ale genului Gellidium i comercializat sub form de fibre, solzi sau pulbere.

    Agarul fibre sau lamele se pretrateaz pentru ndeprtarea impuritilor. ncercrile de a nlocui agarul cu

    gelatina nu au reuit deoarece aceasta nu permite aerarea mediului solidificat, schimburile ionice i

    absorbia substanelor din mediu este frnat.

    Ca ageni de solidificare a mediului se mai folosesc

    Agaroza: o form pur de agar

    Gelrite: un gelifiant sintetic

    Phytagel: un substituent de agar sintetizat din gum gellan. Acest produs nu opacizeaz mediul de cultur i

    datorit gradului ridicat de transparen este recomandat folosirea lui n cazul mediilor pentru studiul

    creterii i dezvoltrii rdcinilor.

    Biogeluri, silicageluri sau geluri de poliacrilamide.

    Suporturi mecanice

  • C4 C4 Etapele micropropagrii

    Cultura de esuturi reprezint o metod comercial rapid de multiplicare a

    cultivarelor noi obinute, a speciilor rare i a plantelor cu probleme de multiplicare prin

    metodele clasice. Datorit cererii tot mai ridicate pentru material vegetal

    micromultiplicat, de la cele cteva laboratoare existente acum civa ani, n prezent

    funcioneaz o adevrat industrie. Cu toate c nc funcioneaz uniti de producie care

    se ocup exclusiv de multiplicarea plantulelor, care sunt apoi vndute mai departe

    cultivartorilor, tendina general este ca marile uniti cultivatoare prin crearea propiului

    laborator de micropropagare s-i includ i etapa de multiplicare in vitro a materialul

    sditor.

  • In vivo=care crete n condiii naturale

    In vitro= care crete n condiii perfect controlate; n vase de sticl

    Ex vitro= aclimatizat pentru condiii naturale, provenind dintr-o cultur in vitro

    T. MURASHIGE descrie n 1974 etapele succesive care trebuie parcurse

    la producerea de plante in vitro, in regim industrial, distingnd 3 stadii :

    - Stadiul I, de infiintarea culturilor aseptice.

    - Stadiul II, de multiplicare si propagare in vitro a subiectului

    - Stadiul III, de pregatire a plantelor generate in vitro, pentru transferarea lor ex-vitro

    n 1982, din ratiunii de ordin economic, Debergh si Maene recomand extinderea numrului de

    stadii, prin nfiinarea unui Stadiu 0, premergator explantrii, i subdivizarea Stadiului III, n dou

    substadii.

    Nu exist reguli inviolabile pentru propagarea unei anumite specii vegetale prin culturi de esuturi

    i adesea este necesar ajustarea i reajustarea compoziiei mediului, a ambientului i chiar a habitatului

    astfel nct culturile s poata fi determinate s porneasc n cretere i dezvoltere.

    Pentru obiectivele micropropagrii poate fi descris o schem ce cuprinde cinci etape de baz:

    Etapa 0 de pregtire a materialului biologic

    Etapa 1 de iniiere a culturii in vitro

    Etapa 2 de micropropagare

    Etapa 3 de pregtire a plantulelor i de nrdcinare n vederea aclimatizrii

    Etapa 4 de aclimatizare.

    Etapa 0 se refer la pregatirea plantelor - mame donoare de explante; Ele trebuie crescute in conditii

    speciale de cultura, in spatii protejate, la temperatura de 25C , in umiditatea atmosferica de 70%; plantele

    vor fi udate numai la nivelul solului . Astfel, se obtine cresterea considerabila, a numrului de inoculi

    necontaminati . De regula - procentul de inoculi necontaminati nu depasea 50% .

    Etapa 1 de iniiere a culturii "in vitro"

    nfiinarea culturii const n exploatarea sau dimensionarea fragmentelor din care vor fi nfiinate

    culturile sau porionarea inoculilor (calus, culturi de celule ori a suspensiei de protoplati) i n introducerea

    acestora n mediu, asigurnd pe tot parcursul operaiilor condiii de asepsie total.

    n aceast etap se practic - selectarea cu responsabilitate a materialului vegetal i a explantului,

    ales ca iniiator al culturii, a mediilor de cultur i a condiiilor de incubare a inoculilor cu meniunea c o

    atenie cu totul special trebuie acordat momentului sterilizrii materialului biologic. De asemenea este

    important splarea la jet de ap, timp ndelungat a materialului biologic donator de explante astfel

    obinndu-se bune rezultate n ntemeierea culturii aseptice la materialele biologice dificile. Aceast etap

  • de iniiere a culturii are o durat mai lung de cca. 6 luni, n dependen cu materialul biologic cu care se

    lucreaz.

    Alegerea metodei de pretratament a plantei care urmeaz s fie propragat "in vitro", n cazul

    multor specii reprezint o etap esenial de care depinde succesul sau insuccesul fazei de iniiere a culturii

    "in vitro".

    Se iau n considerare urmtorii factori:

    Gradul de contaminare a materialului de pornire;

    Cnd explantele necesare iniierii unei culturi sunt recoltate din pri mature ale plantei

    sunt necesare procedee foarte complicate de sterilizare.

