Planul sectorial pentru cercetare‐dezvoltare din domeniul agricol şi de dezvoltare rurală al

Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, pe anii 2015‐2018, "Agricultură şi Dezvoltare

Rurală ‐ ADER 2020“

Contractor: Staţiunea de Cercetare Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Dancu, Iaşi

Obiectivul general:7. Eficientizarea sistemelor de exploatare a animalelor de fermăObiectivul specific 7.2. Îmbunătățirea indicatorilor de reproducere la animalele de fermă prin utilizarea biotehnologiilor specifice

Numărul /codul proiectului: 64 / ADER 7.2.1.Contract de finanțare 7.2.1./03.11.2015Anul începerii 03.11.2015Anul finalizării 10.12.2018Durata (luni): 39

Denumirea proiectului:Îmbunătățirea potențialului productiv în fermele de vaci pentru lapte din N-E României prin producerea de embrioni in vitro folosind donatoare de ovocite înalt productive și material seminal (sexat și nesexat) provenit de la tauri testați.

Persoana de contact (Directorul proiect): BORȘ Silviu-Ionuț

Date contact (tel/fax, e-mail): 0232272465, 0726399084 e-mail: bors.ionut@yahoo.com

Număr matricol Producția de lapte

Kg/305 zile, EM

conform

A.G.C.T.R.

Potențial productiv

Kg lapte/305 zile

RO509000954093 8594 -

RO249001002721 8214 -

RO502001664314 8848 -

RO501000112390 8397 -

RO503001166222 8590 -

RO505001664368 8590 -

RO505001664496 8090 -

RO507005673139 - 10368,93

RO504005673101 - 13699,91

RO505005673120 - 11338,22

Producția de lapte și potențialul productiv ale

donatoarelor de ovocite din rasa Bălțată cu Negru

Românească (tulpina Holstein Friesian) utilizate în faza

IV/2018 a proiectului Ader 7.2.1.

Producția potențială a fost calculată după

formula (Gâlcă I. și Maciuc V., 2004):

Lpi= (MT-M)/2*h2 +M;

Lpi- producţia de lapte potenţială (estimată)

MT – producţia de lapte a mamei tatălui

M-producţia de lapte a mamei

h2- coeficientul de heritabilitate

Selectarea donatoarelor de gameți sexuali femeli (ovocite) din rasa

Bălțată cu Negru Românească (tulpina Holstein Friesian)

Pentru realizarea rezultatului scontat 1 (utilizare de vaci înalt productive) au fost

selectate, în scopul recoltării gametului sexual femel (ovocit), 7 vaci din rasa Bălțată cu

Negru Românească (tulpina Holstein Friesian) cu producții de lapte mai mari de 8000

kg/305 zile, îndeplinindu-se criteriul de îmbunătățire a potențialului productiv pentru ferma

Dancu și pentru zona de nord-est a României.

Pentru a aplica această biotehnică și la rasa Holstein Friesian, SCDCB Dancu-Iași a

achiziționat juninci gestante de la o fermă specializată în această rasă (S.C. Panifcom

S.R.L.), juninci care prezintă potențial genetic crescut.

Selectarea taurului donator al gametului sexual mascul, din primii 10 tauri

ai topului european

S-a achiziționat material seminal congelat (sexat și nesexat) provenit de la taurul Big Point

(DE 06 66050471, ZB-NR 10 619043), în scopul realizării fecundației in vitro. Alegerea acestui

taur a fost susținută de faptul că în data de 8 August 2017 se clasa pe locul 1 prezentând

valoarea de ameliorare totală- RZG 147 (3520 fiice evaluate), în data de 05 Decembrie 2017 se

clasa pe locul 3 cu valoarea RZG 146 (4972 fiice evaluate) și în data de 4 Aprilie 2018 se clasa

pe locul 10 cu valoarea RZG 141 (6851 fiice evaluate)

Recoltarea gametului sexual femel prin tehnica secțiunilor multiple

efectuate în corticala ovariană (de la vaci abatorizate) și prin puncție

transvaginală ecoghidată (in vivo), metoda Ovum Pick Up (OPU)

