DIAGNOSTICUL DE LABORATOR BACTERIOLOGIC

LUCRAREA 3.

SCHEMA DIAGNOSTICULUI BACTERIOLOGIC

Nr.crt.BACTERIOLOGIEVIRUSOLOGIEPARAZITOLOGIE

METODE DIRECTE

1Recoltarea produsului patologicDiferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltatDiferita in functie de pp recoltat

2Examenul direct al produsului patologic1. examen macroscopic

2. examen microscopic microscopie optic

o preparat nativ

o coloraie negativ

o coloraie simpl

o coloraii compuse

3. evidenierea antigenelor bacteriene prin metode serologice

4. detectarea ADN-ului microbian (reacii de hibridizare, amplificare genic PCR)1. examen macroscopic-nu

2. examen microscopic

o evidenierea incluziilor

virale microscopie optic

o microscopie electronic

3. reacii antigen-anticorp

(evidenierea antigenului)

4. detectarea ADN-ului - reacii de hibridizare, amplificare genic

(PCR)Examen coproparazitologic:

1. examen macroscopic

2. examen microscopic

o metode directe

preparat nativ, n ser

fiziologic

preparat nativ n soluie lugol

frotiu colorat

o metode de examinare n strat gros

o metode de concentrare

o metode larvoscopice

o amprenta anal

3. detectarea ADN-ului - reacii de

hibridizare, amplificare genic

(PCR)

3CultivareIzolarea germenului n cultur pur

nsmnarea si cultivarea pe medii de cultur

inoculare la animale de laboratorCultivarea virusurilor

culturi celulare, linii celulare

animale de laborator oul de gin embrionatCultivarea paraziilor

nsmnarea se face

pentru paraziii unicelulari pe medii

nclzite la 37C, 1sau mai multe zile

animale de laborator

4IdentificareIdentificarea germenului izolat din cultur pur

1. cercetarea caracterelor de cultur si morfotinctoriale

2.cercetarea caracterelor biochimice si de metabolism

3.determinarea structurii antigenice prin:

reacii de aglutinare

reacii de precipitare

reacii de umflare a capsulei

4. tehnici de detectare a ADN

microbian

5. Determinarea patogenitii

germenului izolat prin:

o teste in vitro

o teste in vivo (boala experimental)Identificarea virusului izolat

1.prin examen microscopic2. modificrile caracteristice

aprute pe

culturile celulare,

OGE animale de experien3. reacii antigen-anticorp4. detectare a ADNului -reacii de hibridizare, amplificare genic (PCR)1.reacii antigen-anticorp

2. tehnici de detectare a ADNmicrobian

5Antibiograma DA

METODE INDIRECTE

61. detectarea anticorpilor din serul bolnavilor (anticorpii se urmresc n dinamic)1. detectarea anticorpilor din

serul bolnavilor

o Seroconversia: cresterea

titrului de anticorpi n probele de ser recoltate la interval de 10-14 zile

o (demonstrarea unei infecii

recente, actuale1. Detectarea anticorpilor din serul bolnavilor

o anticorpii se urmresc n

dinamic

reacii biologice

cutanate de diagnostic

(IDR) - rar

Alt model schema simplificata:

Caractere generale:

Diagnosticul de laborator consta in:

I. Diagnosticul bacteriologic

1. Recoltarea produselor patologice;

2. Examnarea macroscopic si microscopic (prin examen direct) al produsului patologic;

3. Insamintarea si izolarea;

4. Citirea si interpretarea rezultatelor;

5. Cercetarea caracterelor de patogenitate:

- teste de patogenitate in vitro;

- teste de patogenitate in vivo.

6. Cercetarea sensibilitatii la actiunea bacteriofagilor;

7. Cercetarea sensibilitatii la antibiotic si chimioterapice.

II. Diagnostic imunologic

RECOLTAREA SI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICERecoltarea i transportul produselor patologice

Obinerea unui rezultat corect la examenul microbiologic impune respectarea unor reguli referitoare la:

- modul de recoltare al produsului patologic (PP);

- metodele de conservare;

- modalitile de transport.

La recoltarea produselor patologice trebuie rspuns la urmtorul chestionar:

Ce se recolteaz? n care produse patologice se pot gsi bacteriile suspectate?

