LUCRARE DE DIPLOMĂ - ACSE...

Universitatea Politehnica Bucureşti

Facultatea de Automatică si Calculatoare

LUCRARE DE DIPLOMĂ

Absolvent, Conducător ştiinţific,

Adrian Filip Prof. univ. dr. ing. Cătălin Buiu

Bucureşti, 2013

Universitatea Politehnica Bucureşti

Facultatea de Automatică si Calculatoare

LUCRARE DE DIPLOMĂ

STRUCTURA GLICOPROTEINELOR HIV –

CORELAŢII CU IMAGINI DE TOMOGRAFIE

ELECTRONICĂ

Absolvent, Conducător ştiinţific,

Adrian Filip Prof. univ. dr. ing. Cătălin Buiu

Bucureşti, 2013

Cuprins

CAPITOLUL 1 INTRODUCERE ............................................................................................. 1

CAPITOLUL 2 NOTIUNI SI CONCEPTE DE BAZĂ ............................................................ 3

2.1 Structurile atomice ........................................................................................................... 3

2.1.1 Aminoacizii ............................................................................................................... 3

2.1.2 Proteinele .................................................................................................................. 4

2.1.3 ARN .......................................................................................................................... 9

2.2 Virusul ........................................................................................................................... 10

2.2.1 Definiţie şi caracteristici ......................................................................................... 10

2.2.2 Evoluţia virusurilor ................................................................................................. 10

2.3 HIV ................................................................................................................................ 11

2.3.1 Etiologie .................................................................................................................. 12

2.3.2 Structură şi funcţionare ........................................................................................... 13

2.4 Determinarea structurii proteinelor ................................................................................ 14

2.4.1 Segmentarea ............................................................................................................ 15

2.4.2 Înregistrarea ............................................................................................................ 16

2.4.3 Metode de filtrare .................................................................................................... 16

2.4.4 Tipuri de filtre ......................................................................................................... 17

2.5 Determinarea structurii învelişului (anvelopei virale) HIV ........................................... 18

2.6 Prezentarea programului UCSF Chimera ...................................................................... 20

2.6.1 Caracteristici ........................................................................................................... 20

CAPITOLUL 3 STUDIU DE CAZ: GLICOPROTEINELE HIV- simulări, fitări, rezultate .. 21

3.1 GP120 ............................................................................................................................ 21

3.2 Fitări de GP120 în hărţi EM ........................................................................................... 25

3.2.1 Monomerul GP120 .................................................................................................. 26

3.2.2 Trimerul GP120 ...................................................................................................... 30

3.2.3 Concluzii privind fitarea ......................................................................................... 35

3.3 GP 41 ............................................................................................................................. 35

CAPITOLUL 4 CONCLUZII .................................................................................................. 39

BIBLIOGRAFIE: ..................................................................................................................... 41

ANEXE .................................................................................................................................... 44

1

CAPITOLUL 1

INTRODUCERE

Complexele macromoleculare stau la baza organismelor biologice. Un

complex macromolecular este compus din componente, cum ar fi proteinele și acizii

ribonucleici (ARN). Obținerea structurilor atât de complexe este critică pentru o mai

bună înţelegere a modului de functionare a acestora și de asemenea, pentru a

înţelege de ce uneori nu reușesc să funcționeze în mod corespunzător, aceasta fiind o

cauză comună a multor boli.

O metodă bine cunoscută utilizată pentru a determina structura complexelor

macromoleculare este cristalografia cu raze X. Cu această metodă, hărțile 3D de

densitate de electroni sunt reconstruite din difracţia pe tipare de cristal, de obicei, la o

rezoluție suficient de înaltă astfel încât poziția fiecărui atom în parte să poată fi

determinată. Totuși complexele trebuie să fie cristalizate înainte de a fi aplicată

aceasta metodă. Astfel, aceasta nu poate fi aplicată în mod universal, de exemplu la

complexele foarte mari, complexele care au structuri dinamice, sau complexele care

sunt încorporate în membranele celulare.

Crio-microscopia electronică (crio-EM) este o formă de microscopie

electronică de transmisie (EM) pentru probe care sunt studiate la temperaturi

criogenice (temperatura azotului lichid, în general).

Popularitatea crio-microscopiei provine din faptul că permite observarea de

probe în mediul lor nativ, în contrast cu cristalografia cu raze X, care în general

necesită introducerea probelor în medii non-fiziologice, care poate duce uneori la

modificări funcționale. În practică, rezoluția harţilor de crio-microscopie nu este

suficient de mare pentru a permite construcția fără echivoc a modelului, de aceea

modelele obținute prin cristalografierea proteinelor sunt folosite pentru a interpreta

hărțile crio-EM. Cu toate acestea, rezoluția harţilor crio-EM se îmbunătățește în mod

constant, iar unele structuri de virus obţinute sunt deja la o rezoluție care poate fi

interpretată în termeni de model atomic.

O versiune a crio-microscopiei electronice este crio-tomografia de electroni

(CET), unde o reconstrucție 3D a unui eșantion este creată din imagini 2D înclinate.

O crio-tomografie poate fi folosită pentru a obține detalii structurale ale organizațiilor

complexe celulare la rezoluții subnanometrice.Cu toate acestea, analiza unor

subtomografii a unei singure particule poate îmbunătăţii rezoluţia până la 15-30

Angstromi.

Structura virusului imunodeficienței umane (HIV) și a unor componente din

alcătuirea sa au fost dificil de studiat în 3D, în primul rând, din cauza variabilității structurilor intrinseci ale acestuia. Descoperirile recente crio-tomografice cu electroni

(CET) au furnizat o nouă abordare pentru determinarea structurilor 3D a virusului

intact, a capsidei HIV şi a învelişului de glicoproteine localizat pe suprafața virusului.

(He 2010)

2

Lucrarea de fata abordează structura glicoproteinelor HIV, acestea reprezentând un obiectiv

major în obţinerea unui vaccin. Infecţia cu virusul imunodeficienţei umane (HIV- human

immunodeficiency virus) este o afecţiune contagioasă, specific umană, caracterizată

printr-o evoluţie stadială, cu semne iniţiale de infecţie acută, clinic reversibile,

urmate de o lungă perioadă de latenţă, cu o stare de sănătate aparentă şi cu

reexprimare clinică finală, progresivă.

Virusul distruge progresiv mecanismele de apărare ale gazdei şi determină,

după un interval de timp variabil, instalarea sindromului de imunodeficienţă

dobândită (SIDA/AIDS– syndrome d’immunodepression acquise/acquired immune

deficiency syndrome) – stadiul final al bolii, caracterizat prin apariţia infecţiilor

şi/sau neoplaziilor oportuniste şi afectarea în grade diferite a sistemului nervos şi a

altor aparate şi sisteme.

Motivaţia alegerii acestei teme este deci implicaţia din ce în ce mai mare pe

care o are HIV-ul în cadrul sistemului public de sănătate atât la nivel mondial, cât şi la

nivel naţional, dar mai ales pentru studiul structurii şi a modului în care acesta

funcţionează la nivel molecular.

Obiectivele generale urmărite în această lucrare sunt:

studiul glicoproteinelor HIV;

acumularea de cunoştinţe privind tomografia electronică;

folosirea unor imagini de tomografie electronică pentru deducerea de

modele atomice cat mai precise precum şi formularea de concluzii pe

baza acestora

Astfel în Capitolul 2. Noţiuni şi concepte de bază, vor fi prezentate acele

noţiuni şi concepte referitoare la structura şi sinteza proteinelor, noţiuni despre virusul

HIV, dar şi mai multe informaţii despre cristalografia cu raze X şi crio-microscopia

electronică. Toate acestea ne vor ajuta pentru o mai bună înţelegere a studiului

efectuat in capitolului 3.

Capitolul 3 , după cum am menţionat, este un Studiu de caz: glicoproteinele

HIV , în care sunt efectuate diferite simulări şi fitări în urma cărora vor fi generate

anumite rezultate. Pe baza acestor rezultate vor exista şi comparaţii şi discuţii pentru o

mai bună înţelegere a acestora. Principalul obiectiv al studiului fiind acela de a

observa ce se întâmplă la nivel molecular când de un monomer sau trimer de GP120

se leagă de CD4 şi un anticorp.

Ultimul capitol este rezervat Concluziilor acestei lucrări, sintetizând ideile

principale referitoare la HIV, mai precis la structura glicoproteinelor din componenţa

sa şi importanţa care o au acestea în realizarea unui vaccin în viitor.

3

CAPITOLUL 2

NOŢIUNI ŞI CONCEPTE DE BAZĂ

2.1 Structurile atomice

O structură atomică este definită prin specificarea unei poziții 3D pentru

fiecare atom pe care aceasta îl conține, împreună cu o listă de legături covalente între

atomi. Într-o moleculă, fiecare atom este legat de cel puțin un alt atom care este, de

asemenea, în moleculă. O structură poate consta dintr-o singură moleculă sau poate

consta din mai multe molecule care sunt legate împreună prin forţe van der Waals și

forțe electrostatice. Structurile care sunt compuse din două sau mai multe molecule

sunt de obicei numite complexe moleculare. Macro-complexele moleculare sunt

compuse din două sau mai multe molecule mari, cum ar fi proteinele sau acizii

ribonucleici (ARN).

2.1.1 Aminoacizii

Aminoacizii sunt compuşi organici cu funcţiuni mixte care conţin în molecula

lor grupa carboxil (-COOH) cu caracter acid şi grupa amino ( ) cu caracter

bazic, legate de un radical hidrocarbonat.

După poziţia pe care o ocupa grupa amino fata de grupă carboxil se deosebesc:

α, β, γ, δ,ε aminoacizi. Poziţia α este vecina grupei carboxil.

Aminoacizii naturali sunt, cu puţine excepţii, α – aminoacizi. În compoziţia

proteinelor intra, în mod constantă, circa 20 de α – aminoacizi. Aceștia sunt: alanină,

valină, leucină, izoleucină, prolină, triptofan, fenilalanină, metionină, glicocol, serină,

treonină, tirozină, asparagină, glutamină, cisteină, acid aspartic, acid glutamic,

arginină, lisină, histidină (acesta din urmă constituie un aminoacid esențial pentru

copiii cu vârsta sub 1 an). Dintre aceștia, 8 sunt esențiali, adică nu pot fi produși de

organismul uman și trebuie aduși din exterior, prin alimentație (valina, leucina,

izoleucina, triptofanul, fenilalanina, metionina, lisina și treonina). (Figura 2.1) (Jones

John 2002)

4

Figura 2.1 - Tabel de aminoacizi naturali

Dintre cele două grupe funcţionale, amino şi carboxil, prioritară în stabilirea

denumirii este grupa carboxil. De aceea, denumirea unui aminoacid se obţine prin

adăugarea prefixului amino la numele acidului.