Aplicarea secțiunilor multiple în

corticala ovariană în scopul recoltării

ovocitelor la specia Bos taurus

Recoltarea ovocitelor prin puncție

transvaginală ecoghidată

(metoda Ovum Pick-Up)

Aspect microscopic al complexelor ovocit-cumulus selectate

din mediul de maturare, înaintea inițierii procesului de

maturare (ovocite provenite din ovarele vacilor abatorizate)

Aspect microscopic al complexelor ovocit-cumulus

maturate înainte de inițierea fecundației in vitro

Complexe ovocit-cumulus maturate provenite din puncție transvaginală

ecoghidată (Ovum Pick Up-OPU) înaintea inițierii fecundației in vitro

Fertilizarea in vitro (FIV) a ovocitelor la rasa

Bălțată cu Negru Românească

Mediul de fertilizare a fost reprezentat de mediul TL (minitube GmbH), suplimentat cu

albumină bovină serică (BSA), piruvat de sodiu, heparină și gentamicină (Sigma-Aldrich).

În cazul folosirii mediului BO-IVF protocolul de lucru a fost asemănător cu cel utilizat

în cazul folosirii mediului pentru fertilizare TL.

Fertilizarea in vitro a fost efectuată cu material seminal provenind de la taurul Big

Point, achiziționat de la un centru specializat în producerea dozelor de însămânțare artificială a

vacilor. Anterior fertilizării, spermatozoizii au fost pregătiți prin tehnica Swim-up, în mediu special

TL sperm îmbogățit cu BSA, piruvat de sodiu și gentamicină.

Gameții în picăturile de fertilizare. Spermatozoizii pot fi

observați sub forma unor puncte albe în zonele de câmp

întunecat (imagine microscopică)

Cultura prezumtivilor zigoți

Cultura prezumtivilor zigoților a fost realizată în mediul de cultură SOF (Synthetic Oviduct

Fluid, Minitube BmbH) îmbogățit cu aminoacizi esențiali, aminoacizi non-esențiali și piruvat de sodiu

(Sigma Aldrich), sau a mediului de cultură BO-IVC (IVF Bioscience).

Din picăturile de fertilizare, zigoții au fost preluați și spălați de două ori în mediul de

cultură, după care au fost denudați prin turbionare și separați de ovocitele nefertilizate.

Zigoți separați, zilele 1-2 de cultură celulară (stadii de dezvoltare: 2, 4 și

8 celule, imagini microscopice)

Evaluarea zigoților în zilele 7, 9 de cultură clulară

Blastociști bovini înconjurați de zonă pelucidă

intactă din ziua a 7-a de cultură celulară

(imagine microscopică)

Ziua 9 de cultură celulară, prezența a 5 blastociști

eclozați obținuți din ovocite prelevate de la vaci

abatorizate (imagine microscopică)

Ziua 9 de cultură celulară, prezența a 6 blastociști eclozați

obținuți din OPU asociat FIV (imagine microscopică)

Inocularea zigoților obținuți din FIV la rasa Bălțată cu Negru Românească

(tulpina Holstein Friesian)

Evaluarea rezultatelor obținute din FIV la rasa Bălțată cu Negru

Românească (tulpina Holstein Friesian)

Nr. crt.

Număr de

ovare

prelevate

Număr de

ovocite

recoltate

Număr de

ovocite selectate

Număr de

embrioni

segmentați

Rata

segmentării

(%)

Număr de

embrioni

obținuți

%

embrioni

dezvoltați

din totalul

de ovocite

selectate

%

embrioni

dezvoltați

din

numărul de

embrioni

segmentați

1 10 110 90 60 66,7% 8 8,9% 13,3%

2 13 150 80 46 57,5% 10 12,5% 21,7%

3 6 60 54 20 37,0% 0 0,0% 0,0%

4 10 150 120 88 73,3% 10 8,3% 11,4%

5 10 92 71 40 56,3% 15 21,1% 37,5%

Medie 9,8 112,4 83 50,8 61,2% 8,6 10,4% 16,9%

Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2017 după efectuarea fertilizării in vitro la vacile

din specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian)

folosind ovare din abatoare

În cazul ovocitelor provenite de la vacile abatorizate, s-a reușit obținerea unei rate de

segmentare de 61,2% și o rată a producerii embrionilor din acestea de 16,9%. Dacă raportăm

rata de dezvoltare embrionară din totalul ovocitelor selectate ca fiind optime pentru fertilizarea in

vitro se obține un procent de 10,4%.