    Etapa 2 de Micromultiplicare

    Multiplicarea esuturilor cultivate "in vitro".

    Multiplicarea explantelor este un stadiu crucial pentru propagarea speciilor, n scopuri comerciale

    i, mai ales, cnd este cerut o rat rapid de multiplicare.

    Cel mai adesea, mediul standard de cretere este suplimentat cu citochinine, de obicei BAP sau

    chinetin. Exist cazuri cnd se nregistreaz un efect negativ la aplicarea citochininelor n concentraii

    mari recomandate pentru sporirea ratei de multiplicare. n general, datorit habiturii esuturilor vegetale la

    aplicarea citochininei, apar probleme serioase. n acest caz exist posibilitatea alternrii diferitelor tipuri de

    citochinine, ce de exemplu, folosirea didiazuronului, cu efect superior fa de BAP la speciile de Malus,

    dnd o rat mai mare de multiplicare i mai puine, probleme n stadiile urmtoare.

    Ali factori care afecteaz rata de multiplicare includ intensitatea luminoas, tipul de agar i

    cantitatea care se folosete, orientarea explantului pe mediu de inducie.

    3. Etapa de inradacinare

    Etapa de nrdcinare, se refer la unele modificri n compoziia mediului de cultur si la

    schimbarea condiiilor de cultur. Dac n etapa II au predominant auxinele iar citochininele au fost

    absente din substratul de cultur sau adgate n concentraii foarte mici, sau chiar au lipsit hormonii in

    totalitate, in etapa III se recomand reinstalarea dominaiei apicale la nivelul tulpinilor generate "in vitro"

    si inrdcinarea acestora. Exista 3 ci de abordare a etapei III.

    1. cultura poate fi transferat pe medii care s permit alungirea lstarilor: dup care vor fi

    recoltai si vor fi subcultivai pe un mediu proaspt, pregtit pentru facilitarea rizogenezei la nivelul

    minibutailor .

    2. inoculii vor fi divizai prin fragmentarea culturii in uniti care s dein o capacitate

    regenerativ rapid -n propagule care apoi vor fi subcultivate, pentru a determina formarea de rdcini, in

    vederea transferrii culturii "ex-vitro".

    3. tulpiniele derivate din Stadiul II, vor fi nrdcinate "in vitro", pe medii agarizate, avnd o

    balant hormonal adecvat acestui scop.

    Regenerarea de plante ntregi din esuturi propagate "in vitro", n mod obinuit, nseamn

    producerea de rdcini, proliferarea ramurilor axilare.

  • Obinerea nrdcinrii la unele specii se realizeaz prin reducerea concentraiei de citochinine, n

    prezena sau absena auxinelor, n special AIB (0,02 0,5 mg/l). Acest tratament poate fi folosit cu succes

    n combinaie cu reducerea componenei ionice a mediului MS, cu jumtate din concentraia nitrailor. La

    unele specii pentru stimularea nrdcinrii mediile pot fi suplimentate cu crbune activ sau ascorbat,

    tratament care nu este ns de rutin.

    Etapa 4 de aclimatizare i transferul la condiiile ex vitro.

    Plantele crescute n condiii "in vitro" se adapteaz la mediul artificial n diferite moduri. Forma

    cea mai extrem o reprezint vitrificarea esuturilor vegetale, ceea ce face ca materialul respectiv s nu fie

    potrivit pentru transferul direct la condiiile ex vitro. n acest caz, o perioad de pregtire postregenerativ

    este necesar pentru asigurarea supravieuirii ex vitro a esuturilor cultivate "in vitro".

    Cerinele sunt, n general, asemntoare pentru majoritatea speciilor. n condiii

    "in vitro" plantele cresc ntr-un mediu cu un nalt grad de umidiate, ca urmare

    pentru aclimatizare a devenit o rutin folosirea camerelor izolate sau a sistemului

    de cea artificial. Umiditatea relativ este meninut la un nivel relativ ridicat,

    80%, att n timpul zilei ct i n timpul nopii.

    Este esenial o splare a rdcinilor plantelor cultivate "in vitro" pentru ndeprtarea oricrui

    reziduu de mediu, care reprezint o excelent surs nutriional pentru bacterii. Este indicat o fertilizare

    cu un coninut ridicat de fosfor, n special n primele stadii ale aclimatizrii. Cnd umiditatea este foarte

    mare, este necesar folosirea fungicidelor.

    Cel mai critic factor n momentul ocului de adaptare l constituie n opinia lui De Fosard,

    funcionarea maxim a rdcinilor.Este necesar de asemenea protejarea tulpinielor impotriva uscciunii

    atmosferice. Acest stadiu poate fi prelungit, uneori, pn la 4 luni . n consecina o deosebit importan

    trebuie acordat momentului transferarii plantulelor din condiiile in vitro, n condiii naturale de viat,

    precum i modului n care se realizeaz aceast trecere, respectiv realizrii unei acomodri treptate a

    neoplantulelor, la condiiile mediului septic.

    ansele de supravieuire sunt determinate de pierderile prin transpiraie, datorit lipsei stratului de

    cear i a activitii aproape inexistente a stomatelor. Anterior transferarii, plantulele trebuie calite la un

    regim de viata mai sarac in umiditate. S-a observat c reducerea umiditii relative la 80% fa de

    maximum ct este recomandat la unele specii este suficient pentru a asigura formarea stomatelor

    funcionale i acoperirea cu un strat de cear suficient pentru asigurarea reducerilor, pierderilor de ap.