Aminoacizii sunt substanţe cristaline care se topesc la temperaturi ridicate

(peste 250 °C) prin descompunere. Aminoacizii sunt solubili în apă şi insolubili în

solvenţi organici. Mulţi aminoacizi au gust dulce.

2.1.2 Proteinele

2.1.2.1 Definiţie şi etimologie

Proteinele sunt substanțe organice macromoleculare formate din lanțuri simple

sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vii în

proporție de peste 50% din greutatea uscată. Toate proteinele sunt polimeri ai

aminoacizilor, în care secvența acestora este codificată de către o genă. Fiecare

proteină are secvența ei unică de aminoacizi, determinată de secvența nucleotidică a

genei.

5

Prima menționare a cuvântului proteină a fost făcută de către Jakob Berzelius,

descoperitorul acestora, în scrisoarea sa către Gerhardus Johannes Mulder din 10 iulie

1838, scrisoare în care menționează:

"The name protein that I propose for the organic oxide of fibrin and albumin, I wanted

to derive from [the Greek word] πρωτειος, because it appears to be the primitive or

principal substance of animal nutrition".

(Numele de proteină pe care îl propun pentru denumirea compusului organic rezultat

prin oxidarea fibrinei sau albuminei, l-am derivat din grecescul πρωτειος (proteios)

deoarece pare a fi substanța primitivă sau principală din nutriția animalelor).

2.1.2.2 Sinteza proteinelor

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celulă își sintetizează

proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza

începând cu procesul de transcripție și terminând cu procesul de translație.

(Figura 2.2)

Procesul de transcripție necesită prezența unei singure molecule de ADN

dublu catenar, numit ADN „șablon”, moleculă care intră în procesul de „inițiere”.

Aici acționează enzima ARN polimerază, enzimă care se leagă de o anumită regiune

din molecula de ADN, regiune (denumită promoter), de unde va începe transcripția.

Pe măsură ce ARN polimerază se leagă de promoter, lanțurile de ADN vor începe să

se desfacă. Următorul proces în care intră ADN este procesul de elongație (alungire a

catenei). Pe măsură ce ARN polimerază se mișcă de-a lungul catenei de ADN, are loc

sinteza ribonucleotidelor complementare (ARNm - ARN mesager). Acest ARN, după

cum îi arată și numele, se poate deplasa și în alte părți ale celulei cum ar fi reticulul

endoplasmatic sau citoplasmă.

În timpul translației ARNm transcris din ADN este decodat de ribozomi

pentru sinteza proteinelor.Acest proces este divizat în 3 etape:

Inițierea

Elongarea

Faza terminală.

Ribozomul are situsuri de legare care permit altei molecule de ARNt (ARN de

transfer), să se lege de o moleculă de ARNm, proces însoțit de prezența unui

anticodon. Pe măsură ce ribozomul migrează de-a lungul moleculei de ARNm (un

codon o dată) o altă moleculă de ARNt este atașată ARNm. Are loc eliberarea ARNt

primar, iar aminoacidul care este atașat de acesta este legat de ARNt secundar, care îl

leagă de o altă moleculă de aminoacid. Translația continuă pe măsură ce lanțul de

aminoacid este format. La un moment dat apare un codon de stop, o secvență formată

din 3 nucleotide (UAG, UAA), care semnalează sfârşitul lanțului proteic. Chiar după

terminarea translației, lanțurile proteice pot suferi modificări post-translaționale și

plierea lanțului proteic, responsabilă de structura secundară și cea terțiară.

Modificările post-translaționale se referă la posibilitatea formării de legături

disulfidice, sau de atașarea la scheletul proteic a diferite grupări ca rol biochimic:

acetat, fosfat etc. (John 2010)

6

Figura 2.2 - Sinteza proteinelor

2.1.2.3 Structura proteinelor

Structura primară – tipul, numărul şi succesiunea aminoacizilor în

catenă. (Figura 2.3)

Secvenţa aminoacizilor este rezultatul informaţiei genetice. Indiferent de numărul

aminoacizilor dintr-o proteină, fiecare lanţ va avea la unul din capete un aminoacid cu

gruparea – NH2 liberă (capătul N – terminal), iar la celălalt capăt un aminoacid cu

gruparea – COOH liberă (capătul C – terminal. Prin convenţie, secvenţa

aminoacizilor întru-un lanţ polipeptidic se considera întotdeauna de la capătul N-

terminal spre capătul C-terminal. (Branden and Tooze 2008)

Figura 2.3 - Structura primară a proteinelor

Structura secundară corespunde unor structuri spaţiale regulate: a – helix, ß

–pliata. Aceste structuri sunt realizate prin legături disulfurice, ionice, de hidrogen,

hidrofobe (Figura 2.4). Aceste tipuri de structuri se datorează proprietăţilor spaţiale a

legăturii peptidice. Structurile a – helix sunt stabilizate prin legăturile de hidrogen

7

intracatenare. Pe fiecare spiră a a-helixului se afla 3 sau 6 resturi de aminoacizi.

Legătură de hidrogen se realizează între gruparea C=O şi NH2 din două spire

vecine. Legăturile de hidrogen sunt paralele cu axul helixului. În proteinele naturale

sensul de rotire al helixului este spre dreapta (sensul acelor unui ceasornic).Structurile

ß – pliate sunt stabilizate prin legături de hidrogen intracatenare. Poate fi cu lanţuri

paralele sau antiparalel. Triplul helix al colagenului este realizat prin intermediul

legăturilor de hydrogen intra şi intercatenare. Acest tip de structura se datorează

prezenţei prolinei şi hidroxi-prolinei. Aceşti aminoacizi nu pot participa la

legături de hidrogen. Structura colagenului prezintă serii de trei aminoacizi în care

glicina ocupa aceeaşi poziţie. Glicina este poziţionată în interiorul helixului. Fiecare

spiră conţine un astfel de triplet. (Branden and Tooze 2008; John 2010)

Figura 2.4 – Structura secundară a proteinelor

Structura terţiară se referă la aranjarea spaţială a acestor structuri

secundare (poziţionarea în spaţiu a fiecărui atom). Este rezultatul unor legături

diverse (hidrogen, hidrofobe, electrostatice, covalente) între aminoacizii aceleiaşi

catene dar care nu sunt vecini în structura primară (Figura 2.5). Datorită acestor

interacţiuni, lanţul polipeptidic nu poate adopta o structură ordonată în spaţiu, pe

toată lungimea sa, ci structurile ordonate sunt separate de coturi sau bucle în care

lanţul polipeptidic nu adopta o structură ordonată. Structura tridimensională a unei

proteine native în mediul său fiziologic este aceea pentru care energia liberă a

sistemului este minimă. În funcţie de structura terţiara, proteinele se clasifica în:

fibrilare şi globulare. Legăturile din cadrul structurii terţiare sunt mai mult sau mai

puţin stabile şi sunt influenţate de mediu. De exemplu acizii şi bazele tari intervin

în legăturile electrostatice ceea ce determina denaturarea proteinelor. Legăturile

disulfurice se realizează preponderent între resturi de cisteina. Agenţii oxidanţi şi

reducători puternici pot oxida cisteina sau pot reduce legăturile disulfurice

denaturând proteina. (Branden and Tooze 2008)

8

Figura 2.5 – Structura terţiară a proteinelor

Structura cuaternară se întâlneşte la proteinele formate din mai multe

subunităţi.Este rezultatul unor legături diverse (hidrogen, hidrofobe, electrostatice,

covalente) între aminoacizii din catene diferite dar care sunt unite într-o singură

moleculă. Fiecare catenă este denumită protomer. Structura cuaternara poate fi

definită ca numărul, tipul şi modul de legare a subunităţilor (protemerilor) dintr-o

entitate proteică cu activitate biologică bine definită. Ruperea legăturilor dintre catene

duce la denaturarea proteinei. (Figura 2.6) (Branden and Tooze 2008)

Figura 2.6 – Structura cuaternară a proteinelor

9

2.1.3 ARN

Acidul ribonucleic (ARN) este, ca și ADN-ul, un polinucleotid format prin

copolimerizarea ribonucleotidelor. Un ribonucleotid este format dintr-o bază azotată

(adenină A, guanină G, uracil U și citozină C), o pentoză (D-2-dezoxiriboză) și un

fosfat. În molecula de ARN uracilul înlocuiește timina. (Figura 2.7)

Molecula de ARN este monocatenară (este alcătuită dintr-un singur lanț polinucleotidic). Este un complex macromolecular similar, structural și funcțional, în

multe privințe ADN-ului. ARN-ul rezultă din copolimerizarea ribonucleotidelor, care

determină formarea unor lanțuri lungi, monocatenare.

Un ribonucleotid este format dintr-o bază azotată (adenină A,guanină G,uracil

U și citozină C),o pentoză (D-2-dezoxiriboză) și un fosfat. În molecula de ARN

uracilul înlocuiește timina). Polimerizarea ribonucleotidelor se realizează prin legături

fosfodiesterice în pozițiile 3’-5’

Compoziția nucleotidică (sau secvența, ordinea nucleotidelor în moleculă)

definește structura primară a moleculei de ARN. Datorită complementarității bazelor

în unele regiuni mai mari sau mai mici ale moleculei de ARN, în soluție și în funcție

de temperatură, prin pliere și aparierea regiunilor complementare, molecula poate

capăta, formând o buclă, o structură parțial bicatenară. Această structură secundară

este deosebit de importantă în funcția unor tipuri de ARN, ca, de exemplu, ARN-ul de

transfer. Molecula de ARN poate adopta o structură tridimensională numită structură

terțiară ce rezultă din aparieri între bazele azotate diferite de aparierile clasice A-T și

C-G. (Know and Learned; Covic, M., Ștefănescu D. 2004; Brown 2002)

Figura 2.7 - ARN

10

2.2 Virusul

2.2.1 Definiţie şi caracteristici

În biologie, un virus este un agent patogen inframicrobian, invizibil la

microscopul optic, care se reproduce numai în interiorul celulelor vii și provoacă

diverse boli infecțioase numite viroze. Virusurile sunt paraziți intacelulari, lipsiți de

metabolism propriu, motiv pentru care nu sunt considerate vii. (Figura 2.8)

Ca structură, virusul este o particulă submicroscopică, alcătuită dintr-o parte centrală

numită genom viral, format din material genetic, care poate fi ADN sau ARN, și o

teacă sau înveliș protector de natură proteică, numită capsidă. Capsida și genomul

viral alcătuiesc nucleocapsida. La virusurile mai complexe mai apare un înveliș

exterior de natură proteică numit pericapsidă, peplos sau anvelopă virală. Din punct

de vedere al prezenței învelișului pericapsidal, virusurile se împart în două categorii:

nude și învelite în peplos. (René 1976)

Figura 2.8 - Virusul

Caracteristici:

dimensiuni foarte mici (de ordinul nm) ;

structura simplă;

parasitism dezvoltat (multiplicare doar în celule vii)

unitate morfofuncţionala infecţioasa = virion (corpuscul elementar)

2.2.2 Evoluţia virusurilor

a) Virusuri ARN

Prima moleculă vie a fost un ARN auto catalitic cu dublă acţiune: codificare şi

enzimatică. Formele existente provin din ARN-ul primordial sau din interacţiuni

genetice între virusurile ARN.