Bacteriile patogene poate fi cutat:

- la pori de intrare;

- n organe int;

- n focare metastatice nespecifice;

- n cile de rspndire (snge i ganglioni);

- n cile de eliminare (intestin, ci urinare)

Bacteriile pot fi depistate prin cutarea antigenelor bacteriene n:

- umori;

- snge;

- urin;

- exsudate: LCR, sput.

Cine poate recolta? Recoltarea produsului patologic este efectuat de medicul clinician i/sau asistent.

Ct se recolteaz? Cantitatea produsului prelevat trebuie s fie suficient.

Cnd se recolteaz? La prelevarea probelor se ine seama de anumite reguli. Recoltarea se face:

- dup pregtirea prealabil a pacientului;

- dup informarea pacientului n legtur cu analiza ce urmeaz a fi efectuat i cu modul corect de efectuare;

- n recipiente pentru recoltare curate, sterile, de unic folosin i adaptate investigaiei. Recipientele de transport se nchid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului i a personalului care manipuleaz produsele patologice;

- ct mai aproape de debut;

- naintea administrrii antibioticului;

- ct mai rapid posibil, corect, aseptic;

- pe recipient se noteaz numele pacientului i proveniena sa, tipul produsului patologic:

n ce scop se face recoltarea? Trebuie s se precizeze ce examene de laborator se solicit.Transportul produsului patologic la laborator se face:

- ct mai repede pentru a preveni degradarea produsului patologic;

- folosind medii de transport care asigur o bun supravieuire a bacteriilor.

La transport, produsul patologic trebuie s fie nsoit de un bilet de trimitere completat corect.

n cazul examenului virusologic:

- produsele patologice se transport n recipiente nchise ermetic, pe ghea, nsoite de formular de cerere de analiz completat corespunztor, imediat dup recoltare;

- dac produsele nu pot fi prelucrate imediat trebuie congelate rapid la -70C, pentru ca unele virusuri sunt deosebit de labile i i pierd viabilitatea/infectivitatea rapid (citomegalovirus, varicela - zoster virus, virusul respirator sinciial);

- trebuie s se evite congelarea produselor patologice la -20C, deoarece virusurile i pierd viabilitatea.Ce produse patologice pot fi recoltate?

Produsele patologice sunt reprezentate de:- exsudat faringian;- secreie nazal;- secreie nazo-faringian;- sput;- snge;- Lichid cefalorahidian LCR;- urin;- secreie vaginal;- secreie uretral i prostatic;- materii fecale;- bil;- puroi;- secreie conjunctival;- exsudate din caviti nchise.Modul de recoltare a celor mai frecvente produse patologice, n funcie de situsul anatomic

Nr. crt.Produs patologicExamen bacteriologicExamen virusologic

1.Exsudat faringianCnd se recolteaz: nainte de tratament antibacterian. nainte de ingestia alimentelor sau toaleta cavitii bucale.

Cantitate recoltat: un tampon sau 2 tampoane n cazurile speciale;

Transport: < 2 oreMod de recoltare se deprim baza limbii cu un apstor steril; se terge ferm cu un tampon, dar nu brutal, amigdalele i peretele posterior al faringelui, zone inflamate, ulcerate sau depozitele purulente.Tamponul este introdus n tubul protector i apoi sunt notate datele pacientului.

Examinare trebuie fcut n maxim 3 ore de la recoltare.

n biletul de trimitere se precizeaz suspiciunea clinic de angin i stomatit Vincent (depozit pseudomembranos);

- dac identificarea lui Staphylococcus aureus este n scop epidemiologic (purttor).- Se terge ferm mucoasa faringian cu un tampon uscat;

- se aeaz tampoanele ncrcate n mediu

de transport;

- se pstreaz produsul patologic pe ghea;

- izolarea virusurilor de pe tampoane este mai puin eficient dect izolarea din aspirate sau lavaje, dar recoltarea cu tamponul este mult mai uor de efectuat;

se transport la laborator pe ghea.

2.Exsudat nazal (Secreie nazal)Pacientul sufl nasul.

Mod de recoltare:

- medicul umecteaz tamponul faringian n ser fiziologic;

- terge, pe rnd vestibulul foselor nazale.

Cantitate recoltat: un tampon pentru fiecare nara.

Transport: < 2 ore.

Examinarea: la 2-3 ore de la recoltare.