    Aceast reducere a umiditii relative se realizeaz prin deschiderea parial a vasului sau prin rcirea bazei

    vasului cu 2-3C sub temperatura aerului.

    Pentru a mri ansele de supravieuire se recomand supunerea plantelor - prealabil deschiderii

    recipientelor de cultur - la un regim special de lumin sau de temperatur prin ridicarea de cca.3-10 ori a

    intensitaii luminoase, in raport cu lumina din camera de cretere, din perioada dezvoltrii inoculilor.

  • Intensitatea luminoas, in funcie de specie, va creste la 8-10 mii luci . Uneori, se recomand aplicarea

    unor ocuri termice, ori schimbarea fotoperioadei; n unele cazuri, se impune transferarea plantulelor de pe

    medii lichide, pe medii solide, respectiv schimbarea calitailor fizice ale substratului de cultur, ori ale

    compoziiei chimice - hormonale - a mediului de cultur.

    Procentul de supravieuire in momentul trecerii plantulelor din condiiile "in vitro", in mediul

    septic, depinde de realizarea acomodrii plantelor la noile condiii i n special de protejarea de stres

    hidric, insolatie, extreme termice si curenii de aer. Plantele vor putea fi cultivate dup metodele

    agrotehnice normale abia dup acomodarea acestora la condiiile septice.

    C5 Embriogeneza somatic. Semine artificiale

    Obinerea de semine artificiale Embriogeneza: reprezint procesul iniierii i dezvoltrii unui organism. Se

    distinge fa de organogenez prin faptul c rezult o structur autonom care nu mai

    are legtur prin intermediul sistemului vascular, cu nici o alt structur iniial. n

    practic, termenul include toate procesele (mai mult sau mai puin sincrone) de

    dezvoltare a celor doi poli: apical i radicular.

    Embriogeneza somatic: reprezint procesul prin care, pornind de la celule somatice,

    fr legtur vascular cu esutul de origine, se formeaz o structur bipolar

    asemntoare embrionului zigotic. Embrionii somatici se pot diferenia dintr-un

    explant vegetal att direct, din celule somatice organizate ct i indirect, prin trecerea

    printr-o faz de calus.

    Organele plantelor se caracterizeaz prin anumite trsturi comune i anume: structura

    celular i tisular (substratul material i sediul proceselor biochimice), caracterul

    sistemic al organelor, polaritatea, simetria, orientarea n spaiu i regenerarea. Caracterul

    sistemic este dat de alctuirea acestora din ansambluri de esuturi specifice, subordonate

    activitii biologice proprii organismului i subordonarea fiziologic a organelor n cadrul

    organismului n ansamblul su, ceea ce asigur realizarea funciilor sale biologice.

    Polaritatea este dat de deosebirea morfologic i fiziologic ntre baza plantei i vrful

    ei. Aceast trstur prezint o importan deosebit n procesele de microbutire

    deoarece indiferent de poziionarea unui buta, rdcinile adventive se vor forma numai

  • la baz, crescnd n jos, iar lstririle numai n partea superioar, crescnd n sus.

    Simetria, necesar pentru meninerea echilibrului plantei n asigurarea verticalitii se

    realizeaz de la baz (cazul rozetelor de frunze) sau pe tulpina plantei.

    Precondiiile morfogenezei vegetale Totipotenialitatea celular

    Competena de regenerare

    potenialul pentru diviziune

    efectul de poziie

    predispoziia

    Totipotenialitatea celular

    La nceputul secolului XX, Gottlieb Haberland (1902) a experimentat cultura

    celulelor de tip mezofilian pe un mediu de cultur. Dei celulele cultivate nu au intrat n

    diviziune, acest experiment este important pentru fundamentarea teoriei totipotenialitii

    celulei vegetale. Totipotenialitatea celular se definete ca fiind capacitatea genetic a

    celulelor vegetale individuale, nucleate, de a regenera un organism vegetal ntreg,

    structural i funcional, n mod direct sau prin intermediul unei faze de calus.

    Teoretic, toate celulele somatice sunt totipotente (Steward et al., 1958; Steward,

    1968), dar practic exist diferene mari ntre diversele tipuri de celule, speciile vegetale,

    gradul de dezvoltare a celulelor de acelai tip, etc. n stadiul difereniat al celulei,

    expresia capacitii totipoenei se numete competen morfogenetic. Incapacitatea unor

    specii/grenotipuri de a manifesta totipotena celular este confundat adesea cu lipsa

    capacitii de regenerare. Expresia variabil a acestei competene este doar rezultatul

    gradului de specializare i a statutului fiziologic al celulei respective sau a incapacitii

    cercettorului de a identifica condiiile de cultur optime cerute de acest proces.