11

Mecanisme:

mutaţii: defecte de transcriere cu rată mare şi cu evoluţie genetic rapidă; pot fi

punctiforme (virusul gripal = drift antigenic) sau mari (blocuri de gene) care

determină genotipuri noi

recombinarea (reorganizarea genetică): copierea alternativă cu rată mare între

virusuri omologe (virusul polio intreserotipuri) şi neomologe (virusul hepatitei

şoarecului / sens pozitiv şi virusul gripal / sens negativ);

reasortarea: doar la virusurile cu genom segmentat prin schimburi de gene

între tulpini circulante animale şi umane. Ex: virusurile gripale printr-o

infecţie mixtă a virusurilor animale (aviare, porcine) cu virusurile umane

determină apariţia de tulpini noi cu potenţial pandemic (Cann 2000)

b) Virusuri ADN

Evolutiv sunt superioare faţă de virusurile ARN: transcripţia se face cu

sisteme celulare, sinteza ADN viral este concomitenta cu replicarea celulei părăsite,

au enzyme care stimulează sinteza de dezoxinucleotide, fac schimb de gene cu

structure celulare. Provin din repliconi mobile: plasmide, transpozoni,

retrotranspozoni.

Mecanisme:

mutaţii: rata mai mică, unele apar la presori de selecţie (antivirale)

recombinarea: acapararea de gene noi de la alte virusuri sau gene celulare

(inclusive de la plasmide sau epizomi) (Alan J. Cann)

2.3 HIV

HIV (Figura 2.9) reprezintă prescurtarea în limba engleză a Human

Immunodeficiency Virus (Virusul Imunodeficienței Umane). De fapt, acest termen

denumește două virusuri înrudite, din categoria retrovirusurilor, HIV-1 și HIV-2, care

cauzează la om sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA). Aparținând

retrovirusurilor, nu poate fi îndepărtat complet din organism pentru că acest tip de

virusuri are capacitatea de a-și înscrie codul în codul genetic al celulei gazdă. O

infectare cu HIV duce după o perioadă lungă de incubare, de ani, chiar zeci de ani, la

declanșarea bolii SIDA. (Eduard J. Beck, Nicholas Mays, Alan W Whiteside 2006)

12

Figura 2.9 – Virusul HIV

2.3.1 Etiologie

Iniţial boală misterioasă a fost cunoscută sub numele de GRID (gay related

immunodeficiency). SIDA (numele primit mai târziu) s-a dovedit a nu fi limitată

numai la homosexuali şi nici asociată efectului imunosupresor al spermei sau al

drogurilor. În 1983 echipa profesorului Luc Montagnier, de la Institutul Pasteur

comunică izolarea unui nou retrovirus, de la un bolnav cu limfadenopatie tipică

asociată cu SIDA şi iniţial l-a denumit LAV (lymphadenopathy associated virus). În

1984 echipa de cercetători condusă de profesorul Robert Gallo a descoperit un virus

ce s-a dovedit a fi agentul etiologic al SIDA, confirmându-se şi identitatea acestuia

cu LAV. În 1986 un comitet internaţional de nomenclatură a dat virusului

denumirea sa definitivă de HIV (virusul imunodeficienţei umane).

Există două tipuri antigenic distincte: HIV-1 şi HIV-2, ambele grupate

între lentivirinae. HIV-2, izolat mai târziu (1986) şi răspândit în Africa de Vest, în

fostele colonii portugheze, s-a dovedit a fi mai puţin patogen.

HIV-1 este cel mai răspândit şi virulent retrovirus uman. El este probabil

originar din Africa centrală de unde a diseminat pandemic. Variaţia genetică este

caracteristica majoră a HIV-1. Două izolate de HIV- 1 nu sunt niciodată identice

chiar dacă ele provin de la acelaşi pacient. Analiza filogenetică a izolatelor de HIV-

1 a permis identificarea a cel puţin 10 subtipuri agregate în două grupuri:

- grupul M (major) cuprinzând subtipuri de la A la J şi

- grupul O (outlier - deviat), găsit în Camerun.

În Europa de Vest şi în SUA subtipul B este cel mai răspândit, în România

subtipul F, iar în Asia subtipul E. Ïn ultimul timp este frapantă diseminarea unor noi

subtipuri (africane, asiatice) în regiunea Europeană. Ïntre arealele de răspândire

africană ale HIV- 1 şi HIV- 2 există o zonă de suprapunere (Ghana, Coasta de

Fildeş) unde infecţia dublă este comună.(Eduard J. Beck, Nicholas Mays, Alan W

Whiteside 2006)

13

2.3.2 Structură şi funcţionare

HIV este un retrovirus circular, din specia lentivirusurilor. Infecțiile cu acest

tip de virus decurg de regulă cronic, cu o perioadă lungă de latență, afectând și

sistemul nervos. Diametrul este de 100-200 nm și este înconjurat de un înveliș de

lipoproteine.

În interiorul acestui înveliș se găsesc circa 72-100 de complexe glicoproteice,

formate dintr-o parte externă (GP 120) și o parte transmembranară de înveliș (GP41).

GP120 are rolul de legare de receptorii CD4 a celulei țintă. Învelișul virusului se

formează din membrana celulei gazdă și are deci o parte din proteinele membranare

ale celulei gazdă, de exemplu molecule HLA I și ÎI și proteine de adeziune (legare).

Copia ARN-ului viral se află în interiorul a două capside alături de enzimele:

reverstranscriptază, intergrază și protează, necesare pentru multiplicarea virală.

Genomul virusului HIV este mai complex decât cel a altor retrovirusuri.

Genele accesorii (vif, vpu, vpr, tat, rev, nef) au alături genele uzuale (gag, pol, env) şi

îndeplinesc mai ales funcţii regulatoare. HIV este format din 2 lanțuri scurte de ARN,

compuse din 9200 nucleotide precum și enzime virale, clasificate astfel:

proteine structurale/enzime virale. Produșii genelor gag, pol, env: revers-

transcriptaza, proteaza, ribonucleaza și integraza, toate încapsulate într-o

anvelopă lipidică, care conține antigenul GP120 cu rol foarte important în

legarea de CD4 a genomului HIV.

proteine reglatoare Tat și Rev (HIV) și Tax/Rex (HTLV) modulează

transcripția și sunt esențiale pentru propagarea virusului.

proteine auxiliare: Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Nef, unele cu rol încă neelucidat.

După intrarea în corpul uman, particulele virale sunt atrase datorită

tropismului către cel mai apropiat receptor CD4, de a cărui membrană celulară se

atașează prin fuziune sau prin endocitoză, după care are loc intrarea în celulă.

Probabilitatea infectării la ambele tipuri de HIV este determinată de capacitatea de

legare cât mai rapidă de CD4, dar și de numărul de receptori CD4 aflați în jurul

locului de penetrare a virusului în organism. În interiorul celulei are loc eliberarea

RNA din anvelopa virală. Enzimele încep să producă gena pol, care la rândul său

codează revers transcriptaza, enzima care transcrie fragmentul de ARN într-un

model de ADN proviral, utilizând aparatul metabolic și de sinteză proteică a celulei

parazitate. Acest ADN proviral va fi integrat în ADN-ul celulei gazdă prin

intermediul integrazei, eliberată în citoplasmă după distrugerea anvelopei virale.

Odată ce ADN-ul proviral este integrat în ADN-ul celulei gazdă, nu mai poate fi

eliminat sau distrus decât prin distrugerea celulei însăși. Începe replicarea HIV-ului

în celula gazdă. Celulele infectate pot elibera virionii prin fenomenul de

înmugurire, sau eliberarea acestora după liza celulei, fenomen care duce la

infectarea altor celule. Anticorpii anti HIV nu apară organismul împotriva infecției,

iar infectarea virală poate persista foarte mult în ciuda unui număr înalt al

anticorpilor. (Merk and Subramaniam 2013; Pancera et al. 2010; Meyerson et al.

2013a; Gustchina et al. 2010)

14

2.4 Determinarea structurii proteinelor

Proiectele de secventializare a genomului produc un număr mare de secvenţe

nucleotidice şi acestea prin traducere generează un număr mare de secvenţe de

aminoacizi. Oricum, este dificilă predicţia structurii unei proteine pornind de la

secvenţa sa de aminoacizi când nu sunt cunoscuţi omologi apropiaţi.

Din acest motiv, cercetătorii determină structurile proteice, experimental, prin

difracţia cu raze X (cunoscută ca şi cristalografie cu raze X) sau prin spectroscopie cu

rezonanţă magnetică nucleară (RMN), ambele procedee foarte laborioase. Cele două

metode oferă informaţii cu poziţiile relative ale atomilor din moleculă (coordonate

atomice).Cristalografia cu raze X nu oferă poziţiile pentru atomii de hidrogen spre

deosebire de RMN.

Produsul final al unei determinări structurale cristalografice îl reprezintă o

hartă a densităţii electronilor, care este de fapt un contur punctat ce indica acele

regiuni din cristal unde pot fi găsiţi electronii din moleculă. Această hartă trebuie

interpretata în sensul unui model atomic cu ajutorul unor proceduri de calcul

semiautomate. Produsul final al unei determinări structurale prin RMN este de obicei

un set de distanţe între nucleii atomilor care definesc atât legăturile atomice cât şi

contactele apropiate din interiorul moleculei. Interpretarea se face prin metode

automate.

În primul rând, proteina trebuie cristalizată. Acesta este adesea un proces

limitativ în determinarea structurii, în special în cazul proteinelor membranare. Apoi

trebuie înregistrat modelul de difracţie din cristal. Spre deosebire de cristalografie,

determinarea structurii prin RMN se face în soluţii apoase, dar proteina trebuie să fie

solubilă fără să agrege la concentraţii apropiate de cele ale unei proteine în structură

cristalină. Determinarea prin RMN necesită două tipuri de date. Primul tip este

reprezentat de măsurarea rezonantei magnetice nucleare a protonilor, atomilor de

carbon şi azot marcaţi radioactiv din moleculă. Al doilea tip de date este reprezentat

de distanţele internucleare deduse prin perturbarea rezonanţei diferiţilor atomi şi

observarea rezonanţei la care răspund; numai la atomii aflaţi la o distanţă mai mică de

5 Ǻ unul de altul se observa acest efect, iar magnitudinea efectului variază cu distanţa

dintre atomi. Setul de distanţe internucleare aproximative este folosit apoi pentru

construcţia unui model structural consecvent datelor.