Observaie: exsudatul nazal este recomandat n principal pentru depistarea purttorilor de Staphylococcus aureus.- Se rotete tamponul umectat cu mediu de

transport n cavitatea nazal;

- tampoanele ncrcate se aeaz n mediu

de transport, acestea se pstreaz/se transport la laborator pe ghea

3.Secreia nazo - faringian

Pacientul este aezat cu capul nclinat pe spate.

Mod de recoltare:

- medicul introduce tamponul nazo - faringian printr-o nar, pn la peretele posterior al nazo - faringelui,

se las cteva secunde, dup care se rotete uor, apoi se retrage puin, se

reinser, rotete i se retrage definitiv.

Examinarea : la 2-3 ore de la recoltare.Tamponul inserat pe tij flexibil se introduce printr-o nar pn ce se atinge peretele posterior al nazo - faringelui, se

ateapt cteva secunde i se retrage;

- se recolteaz n primele 5 zile de la apariia simptomelor;

- se transport la laborator pe ghea.

4.SputSe recolteaz la internare.

Mod de recoltare: se efectu periajul dinilor, cltirea energic a gurii i gargar cu ap steril. Pacientul tuete i expectoreaz ntr-un recipient steril (cu gtul larg i cu un capac care se nchide ermetic).

Tuse spontan, intens, supravegheat.

Cantitatea recoltat: 1-2 ml prob purulent.

Tuitori cronici, TBC: toat sputa de la expectoraia matinal sau

expectorat n interval de 1 - 2 ore

Tuse slab productiv: stimularea expectoraiei

Transport: < 2 ore.

Observaii: se recolteaz sputa sub directa ndrumare a asistentei. Se explic pacientului diferena dintre a expectora i a scuipa. Sputa se recolteaz dimineaa cnd pacientul face toaleta bronhiilor. Nu se examineaz probele de sput adunate n 24 de ore.Se transport la laborator pe ghea

5.Secreie trahealMod de recoltare: secreie aspirat n recipient steril.

Cantitatea recoltat: > 3 mL.

Transport: < 2 ore.

Observaii: se aspir cu ajutorul unei sonde de unic folosin, atraumatic, aseptic. Se va efectua preoxigenarea bolnavului cu fracie inspiratorie Fi O2 = 1, timp de trei minute.-

6Secreie otic internMod de recoltare - timpan perforat: se colecteaz fluidul cu un tampon flexibil cu ajutorul unui speculum auditiv.

Cantitatea recoltat: tampon cu mediu de transport sau sistem anaerob. Obligatoriu se recolteaz doua tampoane din acelai loc.

Transport: < 2 ore.

Observaii: n cazul secreiei aspirate sau biopsiei se folosete sistemul de transport anaerob. Culturile de la nivel nazofaringian sau exsudat faringian nu sunt predictive pentru agenii etiologici n otita medie.

7.Secreie otic externMod de recoltare: cu un tampon umezit se cur conductul auditiv extern. Cu un al II-lea tampon se recolteaz prin rotire ferm.

Cantitatea recoltat: obligatoriu se recolteaz 2 tampoane.

Transport: < 2 ore.

Observaii: pentru secreia otic externa se va efectua rotirea riguroas a tamponului.

8.Secreii oculareConjunctiv

Mod de recoltare:

se recolteaz cte un tampon separat pentru fiecare ochi;

tamponul este umezit n ser fiziologic steril; se rotete tamponul i se nsmneaz direct pe mediile de cultur, majoritatea germenilor avnd viabilitate redus.Transport: nsmnare direct pe mediile de cultura (chocolate, geloz-snge), frotiuri pentru examenul microscopic direct. Plcile nsmnate se trimit la laborator < 15 min.Observaii: se recolteaz nainte de: toaleta feei, terapie antimicrobian topic sau sistemic; se recolteaz de la nivelul ambelor conjunctive. Ochiul neinfectat servete drept control.

CorneeMod de recoltare: se racleaz din mai multe arii ale ulcerului cornean. Se folosete soluie anestezic local.

Transport: nsmnare direct pe mediile de cultura (BHI, chocolate), frotiuri pentru examenul microscopic direct. Plcile nsmnate se trimit la laborator < 15 min.

9.Snge - hemoculturRecoltare n recipiente speciale pentru

Hemocultur:1 set = 1 flacon aerob + 1 flacon anaerob.