    Competena de regenerare

    ntr-un organism vegetal intact, la nivelul celulelor nalt specializate, nu mai apar

    niciodat schimbri, ntruct prin ultraspecializarea lor acestea i pierd capacitatea de a

    forma plante noi i deci, aceste celule nu pot deveni morfogenice. Unele celule i

    pstreaz capacitatea pentru diferenieri particulare sau pentru morfogenez, sau pot

  • dobndi aceast capacitate ca rspuns la un stimul adecvat; acest tip de celule se numesc

    celule competente.

    Competena reprezint prima condiie a unei celule spre morfogenez, adic de a

    urma o cale de dezvoltare definit.

    In vitro competena de regenerare este influenat direct de genotip (genele

    nucleare, genele citoplasmatice i genele de interaciune), faza ontogenetic a explantului

    iniial precum i de condiiile de cultur (mediul i factorii fizici) alei. Toi aceti facori

    sunt folosii n stabilirea unui rspuns morfogenic, relativ comun, n cadrul unei specii

    vegetale.

    potenialul pentru diviziune- reprezint precondiia esenial n

    alegerea explantului iniial, fiind definit de prezena unei capaciti de

    diviziune ridicat i o plasticitate morfogenetic pronunat

    efectul de poziie n 1878 Vchting sublinia importana poziiei unei

    celule n organism demonstrnd c destinul ei este n funcie de poziia

    sa (teoria proximitii celulare). Dei toate celulele specializate sunt

    derivate dintr-o celul iniial (celula ou) nedifereniat, dar care se

    divide, forma i polarizarea celulelor, a esuturilor i respectiv, a

    organelor vegetale ale unui organism, este stabilit nc din faza

    embrionar. Stadiul de difereniere odat fixat, are un rol determinant

    n evoluia ulterioar a explantului prelevat. Astfel, explantele

    prelevate din partea inferioar formeaz muguri vegetativi (lstari) n

    proporie de 100 %, explantele din zona median formeaz muguri n

    procent de aproximativ 25 % care evolueaz spre lstari floriferi iar

    explantele prelevate din zona florifer, sunt capabile s regenereze, pe

    substratul de cultur, direct structuri florale.

    predispoziia- este realizat prin utilizarea esuturilor tinere, aflate n

    cretere (de exemplu agregate celulare friabile periclinale, celule mari

    nedifereniate din coleoriz, mezocotil, apex radicular, etc.).

    Organogeneza ca proces de dezvoltare

  • La modul general, dezvoltarea este procesul care rezult ntr-un organism normal,

    matur i funcional. Dezvoltarea cuprinde toate evenimentele din timpul vieii unui

    organism care au ca scop realizarea corpului organismului n forma sa capabil de a

    exercita funciile vitale de nutriie i reproducere, de a folosi oportunitile pentru a face

    fa evenimentelor de hazard din timpul vieii (Fosket, 1994). Organogeneza este un

    proces de dezvoltare unic n lumea vegetal. Celulele animale urmeaz calea de

    dezvoltare ntr-un mod ireversibil al diferenierii spre un esut sau celule specifice

    deoarece, n lumea animal mitoza duce la formarea a dou celule fiice identice ca

    urmare a separrii celulelor prin formarea unei cute a membranei. (Rappaport, 1986). Cu

    alte cuvinte, celulele animale i esuturile rmn din punct de vedere structural i

    funcional la forma la care au fost programate din momentul iniierii dezvoltrii. Spre

    deosebire de celulele animale, celulele vegetale pe tot parcursul vieii i pstreaz

    capacitatea de a se dediferenia din structura i funcionarea lor curent i s nceap o

    nou cale de dezvoltare care s sfreasc n structuri morfogenetice complet diferite.

    Mitoza n celulele vegetale este un proces al diferenierii interne a citoplasmei (Peters et

    al., 2000); aceasta se poate datora i faptului c formarea plcii mediane n nucleu, n

    timpul separrii nucleelor fiice, se face ntr-o manier centrifugal; materialul necesar

    noului perete este furnizat de aparatul Golgi. Aceast manier de separare, specific

    celulelor vegetale, permite meninerea unor pori (deschideri) la nivelul plasmodesmatei

    (Krager i Monzer, 1998), deschideri prin care are loc micarea unor macromolecule

    (McLean et al., 1997) i chiar nuclei i plastide (Zhang et al., 1990), celulele fiice

    meninnd astfel o legtur informaional cu celula mam, continuitate simplastic

    indispensabil dezvoltrii i specializrii celulelor (Lucas et al., 1993).

    Fragmentele de esuturi vegetale cultivate in vitro pot produce, pornind de la una sau

    mai multe celule, numeroase tipuri de primordii de novo, inclusiv de tipul acelora care se

    vor diferenia n embrioni, flori, frunze, lstari i rdcini. Celulele din care se vor forma

    plantule de novo sunt stimulate pentru a iniia o serie de diviziuni celulare rapide care

    au ca scop formarea unor agregate celulare de tip meristematic , denumite

    meristemoizi. Termenul de meristemoid a fost introdus n anul 1966 de ctre Torrey i

    definete o mas sferic de 6-24 celule nespecializate mici, izodiametrice, cu perete

    celular subire, fr vacuole, cu nuclei mari i citoplasm foarte dens (Thorpe, 1982). n

  • primele faze de dezvoltare, meristemoizii sunt structuri morfogenice plastice, fiind

    capabile s se dezvolte n diferite tipuri de celule primordiale. Aceast caracteristic de

    dezvoltare flexibil st la baza folosirii culturilor de celule n sistemele de propagare.