Spre deosebire de difracţia cu raze X, care oferă o imagine statică (o medie în

timp şi spaţiu) a structurii proteice, RMN are capacitatea de a măsura anumite

proprietăţi dinamice ale proteinelor în timp. (Milne and Subramaniam 2009;

Bartesaghi et al. 2012)

Crio-tomografia de electroni (crio-ET) permite vizualizarea structurilor

celulare în condiţii aproape de viaţă la o rezoluție moleculară. Printre tehnicile

utilizate în biologia celulară, crio- tomografia de electroni (crio-ET) este una relativ

recentă. Aceasta combină avantajele unei imagini 3D a celulelor conservate aproape

de viaţă și permite studierea materialului biologic la rezoluție moleculară. Congelarea

rapidă, urmată de investigarea probelor congelate-hidratate evită obiecte cunoscute

pentru procedurile Wxation și de deshidratare chimică. În plus, materialul biologic

este direct observat, fără încărcare cu metale grele, evită problemele de interpretare

cauzate de acumularea imprevizibilă de material. Prin urmare, crio-ET a celulelor

15

întregi are avantajul că arhitectura supramoleculară poate fi studiată în medii celulare

neperturbate.

Microscopia electronică (EM) în general, și crio-ET, oferă imagini statice

pentru un sistem biologic, la fel ca cristalografia cu raze X. În ciuda acestei limitări

aparente, ambele metode pot oferi un cadru structural pentru o mai bună înțelegere a

mecanismului de funcții moleculare şi celulare. Crio-ET a împins deja limitele

rezoluțiilor și a crescut fidelitatea imaginilor, și ne putem aștepta ca această tendință

să continue.

Diferite abordări au fost folosite pentru a ajuta la detectarea sau identificarea

de structuri și, de asemenea, pentru a permite imaginilor stucturilor intracelulare

crio-ET să fie anlizate. Aceasta este o ramură foarte tânără, și, prin urmare, literatura

de specialitate nu este extinsă. S-a acordat o atenție deosebită la metodele folosite și

la dezvoltarea de metode care ar putea fi relevante pentru viitor. Metodele au fost

separate în două categorii principale: pe de o parte sunt manipulările genetice și pe de

altă parte cele farmacologice, care sunt folosite de-a lungul liniilor de paradigmă de

bază. Când se aplică pe crio-ET, un număr de tomografii sunt înregistrate pentru

mostre din fiecare grup și o valoare este asociată cu fiecare tomogramă cu scopul de a

evalua efectul unui tratament. Microscopia optică corelativă (LM) și metodele de EM

se încadrează în a doua categorie. Avantajul acestei abordări este că LM furnizează

informații despre un mediu mai mare și stările funcționale ale structurilor vizualizate

în crio-ET, sau, alternativ, se extinde rezoluția.

Rezoluția relativ scăzută a harţilor de densitate crio-EM face ca extracția de

informaţii structurale să fie o provocare. Instrumentele folosite pentru a construi

modele atomice într-o hartă de densitate de electroni de la cristalografia cu raze X nu

au fost încă aplicate cu succes, deoarece aceste instrumente necesită rezoluții mai

mari. Prin urmare, segmentarea și metodele de înregistrare sunt de obicei folosite

pentru a extrage informații structurale din hărți de densitate Crio-EM.

Segmentarea și metodele de înregistrare utilizate în prezent în analiza hărților

de densitate crio-EM au limitări serioase, așa cum va fi descris mai jos. Aceste

limitări vor fi accentuate în mai rău cu cât dimensiunea și complexitatea hărți de

densitate obținute continuă să crească. (Bartesaghi et al. 2012; Lucić, Leis, and

Baumeister 2008)

2.4.1 Segmentarea

În timpul procesului de segmentare, scopul este de a identifica regiuni într-o

hartă de densitate, care aparțin componentelor moleculare individuale. Acest lucru ne

ajută să învățăm ce componente alcătuiesc un complex, și cum compoziția să pot fi

legată de funcţia care o îndeplineşte. Metodele actuale de segmentare aplicate hărților

de densitate crio-EM necesită o mulțime de îndrumări de la utilizator, și, prin urmare,

necesită o forța de muncă intensivă. Rezultatele depind în mare măsură de abilitățile

și cunoștințele utilizatorului, și astfel, ele pot fi foarte subiective.

Segmentarea hărților de densitate Crio-EM este o problemă grea din mai

multe motive. În primul rând, regiunile care urmează să fie segmentate sunt de natura

16

3D, și interacţionând cu stucturi 3D pe dispozitivele de afișare 2D nu este o sarcină

ușoară. În al doilea rând, formele moleculare sunt foarte complexe, și, astfel, nu este

ușor pentru utilizatorii cu mai puţină experienţă şi mai puține cunoștințe să identifice

aceste forme. În al treilea rând, granițele dintre componentele moleculare nu sunt

foarte clare atunci când vizualizezi o hartă de densitate, și astfel, sunt greu de

identificat. Pentru a rezolva aceste probleme, metoda de segmentare trebuie fie în

măsură să se ocupe eficient de date 3D, şi de a fi în mare măsură automată, astfel

încât utilizatorii să nu fie nevoiţi să identifice singuri formele 3D. (Martinez-Sanchez,

Garcia, and Fernandez 2011)

2.4.2 Înregistrarea

Procesul de înregistrare implică luarea dintr-o structură cunoscută a unei

componente moleculare, de exemplu obținută folosind cristalografia cu raze X, și

plasarea acesteia, ca si cum s-ar suprapune cel mai bine cu o componentă similară în

harta de densitate. Înregistrarea unei structuri pe o hartă de densitate este un

instrument util de analiză. Deoarece hărțile Crio-Em au o rezoluţie redusă, ele nu pot

fi folosite pentru a determina în mod direct pozițiile atomice a fiecărei componente.

Înregistrarea structurilor cu harta poate fi folosită ca o modalitate de a construi

modele structurale la nivele atomice ale complexelor capturate în harta de densitate

folosind Crio-Em. Mai mult, procesul de înregistrare poate fi folosit pentru a

descoperi relațiile dintre majoritatea structurilor cunoscute în prezent și hărțile de

densitate realizate de Crio-Em.

2.4.3 Metode de filtrare

Aplicarea unui filtru pentru o imagine este, de obicei, un pas important înainte

de aplicarea unei metode de segmentare. Filtrele pot fi în general împărțite în

filtre liniare și filtre neliniare. Filtrele liniare includ filtre trece-jos, care păstrează

doar frecvențele joase dintr-o imagine și, astfel, au un efect de netezire, și

filtre trece-sus, care păstrează doar frecvențe mai mari, subliniind de obicei contururi

în jurul obiectelor. Un filtru pe baza funcției Gauss, de exemplu, este un filtru trece-

jos, în timp ce un filtru care calculează magnitudini de înclinare este un filtru trece-

sus. (Figura 2.10)

Filtrele trece-sus sunt standard în procesarea imaginii pentru viziulizarea

computerizată și analiza imaginilor medicale, deoarece acestea evidentiează conturul

în jurul obiectelor. Filtrele trece-jos netezesc imaginea, reducând astfel zgomotul de

înaltă frecvență și în acest sens au de asemenea tendința de a estompa contururile în

jurul obiectelor. Pentru a reduce neclaritatea contururilor obiectelor, pot fi utilizate

filtre trece-jos anizotrope, care încearcă să netezească în direcții perpendiculare pe

contururi , reducând astfel efectul de neclaritate pe contur.

17

Figura 2.10 – Graficul unui filtru gaussian

2.4.4 Tipuri de filtre

a) Filtrare-spațială

Teoria de scalare spațială este un cadru de reprezentare semnal multi-scală

dezvoltat pentru vizualizarea computerizată, pentru prelucrarea imaginii și pentru

comunitățile de procesare a semnalului cu motivațiile complementare de la fizică

şi vizualizare biologice. Este o teorie formală pentru manipularea structurilor de

imagine la scări diferite, prin reprezentarea unei imagini ca o familie

monoparametru de imagini netezite.

Filtrarea spaţială a imaginilor digitale este o operaţie care se aplică local, la

nivelul fiecărui pixel din imagine, înlocuind valoarea pixelului curent cu o valoare

ce depinde de valorile pixelilor vecini (de aici şi denumirea lor de filtre spaţiale –

se consideră o vecinătate spaţială în sistemul de coordonate asociat

imaginii). Aceste filtre operează pe vecinătăţi mici, intre 3x3 şi 11x11.

b) Filtrele de mediere sunt în general filtre liniare aplicate printr-o operaţie

de convoluţie a imaginii cu un nucleu (masca) de convoluţie. Ele determina o

mediere ponderată a vecinilor. Sunt mai eficiente pentru imagini cu zgomot

uniform sau zgomot gaussian.

c) Filtrele ordonate sunt filtre neliniare implementate prin ordonarea

crescătoare a valorilor pixelilor din vecinătatea pixelului curent. Aceasta

ordonare se foloseşte pentru a selecta una dintre valori. Filtrele ordonate (în

special filtrul median) sunt mai eficiente pentru imaginile cu zgomote salt-and-

peper, zgomote exponenţial negative şi zgomote Reyleigh.

Un filtru care îşi schimbă comportamentul bazându-se pe caracteristicile

nivelelor de gri ale vecinilor este numit filtru adaptativ, şi aceste filtre sunt des

folosite în multe aplicaţii practice. (S. Jayaraman, S. Esakkirajan 2011)

18

2.5 Determinarea structurii învelişului (anvelopei virale) HIV

Învelişul de glicoproteine trimerice al HIV-1, compus din subunităţile GP120

și GP41, rămâne un obiectiv major pentru dezvoltarea unui vaccin. Structurile din

regiunile centrale ale monomerului GP120 și GP41 au fost determinate anterior prin

cristalografie cu raze X. Perspective noi în structura învelişului de glicoproteine

trimerice HIV-1 vin acum de la tomografiile şi studiile crio-electronice asupra

GP120/GP41 din viruși intacţi.

Cunoașterea structurii moleculare a învelişului trimeric pe virusuri intacte este

importantă atât pentru înţelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza

interacțiunilor virus-celula cât şi pentru proiectarea de imunogeni eficienţi de

combatere a HIV / SIDA. S-au luat mai multe măsuri importante de-a lungul ultimilor

doi ani față de înțelegerea structurii învelişului trimeric al glicoproteine și baza

structurală de intrare a HIV-ului și neutralizarea acestuia.

S-au efectuat studii ce au dus la o primă determinare a structurii de GP120

trimeric pe suprafața membranei HIV-1 în stare neliganda, în complex cu anticorpii

cu spectru larg de neutralizare b12 și într-un complex ternar cu CD4 și anticorpi 17b.