Se recomand recoltarea sngelui din 2 locuri diferite

Volum recoltat: 10 ml (1-3 ml la copii)

Recoltarea pentru hemocultur, presupune lipsa tratamentului cu antibiotice, altfel exist riscul ca germenii s nu creasc.

Tehnica de recoltare: se procedeaz la antiseptizarea tegumentului cu iod (betadine), apoi cu alcool 70%; se ateapt uscarea zonei antiseptizate dac acest interval nu poate fi respectat, probele trebuie pstrate la 4C imediat dup recoltare. Recoltarea sngelui se face cu ac i siring i se transfer n flacoane. Se inoculeaz fiecare flacon fr a depi semnul de pe etichet.

Transport: se folosesc flacoane pentru sistemul automat (BactAlert). Se impune decontaminarea dopurilor la flacoanele de hemocultur cu alcool 70%. Se inoculeaz fiecare flacon fr a depi semnul de pe etichet. Transportul trebuie fcut imediat. Nu se refrigereaz.

Observaii: Sepsis acut: 3 seturi, 3 venopuncii separate, la interval de 10 minute, nainte de a ncepe antibioticoterapia. Endocardita acut: 3 seturi, 3 venopuncii separate n primele 1-2 ore de evoluie; se recomand nceperea terapiei. Endocardita subacut: 3 seturi, 3 venopuncii separate la interval de 15 minute n prima zi. Dac rezultatul la 24 ore este negativ, recoltai nc trei seturi. Endocardita n timpul tratamentului cu antibiotice: 3 seturi, 3 venopuncii separate, zilnic, 3 zile succesiv. Se recolteaz imediat naintea nceperii urmtoarei doze de antibiotic. Nu se recolteaz cnd concentraia seric a antibioticului este maxim. Febra de origine necunoscut: 2-3 seturi, venopuncii separate la interval de cel puin o ora. Dac rezultatul la 24-36 ore este negativ, se repet recoltarea.n cursul diagnosticului serologic: se recolteaz snge n vacutainere

fr anticoagulani (dop rou).

Sngele recoltat se transport fr

refrigerare, la temperatura camerei.

Serul este separat n laborator.

n cazul determinrii statusului imun: se recolteaz o singur prob; pentru detectarea infeciilor acute se recolteaz probe perechi, o prob de snge n perioada de stare a bolii i o prob n starea de convalescen, la interval de 10-14 zile ntre probe.

10.Lichid cefalorahidian (LCR)LCR se recolteaz prin puncie lombar n condiii stricte de asepsie.

Produsul patologic nu se refrigereaz (Neisseria meningitidis).Recoltarea se face n primele 7 zile de la

debut;

- se transport la laborator pe ghea.

11.UrinPacientul trebuie educat (explicat pe nelesul fiecrui bolnav) pentru prevenirea contaminrii probei

Momentul prelevrii: prima urin de diminea.

Recoltarea urinei se face:

- dup cel puin 3-4 ore de la miciunea anterioar;

- dup toaleta riguroas a organelor genitale externe cu ap cldu i spun;

- din jetul mijlociu fr ntrerupere fluxului;

- n recipiente sterile speciale pentru

recoltarea urinei.

Cantitatea necesar: 10-20 ml.

Pentru nou-nscui se folosesc pungi sterile din material plastic.

Se mai poate preleva urin prin puncie

suprapubian sau prin cateter:

Examenul microbiologic al urinei trebuie efectuat n cel mult 2 ore de la prelevare

indiferent de modul de recoltare.Se recolteaz jetul mijlociu n recipient

steril cu capac filetat;

- se transport imediat la laborator pe ghea;

- recoltarea se face n primele 2 sptmni de boal; pentru CMV se recolteaz oricnd pe durata boli;

- se transport la laborator pe ghea.

12.Secreiile

genitale - la

femei

Vaginite: se recolteaz din fundul de sac vaginal, cu tampon steril care apoi se introduce n mediu de transport;- se efectueaz dou frotiuri.

Transport: < 2 ore.

Observaii: n cazul suspiciunii infeciei cu Trichomonas vaginalis, un tampon se imerseaz n tub steril cu 1 mL soluie salin izoton (37C), pentru examen microscopic (preparat proaspt ntre lam-lamel.