    Exist dou evenimente organogenice care sunt folosite n mod curent pentru propagarea

    in vitro. Primul l constituie regenerarea unui numr mare de meristeme caulinare, etap

    care este urmat de creterea i dezvoltarea lor n microbutai pn la o mrime suficient

    pentru trecerea la al doilea eveniment care const n inducerea produciei de meristeme

    radiculare de novo. Meristemele morfogenice pot lua natere pe dou ci distincte:

    Direct din celulele difereniate ale esutului proaspt transferat pe un mediu, fr

    proliferarea unor celule nedifereniate

    Din celulele nespecializate, neorganizate i dedifereniate ale unei culturi de calus

    sau suspensie.

    Hicks (1980) a denumit aceste dou ci ale morfogenezei ca organogenez direct

    i, respectiv, indirect. Cele dou metode difer prin prezena sau absena unui stadiu de

    calus n secvenierea organogenetic. Metoda care conine ca faz intermediar

    producerea de calus se numete organogenez indirect.

    Organogeneza direct

    Explant primar

    Explant primar Calus Meristemoid

    Meristemoid

    Primordii de organe

    Primordii de organe

    Organogeneza indirect

  • Formarea organelor de novo prin intermediul organogenezei indirecte poate duce

    la creterea posibilitii de introducere a variaiei n constituia cromozomial. De

    exemplu, schimburi poliploidice la nivelul celulelor aflate n faza de calus i astfel, poate

    determina apariia unor organe care s prezinte att variaii fiziologice ct i morfogenice.

    Pentru cercetrile care sunt dirijate n scopul determinrii cilor fizio-chimice a

    procesului de organogenez exist un alt motiv care necesit reducerea sau mcar

    minimalizarea acestui tip de dezvoltare organogenetic. Prezena unui stadiu de calus

    aflat n diviziune determin o complicare a analizelor evenimentelor moleculare care

    nsoesc i care pot determina producia organelor de novo. Grupurile de celule care n

    mod particular sunt destinate pentru a deveni organogenice se gsesc ntr-un numr

    relativ redus ntr-o mas mare de celule de calus aflate n diviziune, ceea ce limiteaz

    foarte mult capacitatea de analiz a fiziologiei i chimiei specifice acestor celule

    (Schwartz i Beaty, 1996).

    Organogeneza direct se realizeaz fr o faz intermediar de calus, secvena

    evenimentelor sintezei organelor de novo fiind urmtoarea:

    - explantul de iniiere

    - meristemoidul

    - primordiul organului.

    Cea mai mare diferen dintre cele dou ci de sintez de novo o reprezint

    prezena sau absena unui stadiu intermediar detectabil de calus. esutul de calus

    coninnd celule care au fost difereniate n forme mai puin specializate din punct de

    vedere morfologic i care sunt foarte flexibile schimbrilor, pot servi ca material de

    pornire pentru organogeneza de novo. n absena unui stadiu intermediar de calus,

    celulele prezente n interiorul explantului au capacitatea de a aciona ca precursori direci

    ai noului primordiu. (pentru exemple de organogenez direct sau indirect pornind att

    de la explante de tip meristematic ct i nemeristematic, n sisteme diferite de cultur,

    vezi Hicks, 1980).

    Culturile n care se induce organogeneza sunt folosite ca modele sistem pentru a

    determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rdcinile i tulpinile n mod

    direct, iar prin generalizare, de a da rspunsuri proceselor morfogenice. ntr-un astfel de

  • model, procesul de organogenez este mprit n cteva faze, conform schemei adaptate

    dup Christianson i Warnick, (1985).

    competen determinare

    EXPLANT ORGAN (regenerare)

    dedifereniere inducere difereniere (redifereniere)

    Punctul de interes n reprezint cele dou faze iniiale care preced faza de

    difereniere, adic de pierderea caracterului de specializat. Aceste faze cuprind

    evenimente care ncep cu dediferenierea, ceea ce duce la obinerea competenei, urmat

    de iniiere care culmineaz cu stadiul complet de determinare. Diferenierile morfologice

    i de dezvoltare ale organului nou format pot duce la realizarea structurii funcionale

    dorit. Primele dou faze ale modelului presupun evenimente care se desfoar naintea

    morfogenezei (Hicks, 1980). Embrionii, meristemele apicale, organele primordiale i

    straturile de celule ale organelor mature sau fragmente complexe ale organelor mature,

    chiar organe intacte i protoplati, pot fi folosii ca explantele de iniiere.