S-a demonstrat că legăturile CD4 rezultate determină o reorganizare majoră a

învelişului trimeric, provocând o rotație exterior și deplasarea fiecărui monomer

GP120. Această descoperire a stărilor închise și deschise ale trimerului GP120 a oferit

o nouă paradigmă de a interpreta și de a înțelege schimbările conformaționale ale

învelişului de glicoproteine relevante pentru infecţia virală. Prelungirea acestor studii

pentru un număr de tulpini HIV furnizează perspective noi și neașteptate în

organizarea moleculară a învelişului trimeric din stările fără liganzi și în complexul cu

anticorpi de neutralizare cât și non-neutralizanți. Virusuri CD4-independente sunt

adesea găsite în zonele imun-privilegiate ale corpului, cum ar fi sistemul nervos

central. Descoperirile sugerează o explicație structurală pentru mecanismul molecular

de infectare virală independentă de CD4 și folosirea în continuare a tomografiei crio-

electronică pentru a descoperi structuri distincte, relevante din punct de vedere a

funcţiei îndeplinite.

Folosind microscopia electronică cu scanare a ionilor de uzură, tomografia de

electroni, și microscopia la super-rezoluție, s-au analizat arhitecturile spațiale ale

contactelor celula-celula şi distribuţia virionilor HIV la sinapse virusologice formate

între celulele dendridice mature şi celulele T. Virușii sunt detectaţi la suprafața

membranei celulelor dendritdice şi celulelor T, dar virionii nu sunt eliberaţi pasiv la

sinapse. În schimb transferul virusului necesită angajamentul receptorilor celulelor T

şi CD4.Izolarea relativă a celulelor T din mediul extracelular, îngroparea locului

transferului HIV și inițierea receptor-dependentă a transferului virion prin celule T

evidenția noi aspecte de transmitere celulă-celulă HIV, și sugerează noi abordări

pentru limitarea răspândirii HIV / SIDA

Infectarea celulelor țintă cu virusul imunodeficienței umane ( o particulă cu

dimensiuni de la 100 nm până la 150 nm), urmăreşte interacțiunea învelişului său de

suprafaţă format din glicoproteine cu receptorul CD4 celular și co-receptori, cum ar fi

CCR5 şi CXCR4. Așa cum este afișată pe suprafața membranei virale, învelişul este

un trimer, compus din trei copii de heterodimeri necovalenti asociaţi ai GP120,

componentă care interacționează cu receptorii celulari, și GP41, componentă

19

transmembranara necesară pentru realizarea fuziunii dintre membrana virală și țintă.

Învelişul trimeric, este heterogen în aproape toate privințele posibile. În plus față de

mutațiile constante care alterează compoziția genetică a virusului în gazdele infectate

și numărul variabil de învelişuri trimerice afișate pe suprafața membranei, fiecare

virus circulant poate fi împânzit cu alte proteine din membrana gazdă, de dimensiuni

diferite, care sunt glicolizate diferit.

Primele descoperiri în structura de HIV-1 GP120 au fost raportate într-o

lucrare , care prezenta structura cristalină a unui nucleu monomer GP120 legat de o

CD4 solubil construit și de un fragment de anticorpi monoclonali fab 17b. Deși

GP120 folosit pentru cristalizare a fost dintrun nucleu trunchiat diglicolizat,

reprezentând 60% din polipeptide, această structură a lansat arhitectura de ansamblu,

precum și interfețele moleculare implicate în legarea de CD4 şi simularea co-

receptorilor 17b. Cunoștințele dobândite din această structură au fost utilizate pentru a

îmbunătăți eficacitatea și simularea micro-moleculelor CD4 și pentru a proiecta o

sondă pentru izolarea mai multor linii mari de anticorpi de neutralizare, cum ar fi

VRC01 .În urma acestui raport inițial, s-au publicat peste două duzini de structuri

cristaline de nuclee de monomer GP120 din HIV-1 în stare liberă, sau în complex cu

diferiţi anticorpi și / sau reactivi. (Kwong et al. 2000)

Crio-tomografia de electroni a apărut ca un instrument puternic pentru a

reduce decalajul dintre biologia structurală și celule prin furnizarea de hărți de

rezoluție intermediară ale ansamblurilor moleculare complexe și heterogene, care nu

pot fi analizate prin cristalografie. Metodele tomografice permit reconstrucția

tridimensională a structurilor întregi de virioni HIV-1 prinşi într-o stare aproape

nativă. Mai mult, analiza tomografica a virusurilor care au fost incubate cu diferiţi

anticorpi și / sau liganzi pot furniza structurile native complet glicozilate de trimeri

funcționali din învelişul de glicoproteine, captate într-o serie de stări conformaționale.

Prin combinarea tomografiei crio-electronica cu imaginea medie şi montarea

de structuri de raze X ale structurilor selectate de GP120 conjugate, a fost determinată

conformația cuaternară de complexe trimerice afișate pe viruși intacţi și rezolvate

controversele timpurii cu privire la posibilitatea formării unei singure tulpini de

înveliş de glicoproteine trimerice. Cristalografia cu raze X și crio-tomografia de

electroni, fiecare oferă informaţii necesare pentru a înţelege mecanismele molecular

GP120. De exemplu, studiile cristalografice de raze X asupra învelişului legat fie de

CD4 (care inițiază infecția), fie de anticorpul de neutralizare VRC01 (care blochează

infecția) sunt extrem de asemănătoare, cu interfețe moleculare aproape identice

implicate în contact a GP120 cu aceşti doi liganzi . Cu toate acestea, atunci când

aceste structurile sunt determinate folosind tomografia crioelectronica, există

diferențe dramatice în structura cuaternară care ajută la explicarea un aspect mecanic

important al anticorpului VRC01. Astfel, VRC01 închide învelişul de glicoproteine

într-o conformație închisa, în care GP41 și componentele sale fusogenice sunt

îngropate la nucleu, în timp ce legarea CD4 induce o conformație deschisă, care

permite expunerea GP41 și inițierea în trepte consecutive din procesul de infecţie.

Profundele diferenţe observate în cazul legării de CD4 sau VRC01, în ciuda

faptului că aceştia se leagă de părţi similare ale monomerului GP120, subliniează

importanţa metodei folosite, cum ar fi crio-ET pentru a determina structurile de

cuaternale. Aceste diferențe sunt, de asemenea, reflectate prin studii biochimice care

arată că învelişul exterior legat de VRC01 nu afișează modificări conformaţionale

20

ample, care sunt observate atunci când se leagă de CD4, în conformitate cu

concluziile de la crio-ET. (Merk and Subramaniam 2013; Hu et al. 2011; Kwong et al.

2000; Meyerson et al. 2013b; Chen et al. 2009; McLellan et al. 2011; Tran et al. 2012)

2.6 Prezentarea programului UCSF Chimera

UCSF Chimera (sau pur și simplu Chimera) este un program extensibil pentru

vizualizare interactivă și analiză a structurilor moleculare și date aferente, inclusiv

hărți de densitate, ansambluri supramoleculare, aliniamente de secvenţe, traiectorii, și

ansambluri conformaţionale. Pot fi create atât imagini cât şi filme de înaltă calitate.

Chimera include documentația completă și poate fi descărcat gratuit pentru utilizare

non-comercială.

Chimera este dezvoltat de departamentul de Resurse pentru Bioinformatica,

Vizualizare și Informatică (RBVI), de la Universitatea din California, San Francisco.

Dezvoltarea este finanţată de Naţional Institutes of Health (NIGMS acorda P41-

GM103311).

2.6.1 Caracteristici

a) Analiza generală a structurii

identificare automată a tipurilor de atomi

măsurători: distanţă, unghiuri, suprafaţă, volum

calculul centroidelor, axelor, planurilor şi măsurători asociate

poate să încarce proteine din baze de proteinte (PDB), hărţi de densitate

(EMDB), etc.

crearea uşoară de atribute personalizate

set bogat de comenzi

b) Prezentare de imagini şi filme

imagini de rezoluţie înaltă

efecte vizuale, inclusiv umbre, margini de siluetă, fundaluri multicolore

reprezentări moleculare standard (bastoane, sfere, panglici, suprafeţe

moleculare)

interfaţă grafică simplă pentru crearea de filmuleţe interactive

scenele pot fi plasate ca şi cadre cheie de-a lungul unei cronologii animate

c) Instrumente de date de volum

multe formate a harţilor de volum de date (exemplu: densitatea de electroni)

ajustare interactivă a pragului

hărţile de densitate pot fi create de la coordonatele atomice

multe instrumente pentru segmentarea şi editarea harţilor de densitate

filtrare Gaussiana, transformată Fourier

O listă a comenzilor de referinţă din cadrul programului UCSF Chimera o puteţi găsi

la Anexă 1.

21

CAPITOLUL 3

STUDIU DE CAZ: GLICOPROTEINELE HIV- simulări, fitări,

rezultate

3.1 GP120

Prima parte a studiului a constat în identificarea ultimelor structuri de GP 120

din baza de date proteice PDBE, obţinute prin cristalografia cu raze X. Acestea sunt:

1gc1, 1yyl, 2b4c, 2i5y, 2nxy, 2ny4, 2ny7, 2qad, 3dnl, 3dnn, 3dno, 3fus, 3hi1, 3idx,

3idy, 3jwd, 3jwo, 3lqa, 3ngb, 3rjg, 3rjq, 3se8, 3se9, 3tgg, 3tgq, 3tgr, 3tgs, 3tgt, 3tih,

3u7y, 4dko, 4dkp, 4dkq, 4dkr, 4dku, 4dkv, 4i3r, 4i3s, 4i53, 4i54, 4j6r, 4jan, 4jb9,

4jdt, 4jkp, 4jm2, 4jpj, 4jpk, 4jpv, 4jpw. Pentru a oferi o comparație a asemănărilor și

diferențelor dintre diferitele structuri GP120 am realizat o suprapunere şi aliniere a

tutoror în funcţie de 1GC1 folosind metoda matchmaker(Figura 3.1). Aceasta metodă

suprapune structuri de acizi nucleici sau proteine, creând întai alinieri de secvenţe,

care apoi le fitează. Pentru secvenţele iniţiale metoda foloseşte informaţii de la

tipurile de reziduri şi/sau de la structurile secundare. (Merk and Subramaniam 2013)

Figura 3.1 – Suprapunerea si alinierea actuală a structurilor GP120

22

Spre deosebire de această suprapunere şi aliniere mai sus prezentată, în

studiile anterioare s-au folosit doar structurile: 3ngb, 3tgt, 3se9, 3se8, 4dkr, 4dkq,

4dkp, 4dko, 3u7y, 3rjq, 3tgs, 3tih, 3tgq, 3jwd, 2b4c, 2qad, 3hi1, 1gc1, 2i5y, 1yyl,

3lqa, 3idx, 2ny7 aşa cum a reieşit figura 3.2.