Cervicite: se recolteaz cu un tampon steril; se ndeprteaz mucusul de la nivelul cervixului; cu un alt tampon se recolteaz produsul patologic prin introducerea i rotirea n canalul cervical; se asigur evitarea contaminrii probei cu flora vaginal; se efectueaz dou frotiuri.

Bartolinite: se preleveaz secreia purulent de la nivelul orificiului conductului glandular.

Cantitatea recoltat > 1 mL.Transport: sistem anaerob.

Endometrite: se badijoneaz cu alcool iodat exocolul i canalul cervical; se introduce un cateter; se aspir lichid endometrial.

Observaii: puroiul aspirat prin puncie (abces) se nsmneaz pe medii aerobe i anaerobe.

La fetie: se efectueaz tamponarea secreiei de la nivelul vulvei.

Cu ajutorul unui cateter se introduc n

vagin 2 ml ser fiziologic steril, apoi se

colecteaz lichidul de spltur;

- se efectueaz dou frotiuri.

Produsul patologic nu se refrigereaz (Neisseria gonnorhoeae).Se transport la laborator pe ghea.

13.Secreiile

genitale - la

brbai

Uretrite:- se recolteaz secreie uretral spontan sau provocat cu tampon steril, care se introduce n mediu de transport:

Cantitatea recoltat: tampon cu mediu de transport; se efectueaz dou frotiuri;

pentru examenul microscopic.

- se poate recolta i urin - primul jet.

Transport: 2 ore.Observaii - examinarea uretrei i prelevarea probelor se fac la cel puin dou ore dup miciune. Pacienii cu scurgere discret vor reduce lichidele pn n ziua urmtoare i prelevarea se face nainte de miciunea matinal. In cazul suspiciunii infeciei cu Trichomonas vaginalis, prelevarea se va face naintea miciunii matinale; tamponul se imerseaz n tub steril cu 1 mL soluie salin izoton (37C), pentru examen microscopic fr ntrziere. Probele destinate cultivrii gonococilor se nsmneaz imediat pe medii speciale, la 37C.

Prostatite:

- se recolteaz secreia prostatic dup

masaj prostatic ejaculare i colectare n recipient steril.

Cantitatea recoltat: tampon cu mediu de transport; doua lame pentru examenul microscopic.

Transport: < 2 ore.Se transport la laborator pe ghea

14.Materii fecale: CoproculturScaun emis spontan.

Defecarea se face n containere de unic utilizare de carton sau material plastic. Se recolteaz:

- cu tampon/linguria coprorecoltorului;

- poriuni lichide, mucoase,

sanguinolente, volumul prelevat fiind de 3 - 5 cm3;

- prelevare rectal;

- cu sonda Nelaton:

- umectarea sondei n ser fiziologic

Steril;

- penetrarea sfincterului anal prin

rotare lent;

introducere intrarectal 15 cm;

adaptarea unei siringi sterile de 10 mL;

- se efectueaz 1 - 2 aspiraii;

- introducerea aspiratului n tub steril cu dop, cu mediu de conservare lichid.

Pentru depistare Clostridium difficile se face recoltarea de scaun diareic (lichid sau moale) n recipient curat, fr mediu de transport.Scaun emis spontan.Se recolteaz probe n primele 2 - 3 zile de boal; nu se folosesc conservani, medii de transport, nu se recolteaz cu tamponul deoarece o mare parte

din virusuri se absoarbe pe tampon:

Metode de conservare:

- refrigerare la 4oC;

- congelare la -70oC. Se folosesc containere sterile.

Cantitatea de prob:

5 - 10 cm3.

15.Lichide Ascit, bil, lichid sinovial, pericardic, peritoneal, pleural

Mod de recoltare: se dezinfecteaz tegumentul cu betadine, 3 badijonri succesive cu respectarea timpul de aciune al antisepticului; se aspir cu ac steril/ chirurgic, se ndeprteaz iodul cu alcool 70%.

Cantitatea recoltat: ntotdeauna trebuie trimis fluid ct de mult posibil. Niciodat nu se recolteaz tampon mbibat n lichid.

Transport: < 15 minute.

Observaii: recoltarea se face n flacoane pentru sistemul automat: se ndeprteaz capacul flacoanelor; se dezinfecteaz capacele de cauciuc cu alcool 70%; se inoculeaz fiecare flacon, fr a depi semnul de pe etichet. Pentru culturi se recomand recoltarea i transportul direct n flacoane de hemocultur.

PAGE 11