    Dediferenierea (dup Schwartz i Beaty, 1996)

    Procesul de dedifereniere presupune reversia spre un stadiu mai flexibil, plastic,

    care poate s dea sau nu natere unui esut de tip calus. n cazul organogenezei directe,

    celulele competente care nu au produs calus pot fi considerate ca singurele implicate n

    formarea organelor progenitoare, ceea ce presupune c aceste celule previn procesele de

    dedifereniere, fie n mod individual, fie n grupuri mici destinate de a produce noi

    primordii. Explantele foliare de Convolvulus arvensis L. produc rdcini i lstari prin

    intermediul unei ci organogenice indirecte care implic procese de dedifereniere ce duc

    la formarea unei cantiti limitate de calus din care sunt generate organe noi (Christianson

    i Warnick, 1983). Rezultatul completrii acestei prime etape const n obinerea

    statutului de competen a explantului iniial, statul care se caracterizeaz prin capacitatea

    de a rspunde la stimulii organogenetici. Atingerea nivelului de competen de ctre

    esutul implicat nu reprezint totdeauna un proces realizat ntr-o singur etap, uneori

    fiind necesar o etap intermediar n care se folosesc fitoregulatorii de cretere. De

  • exemplu, n cazul calusului de Medicago sativa care a fost cultivat timp de 4 zile pe un

    mediu cu o concentraie relativ ridicat de chinetin i o concentraie sczut de 2,4-D au

    fost obinute rdcini. Lstarii sunt produi cnd calusul este tratat n acelai regim de

    cultur, cu excepia faptului c raportul regulatorilor de cretere este schimbat

    (concentraii mari de 2,4-D i sczute de chinetin). Tratamentul cu fitoregulatori de

    cretere urmat de transferul pe un mediu lipsit de regulatori de cretere nu este suficient

    ca s aduc esuturile n faza a doua de iniiere, faz cerut pentru producerea rdcinilor

    sau a tulpinilor (Walker et al., 1979). Este necesar o anumit mrime cu o limit minim

    de 105 m, precum i o mrime minim a diametrului agregatelor celulare de calus

    pentru a fi competente pentru iniierea morfogenezei.

    Iniierea

    Etape de iniiere apare n perioada dintre momentul n care esutul devine

    competent i momentul n care devine complet determinat pentru a produce primordiile.

    Aceast faz se caracterizeaz printr-un numr de timpi fenocritici, momente care

    rezult din funcionarea unei ci genice integrate care dirijeaz procesele de dezvoltare i

    precede diferenierea morfologic. n 1958 a fost sugerat ideea (Landauer) c anumii

    stimuli chimici i fizici pot s ntrerup o cale de dezvoltare determinat genetic, ceea ce

    duce la modificarea rezultatului morfogenic care produc apariia fenotipurilor de tip

    mutant. Christianson i Warnick, n 1984, au identificat civa ageni chimici care

    intervin n timpul fazei de iniiere la Convolvulus arvensis. Agenii care induc producerea

    acestor tipuri de fenotipuri sunt efectivi numai n anumite momente specifice n timpul

    etapei de iniiere, fiind denumii elemente-cheie n calea genetic a proceselor de

    dezvoltare. Agenii inductori sau inhibitori specifici de etap se pare c blocheaz

    anumite ci directe de aciune a genei sau a produsului genei prin activarea unei gene

    control. n sistemul prezentat la Convolvulus arvensis a fost blocat gena de determinare

    a iniierii lstarului aprnd un fenotip modificat de tip calus.

    Sfritul procesului de iniiere este definit ca punctul n care o celul sau un grup

    de celule devin complet determinate pentru producerea lstarilor sau a rdcinilor.

    Practic, acest punct este atins cnd explantele vegetale pot fi transferate de pe mediul de

    inducere al lstarilor sau rdcinilor i transferate pe un mediu de baz fr regulatori de

  • cretere coninnd doar sruri minerale, vitamine i o surs de carbon, cultura avnd ca

    scop producerea organului dorit. n acest moment, esutul a ncheiat complet procesul de

    iniiere i poate fi considerat complet determinat pentru organogenez (Schwartz i

    Beaty, 1996).

    Gradul de competen celular pentru organogenez variaz n funcie de specie i

    uneori chiar n cadrul speciei. Tipul de esut recoltat din planta mam influeneaz radical

    organogeneza (la mr, obinerea de embrioni somatici din frunz este dependent de

    genotip, Welander, 1988). Aceasta sugereaz efectul primar i secundar al unor gene.

    Caracteristicile genetice ale esuturilor cultivate in vitro sunt direct legate de

    comportamentul esutului respectiv manifestat ca parte a plantei ntregi, (in vivo), dar

    rspunsurile morfogenice ale fragmentului separat i cultivat pe mediu sunt rezultatul

    efectului secundar i a altor gene, activate datorit noilor condiii de via. Existena

    acestor mecanisme genetice de control a competenei celulare poate fi:

    - rezultatul unei expresii pleiotropice a genelor care sunt activate numai n

    anumite tipuri de esuturi, sau

    - controlat de secvene genice specifice care au un efect comun n toate tipurile

    de celule, dar care :

    sau sunt exprimate chiar n momentul recoltrii explantului

    sau nivelul lor de expresie depinde de prezena unui anumit grad de dezvoltare a

    celulei.