Figura 3.2 – Suprapunerea si alinierea veche a structurilor GP120

Pentru a evidenţia această diferenţă cât şi multitudinea de mutaţii care le

suferă virusul HIV la nivel de glicoproteine am redus studiul la o comparaţie între

structura 1GC1 descoperită în anul 1998 şi 4I54 descoperită în anul 2013.

Paşii care i-am efectuat in crearea şi segmentarea hârţilor de densitate

simulate:

încărcarea structurilor din baza de date proteice (File Fetch by ID)

în linia de comandă ( Favorites Command Line) am introdus

următoarele comenzi:

o “set bg_color white” – culoarea de fundal devine albă

o “rainbow chain” – se evidenţiează lanţurile din alcătuirea

structurii

o “molmap #0 2.5” – unde “#0” reprezintă numărul modelului,

iar “2.5” rezoluţia la care va fi creată harta de densitate

în urma acestor comenzi o să se creeze harta de densitate simulată şi se

v-a deschide automat o fereastră nouă denumită „Volume Viewer”

pentru a segmenta harta de densitate, din fereastra nou deschisă, alegeţi

meniul Tools Segment map

se v-a deschide o a treia fereastră unde trebuie doar sa apăsaţi butonul

„Segment”

23

Cod PDB 1gc1

Nume moleculă HIV-1 GP120 CORE COMPLEXED WITH

CD4 AND A NEUTRALIZING HUMAN

ANTIBODY

Rezoluţie 2.5 Å

Dată publicare 1998

Metoda X-ray

Publicată în Structure of an HIV GP120 envelope

glycoprotein in complex with the CD4 receptor

and a neutralizing human antibody

Imagine

Hartă de densitate simulată

Cod PDB 4i54

Nume moleculă Crystal structure of clade A/E 93TH057

HIV-1 GP120 H375S core in complex with

DMJ-II-121

Rezoluţie 2.5 Å


Metoda X-ray

Publicată în Structure-Based Design and Synthesis of

an HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-

Ray and Thermodynamic Characterization

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/1gc1/citation.html



http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/singapore-jul2012/shiny.html

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/4i54/citation.html



24

Imagine


Aşa cum se poate observa şi din tabelele de mai sus metoda folosită pentru

determinarea structurilor a fost cristalografia cu raze X la o rezoluţie de 2.5 Å.

Detaliile suplimentare referitoare la aceste două ar fi acelea că 1GC1 este alcătuită din

lanţurile G, C, L, H iar 4I54 din lanţurile A şi B.

Am efectuat o aliniere a celor 2 structuri rezultând figura 3.3:

Figura 3.3 – Suprapunerea si alinierea structurilor 1GC1 si 4I54

25

În urma acestei alinieri am făcut o analiză cantitativă reprezentată în procente

privind gradul de asemănare la nivel de aminoacizi a lanţurilor din 1GC1 cu cele din

4I54. De exemplu comparând lanţul G din 1GC1 cu lanţul A din 4I54 am ajuns la o

asemănare de 61,37% . Figura de mai jos arătând exact părţile comune fiecăruia, dar

şi părţile distincte. (Figura 3.4)

Figura 3.4 – Rezultate analiză la nivel de aminoacizi a lanţurilor din 1GC1 cu 4I54

Dacă în compararea cu lanţul G a existat o asemănare de 61,37% , în cea cu

lanţul C gradul de asemănare este de 0.00 % , acest lucru arată întocmai diferenţentele

mari existente.

3.2 Fitări de GP120 în hărţi EM

În urma acestora vom reuşi să înţelegem detaliile la nivel molecular care stau

la baza încercărilor de a dezvolta un vaccin, care să reuşească să provoace reacţia

unor anumitor tipuri de anticorpi. Una din cele mai promiţătoare locuri ţintă în

dezvoltarea vaccinului este locul unde se leagă CD4 de anvelopă virală. Virusul

foloseşte acest loc pentru a intra în celulele pe care le infectează. În teorie anticorpii

care acţionează în blocarea acestui lucru ar putea proteja celulele de la infecţie. În

practică însă, câţiva anticorpi indentificaţi de la indivizii infectaţi cu HIV acţionează

asupra intrării virale, dar din motive necunoscute, nu se pot lega, prin urmare nu

reuşesc să oprească răspândirea virusului. Doar unul , anticorpul fab 17b, pare a fi

eficient, neutralizând aproximativ jumătate din circulaţia virusului; doar fab 17b se

poate lega de trimerul GP120, dar imediat ce GP120 este izolat din această formaţie

de trimer se leagă de acesta până şi anticorpii ineficienţi. Teoretic efortul vaccinului

poate localiza fab 17b, dar trimerul GP120 nu este suficient de stabil pentru a fi folosit

ca imunogen într-un vaccin. Ca rezultat însă, efortul vaccinului de a localiza fab 17b

foloseşte în cele mai multe cazuri doar monomerul GP120, care din nefericire

provoacă şi legarea altor anticorpi, majoritatea ineficienţi. (Meyerson et al. 2013b)

26

În cele ce urmează am realizat diferite simulări pentru a vedea ce se întâmplă

la nivel molecular atunci când monomerul GP120 este în stare liberă, în comparaţie

când de acesta se leagă doar de CD4, dar şi de CD4 şi de fab 17b. Am realizat şi

simulări privind trimerul GP120 în stare liberă în comparaţie când de acesta se leagă

doar de fab 17b, dar şi de CD4 şi fab 17b.

Pentru a descrie calitatea fitării (potrivirii) unui model atomic în hărţile EM se

foloseşte un coeficient de corelaţie dintre acestea. Fitarea raportează de asemenea

numărul de atomi aflaţi în afara suprafeţei hărţii, dar şi matricea de rotaţie şi

translaţie, şi unghiul de rotaţie în grade.

3.2.1 Monomerul GP120

a) Monomerul în stare liberă

În simulare am folosit monomerul GP120 din structura 1GC1 fitat pe harta de

densitate EM-5020.

Figura 3.5 – Coeficient de corelaţie: monomer GP120 in stare liberă pe harta EM-

5020

27

Figura 3.6 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie: monomer GP120 in stare liberă

pe harta EM-5020

Rezultatele obţinute:

Fit molecule 1gc1.ent (#0) to map emd_5020.map using 2702 atoms

average map value 4.299

steps 148

shifted from previous position 80.5

rotated from previous position 52.7 degrees

atoms outside contour 403

contour level 1.8319

Position of 1gc1.ent (#0) relative to emd_5020.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.28545666 -0.90942686 -0.30241905 226.42613178

0.54662832 0.41368477 -0.72805383 223.47707605

0.78721787 0.04251700 0.61520756 154.62319381

Axis 0.39013446 -0.55167531 0.73719024

Axis point -139.95849055 325.03730265 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

80.95706829

Shift along axis 79.03655961

b) Monomerul GP120 legat cu CD4

28

Figura 3.7 – Coeficient de corelaţie: monomer GP120 legat cu CD4 pe harta EM-5020

Figura 3.8 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie: monomer GP120 legat cu CD4

pe harta EM-5020

Rezultate obţinute:

Fit molecule 1gc1 (#1) to map emd_5020.map using 4230 atoms


steps 108





Position of 1gc1 (#1) relative to emd_5020.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

-0.02647369 -0.77387965 -0.63277913 245.92483034

-0.94566369 -0.18581873 0.26681750 208.53161308

29

-0.32406685 0.60545990 -0.72691058 248.12947598

Axis 0.69198406 -0.63082467 -0.35102462

Axis point 0.00000000 195.61424380 202.41450991

Rotation angle

(degrees)

159.36651815

Shift along axis -48.47037963

c) Monomerul GP120 legat de CD4 şi fab 17b

Figura 3.9 – Coeficient de corelaţie: monomer GP120 legat cu CD4 şi fab 17b pe

harta EM-5020

Figura 3.10 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie : monomer GP120 legat cu

CD4 şi fab 17b pe harta EM-5020

30


Fit molecule 1gc1 (#1) to map emd_5020.map using 7877 atoms


steps 120

shifted from previous position 24




Position of 1gc1 (#1) relative to emd_5020.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

-0.14807590 0.55687307 -0.81729181 288.40830500

-0.92261467 -0.37540283 -0.08862774 191.54884444

-0.35616807 0.74092179 0.56936738 179.07595898

Axis 0.47193932 -0.26233808 -0.84169591

Axis point 256.09869473 -44.89492774 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

118.49327965

Shift along axis -64.86683780

3.2.2 Trimerul GP120

a) Trimerul GP120 in stare liberă

Pentru rezultate cât mai precise am folosit structura 3dnn pe harta de densitate EM-

5019

31

Figura 3.11 – Coeficient de corelaţie: trimerul GP120 in stare liberă pe harta EM-

5019

Figura 3.12 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie: trimerul GP120 in stare liberă

pe harta EM-5019

Rezultate:

Fit molecule 3dnn (#0) to map emd_5019.map using 6738 atoms


steps 48


32




Position of 3dnn (#0) relative to emd_5019.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99999989 0.00039121 -0.00026892 -0.03732896

-0.00039130 0.99999987 -0.00034018 0.11553294

0.00026879 0.00034028 0.99999991 -0.73464496

Axis 0.58253071 -0.46032657 -0.66989358

Axis point 785.81421066 716.89174567 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

0.03346368


b) Trimerul GP120 legat de fab 17b

In această simulare am folosit structura 3dnl pe harta de densitate EM-5018

Figura 3.13 – Coeficient de corelaţie: trimerul GP120 legat cu fab 17b pe harta EM-

5018

33

Figura 3.14 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie: trimerul GP120 legat cu

fab 17b pe harta EM-5018


Fit molecule pdb3dnl.ent (#1) to map emd_5018.map using 6738 atoms


steps 48





Position of pdb3dnl.ent (#1) relative to emd_5018.map (#0) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99903530 -0.04389329 -0.00135927 9.43196879

0.04389362 0.99903619 0.00020797 -8.90859972

0.00134883 -0.00026743 0.99999905 1.47906789

Axis -0.00541272 -0.03083344 0.99950988

Axis point 206.38673224 210.55789957 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

2.51695239


34

c) Trimerul GP120 legat de CD4 si fab 17b

Strutura folosită a fost 3dno fitată pe harta de densitate EM-5020

Figura 3.15 – Coeficient de corelaţie: trimerul GP120 legat cu CD4 si fab 17b pe harta

EM-5020

Figura 3.16 – Unghiul de rotaţie faţă de axa de rotaţie: trimerul GP120 legat cu CD4

şi fab 17b pe harta EM-5020

35

Rezultate:

Fit molecule 3dnn (#0) to map emd_5019.map using 6738 atoms


Steps 48





Position of 3dnn (#0) relative to emd_5019.map (#1) coordinates:

Matrix rotation

and translation

0.99999989 0.00039121 -0.00026892 -0.03732896

-0.00039130 0.99999987 -0.00034018 0.11553294

0.00026879 0.00034028 0.99999991 -0.73464496

Axis 0.58253071 -0.46032657 -0.66989358

Axis point 785.81421066 716.89174567 0.00000000

Rotation angle

(degrees)

0.03346368


3.2.3 Concluzii privind fitarea

În urma studiului am realizat că după ce GP120 se leagă de CD4, are loc o

schimbare la nivel de structură, provocând o rotație exterioră și deplasarea fiecărui

monomer GP120. Acesta este strâns legat de o rearanjare a regiunii GP41 de-a lungul

axei centrale a trimerului, ceea ce duce la un contact mai apropiat între membranele

celulelor virale și țintă.