Nr. matricol Ovocite

recoltate

Ovocite

maturate

Zigoți

stadiul 8-

16 celule

Morule Zigoți

(Blastociști

expandați)Blastociști

inoculați

Blastociști

congelați

RO509000954093 90 80 30 25 9 5

(1 paietă)

4 (1 paieta)

RO249001002721 24 20 10 9 9 0 9 (2 paiete

4+5)

RO502001664314 24 10 9 4 4 4

(1 paietă)

0

RO501000112390 35 12 8 4 4 4

(1 paietă)

0

RO503001166222 45 40 36 15 8 8

(3 paiete)

0

RO505001664368 50 35 22 15 6 6

(1 paietă)

0

RO505001664496 40 22 22 5 0 0 0

Nr. matricol Foliculi

punctionati

Ovocite

recuperate

Rata de

recuperare

Zigoți % embrioni

dezvoltați

Zigoți inoculați

receptoarelor

RO505005673120 15 5 33% 1 20 0

RO504005673101 16 9 56 % 6 66,6 0

RO507005673139 16 4 25 % 1 25 1 (juninca

receptoare

RO502007300821)

Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2018 după efectuarea fertilizării in vitro la

specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian) folosind ovare de la vacile abatorizate

În anul 2018 s-au obținut următoarele rezultate: în medie au fost recoltate 44 ovocite/animal

abatorizat din care 71% au evoluat în cadrul procesului de maturare in vitro și s-a obținut o rată de dezvoltare a

blastociștilor din totalul ovocitelor recoltate de 12.9%. Dacă ne raportăm la ovocitele maturate, atunci se obține o

rată a dezvoltării zigoților de 18,3%, aceasta fiind un rezultat satisfăcător având în vedere că pe plan

internațional acesată valoare este de aproximativ 25-30%.

Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2018 după efectuarea

fertilizării in vitro la specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian)

folosind ovocite recoltate prin OPU

În anul 2018, rezultatul fertilizării in vitro folosindu-se ovocite prelevate prin metoda OPU a fost 60%

rată de segmentare a blastociștilor și 44% rată de dezvoltare a embrionilor.

Evaluarea rezultatelor obținute ca urmare a inoculării zigoților (blastociști

expandați) rezultați din FIV la rasa Bălțată cu Negru Românească

(tulpina Holstein Friesian)

Nr.

crt

Vaca receptoare Data estrului Data inoculării

zigoților

Zigoți

inoculați

Diagnostic

gestație

1 RO506005694070 24.07.2017 31.07.2017 1 Negestantă

2 RO508005500898 26.07.2017 02.08.2017 2 Gestantă

3 RO500005695174 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă

4 RO508005695219 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă

5 RO507005694057 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă

6 RO504005695217 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă

Nr.

crt

Vaca receptoare Data inoculării

zigoților

Zigoți

inoculați

Vaca donatoare Diagnostic

gestație

1 RO509007200580 01.03.2018 5 RO509000954093 Gestantă

2 RO503007200566 15.03.2018 4 RO502001664314 Negestantă

3 RO506005695242 16.03.2018 4 RO501000112390 Negestantă

4 RO507007200555 16.03.2018 4 RO509000954093 Negestantă

5 RO503003318805 26.03.2018 4 RO503001166222 Negestantă

6 RO502000112377 27.03.2018 2 RO503001166222 Negestantă

7 RO507005694099 27.03.2018 2 RO503001166222 Gestantă

8 RO507003831490 27.03.2018 2 Embrioni Panifcom Negestantă

9 RO504007200626 11.05.2018 3 (sexați) RO505001664368 Negestantă

10 RO504007200655 11.05.2018 3 (sexați) RO505001664368 Negestantă

11 RO508007200615 20.06.2018 4 RO249001002721 Negestantă

12 RO504007200626 20.06.2018 5 RO249001002721 Negestantă

Centralizator al rezultatelor obținute în urma inoculării zigoților obținuți în anul 2017