    Msura n care explantul vegetal devine competent i, eventual determinant, este

    n funcie de condiii fizice i chimice la care a fost expus. n cazul culturilor in vitro,

    proprietile mediului nutritiv sunt asociate cu condiiile fizice care, amndou, joac un

    rol esenial n determinarea semnalelor organogenice. Faptul c mediul de cultur este

    elementul-cheie n controlul chimic al organogenezei in vitro ca raport dintre auxinele i

    citochininele prezente n mediu a fost demonstrat de Skoog i Miller, nc din 1957.

    Concluzia lor este c: interaciunile cantitative dintre factorii de cretere n special dintre

    AIA i chinetin (auxine i citochinine) i ntre acestea i ali factori asigur un mecanism

    comun de control al tuturor tipurilor de cretere analizate, de la creterea n mrime a

    celulelor pn la formarea organelor. Pe lng acestea, variabile precum: lungimea zilei,

    calitatea i cantitatea luminii, vrsta i mrimea explantului vegetal, genotipul i nutriia

  • mineral sunt civa dintre factorii care influeneaz capacitatea de regenerare. n absena

    unor markeri genetici sau biochimici care s indice n mod clar calea de dezvoltare exact

    a explantului primar i pn cnd vor fi puse la punct metode de dirijare i programare

    genetic a esuturilor recalcitrante, singura modalitate de a determina iniierea

    organogenezei ntr-un esut vegetal, rmne ghicitul prin tatonare (Schwarz i Beaty,

    1996).

    Diferenierea

    Cea de-a treia etap n organogenez o reprezint faza de difereniere, etap n

    care noul organ devine vizibil.

    Faza de difereniere final a organogenezei asigur primul moment n care poate

    fi observat geneza structural a noului organ ca rezultat al programului de dezvoltare

    nceput n faza de iniiere. Prin observaia microscopic a schimbrilor arhitecturii

    histologice interme i de suprafa, care apar n timpul fazei de difereniere, pot fi

    identificate etapele morfologice ale evenimentelor care apar n timpul procesului de

    organogenez : schimbri morfologice la nivelul suprafeei explantului, apariia

    meristemoizilor, expansiunea verical i orizontal a noii regiuni formate, ieirea noului

    meristem de sub epiderm, primordiile foliare i, n final, mugurele adventiv nou format.

    C. Regenerare prin embriogenez somatic (nezigotic)

    Embriogeneza somatic a fost observat pentru prima dat de Reinert (1958) i

    apoi de Steward i Mearks (1958). Regenerarea prin embriogenez somatic se distinge

    evident de regenerarea prin meristeme datorit unor caracteristici specifice de dezvoltare

    i anume:

    Formarea unui embrion (somatic dar i zigotic) ncepe de la o singur celul i

    trece obligatoriu prin fazele globular, cordiform, torpedou i de maturare (faza

    cotiledonal); rezultatul este o structur bipolar, deinnd dou tipuri de

    meristeme: radicular, la un capt i, caulinar, la cellalt capt, n timp ce

    organogeneza d natere numai la un singur tip din cele dou meristeme.

    Embrionii somatici trebuie s ndeplineasc obligatoriu criteriul de baz al unei

    structuri bipolare, adic formarea unei structuri vasculare proprii i izolate; n

  • cazul organogenezei, vasele conductoare asigur continuitatea legturii cu

    esutul original (calusul).

    Proteinele specifice care apar n cotiledoanele embrionilor somatici nu au fost

    identificate n frunzele regenerate din lstarii adventivi (Crouch, 1982).

    Embriogeneza in vitro, pornind de la celule somatice, trebuie vzut ca o

    proprietate general specific plantelor superioare. Cnd embrionii somatici sunt obinui

    pornind de la o singur celul procesele decurg de la omogen i general spre heterogen i

    particular, fenomenul demonstrnd indiscutabil totipotenialitatea celular; prezena unui

    program de dezvoltare foarte bine conservat este nnscut ntr-un numr mare de tipuri de

    celule. Culturile de celule embriogenice permit ca ntreg genomul vegetal s poat fi

    manipulat genetic prin tehnicile biologice. Odat ce celulele prolifereaz, pot fi

    modificate genetic, iar plantele regenerate din astfel de celule modificate pot fi

    reconstituite plante modificate.

    Embriogeneza somatic

    Un embrion, zigotic, somatic, (direct sau indus), este definit ca un individ nou,

    rezultat dintr-o singur celul, care nu are legtur vascular cu esutul mam (Haccius,

    1978) i este stadiul primar multicelular al unui individ, stadiu care are loc nainte de

    dezvoltarea structurilor i a organelor caracteristice a unei specii date. n majoritatea

    organismelor, embrionul este o entitate distinct morfologic care funcioneaz ca un

    stadiu intermediar n procesul de tranziie de la viaa gametofitic la cea sporofitic

    (Gray, 1996). La speciile superioare, tipic este embrionul zigotic, care se dezvolt n

    interiorul seminei. Acest tip de embrion se formeaz ca produs al fuziunii gametice, n

    urma reproducerii sexuale, fiind denumit embrion zigotic.