3.3 GP 41

Primii paşi efectuaţi pentru studiul GP120 i-am repetat şi pentru următoarele

structuri de glicoproteine GP41: 1aik, 1df4, 1dlb, 1env, 1f23, 1i5x, 1i5y, 1k34, 1qr9,

1szt, 2cmr 2ot5, 2x7r, 2xra, 2z2t, 3aha, 3cp1, 3cyo, 3k9a, 3ma9, 3mac, 3p30, 3vie,

3vtp. Suprapunerea şi alinierea s-a făcut în comparaţie cu 1AIK şi a rezultat

figura 3.17:

36

Figura 3.17 – Suprapunerea si alinierea nouă a structurilor GP41

Studiile anterioare s-au rezumat doar la structurile: 1aik, 2x7r, 2xra, 3mac,

3ma9, 2cmr, 3vie, 1f23, 3aha, 2z2t, 3p30, 1env, 1k34, 1dlb, 1szt, 1dfa, 3cp1, 3cyo,

2ot5, 1qr9, 1l5x, 1l5y, 3vpt şi 3k9a, alinierea făcându-se tot în comparaţie cu 1AIK

(Figura 3.18):

Figura 3.18 – Suprapunerea si alinierea veche a structurilor GP41

La fel ca şi în studiul precedent referitor la structurile GP120 şi aici am

selectat două structuri de GP41 pentru o analiză la nivel de lanţuri de aminoacizi.

Structurile alese au 1AIK din anul 1997 şi 3VTP determinată în anul 2012.

37

Cod PDB 3VTP

Nume moleculă HIV fusion inhibitor MT-C34

Rezoluţie 1.9 Å

Data publicare 2012

Metoda X-ray

Publicată în The M-T hook structure is critical for design of

HIV-1 fusion inhibitors

Imagine


Cod PDB 1AIK

Nume moleculă HIV GP41 CORE STRUCTURE

Rezoluţie 2.0 Å


Metoda X-ray

Publicată în Core structure of GP41 from the HIV

envelope glycoprotein.

Imagine


http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/3vtp/citation.html

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/3vtp/citation.html


http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/1aik/citation.html

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/1aik/citation.html


38

Din tabele se poate observa că amândouă s-au determinat prin cristalografie cu raze X

la rezoluţii relativ apropiate: 1AIK la 1.9 Å , iar 3VTP la 2 Å. Alte asemnari şi

diferenţe sunt şi la nivel de lanţuri: 1AIK fiind alcătuit din lanţurile N şi C, iar 3VTP

din lanţurile C şi D.

Ca urmare a alinieri celor două structuri a rezultat figura 3.19:

Figura 3.19 – Suprapunerea si alinierea structurilor 1AIK si 3VTP

din cadrul căreia am comparat lanţul C din 1AIK cu lanţul D din 3VTP. Rezultatul

acestei comparări fiind un procent de 71,43%, celalate perechi având un procent de

0.00%. (Figura 3.20)

Figura 3.20 - Rezultate analiză la nivel de aminoacizi a lanturilor din 1AIK cu 3VTP

39

CAPITOLUL 4

CONCLUZII

Ultimul capitol, destinat concluziilor acestei lucrări, încearcă o sintetizare a

principalelor idei referitoare la HIV, la modul cum acesta interacţionează cu celula

ţintă, la schimbările molecular pe care acesta le suferă şi importanţa studiului efectuat

în încercările viitoare de a dezvolta un vaccin.

Înţelegând atât structura avelopei de pe suprafaţa virusului cât şi variaţia

acestei structuri, la o rezoluţie cât mai mare posibilă rămâne una dintre cele mai

importante provocări pentru biologia structurilor anvelopelor virale.

Îmbunatăţirile recente din cadrul acestei ramuri a biologiei ne arată ca

combinând informaţiile provenite din cristalografiile cu raze X, cu cele din crio-EM şi

crio-ET pot fi o unealtă puternică în înţelegerea mecanismelor de infecţie virală.

Deoarece cristalografia cu raze X are nevoie de cristale 3D pentru a obţine informaţii

legate de structură, este folosită pe un număr restrâns de modele proteice. În general

crio-EM şi crio-ET au potenţialul de a descrie intact, structura anvelopei virale. Totuşi

aceste metode nu s-au dovedit folositoare pentru a obţine informaţii la rezoluţii de

3 - 4 Å, care ar fi necesare pentru o înţelegere adecvată.

Având în vedere limitările acestor metode, provocarea pentru viitor este aceea

că odată cu dezvotarea tehnologiei atât biologii cât şi bioinginerii care se ocupa cu

studiul virusului HIV să depăşească şi ei barierele. Analizele oferite de modelarea pe

calculator trebuie să găsească modalităţi noi în a integra toate aceste informaţii

experimentale viitoare în modele de structuri pline de înţeles.

HIV-ul este virusul imunodeficienţei umane care poate duce la sindromul

imunodeficienţei dobândite, sau SIDA. Știm că HIV-ul se poate ascunde pentru

perioade lungi de timp, în celulele corpului și că acesta atacă o parte cheie a

sistemului imunitar – celulele T sau celulele CD4. Corpul tău are nevoie de aceste

celule să lupte împotriva infecţiilor şi a bolilor, dar HIV le invadeaza, le utilizează

pentru a face mai multe copii de la sine, și apoi le distruge.

De-a lungul timpului, HIV poate distruge atât de multe celule CD4 încât organismul

nu mai poate lupta împotriva infecțiilor și a bolilor. Când acest lucru se întâmplă,

infectia cu HIV poate duce la SIDA.

Din păcate nu exista încă un vaccin impotriva HIV-ului, totuşi singura măsură

care poate fi luată este prevenirea. În acest sens trebuie să se realizeze câteva lucruri

cum ar fi promovarea conştientizării cat mai extinse privind HIV si modul de

răspandire a acestuia, dar si campaniile mass media şi educaţia in şcoli sunt printre

cele mai bune metode de a atinge acest lucru. O altă parte esenţiala a programelor de

prevenire HIV este consilierea si testarea la HIV. Persoanele care trăiesc cu HIV sunt

mai puţin predispuşi în a transmite virusul altora dacă sunt conştienţi de faptul că sunt

infectaţi si dacă au beneficiat de consiliere privind abordarea unui comportament

protejat.

În urma studiului efectuat am realizat că după ce GP120 se leagă de CD4, are

loc o schimbare la nivel de structură, provocând o rotație exteriora și deplasarea

40

fiecarui monomer GP120. Acesta este strans legat de o rearanjare a regiunii GP41

de-a lungul axei centrale a trimerului, ceea ce duce la un contact mai apropiat între

membranele celulelor virale și țintă. Acestă identificare si schimbare de structură fiind

un pas relevant de început pentru a furniza indicii importante în dezvoltarea unui

vaccin.

41

BIBLIOGRAFIE:

Alan J. Cann. “DNA Viruses.” 2000.

Bartesaghi, Alberto, Federico Lecumberry, Guillermo Sapiro, and Sriram Subramaniam. 2012. “Protein Secondary Structure Determination by Constrained Single-particle Cryo-electron Tomography.” Structure (London, England : 1993) 20 (12) (December): 2003–2013. doi:10.1016/j.str.2012.10.016. http://dx.doi.org/10.1016/j.str.2012.10.016.

Branden, Carl, and John Tooze. 2008. “Introduction to Protein Structure.”

Brown, TA. 2002. Genomes, 2nd Edition.

Cann, Alan J. 2000. RNA Viruses.

Chen, Lei, Young Do Kwon, Tongqing Zhou, Xueling Wu, Sijy O’Dell, Lisa Cavacini, Ann J Hessell, et al. 2009. “Structural Basis of Immune Evasion at the Site of CD4 Attachment on HIV-1 Gp120.” Science (New York, N.Y.) 326 (5956) (November): 1123–1127. doi:10.1126/science.1175868. http://www.sciencemag.org/content/326/5956/1123.abstract.

Covic, M., Ștefănescu D., Sandovici I. 2004. Genetică Medicală.

Eduard J. Beck, Nicholas Mays, Alan W Whiteside, and José M Zuniga. 2006. The HIV Pandemic - Local and Global Implications.

Gustchina, Elena, Mi Li, John M Louis, D Eric Anderson, John Lloyd, Christian Frisch, Carole A Bewley, Alla Gustchina, Alexander Wlodawer, and G Marius Clore. 2010. “Structural Basis of HIV-1 Neutralization by Affinity Matured Fabs Directed Against the Internal Trimeric Coiled-coil of Gp41.” Ed. Alexandra Trkola. PLoS Pathogens 6 (11) (January): e1001182. doi:10.1371/journal.ppat.1001182. http://dx.plos.org/10.1371/journal.ppat.1001182.

He, Wanzhong. 2010. “Electron Tomography.” doi:10.1002/9780470015902.a0021877.

Hu, Guiqing, Jun Liu, Kenneth A Taylor, and Kenneth H Roux. 2011. “Structural Comparison of HIV-1 Envelope Spikes with and Without the V1/V2 Loop.” Journal of Virology 85 (6) (March): 2741–2750. doi:10.1128/JVI.01612-10. http://jvi.asm.org/content/85/6/2741.

John, Lackie. 2010. A Dictionary of Biomedicine.

Jones John. 2002. Amino Acid and Peptide Synthesis.

Know, What I, and What I Learned. “RNA And”: 193–204.

Kwong, Peter D, Richard Wyatt, Shahzad Majeed, James Robinson, Raymond W Sweet, Joseph Sodroski, and Wayne A Hendrickson. 2000. “Structures of HIV-1 Gp120 Envelope Glycoproteins from Laboratory-Adapted and Primary Isolates.” Structure 8 (12) (December): 1329–1339. doi:10.1016/S0969-2126(00)00547-5. http://dx.doi.org/10.1016/S0969-2126(00)00547-5.