Centralizator al rezultatelor obținute în urma inoculării zigoților obținuți în anul 2018

S-a observat faptul că nu există diferențe ale ratei gestației, ca urmare a FIV și ET, între anii

2017 (16,7%) și 2018 (16,6%) chiar dacă în primul an au fost utilizate paiete cu zigoți, congelate iar în cel de-

al doilea an paiete cu zigoți, necongelate.

Aspecte ecografice ale diagnosticului de gestație efectuat la vacile

receptoare pentru zigoții obținuți din FIV

Aspect ecografic al gestației (vârsta 30 zile)

obținută din FIV și ET la rasa Bălțată cu Negru

Românească (tulpina Holstein Friesian)

Aspect ecografic al gestației (vârsta 60 zile)

obținută din FIV și ET la rasa Bălțată cu Negru

Românească (tulpina Holstein Friesian)

Evaluarea potențialului productiv al produsului/produșilor din specia

Bos taurus, rasa Bălțată cu Negru Românsească (tulpina Holstein

Friesian), obținuți în urma fertilizării in vitro

Potențialul productiv pentru femele produse din FIV și ET din anul 2017, nu poate fi stabilit deoarece în acel an s-

au realizat experimente în scopul îmbunătătirii performanțelor ca urmare a folosirii acestor biotehnici în cadrul SCDCB Dancu-

Iași.

În anul 2018 potențialul productiv al produsului din rasa Bălțată cu Negru Românească (tulpina Holstein Friesian)

obținut din OPU și FIV a fost calculat după formula (Gâlcă I. și Maciuc V., 2004):

Lpi= (MT-M)/2*h2 +M;

Lpi- producţia de lapte potenţială (estimată)

MT – producţia de lapte a mamei tatălui

M-producţia de lapte a mamei

h2- coeficientul de heritabilitate

Nr. curent produs obținut

din fertilizare in vitro

(vacă donatoare, vacă

receptoare)

Producţia de lapte

a mamei -Kg/305

zile

Producţia de

lapte a mamei

tatălui - kg/305

zile

Heritabilitatea-

h2

Producţia

potenţială de lapte

Kg/305 zile

1 produs-gestație 8,5 luni

(RO509000954093,

RO509007200580)

8.594 13.883 0,21 9.149,345

1 produs-avortat

(RO507005694099,

RO503001166222

8.590 13.883 0,21 9.145,765

Testarea originii produșilor obținuți din Fertilizare in vitro și

embrio-transfer la rasa Bălțată cu Negru Românească

(tulpina Holstein Friesian)

Animalele COD RO 509007448292, RO

506007448293 sunt gemeni dizigoți cu

următoarele caracteristici imunogenetice: markeri

identici de fenogrup, transmitere specifică în

chimerism eritrocitar;

Animalul RO 508005500898 este mama

receptoare-purtătoare a gemenilor RO

509007448292 și RO 506007448293 cu

următoarele caracteristici: prezența factorului J

natural de anticorpi eritrocitari și V+ în sistemul F,

lipsește fenogrupul I1, E' 1, E' 2, E' 3. Aceste

diferențe prezente în structura imunogenetică

eritrocitară de fenogrup, confirmă că animalul

RO508005500898 este mama purtătoare.

Concluzia raportului transmis de firma

GENTEST INTERNATIONAL SRL stipulează că

femelele purtătoare ale crotaliilor cu numerele

RO509007448292, RO506007448293 sunt

provenite din embrio-tranfer cu mama purtătoare

RO508005500898.