Planul sectorial pentru cercetare dezvoltare din …...Fluid, Minitube BmbH) îmbogățitcu...
Transcript of Planul sectorial pentru cercetare dezvoltare din …...Fluid, Minitube BmbH) îmbogățitcu...
Planul sectorial pentru cercetare‐dezvoltare din domeniul agricol şi de dezvoltare rurală al
Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, pe anii 2015‐2018, "Agricultură şi Dezvoltare
Rurală ‐ ADER 2020“
Contractor: Staţiunea de Cercetare Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Dancu, Iaşi
Obiectivul general:7. Eficientizarea sistemelor de exploatare a animalelor de fermăObiectivul specific 7.2. Îmbunătățirea indicatorilor de reproducere la animalele de fermă prin utilizarea biotehnologiilor specifice
Numărul /codul proiectului: 64 / ADER 7.2.1.Contract de finanțare 7.2.1./03.11.2015Anul începerii 03.11.2015Anul finalizării 10.12.2018Durata (luni): 39
Denumirea proiectului:Îmbunătățirea potențialului productiv în fermele de vaci pentru lapte din N-E României prin producerea de embrioni in vitro folosind donatoare de ovocite înalt productive și material seminal (sexat și nesexat) provenit de la tauri testați.
Persoana de contact (Directorul proiect): BORȘ Silviu-Ionuț
Date contact (tel/fax, e-mail): 0232272465, 0726399084 e-mail: [email protected]
Număr matricol Producția de lapte
Kg/305 zile, EM
conform
A.G.C.T.R.
Potențial productiv
Kg lapte/305 zile
RO509000954093 8594 -
RO249001002721 8214 -
RO502001664314 8848 -
RO501000112390 8397 -
RO503001166222 8590 -
RO505001664368 8590 -
RO505001664496 8090 -
RO507005673139 - 10368,93
RO504005673101 - 13699,91
RO505005673120 - 11338,22
Producția de lapte și potențialul productiv ale
donatoarelor de ovocite din rasa Bălțată cu Negru
Românească (tulpina Holstein Friesian) utilizate în faza
IV/2018 a proiectului Ader 7.2.1.
Producția potențială a fost calculată după
formula (Gâlcă I. și Maciuc V., 2004):
Lpi= (MT-M)/2*h2 +M;
Lpi- producţia de lapte potenţială (estimată)
MT – producţia de lapte a mamei tatălui
M-producţia de lapte a mamei
h2- coeficientul de heritabilitate
Selectarea donatoarelor de gameți sexuali femeli (ovocite) din rasa
Bălțată cu Negru Românească (tulpina Holstein Friesian)
Pentru realizarea rezultatului scontat 1 (utilizare de vaci înalt productive) au fost
selectate, în scopul recoltării gametului sexual femel (ovocit), 7 vaci din rasa Bălțată cu
Negru Românească (tulpina Holstein Friesian) cu producții de lapte mai mari de 8000
kg/305 zile, îndeplinindu-se criteriul de îmbunătățire a potențialului productiv pentru ferma
Dancu și pentru zona de nord-est a României.
Pentru a aplica această biotehnică și la rasa Holstein Friesian, SCDCB Dancu-Iași a
achiziționat juninci gestante de la o fermă specializată în această rasă (S.C. Panifcom
S.R.L.), juninci care prezintă potențial genetic crescut.