42

Lucid, Vladan, Andrew Leis, and Wolfgang Baumeister. 2008. “Cryo-electron Tomography of Cells: Connecting Structure and Function.” Histochemistry and Cell Biology 130 (2) (August): 185–96. doi:10.1007/s00418-008-0459-y. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2491709&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.

Martinez-Sanchez, Antonio, Inmaculada Garcia, and Jose-Jesus Fernandez. 2011. “A Differential Structure Approach to Membrane Segmentation in Electron Tomography.” Journal of Structural Biology 175 (3) (September): 372–83. doi:10.1016/j.jsb.2011.05.010. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616152.

McLellan, Jason S, Marie Pancera, Chris Carrico, Jason Gorman, Jean-Philippe Julien, Reza Khayat, Robert Louder, et al. 2011. “Structure of HIV-1 Gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9.” Nature 480 (7377) (December): 336–343. doi:10.1038/nature10696. http://dx.doi.org/10.1038/nature10696.

Merk, Alan, and Sriram Subramaniam. 2013. “HIV-1 Envelope Glycoprotein Structure.” Current Opinion in Structural Biology 23 (2) (April 18): 268–76. doi:10.1016/j.sbi.2013.03.007. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23602427.

Meyerson, Joel R, Erin E H Tran, Oleg Kuybeda, Weizao Chen, Dimiter S Dimitrov, Andrea Gorlani, Theo Verrips, Jeffrey D Lifson, and Sriram Subramaniam. 2013a. “Molecular Structures of Trimeric HIV-1 Env in Complex with Small Antibody Derivatives.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 (2) (January): 513–518. doi:10.1073/pnas.1214810110. http://www.pnas.org/content/110/2/513.

———. 2013b. “Molecular Structures of Trimeric HIV-1 Env in Complex with Small Antibody Derivatives.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110 (2) (January 8): 513–8. doi:10.1073/pnas.1214810110. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3545814&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.

Milne, Jacqueline L S, and Sriram Subramaniam. 2009. “Cryo-electron Tomography of Bacteria: Progress, Challenges and Future Prospects.” Nature Reviews. Microbiology 7 (9) (September): 666–675. doi:10.1038/nrmicro2183. http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro2183.

Pancera, Marie, Shahzad Majeed, Yih-En Andrew Ban, Lei Chen, Chih-chin Huang, Leopold Kong, Young Do Kwon, et al. 2010. “Structure of HIV-1 Gp120 with Gp41-interactive Region Reveals Layered Envelope Architecture and Basis of Conformational Mobility.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107 (3) (January): 1166–1171. doi:10.1073/pnas.0911004107. http://www.pnas.org/content/107/3/1166.

René, Taton. 1976. Istoria Generală a Științei.

S. Jayaraman, S. Esakkirajan, T. Veerakumar. 2011. Digital Image Processing.

Tran, Erin E H, Mario J Borgnia, Oleg Kuybeda, David M Schauder, Alberto Bartesaghi, Gabriel A Frank, Guillermo Sapiro, Jacqueline L S Milne, and Sriram Subramaniam. 2012.

43

“Structural Mechanism of Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein Activation.” Ed. Félix A Rey. PLoS Pathogens 8 (7) (January): e1002797. doi:10.1371/journal.ppat.1002797. http://dx.plos.org/10.1371/journal.ppat.1002797.

44

ANEXE

ANEXA 1 – Comenzi de referinta in UCSF Chimera

2dlabels create labels with text, symbols, and arrows in 2D

ac enable accelerators (keyboard shortcuts)

addaa add an amino acid to a peptide N- or C-terminus

addcharge assign partial charges to atoms

addh add hydrogens

alias* create an alias or list the existing aliases

align align two atoms or sets of atoms along the line of sight

angle measure angles formed by atoms or by axes and planes

aniso* show thermal ellipsoids

aromatic* show ring aromaticity

background set background color, gradient, or image

bond* add/delete bonds

bondzone* make zoning tools use points along bonds

cd change the working directory

center center the view on specified atoms

changechains reassign chain identifiers

chirality report the R/S configuration of a chiral center

clip* move global clipping planes

close close a model

cofr* report or change the center of rotation

color* color atoms/bonds, ribbons, labels, surfaces

colordef define a new color

combine combine molecule models into a single model

coordset play through frames of a trajectory

copy save image files

coulombic color surfaces by Coulombic electrostatics

crystalcontacts identify clashes between PDB symmetry copies

defattr assign attribute values to atoms, residues, or models

define* calculate and display axes, planes, centroids

delete delete atoms and bonds

display* display specified atoms

distance* measure distances between atoms, axes, planes, centroids

echo send text to the status line and Reply Log

export save the graphical scene

fillring* show rings as filled

findclash* identify clashes and contacts

findhbond* (hbonds) identify hydrogen bonds

fitmap fit atoms or map into map

fly smoothly traverse a series of saved positions

focus* adjust the view and center of rotation

freeze stop all motion

getcrd report coordinates

help display the manual page for a command

45

hkcage create icosahedron as hexagon/pentagon mesh

intersurf generate and display interface surfaces

invert swap substituents of an atom

ksdssp determine secondary structure from protein coordinates

label* display atom labels

labelopt control the information in atom labels

linewidth control the width of wire bonds

longbond* show/hide pseudobonds representing missing segments

mask extract volume data bounded by surfaces

match perform least-squares fitting of specified atoms

matchmaker (mmaker) align models in sequence, then in 3D

matrixcopy apply the transformation of one model to another

matrixget write the current transformation matrices to a file

matrixset read and apply transformation matrices from a file

mclip* control per-model clipping

mcopy copy settings from one molecule model to another

measure perform calculations on structures, surfaces, maps

meshmol create a "molecule" to show surface mesh as sticks

minimize energy-minimize structures

modelcolor set color at the model level

modeldisplay* set display at the model level

molmap create a density map from atomic coordinates

morph morph (interpolate) between different structures

move translate models

movie capture image frames and assemble them into a movie

msc* color multiscale surfaces to match atoms

namesel* save and name the current selection

nucleotides* create special nucleotide representations

objdisplay* display graphical objects

open* read local files or fetch by ID

pause pause script execution until the user presses a key

perframe* specify commands to be executed at each display frame

play script various complex motions

preset apply a predefined combination of display settings

rainbow color residues, chains, or models over a range

rangecolor color over a range according to attribute values

read execute a command file, updating display at the end

represent control atom/bond style (wire, stick, bs, sphere)

reset restore default or saved orientations

resrenumber reassign residue numbers

ribbackbone* allow display of both ribbon and backbone atoms

ribbon* display ribbon

ribclass set ribbon residue class

ribinsidecolor* set a separate color for inside protein helix ribbons

ribrepr control ribbon style (flat, edged, rounded)

ribscale control ribbon scaling (Chimera default, licorice)

ribspline control ribbon path (B-spline or cardinal spline)

rlabel* display residue labels

rmsd evaluate the RMSD between specified sets of atoms

rock rock (rotate back and forth)

46

roll roll (rotate continuously)

rotation* make a bond rotatable

runscript run Python script with command-line arguments

save save the current Chimera session

savepos* save model positions

scale* scale the view

scene* save/restore scenes (positions, styles, colors, labels, etc.)

scolor color surfaces by volume data or geometry

section move global clipping planes in parallel

segment act on segmentation models

select* select atoms, (de)activate models for motion

set* set visual effects, individual model rotation

setattr* set an attribute to a specified value

shape create a surface of a specified geometric shape

show* display specified atoms, undisplay the others

sleep pause script execution for a specified time

solvate add solvent using AmberTools

sop adjust capping, edit surface models

split partition a molecule model into separate submodels

start start Chimera tools by name

stereo* switch amongst stereo options and mono viewing

stop exit from Chimera

surface* calculate and display molecular surfaces

surfcat (msms cat) group atoms for surface calculations

surfrepr (msms repr) control surface style (solid, mesh, dot)

swapaa mutate amino acids or swap rotamers

swapna mutate nucleic acid residues

sym* generate symmetry-related copies of a structure

system send a command to the system shell

thickness move global clipping planes in opposite directions

tile* arrange models in a plane

topography plot values in a volume data plane as surface heights

transparency* make atoms/bonds, ribbons, and surfaces transparent

turn rotate models

vdw* display van der Waals (VDW) dot surface

vdwdefine* set VDW radii

vdwdensity set VDW surface dot density

version show copyright information and Chimera version

viewdock start ViewDock and load docking results

volume display volume data such as electron density

vop edit volume data

vseries display an ordered sequence of volume data sets

wait suspend command processing until motion has stopped

window adjust the view to contain the specified atoms

windoworigin set graphics window location

windowsize* adjust the dimensions of the graphics window

write save atomic coordinates (pdb, mol2)

47

ANEXA 2 – Exemple structuri GP120

Cod PDB 4jm2

Nume moleculă Crystal Structure of PGT 135 Fab in Complex

with gp120 Core Protein from HIV-1 Strain JR-

FL Bound to CD4 and 17b Fab

Rezoluţie 3.1 Å


Metoda X-ray

Publicată în -

Imagine


48

Cod PDB 4i54

Nume moleculă Crystal structure of clade A/E 93TH057 HIV-1

gp120 H375S core in complex with DMJ-II-

121

Rezoluţie 2.5 Å


Metoda X-ray

Publicată in Structure-Based Design and Synthesis of an

HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-Ray and

Thermodynamic Characterization

Imagine





49

Cod PDB 4i53

Nume moleculă Crystal structure of clade C1086 HIV-1

gp120 core in complex with DMJ-II-12

Rezoluţie 2.5002 Å


Metoda X-ray

Publicată în Structure-Based Design and Synthesis of an

HIV-1 Entry Inhibitor Exploiting X-Ray and

Thermodynamic Characterization.

Imagine





50

ANEXA 3 – Exemple de structuri GP41

Cod PDB 3K9A

Nume moleculă Crystal Structure of HIV gp41 with MPER

Rezoluţie 2.1 Å

Data publicare 2009

Metoda X-ray

Publicată în Structural characterization of HIV gp41 with the

membrane-proximal external region

Imagine


http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/3k9a/citation.html

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/3k9a/citation.html


51

Cod PDB 2X7R

Nume moleculă Complex of 2 biomacromolecules, namely

TRANSMEMBRANE PROTEIN GP41.

Rezoluţie 2.0 Å


Metoda X-ray

Publicată in Crystal Structure of HIV-1 Gp41 Including Both

Fusion Peptide and Membrane Proximal External

Regions

Imagine

Hartă de densitate

simulată

http://www.ebi.ac.uk/pdbe-srv/view/entry/2x7r/citation.html




LUCRARE DE DIPLOMĂ - ACSE...

Documents

Transcript of LUCRARE DE DIPLOMĂ - ACSE...