    Caracteristic speciilor vegetale este faptul c din esuturi nedifereniate pot s

    formeze embrioni nezigotici, perfect formai morfologic i funcional. Deoarece acest tip

    de embrioni se formeaz apomictic (pe cale asexuat), plantulele care se dezvolt din ei

    sunt identice genetic cu planta mam. Tipurile de celule din care pot s apar astfel de

    formaiuni aparin diferitelor esuturi somatice i sunt ntr-un numr diferit att n faza

    gametofitic ct i sporofitic a ciclului vegetal. Iniial, embrionii somatici au fost

  • denumii embrioizi, pentru a sublinia diferena fa de embrionii zigotici i din pcate

    acest termen mai este meninut n anumite lucrri. Diferena dintre embrionul zigotic i

    cel somatic nu este foarte bine neleas i descris n literatur.

    Tabel.6. Clasificarea embrinilor (dup Bhojwani i Razdan, 1983)

    1. Embrioni zigotici

    2. Embrioni nezigotici:

    - embrioni somatici

    - embrioni adventivi

    - embrioni partenogenetici

    - embrioni androgenetici

    Formai prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului

    Formai din alte celule dect cele zigotice

    - formai de celulele sporofitice, cu excepia

    zigotului

    - embrioni somatici formai direct din ali

    embrioni sau organe

    - formai din celule ou nefertilizate

    formai de gametofilul mascul (microspori,

    grunciori de polen)

    Datorit faptului c majoritatea acestor tipuri de embrioni pot fi manipulai n

    culturile in vitro, sistemele de cultur embriogenice sunt folosite ca baz n metodologiile

    destinate mbuntirii calitative a plantelor, deoarece permit nu numai clonarea prin

    propagarea vegetativ, dar i schimbri specifice i direcionate care pot fi introduse n

    indivizi de elit selecionai. Celulele individuale modificate sau embrionii pot fi dup

    aceea multiplicai eficient in vitro, ntr-un numr foarte mare de exemplare nainte de

    dezvoltarea plantei. Aceas modalitate de manipulare genetic elimin consecinele

    nedorite ale reproducerii sexuale (recombinarea genetic n mas i ciclurile de selecie

    cerute), astfel nct tehnologia de ameliorare este net superioar prin reducerea timpului

    i a efortului de execuie.

    Condiiile de cretere a embrionilor somatici versus embrioni zigotici

  • n smn, n esutul nucelar, embrionul se formeaz ca rezultat al fertilizrii unei

    celule ou. Unele specii au tendina de a forma mai mult de un embrion, ca urmare a

    diviziunii celulei embrionice primare, rezultnd poliembrioni (la unele varieti de

    Citrus).

    Embrionii somatici pot aprea uneori i n natur, din esut ovular fr fuziunea

    unor celule sau nuclee, proces denumit apomixie. Originea lor este unicelular (dintr-o

    celul somatic diploid a sacului embrionar, fiind denumii apospori- sau dintr-o celul

    nucelar, fiind denumii embrioni nucelari). Mai rar, embrionii somatici se formeaz

    direct pe frunzele unor specii ca de exemplu Kalanchoe, Ranunculus Asplenium, etc.

    n smn, esutul nutritiv, endospermul, mbrac embrionul zigotic aflat n

    dezvoltare. n primele faze ale embriogenezei, substanele nutritive ajung la embrionul

    zigotic att prin celulele suspensoare ct i prin suprafaa embrionului propriu-zis. n

    funcie de specie pot s apar diferene n modul de nutriie prin suspensor sau embrionul

    propriu-zis, de la o specie la alta. Spre deosebire de aceasta, n cazul embrionilor somatici

    faptul c se dezvolt fr esut protector (ei nu sunt mbrcai de un esut precum

    endospermul), face ca ei s nu fie subordonai unui regim nalt controlat i specializat

    (Gray i Purohit, 1991). Cel mai adesea, suspensorul este singura legtur ntre embrion

    i mediul de cultur. Aceasta demonstreaz c suspensorul poate servi ca mod de

    asigurare a nutriiei necesare i c endospermul nu este absolut necesar n timpul

    embriogenezei i a germinaiei (Gray, 1996).

    Ce este o smn ?

    O smn vegetal este o structur generativ, alctuit din embrion, endosperm

    i un nveli de protecie denumit testa. La dicotiledonate embrionul este alctuit din dou

    cotiledoane ataate unei axe centrale. Partea apical, plumula, crete sub form de lstar

    iar partea bazal este alctuit din hipocotil i radicel, viitorul sistem radicular.

    Endospermul asigur suportul nutritiv pe durata germinaiei, pn cnd plantula este

    capabil de fotosintez. Testa, asigu protecia embrionului pe durata germinaiei fiind

    ndeprtat pentru eliberarea rdcinuei i apoi a tulpiniei.

    Ce este o smn artificial?

  • Seminele arificiale au fost introduce njurul anilor 1970 ca analog seminelor

    obinuite. Acest produs se adreseaz speciilor care nu produc semine viabile,

    reprezentnd metoda de multiplicare a acestora. Datorit dimensiunilor lor mici,

    seminele artificiale prezint i avantaje n ceea ce privete manipularea, depozitarea,

    transportul i plantarea lor.

    Cum se obine o smn artificial?

    Seminele artificiale se obin prin ncapsularea unui propagul vegetal

    (embrionul) ntr-u