Selectarea taurului donator al gametului sexual mascul, din primii 10 tauri
ai topului european
S-a achiziționat material seminal congelat (sexat și nesexat) provenit de la taurul Big Point
(DE 06 66050471, ZB-NR 10 619043), în scopul realizării fecundației in vitro. Alegerea acestui
taur a fost susținută de faptul că în data de 8 August 2017 se clasa pe locul 1 prezentând
valoarea de ameliorare totală- RZG 147 (3520 fiice evaluate), în data de 05 Decembrie 2017 se
clasa pe locul 3 cu valoarea RZG 146 (4972 fiice evaluate) și în data de 4 Aprilie 2018 se clasa
pe locul 10 cu valoarea RZG 141 (6851 fiice evaluate)
Recoltarea gametului sexual femel prin tehnica secțiunilor multiple
efectuate în corticala ovariană (de la vaci abatorizate) și prin puncție
transvaginală ecoghidată (in vivo), metoda Ovum Pick Up (OPU)
Aplicarea secțiunilor multiple în
corticala ovariană în scopul recoltării
ovocitelor la specia Bos taurus
Recoltarea ovocitelor prin puncție
transvaginală ecoghidată
(metoda Ovum Pick-Up)
Aspect microscopic al complexelor ovocit-cumulus selectate
din mediul de maturare, înaintea inițierii procesului de
maturare (ovocite provenite din ovarele vacilor abatorizate)
Aspect microscopic al complexelor ovocit-cumulus
maturate înainte de inițierea fecundației in vitro
Complexe ovocit-cumulus maturate provenite din puncție transvaginală
ecoghidată (Ovum Pick Up-OPU) înaintea inițierii fecundației in vitro
Fertilizarea in vitro (FIV) a ovocitelor la rasa
Bălțată cu Negru Românească
Mediul de fertilizare a fost reprezentat de mediul TL (minitube GmbH), suplimentat cu
albumină bovină serică (BSA), piruvat de sodiu, heparină și gentamicină (Sigma-Aldrich).
În cazul folosirii mediului BO-IVF protocolul de lucru a fost asemănător cu cel utilizat
în cazul folosirii mediului pentru fertilizare TL.
Fertilizarea in vitro a fost efectuată cu material seminal provenind de la taurul Big
Point, achiziționat de la un centru specializat în producerea dozelor de însămânțare artificială a
vacilor. Anterior fertilizării, spermatozoizii au fost pregătiți prin tehnica Swim-up, în mediu special
TL sperm îmbogățit cu BSA, piruvat de sodiu și gentamicină.
Gameții în picăturile de fertilizare. Spermatozoizii pot fi
observați sub forma unor puncte albe în zonele de câmp
întunecat (imagine microscopică)
Cultura prezumtivilor zigoți
Cultura prezumtivilor zigoților a fost realizată în mediul de cultură SOF (Synthetic Oviduct
Fluid, Minitube BmbH) îmbogățit cu aminoacizi esențiali, aminoacizi non-esențiali și piruvat de sodiu
(Sigma Aldrich), sau a mediului de cultură BO-IVC (IVF Bioscience).
Din picăturile de fertilizare, zigoții au fost preluați și spălați de două ori în mediul de
cultură, după care au fost denudați prin turbionare și separați de ovocitele nefertilizate.
Zigoți separați, zilele 1-2 de cultură celulară (stadii de dezvoltare: 2, 4 și
8 celule, imagini microscopice)
Evaluarea zigoților în zilele 7, 9 de cultură clulară
Blastociști bovini înconjurați de zonă pelucidă
intactă din ziua a 7-a de cultură celulară
(imagine microscopică)
Ziua 9 de cultură celulară, prezența a 5 blastociști
eclozați obținuți din ovocite prelevate de la vaci
abatorizate (imagine microscopică)
Ziua 9 de cultură celulară, prezența a 6 blastociști eclozați
obținuți din OPU asociat FIV (imagine microscopică)
Inocularea zigoților obținuți din FIV la rasa Bălțată cu Negru Românească
(tulpina Holstein Friesian)
Evaluarea rezultatelor obținute din FIV la rasa Bălțată cu Negru
Românească (tulpina Holstein Friesian)
Nr. crt.
Număr de
ovare
prelevate
Număr de
ovocite
recoltate
Număr de
ovocite selectate
Număr de
embrioni
segmentați
Rata
segmentării
(%)
Număr de
embrioni
obținuți
%
embrioni
dezvoltați
din totalul
de ovocite
selectate
%
embrioni
dezvoltați
din
numărul de
embrioni
segmentați
1 10 110 90 60 66,7% 8 8,9% 13,3%
2 13 150 80 46 57,5% 10 12,5% 21,7%
3 6 60 54 20 37,0% 0 0,0% 0,0%
4 10 150 120 88 73,3% 10 8,3% 11,4%
5 10 92 71 40 56,3% 15 21,1% 37,5%
Medie 9,8 112,4 83 50,8 61,2% 8,6 10,4% 16,9%
Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2017 după efectuarea fertilizării in vitro la vacile
din specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian)
folosind ovare din abatoare
În cazul ovocitelor provenite de la vacile abatorizate, s-a reușit obținerea unei rate de
segmentare de 61,2% și o rată a producerii embrionilor din acestea de 16,9%. Dacă raportăm
rata de dezvoltare embrionară din totalul ovocitelor selectate ca fiind optime pentru fertilizarea in
vitro se obține un procent de 10,4%.
Nr. matricol Ovocite
recoltate
Ovocite
maturate
Zigoți
stadiul 8-
16 celule
Morule Zigoți
(Blastociști
expandați)Blastociști
inoculați
Blastociști
congelați
RO509000954093 90 80 30 25 9 5
(1 paietă)
4 (1 paieta)
RO249001002721 24 20 10 9 9 0 9 (2 paiete
4+5)
RO502001664314 24 10 9 4 4 4
(1 paietă)
0
RO501000112390 35 12 8 4 4 4
(1 paietă)
0
RO503001166222 45 40 36 15 8 8
(3 paiete)
0
RO505001664368 50 35 22 15 6 6
(1 paietă)
0
RO505001664496 40 22 22 5 0 0 0
Nr. matricol Foliculi
punctionati
Ovocite
recuperate
Rata de
recuperare
Zigoți % embrioni
dezvoltați
Zigoți inoculați
receptoarelor
RO505005673120 15 5 33% 1 20 0
RO504005673101 16 9 56 % 6 66,6 0
RO507005673139 16 4 25 % 1 25 1 (juninca
receptoare
RO502007300821)
Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2018 după efectuarea fertilizării in vitro la
specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian) folosind ovare de la vacile abatorizate
În anul 2018 s-au obținut următoarele rezultate: în medie au fost recoltate 44 ovocite/animal
abatorizat din care 71% au evoluat în cadrul procesului de maturare in vitro și s-a obținut o rată de dezvoltare a
blastociștilor din totalul ovocitelor recoltate de 12.9%. Dacă ne raportăm la ovocitele maturate, atunci se obține o
rată a dezvoltării zigoților de 18,3%, aceasta fiind un rezultat satisfăcător având în vedere că pe plan
internațional acesată valoare este de aproximativ 25-30%.
Centralizator al rezultatelor obținute în anul 2018 după efectuarea
fertilizării in vitro la specia Bos taurus (tulpina Holstein Friesian)
folosind ovocite recoltate prin OPU
În anul 2018, rezultatul fertilizării in vitro folosindu-se ovocite prelevate prin metoda OPU a fost 60%
rată de segmentare a blastociștilor și 44% rată de dezvoltare a embrionilor.
Evaluarea rezultatelor obținute ca urmare a inoculării zigoților (blastociști
expandați) rezultați din FIV la rasa Bălțată cu Negru Românească
(tulpina Holstein Friesian)
Nr.
crt
Vaca receptoare Data estrului Data inoculării
zigoților
Zigoți
inoculați
Diagnostic
gestație
1 RO506005694070 24.07.2017 31.07.2017 1 Negestantă
2 RO508005500898 26.07.2017 02.08.2017 2 Gestantă
3 RO500005695174 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă
4 RO508005695219 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă
5 RO507005694057 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă
6 RO504005695217 26.07.2017 02.08.2017 2 Negestantă
Nr.
crt
Vaca receptoare Data inoculării
zigoților
Zigoți
inoculați
Vaca donatoare Diagnostic
gestație
1 RO509007200580 01.03.2018 5 RO509000954093 Gestantă
2 RO503007200566 15.03.2018 4 RO502001664314 Negestantă
3 RO506005695242 16.03.2018 4 RO501000112390 Negestantă
4 RO507007200555 16.03.2018 4 RO509000954093 Negestantă
5 RO503003318805 26.03.2018 4 RO503001166222 Negestantă
6 RO502000112377 27.03.2018 2 RO503001166222 Negestantă
7 RO507005694099 27.03.2018 2 RO503001166222 Gestantă
8 RO507003831490 27.03.2018 2 Embrioni Panifcom Negestantă
9 RO504007200626 11.05.2018 3 (sexați) RO505001664368 Negestantă
10 RO504007200655 11.05.2018 3 (sexați) RO505001664368 Negestantă
11 RO508007200615 20.06.2018 4 RO249001002721 Negestantă
12 RO504007200626 20.06.2018 5 RO249001002721 Negestantă
Centralizator al rezultatelor obținute în urma inoculării zigoților obținuți în anul 2017
Centralizator al rezultatelor obținute în urma inoculării zigoților obținuți în anul 2018
S-a observat faptul că nu există diferențe ale ratei gestației, ca urmare a FIV și ET, între anii
2017 (16,7%) și 2018 (16,6%) chiar dacă în primul an au fost utilizate paiete cu zigoți, congelate iar în cel de-
al doilea an paiete cu zigoți, necongelate.
Aspecte ecografice ale diagnosticului de gestație efectuat la vacile
receptoare pentru zigoții obținuți din FIV
Aspect ecografic al gestației (vârsta 30 zile)
obținută din FIV și ET la rasa Bălțată cu Negru
Românească (tulpina Holstein Friesian)
Aspect ecografic al gestației (vârsta 60 zile)
obținută din FIV și ET la rasa Bălțată cu Negru
Românească (tulpina Holstein Friesian)
Evaluarea potențialului productiv al produsului/produșilor din specia
Bos taurus, rasa Bălțată cu Negru Românsească (tulpina Holstein
Friesian), obținuți în urma fertilizării in vitro
Potențialul productiv pentru femele produse din FIV și ET din anul 2017, nu poate fi stabilit deoarece în acel an s-
au realizat experimente în scopul îmbunătătirii performanțelor ca urmare a folosirii acestor biotehnici în cadrul SCDCB Dancu-
Iași.
În anul 2018 potențialul productiv al produsului din rasa Bălțată cu Negru Românească (tulpina Holstein Friesian)
obținut din OPU și FIV a fost calculat după formula (Gâlcă I. și Maciuc V., 2004):
Lpi= (MT-M)/2*h2 +M;
Lpi- producţia de lapte potenţială (estimată)
MT – producţia de lapte a mamei tatălui
M-producţia de lapte a mamei
h2- coeficientul de heritabilitate
Nr. curent produs obținut
din fertilizare in vitro
(vacă donatoare, vacă
receptoare)
Producţia de lapte
a mamei -Kg/305
zile
Producţia de
lapte a mamei
tatălui - kg/305
zile
Heritabilitatea-
h2
Producţia
potenţială de lapte
Kg/305 zile
1 produs-gestație 8,5 luni
(RO509000954093,
RO509007200580)
8.594 13.883 0,21 9.149,345
1 produs-avortat
(RO507005694099,
RO503001166222
8.590 13.883 0,21 9.145,765
Testarea originii produșilor obținuți din Fertilizare in vitro și
embrio-transfer la rasa Bălțată cu Negru Românească
(tulpina Holstein Friesian)
Animalele COD RO 509007448292, RO
506007448293 sunt gemeni dizigoți cu
următoarele caracteristici imunogenetice: markeri
identici de fenogrup, transmitere specifică în
chimerism eritrocitar;
Animalul RO 508005500898 este mama
receptoare-purtătoare a gemenilor RO
509007448292 și RO 506007448293 cu
următoarele caracteristici: prezența factorului J
natural de anticorpi eritrocitari și V+ în sistemul F,
lipsește fenogrupul I1, E' 1, E' 2, E' 3. Aceste
diferențe prezente în structura imunogenetică
eritrocitară de fenogrup, confirmă că animalul
RO508005500898 este mama purtătoare.
Concluzia raportului transmis de firma
GENTEST INTERNATIONAL SRL stipulează că
femelele purtătoare ale crotaliilor cu numerele
RO509007448292, RO506007448293 sunt
provenite din embrio-tranfer cu mama purtătoare
RO508005500898.